專利名稱：人卵透明帶蛋白-4的表位最小基序肽及其擴(kuò)展短肽和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人卵透明帶蛋白-4能被特異單抗識(shí)別的表位最小基序肽及其擴(kuò)展短肽和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
除了小鼠,包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物卵透明帶(zona pellcida,ZP)都由四個(gè)糖蛋白(分別被命名為ZP1，ZP2，ZP3和ZP4)組成。作為抗生育環(huán)節(jié)之一，阻斷人精卵結(jié)合受精從而導(dǎo)致不孕無疑是不會(huì)引起爭(zhēng)議的最理想途徑。因此，40多年來世界上許多實(shí)驗(yàn)室一直在開展ZP避孕疫苗的研究。雖然以小鼠和兔等為動(dòng)物模型的許多研究證實(shí)了 ZP或単一 ZP3蛋白抗原主動(dòng)免疫的抗生育充分有效性，但受試動(dòng)物都發(fā)生卵巣炎、卵泡和卵巢萎縮或卵子發(fā)生衰減等病理現(xiàn)象。對(duì)人類而言，ZP疫苗這方面的免疫副作用顯然是不可接受的。為此，如何克服ZP疫苗的這ー嚴(yán)重缺陷是相關(guān)研究人員始終關(guān)注的焦點(diǎn)，也獲得了ー些重要進(jìn)展。例如，美國(guó)NIH的Dean實(shí)驗(yàn)室首先用一單克隆抗體(以下簡(jiǎn)稱單杭)鑒定出小鼠精子受體ZP3蛋白羧基端的一個(gè)線性B細(xì)胞表位(以下簡(jiǎn)稱表位)，并以其表位化學(xué)合成肽作為免疫原獲得了不完全的抗生育效果(Millar SE, et al. Vaccination with a syntheticzona pellucida peptide produces long-term contraception in female mice. Science1989; 246: 935-938)。隨后發(fā)現(xiàn)該表位合成肽在其他一些近交系小鼠品系仍然出現(xiàn)卵巢炎，并證明它是由其長(zhǎng)表位肽中的一 ZP特異致病性T細(xì)胞表位造成，剔除此T細(xì)胞表位的合成肽疫苗則可消除小鼠ZP免疫卵巣炎(Lou YH, et al. A zona pellucida 3peptiae vaccine induces antibodies and reversible infertility without ovarianpathology. J Immunol 1995; 155: 2715-2720)。已知 T 細(xì)胞表位通常由 9 30 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，而B細(xì)胞表位則由3 8個(gè)殘基組成，顯然通過鑒定B細(xì)胞表位最小基序就能排除在ー長(zhǎng)表位肽中可能存在的T細(xì)胞表位(Bagavant H, et al. Immunogenicityand contraceptive potential of a human zona pellucida J peptide vaccine. Bio丄Reprod 1997; 56: 764-770)?；瘜W(xué)合成肽疫苗曾被寄希望能成為疫苗發(fā)展史上第三個(gè)里程碑。但是，由于受現(xiàn)有線性B細(xì)胞表位鑒定方法的限制，各靶蛋白上被鑒定的表位極為有限，因而導(dǎo)致研制的化學(xué)合成肽疫苗都難以達(dá)到有效的病毒感染或疾病預(yù)防或治療效果，以致至今未產(chǎn)生能應(yīng)用于人類臨床的合成肽疫苗。許多ZP合成肽疫苗研究論文也都提及需要研制多表位肽疫苗，以實(shí)現(xiàn)ZP合成肽疫苗抗生育效果的充分有效性。而要實(shí)現(xiàn)這樣的目標(biāo)，顯然有賴于能更多地鑒定ZP蛋白的表位，特別是它們的最小基序?，F(xiàn)在已清楚人ZP4蛋白也能誘導(dǎo)人精子頂體反應(yīng)和與之結(jié)合(Chiu PC, et al. Effects of native human zona pellucida glycoprotein-3 and -4 on acrosome reaction and zona pellucida binding of humanspermatozoa. Biol Reprod 2008;79:869-877)。另外，也已制備了 抗重組人 ZP4 的單抗(Bukovsky A, Gupta SK, et al. Production of monoclonal antibodies againstrecombinant human zona pellucida glycoproteins: utility in immunolocalizationof respective zona proteins in ovarian follicles. J Reprod Tmmunol 2008; 78:102-114)，其中MA-1662 ( (IgG2a)和MA-1671 (IgGl)具有與人卵子的反應(yīng)性和抑制ZP4 介導(dǎo)人精子頂體反應(yīng)的特性(Xu WX, et al. Mapping of epitopes relevant forinduction of acrosome reaction on human zona pellucida glycoprotein-4 usingmonoclonal antibodies.