β-腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原及寬譜特異性抗體及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于β-腎上腺素受體激動(dòng)劑多殘留檢測(cè)的多簇抗原、抗體及其制備方法。本發(fā)明包括八種β-激動(dòng)劑多簇抗原，分別為克倫特羅-萊克多巴胺-牛血清白蛋白、克倫特羅-沙丁胺醇-牛血清白蛋白、沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白、克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白、克倫特羅-萊克多巴胺-卵清蛋白、克倫特羅-沙丁胺醇-卵清蛋白、沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白及克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白，并采用所述的多簇抗原通過(guò)動(dòng)物免疫制備了四種可用于β-腎上腺素受體激動(dòng)劑多殘留檢測(cè)的寬譜特異性抗體。
【專(zhuān)利說(shuō)明】β-腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原及寬譜特異性抗體及其制備

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫化學(xué)和分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑(以下簡(jiǎn)稱(chēng)β-激動(dòng)劑)多簇抗原及寬譜特異性抗體及其制備。

【背景技術(shù)】
[0002]β_腎上腺素受體激動(dòng)劑，簡(jiǎn)稱(chēng)β_激動(dòng)劑，是動(dòng)物源性食品中檢出率最高、危害最嚴(yán)重的化學(xué)性殘留危害物，其中最著名的就是克倫特羅(clenbuterol，CL)，俗稱(chēng)“瘦肉精”。上世紀(jì)80年代，美國(guó)脂胺公司的科研人員意外發(fā)現(xiàn)，“瘦肉精”能增強(qiáng)動(dòng)物脂肪分解，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，大大縮短肉品上市周期，顯著提高胴體瘦肉率、飼料回報(bào)率和經(jīng)濟(jì)效益。隨后在世界各地迅速推廣，80年代后期，傳入我國(guó)并在許多地區(qū)的飼料加工企業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)推廣使用，很快成為養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用最廣泛的“添加劑”。
[0003]“瘦肉精”除克倫特羅外，還包括沙丁胺醇(salbutamoI，SAL)、萊克多巴胺(ractopamine, RAC)等20多個(gè)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相類(lèi)似的化合物。這類(lèi)化合物進(jìn)入體內(nèi)后選擇性作用于腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致人體產(chǎn)生低敏感現(xiàn)象，哮喘發(fā)生率和發(fā)病程度升高；還可導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂，誘發(fā)染色體畸變及惡性腫瘤，嚴(yán)重時(shí)可致人死亡。因此我國(guó)和世界上大多數(shù)國(guó)家都明文禁止“瘦肉精”用作飼料添加劑。
[0004]目前，β-激動(dòng)劑類(lèi)獸藥殘留的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和熒光免疫法(FIA)等。
[0005]色譜法是β_激動(dòng)劑獸藥殘留的主要檢測(cè)方法，但是色譜法檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜、大量的陰性樣品重復(fù)檢測(cè)；而酶聯(lián)免疫法具有特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但特異性強(qiáng)的特點(diǎn)同時(shí)也決定了它的致命缺點(diǎn):一種酶聯(lián)免疫試劑盒或試紙條只能檢測(cè)一種獸藥殘留，而無(wú)法檢測(cè)其它的同類(lèi)獸藥殘留，這就是容易出現(xiàn)漏檢的原因(如2011年轟動(dòng)全國(guó)的“雙匯瘦肉精”事件)；此外，隨著β_激動(dòng)劑多種替代品的出現(xiàn)，如果進(jìn)行完全檢測(cè)，一個(gè)樣品需要使用多種檢測(cè)產(chǎn)品，大大提高了檢測(cè)成本和工作時(shí)間，失去了快速篩選的意義。
[0006]多殘留免疫分析能同時(shí)檢測(cè)一類(lèi)藥物殘留，其低成本、高通量、快速現(xiàn)場(chǎng)的優(yōu)點(diǎn)是現(xiàn)有的色譜法和特異性免疫方法無(wú)法比擬的，是未來(lái)食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一，逐漸引起人們的重視。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種β -腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原及寬譜特異性抗體及其制備方法。
[0008]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]一種β_腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原，其特征在于，所述的多簇抗原是兩種以上β_腎上腺素受體激動(dòng)劑與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述的載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白，所述的β-腎上腺素受體激動(dòng)劑選自克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺。
[0010]本發(fā)明所述的多簇抗原是在載體蛋白上，依次偶聯(lián)兩種以上的β -腎上腺素受體激動(dòng)劑半抗原得到，半抗原選自克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺，其中克倫特羅半抗原采用重氮法偶聯(lián)，沙丁胺醇和萊克多巴胺采用混合酸酐法偶聯(lián)。