論文投稿中)。因此，鑒于今后研制重組ZP多表位肽檢測(cè)抗原和/或人用避孕疫苗免疫原，以及闡明人ZP4蛋白具有生物學(xué)意義功能域的需要，本發(fā)明用以上兩個(gè)單抗鑒定了它們可識(shí)別的精細(xì)表位氨基酸序列。本發(fā)明的技術(shù)背景或主要基礎(chǔ)是已建立了更方便更經(jīng)濟(jì)的線性表位，包括最小基序鑒定的改良生物合成肽法(Xu WX, etal. Minimal motif mapping of a known epitope on numan zona pelluciaa protein-4using a peptide biosynthesis strategy. J Reprod Tmmunol 2009; 81:9—16; Xu WX,et al. Mapping of minimal motifs of B-cell epitopes on human zona pellucidaglycoprotein-3. Clin Dev Tmmunol doi: 10: II55/20I2/831010) 在研制重組多表位肽疫苗方面已有這方面研究報(bào)道，如:組合瘧原蟲7個(gè)特異 抗原的 11 個(gè)表位月太疫苗(Shi YP, et al. Immunogenicity and in vitro protectiveefficacy of a recombinant multistage Plasmodium ialciparum candidate vaccine.Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 1615 -1620)和組合三個(gè)表位的人絨毛膜促性腺?zèng)]苗石開究(Xu WX, et al. Immunogenic comparison for two different recombinantchimeric peptides (CPI2 and CP22) containing one or two copies of three linearB cell epitopes from -hCG subunit. J Biothech 2011; 151: 15-21)等。但是，就單個(gè)靶抗原而言，以上研究受以往線性表位鑒定數(shù)的限制，因組合表位數(shù)有限而都還難以在線性抗體水平達(dá)到合成肽疫苗充分的預(yù)防或治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用兩個(gè)單抗人卵透明帶蛋白-4 (huZP4)單抗(MA-1662和MA-1671)鑒定的兩個(gè)線性表位的最小基序肽，并提供可用化學(xué)合成或與GST載體蛋白融合表達(dá)的含所述最小基序肽的擴(kuò)展短肽(8肽)或長(zhǎng)于該短肽(8肽)的抗原；還提供所述最小基序肽、最小基序肽的擴(kuò)展短肽(8肽)或長(zhǎng)于該短肽(8肽)的抗原的應(yīng)用。本發(fā)明提供的人卵透明帶蛋白-4 (huZP4)的兩個(gè)線性表位的最小基序肽，其氨基酸序列分別為SEQ. ID No. I和SEQ. ID No. 2所示，前者記為huZP4147—151，其一字簡(jiǎn)寫氨基酸序列為PARDR (SEQ. ID No. I);后者記為huZP4256_26°，其一字簡(jiǎn)寫氨基酸序列為ENELV (SEQ.ID No. 2)。本發(fā)明提供的含上述的最小基序膚的短膚，其氨基酸序列分別為SEQ. ID No. 3和SEQ. ID No. 4所示。記為huZP4-l，其擴(kuò)展的人ZP4145—152或人ZP4146—153表位8聚肽一字簡(jiǎn)寫的氨基酸序列為SIPARDRL (SEQ. ID No. 3)或IPARDRLP (SEQ. ID No. 4)。在化學(xué)合成或融合表達(dá)該8肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其他殘基替代。本發(fā)明提供的含上述的最小基序膚的短膚，其氨基酸序列也可為SEQ. ID No. 5和SEQ. ID No. 6所示。記為huZP4-2，其擴(kuò)展的人ZP4254—261或人ZP4255—262表位8聚肽一字簡(jiǎn)寫的氨基酸序列為VYENELVA (SEQ. ID No. 5)或YENELVAT (SEQ. ID No. 6)。在化學(xué)合成或融合表達(dá)該8肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其他殘基替代。本發(fā)明還提供上述線性表位的最小基序肽在設(shè)計(jì)研制人用ZP多表位肽避孕疫苗中應(yīng)用；進(jìn)ー步還提供含上述最小基序肽的短肽(表位8肽)或其融合蛋白単獨(dú)或組合用作臨床診斷由ZP自身免疫導(dǎo)致婦女不孕病因的血清識(shí)別表位標(biāo)志物的應(yīng)用。本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)ー步具體描述如下
1，人ZP4蛋白(曾被先后命名為ZPB和ZPl)編碼基因克隆[Harrist JD, et al.しloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs irom a varietyof mammalian species: the ZPA, ZPB and ZPC gene families. DNA Seq 1994; 4:361-393; Skinner SM, et al. Mapping of dominant B cell epitopes of a human zonapellucida protein (ZPl) · Biol Reprod 1999; 61: 1373-1380]由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。用常規(guī)PCR方法從huZP4 cDNA克隆中擴(kuò)增出編碼huZP4成熟蛋白N端大片段(去除N端信號(hào)肽的氨基酸殘基58-234，簡(jiǎn)稱為huZP4N58_234)和C端大片段(去除C端跨膜區(qū)的殘基227-463，簡(jiǎn)稱為huZP4C227—463 )的cDNAs，然后分別重組插入pSY621表達(dá)質(zhì)粒[沈蕓，應(yīng)康，徐萬祥，謝毅大腸桿菌高效表達(dá)載體PSY621的構(gòu)建.復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2000 ；39 (3) : 313 - 317]，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行熱誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果在免疫印跡試驗(yàn)中MA-1671單抗識(shí)別重組huZP4N蛋白，而MA-1662單抗識(shí)別重組huZP4C蛋白(結(jié)果未顯示)。，先前發(fā)明人已構(gòu)建了專門用于抗原表位掃描作圖的短肽生物合成的PXXGST-IM蟲本 kXu WX, et al. Minimal motif mapping of a known epitope on humanzona pellucida protein-4 using a peptide biosynthesis strategy. J ReprodImmunol, 81: 9-16，2009)。因此，在鑒定上述兩個(gè)單抗識(shí)別表位氨基酸序列之前，首先分別構(gòu)建ニ組分別跨越huZP4N和huZP4C全長(zhǎng)度相互重疊10個(gè)殘基的系列18聚短肽(以GST188蛋白為融合表達(dá)載體。具體操作步驟外送合成所設(shè)計(jì)的系列18聚肽并含兩端BamHI和Sal I粘性末端的編碼DNA正負(fù)鏈片段；DNA正負(fù)鏈片段配對(duì)退火后重組插入表達(dá)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌；挑選重組克隆測(cè)序驗(yàn)證插入片段DNA序列；以及熱誘導(dǎo)表達(dá)目的GST188-18肽融合蛋白)。進(jìn)而實(shí)施兩個(gè)單抗的第一輪識(shí)別18聚肽的蛋白印跡鑒定，即將分別含huZP4N的21個(gè)18聚肽(編號(hào)Pl P21)和含huZP4C的28個(gè)18聚肽(編號(hào)P22 P49)融合蛋白的各誘導(dǎo)菌總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，繼而電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，最后用MA-1662和MA-1671單抗完成印跡鑒定。結(jié)果MA_1671單抗識(shí)別Pll和P12短肽(融合蛋白)，而MA-1662單抗識(shí)別P25短肽(融合蛋白)(圖未顯示)。，按前述系列18聚短肽融合蛋白構(gòu)建表達(dá)步驟，進(jìn)ー步表達(dá)GST188為載體跨越Pll和P12合并長(zhǎng)度以及P25長(zhǎng)度相互重疊7個(gè)殘基的系列8聚肽融合蛋白(前者編號(hào)P50 P62，后者編號(hào)P63 P70)，繼而實(shí)施第二輪MA-1662和MA-1671單抗識(shí)別表位的精細(xì)基序免疫印跡鑒定(步驟同第一輪18聚表位肽鑒定)。結(jié)果MA-1671單抗識(shí)別的最小基序依據(jù)四個(gè)免疫反應(yīng)性8聚肽中共有序列確定為PARDR五肽(圖1)，而MA-1662單抗識(shí)別的最小基序同樣依據(jù)四個(gè)反應(yīng)性8肽共有序列確定為ENELV五肽(圖2)。以上用MA-1662和MA-1671兩個(gè)特異單抗的人ZP4蛋白上兩個(gè)功能性表位最小基序的鑒定，為今后設(shè)計(jì)研制無ZP特異性T細(xì)胞表位(導(dǎo)致ZP免疫卵巢功能障礙的關(guān)鍵病因)人用ZP多表位肽疫苗提供了兩個(gè)重要候選表位。另外，這兩個(gè)精細(xì)表位和/或可擴(kuò)展8肽的化學(xué)合成肽或與GST188融合表達(dá)短肽，也可用作開發(fā)診斷婦女ZP自身免疫不孕病因用多表位肽檢測(cè)抗原的候選表位或表位肽，或單獨(dú)和/或組合用作診斷ZP自身免疫疾病的表位標(biāo)志物。