[0011]本發(fā)明所述多簇抗原包括八種β -激動(dòng)劑多簇抗原，具體為克倫特羅-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-RAC-BSA)、克倫特羅-沙丁胺醇-牛血清白蛋白(CL-SAL-BSA)、沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(SAL-RAC-BSA)、克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-SAL-RAC-BSA)、克倫特羅-萊克多巴胺-卵清蛋白(CL-RAC-OVA)、克倫特羅-沙丁胺醇-卵清蛋白(CL-SAL-OVA)、沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白(SAL-RAC-0VA)及克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白(CL-SAL-RAC-0VA)。
[0012]其中，克倫特羅-沙丁胺醇-牛血清白蛋白(CL-SAL-BSA)或克倫特羅-沙丁胺醇-卵清蛋白(CL-SAL-OVA)是以克倫特羅和沙丁胺醇為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟制備得到:
[0013]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以重氮法偶聯(lián)克倫特羅半抗原，再進(jìn)行純化:
[0014]將0.2mmol鹽酸克倫特羅于溶于I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至淀粉碘化鉀試紙變?yōu)樽仙^續(xù)反應(yīng)I?3h后將反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的碳酸鈉緩沖溶液中，再繼續(xù)反應(yīng)3?5h。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0015]2)在步驟I)的產(chǎn)物上以混合酸酐法偶聯(lián)沙丁胺醇半抗原，再進(jìn)行純化:
[0016]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心。將下層固體溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯,繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0017]克倫特羅-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-RAC-BSA)或克倫特羅-萊克多巴胺-卵清蛋白(CL-RAC-OVA)是以克倫特羅和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟制備得到:
[0018]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶聯(lián)萊克多巴胺半抗原，再進(jìn)行純化:
[0019]將0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應(yīng)10?20h，蒸干溶劑，將所得油狀物溶于5?1ml N, N- 二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0020]2)在步驟I)的產(chǎn)物上以重氮法偶聯(lián)克倫特羅半抗原，再進(jìn)行純化:
[0021]將0.2mmol鹽酸克倫特羅于溶于I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至淀粉碘化鉀試紙變?yōu)樽仙?，繼續(xù)反應(yīng)I?3h后將反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物的碳酸鈉緩沖溶液中，再繼續(xù)反應(yīng)3?5h。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0022]沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(SAL-RAC-BSA)或沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白(SAL-RAC-0VA)是以沙丁胺醇和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟制備得到:
[0023]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶聯(lián)沙丁胺醇半抗原，再進(jìn)行純化:
[0024]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2 mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心。將下層固體溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯,繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0025]2)在步驟I)的產(chǎn)物上繼續(xù)以混合酸酐法偶聯(lián)萊克多巴胺半抗原，再進(jìn)行純化:
[0026]將0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2 mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應(yīng)10?20h，蒸干溶劑，將所得油狀物溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0027]克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-SAL-RAC-BSA)或克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白(CL-SAL-RAC-OVA)是以克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，可按以下步驟中任意一種制備得到:
[0028]I)在克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物上以混合酸酐法偶聯(lián)沙丁胺醇，再進(jìn)行純化:
[0029]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心。將下層固體溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0030]2)在克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物上以混合酸酐法偶聯(lián)萊克多巴胺，再進(jìn)行純化:
[0031]將0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應(yīng)10?20h，蒸干溶劑，將所得油狀物溶于5?1ml N, N- 二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2 mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0032]3)在沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物上以重氮法偶聯(lián)克倫特羅，再進(jìn)行純化:
[0033]將0.2mmol鹽酸克倫特羅于溶于I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至淀粉碘化鉀試紙變?yōu)樽仙^續(xù)反應(yīng)I?3h,將反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
[0034]本發(fā)明還提供了所述的多簇抗原制得的β -腎上腺素受體激動(dòng)劑寬譜特異性抗體；特別是四種β_激動(dòng)劑寬譜特異性抗體，所述寬譜特異性抗體分別為由β_腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原 CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA, SAL-RAC-BSA 或 CL-SAL-RAC-BSA 通過(guò)動(dòng)物免疫獲得的。
[0035]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明成功地合成了八種β_激動(dòng)劑多簇抗原，并基于動(dòng)物免疫方法制備得到β_激動(dòng)劑寬譜特異性抗體。所述的β_激動(dòng)劑多簇抗原可用于構(gòu)造免疫電化學(xué)傳感器，基于β_激動(dòng)劑寬譜特異性抗體對(duì)β_激動(dòng)劑的交叉免疫反應(yīng)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)包括克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特步他林、馬布特羅及妥布特羅在內(nèi)的多種β_激動(dòng)劑的檢測(cè)。由于采用的β_激動(dòng)劑寬譜特異性抗體對(duì)多種β_激動(dòng)劑都具有較高交叉反應(yīng)率，因而能實(shí)現(xiàn)對(duì)β_激動(dòng)劑的共同檢測(cè)，且多殘留免疫分析具有快速、高效、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
[0036]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以【具體實(shí)施方式】為限，而是由權(quán)利要求加以限定。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1為CL、BSA以及CL-BSA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)光譜圖。
[0038]圖2為SAL、CL-BSA偶聯(lián)物以及CL-SAL-BSA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)光譜圖。
[0039]圖3為SAL、BSA以及SAL-BSA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)光譜圖。
[0040]圖4為RAC、SAL-BSA偶聯(lián)物以及SAL-RAC-BSA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)光譜圖。
[0041]圖5為RAC、OVA以及RAC-OVA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。
[0042]圖6為CL、RAC-OVA偶聯(lián)物以及CL-RAC-OVA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。
[0043]圖7為SAL、CL-RAC-OVA偶聯(lián)物以及CL-SAL-RAC-OVA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0044]實(shí)施例1CL-SAL-BSA偶聯(lián)物的制備
[0045]I)在BSA上以重氮法偶聯(lián)CL半抗原，再進(jìn)行純化:
[0046]將0.2mmol鹽酸克倫特羅于溶于I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至淀粉碘化鉀試紙變?yōu)樽仙?，繼續(xù)反應(yīng)I?3h后將反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml BSA的碳酸鈉緩沖溶液中，再繼續(xù)反應(yīng)3?5h。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到CL-BSA偶聯(lián)物凍干粉。根據(jù)CL、BSA以及CL-BSA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(見(jiàn)附圖1)計(jì)算可得偶聯(lián)比，BSA: CL=1: 28。
[0047]2)在步驟I)的產(chǎn)物上以混合酸酐法偶聯(lián)SAL半抗原，再進(jìn)行純化:
[0048]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心。將下層固體溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/mlCL-BSA偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到CL-SAL-BSA偶聯(lián)物凍干粉。根據(jù)SAL、CL_BSA偶聯(lián)物以及CL-SAL-BSA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(見(jiàn)附圖2)計(jì)算可得偶聯(lián)比，BSA: CL: SAL=1: 28: 17。
[0049]實(shí)施例2SAL-RAC-BSA偶聯(lián)物的制備
[0050]I)在BSA上以混合酸酐法偶聯(lián)SAL半抗原，再進(jìn)行純化:
[0051]將0.2 mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心。將下層固體溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯,繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/mlBSA的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到SAL-BSA偶聯(lián)物凍干粉。根據(jù)SAL、BSA以及SAL-BSA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(見(jiàn)附圖3)計(jì)算可得偶聯(lián)比，BSA: SAL = I: 8.5。
[0052]2)在步驟I)的產(chǎn)物上繼續(xù)以混合酸酐法偶聯(lián)RAC半抗原，再進(jìn)行純化:
[0053]將0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應(yīng)10?20h，蒸干溶劑，將所得油狀物溶于5?1ml N, N- 二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?1mg/mlSAL-BSA偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到SAL-RAC-BSA偶聯(lián)物凍干粉。根據(jù)RAC、SAL-BSA偶聯(lián)物以及SAL-RAC-BSA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(見(jiàn)附圖4)計(jì)算可得偶聯(lián)比，BSA: SAL:RAC = 1: 8.5: 30。
[0054]實(shí)施例3CL-RAC-0VA偶聯(lián)物的制備
[0055]I)在OVA上以混合酸酐法偶聯(lián)RAC半抗原，再進(jìn)行純化:
[0056]將0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應(yīng)10?20h，蒸干溶劑，將所得油狀物溶于5?1ml N, N- 二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml0VA的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到RAC-OVA偶聯(lián)物凍干粉。根據(jù)RAC、OVA以及RAC-OVA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(見(jiàn)附圖5)計(jì)算可得偶聯(lián)比，OVA =RAC= I: 20。
[0057]2)在步驟I)的產(chǎn)物上以重氮法偶聯(lián)CL半抗原，再進(jìn)行純化:
[0058]將0.2mmol鹽酸克倫特羅于溶于I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至淀粉碘化鉀試紙變?yōu)樽仙^續(xù)反應(yīng)I?3h后將反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml RAC-OVA偶聯(lián)物的碳酸鈉緩沖溶液中，再繼續(xù)反應(yīng)3?5h。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得CL-RAC-OVA偶聯(lián)物凍干粉。根據(jù)CL、RAC-OVA偶聯(lián)物以及CL-RAC-OVA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(見(jiàn)附圖6)計(jì)算可得偶聯(lián)比，OVA: RAC: CL = I: 20: 16。
[0059]實(shí)施例4CL-SAL-RAC-0VA偶聯(lián)物的制備
[0060]將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心。將下層固體溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h。將反應(yīng)液緩慢加入到5?1ml含有5?I Omg/ml CL-RAC-OVA偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到CL-SAL-RAC-OVA偶聯(lián)物凍干粉。根據(jù)SAL、CL-RAC-OVA偶聯(lián)物以及CL-SAL-RAC-OVA偶聯(lián)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(見(jiàn)附圖7)計(jì)算可得偶聯(lián)比，OVA:RAC: CL: SAL = I: 20: 16: 21。
[0061]按照與實(shí)施例1-4相似的方法可分別制備CL-RAC-BSA、CL-SAL-OVA、SAL-RAC-0VA和 CL-SAL-RAC-BSA 偶聯(lián)物。
[0062]實(shí)施例5 抗 CL-RAC-BSA、抗 CL-SAL-BSA、抗 SAL-RAC-BSA 以及抗 CL-SAL-RAC-BSA抗體的制備
[0063]用合成的偶聯(lián)物(CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA、SAL-RAC-BSA或 CL-SAL-RAC-BSA 中的一種)作為免疫原免疫體重約2kg的健康大白兔。首次免疫時(shí)將0.25mg免疫原與等量弗氏完全佐劑混合并充分乳化，背部皮下多點(diǎn)注射。兩周后用同樣劑量免疫原與等量弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化并進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)三次。最后一次免疫10天后對(duì)大白兔進(jìn)行頸靜脈采血，放在4°C環(huán)境下靜置30min，再用硫酸銨多級(jí)沉淀法進(jìn)行純化，即可得到抗 CL-RAC-BSA、抗 CL-SAL-BSA、抗 SAL-RAC-BSA 以及抗 CL-SAL-RAC-BSA 多克隆抗體。
[0064]實(shí)施例6抗體效價(jià)測(cè)定
[0065]將純化后的的血清稀釋不同的倍數(shù)，用間接ELISA法分別對(duì)抗CL-RAC-BSA、抗CL-SAL-BSA、抗SAL-RAC-BSA以及抗CL-SAL-RAC-BSA抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果如下:
[0066]CL-SAL-BSA抗血清的效價(jià)為1: 1600，CL-SAL-RAC-BSA的抗血清效價(jià)為I: 6400，CL-RAC-BSA 抗血清的效價(jià)為 I: 12800，SAL-RAC-BSA 的抗血清效價(jià)為 I: 3200。
【權(quán)利要求】
1.一種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原，其特征在于，所述的多簇抗原是兩種以上β-腎上腺素受體激動(dòng)劑與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述的載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白，所述的β -腎上腺素受體激動(dòng)劑選自克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β_腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原，其特征在于:系克倫特羅-沙丁胺醇-牛血清白蛋白或克倫特羅-沙丁胺醇-卵清蛋白偶聯(lián)物，以克倫特羅和沙丁胺醇為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟制備得到: 1)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以重氮法偶聯(lián)克倫特羅半抗原，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol鹽酸克倫特羅于溶于I?5ml稀鹽酸中，加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至淀粉碘化鉀試紙變?yōu)樽仙?