圖I. MA-1671單抗識(shí)別表位最小基序的免疫印跡鑒定(A)和列表共有序列分析(B)。注印跡膜上顯示Lanes 50_62代表表達(dá)的P50-P62短肽融合蛋白。圖A注箭頭分別指示印跡反應(yīng)性8聚肽(P53-P56)。圖B黃色陰影蛋白反應(yīng)性8聚肽中共有氨基酸序列(位于Pll和P12短肽之間的10個(gè)殘基重疊區(qū)內(nèi))。圖2. MA-1662單抗識(shí)別表位最小基序的免疫印跡鑒定(A)和列表共有序列分析(B)。注印跡膜上顯示Lanes 63-70代表表達(dá)的P63-P70短肽融合蛋白。圖A注箭頭分別指示印跡反應(yīng)性8聚肽(P64-P67)。圖B黃色陰影蛋白反應(yīng)性8聚肽中共有氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可進(jìn)ー步通過下列實(shí)例描述。列舉實(shí)例并不意味限制本發(fā)明所涉及的范圍，該范圍在之前的描述中已被充分陳述闡明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照常規(guī)條件以及[美]J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾編著黃培堂等翻譯的第三版“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(科學(xué)出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.萊恩編著沈關(guān)心等翻譯的“抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南”(科學(xué)出版社，2002)中所述的步驟，或按照生產(chǎn)銷售商建議的條件進(jìn)行。實(shí)施例I :鼠抗人ZP4單抗MA-1671的精細(xì)表位鑒定 材料和方法
I.人ZP4基因克隆由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。熱誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pSY621和pXXGST-Ι由本專利發(fā)明人構(gòu)建[沈蕓，應(yīng)康，徐萬祥，謝毅大腸桿菌高效表達(dá)載體PSY621的構(gòu)建·復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版')2000 ；39(3) :313 - 317 ；Xu WX, et al.Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein—4 usinga peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol 2009; 81:9-16]。大腸桿菌BL21(DE3)菌株由復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。2.鼠抗 huZP4 單抗 MA-1662 和 MA-1671 由發(fā)明人制備(Bukovsky A, GuptaSKj et al. Production of monoclonal antibodies against recombinant human zonapellucida glycoproteins: utility in immunolocalization of respective zonaproteins in ovarian follicles. J Reprod Immunol 2008; 78: 102-114)。3.限制性內(nèi)切酶EcoR KBamH I、Sal I、Taq酶和T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa Biotechnology公司，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠ニ抗(IgG /HRP)、ニ氨基聯(lián)苯胺(DAB)和0.2 Wn硝酸纖維素膜購自上海生エ生物技術(shù)服務(wù)公司。免疫印跡化學(xué)發(fā)光ECL檢測(cè)試劑盒購自GE公司。
4. QIAprep spin miniprep Kit質(zhì)粒抽提試劑盒、QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒和quick凝膠回收試劑盒購自德國(guó)QIAGEN公司。5.兩端分別為BamH I和Sal I粘性末端，中間為各8_18肽編碼DNA序列加TAA終止密碼子的正負(fù)鏈DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。6.系列8/18妝編碼DNA序列依據(jù)人ZP4蛋白編碼基因和蛋白質(zhì)氣基酸序列公開 1百 ノ窗、(Harrist JD, et al.し丄oning ana characterization of zona pellucidagenes and cDNAs from a variety of mammalian species: the ZPA, ZPB and ZPC genefamilies. DNASeq 1994; 4: 361-393)。 制備過程摘要如下從huZP4基因克隆質(zhì)粒中通過PCR擴(kuò)增出去除信號(hào)肽和跨膜區(qū)的兩端為EcoR I和Sal I限制酶位點(diǎn)的huZP4N(氨基酸殘基58-234)和huZP4C (殘基227-463)兩個(gè)編碼基因片段；雙酶切后重組插入pSY621熱誘導(dǎo)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌；誘導(dǎo)表達(dá)huZP4N和huZP4C蛋白供MA-1662和MA-1671單抗鑒定表位肽用。用MA-1671單抗的人卵透明帶蛋白_4 (huZP4)精細(xì)表位鑒定的具體步驟如下
I.依據(jù)huZP4 (曾命名為ZPB和ZPl)基因序列公開信息，PCR擴(kuò)增出huZP4N和
huZP4C兩個(gè)大片段蛋白編碼基因，重組插入pSY621熱誘導(dǎo)原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析和用MA-1662和MA-1671單抗完成免疫印跡鑒定，確定兩個(gè)單抗可識(shí)別huZP4N 和 huZP4C 區(qū)段。2.設(shè)計(jì)跨越可被MA-1671識(shí)別的huZP4N全長(zhǎng)度序列相互重疊10個(gè)氨基酸殘基的系列18肽(編號(hào)P1-P21)編碼DNA正負(fù)鏈片段(正鏈5’ -端加5’ -gatcc，3’ -端加taag-3’ ；負(fù)鏈5’ _端加5’ _tcgactta,3’ -端加g_3’),外送DNA化學(xué)合成。3.將I或2個(gè)OD的互補(bǔ)正負(fù)鏈片段用ddH20溶解成20 μ mol/μ I儲(chǔ)存液(根據(jù)DNA合成報(bào)告單數(shù)據(jù))；各取10 μ I儲(chǔ)存液和20 ddH20于L 5 ml Eppendorf管中，94°C水浴加熱5min,自然降至室溫后,在15 μ I反應(yīng)體積中吸入2 μ I退火片段、I μ I約200ng/ μ I經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切的pXXGST-Ι質(zhì)粒、I μ I Τ4 DNA連接酶和其1.5 μ I緩沖液，連接過夜；連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21 (DE3)宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37V培養(yǎng)過夜；第二天挑取氨芐LB平板上長(zhǎng)出的單克隆轉(zhuǎn)接3 ml LB培養(yǎng)液誘導(dǎo)表達(dá)，以由pXXGST-2表達(dá)的GST188蛋白為對(duì)照，各表達(dá)的GST188-18肽(P1-P21)融合蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE分析確認(rèn)(與對(duì)照蛋白電泳遷移率相差約2個(gè)kDa)，挑取各重組克隆外送進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。4.將插入片段測(cè)序結(jié)果正確的克隆接種加入Amp的3 ml LB培養(yǎng)液中，于30°C振蕩培養(yǎng)過夜，翌日晨按1/50比例轉(zhuǎn)接新鮮含Amp的LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)2 3 h至菌體濃度達(dá)到0.6 0.8 OD后，調(diào)高溫度至42°C熱誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體，加上樣裂解液煮沸5 min備用。5.將誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白樣品同時(shí)走15% SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，ー塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，ニ塊凝膠進(jìn)行硝酸纖維素膜電(100 mA)轉(zhuǎn)移2 h，用麗春紅染色轉(zhuǎn)印跡膜2min,在目的短肽融合蛋白條帶處用針頭打孔標(biāo)記，用水沖洗掉麗春紅染色。6.印跡膜用PBS緩沖液反復(fù)洗滌四次，用5%脫脂奶粉封閉過夜，PBS緩沖液洗滌四次，分別在8 10 ml反應(yīng)液中加入I μ I—抗MA-1671單抗，室溫反應(yīng)2 h，PBS緩沖液洗滌后加入5 μ I ニ抗羊抗鼠IgG /HRP (I: 2000稀釋)，室溫反應(yīng)I h，用PBS緩沖液洗滌后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯色，依據(jù)免疫印跡結(jié)果確認(rèn)Pll和P12為反應(yīng)性18聚肽(融合蛋白)。7.設(shè)計(jì)覆蓋可被MA-1671識(shí)別的Pll和P12兩個(gè)重疊18聚肽殘基序列總長(zhǎng)度相互重疊7個(gè)氨基酸殘基的系列8肽(11個(gè)，編號(hào)P50-P62)編碼DNA正負(fù)鏈片段(正鏈5’-端加 5，-gatcc, 3，-端カロ taag-3’ ；負(fù)鏈 5，-端カロ 5，-tcgactta, 3，-端カロ g_3，),外送 DNA 化學(xué)合成。8.如前述3-5操作步驟，完成13個(gè)系列短肽融合蛋白的構(gòu)建表達(dá)及其表位最小基序免疫印跡鑒定，確認(rèn)被MA-1671單抗識(shí)別的P53-P56供四個(gè)反應(yīng)性8聚肽融合蛋白(圖1A)。9.依據(jù)上述四個(gè)反應(yīng)性8聚肽(融合蛋白)中黃色陰影顯示的共有氨基酸殘基數(shù)，最終確定鼠抗huZP4單抗MA-1671識(shí)別的表位最小基序?yàn)镻ARDR，其五肽殘基序列位于18聚短肽Pll和P12的10個(gè)殘基重疊區(qū)內(nèi)。 另外，MA-1662單抗識(shí)別huZP4蛋白的精細(xì)表位鑒定，也采用上述同樣的方法和步驟。簡(jiǎn)述如下首先設(shè)計(jì)跨越可被MA-1662識(shí)別的huZP4C全長(zhǎng)度序列相互重疊10個(gè)氨基酸殘基的系列18肽(編號(hào)P22-P49)編碼DNA正負(fù)鏈片段，重組表達(dá)系列18聚短肽融合蛋白，用MA-1662單抗進(jìn)行第一輪反應(yīng)性18聚肽掃描作圖鑒定；繼而表達(dá)覆蓋P25反應(yīng)性18聚肽相互重疊7個(gè)殘基的系列8聚肽(P63-P70)融合蛋白，進(jìn)行第二輪精細(xì)表位鑒定，最終依據(jù)MA-1662單抗識(shí)別P64-P67四個(gè)短肽中的共有殘基，確定其表位最小基序?yàn)镋NELV。盡管本發(fā)明描述了人卵透明帶蛋白-4 (huZP4)可被單抗MA-1662和MA-1671識(shí)別的兩個(gè)線性抗原表位最小基序和它們擴(kuò)展的8肽，它們既可以單獨(dú)和/或組合用作研制安全、有效且可逆的人用ZP重組多表位疫苗候選表位，也能通過化學(xué)合成或融合表達(dá)或單獨(dú)或組合用作由ZP自身免疫導(dǎo)致婦女不孕病因診斷的候選表位抗原或表位標(biāo)志物(檢測(cè)患者血清組合ZP抗體)，但有一點(diǎn)對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域研究技術(shù)人員來說是顯而易見的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明的最小表位肽和其擴(kuò)展的8肽或8肽融合蛋白作各種變化改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種人卵透明帶蛋白-4的表位最小基序肽，其特征在于氨基酸序列為SEQ. IDNo. I所示，記為huZP4147-151 ;或者氨基酸序列為SEQ. ID No. 2所示，記為huZP4256-260。
2.ー種含如權(quán)利要求I所述的表位最小基序肽的擴(kuò)展短肽，其特征在于其氨基酸序列為SEQ. ID No. 3和SEQ. ID No. 4所示，在化學(xué)合成或融合表達(dá)該8肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其他殘基替代； 或者其氨基酸序列為SEQ. ID No. 5和SEQ. ID No. 6所示，在化學(xué)合成或融合表達(dá)該8肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其他殘基替代。
3.如權(quán)利要求I所述的表位最小基序肽在制備人用ZP多表位肽避孕疫苗中應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的表位最小基序肽的擴(kuò)展短肽単獨(dú)或組合制備作為臨床診斷由ZP自身免疫導(dǎo)致婦女不孕病因的血清識(shí)別表位標(biāo)志物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥與生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種人卵透明帶蛋白-4(ZP4)上能被抗人ZP4蛋白單克隆抗體MA-1662和MA-1671識(shí)別的兩個(gè)線性抗原表位最小基序肽及其擴(kuò)展8肽和用途。本發(fā)明提供了2個(gè)可用于研制人類免疫生育調(diào)控重組多表位肽疫苗原的候選表位肽，其氨基酸序列為SEQ.IDNo.l所示，記為huZP4147-151，或者為SEQ.IDNo.2所示，記為huZP4256-260；還提供了可用作研制診斷ZP自身免疫不育婦女血清ZP抗體的新型高特異性高靈敏度重組多表位肽檢測(cè)抗原的候選表位，其氨基酸序列為SEQIDNo.3~SEQIDNo.6所示。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102659923SQ201210145968
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月13日
發(fā)明者唐海平, 季朝能, 山奇塔·喬德哈瑞, 徐萬祥, 王健, 謝毅, 貝納·布罕達(dá)瑞, 賽提旭·古普塔, 顧少華 申請(qǐng)人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 復(fù)旦大學(xué)