，繼續(xù)反應(yīng)I?3h后將反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的碳酸鈉緩沖溶液中，再繼續(xù)反應(yīng)3?5h ;將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉； 2)在步驟I)的產(chǎn)物上以混合酸酐法偶聯(lián)沙丁胺醇半抗原，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心,將下層固體溶于5?1ml N,N- 二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h ;將上述反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?1mg/ml克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β_腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原，其特征在于:系克倫特羅-萊克多巴胺-牛血清白蛋白或克倫特羅-萊克多巴胺-卵清蛋白偶聯(lián)物，以克倫特羅和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟制備得到: 1)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶聯(lián)萊克多巴胺半抗原，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應(yīng)10?20h，蒸干溶劑，將所得油狀物溶于5?1ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h ;將上述反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉； 2)在步驟I)的產(chǎn)物上以重氮法偶聯(lián)克倫特羅半抗原，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol鹽酸克倫特羅于溶于I?5ml稀鹽酸中，加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至淀粉碘化鉀試紙變?yōu)樽仙?，繼續(xù)反應(yīng)I?3h后將反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?10mg/ml萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物的碳酸鈉緩沖溶液中，再繼續(xù)反應(yīng)3?5h ;將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β_腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原，其特征在于:系沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白或沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白偶聯(lián)物，以沙丁胺醇和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下步驟制備得到: I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶聯(lián)沙丁胺醇半抗原，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心,將下層固體溶于5?1ml N,N- 二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h ;將上述反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?10mg/ml載體蛋白的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉； 2)在步驟I)的產(chǎn)物上繼續(xù)以混合酸酐法偶聯(lián)萊克多巴胺半抗原，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應(yīng)10?20h，蒸干溶劑，將所得油狀物溶于5?1ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h ;將上述反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?1mg/ml沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β-腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原，其特征在于:系克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清白蛋白或克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-卵清蛋白偶聯(lián)物，以克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺為半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體，按以下任意一種方法制備得到: 1)在克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物上以混合酸酐法偶聯(lián)沙丁胺醇，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml無(wú)水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室溫下反應(yīng)3?5h,離心,將下層固體溶于5?1ml N,N- 二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h ;將上述反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉； 2)在克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物上以混合酸酐法偶聯(lián)萊克多巴胺，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol鹽酸萊克多巴胺，室溫反應(yīng)10?20h，蒸干溶劑，將所得油狀物溶于5?1ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)I?3h ;將上述反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?10mg/ml克倫特羅-沙丁胺醇-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉； 3)在沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物上以重氮法偶聯(lián)克倫特羅，再進(jìn)行純化: 將0.2mmol鹽酸克倫特羅于溶于I?5ml稀鹽酸中，緩慢加入0.2?2mol/L的亞硝酸鈉溶液至淀粉碘化鉀試紙變?yōu)樽仙^續(xù)反應(yīng)I?3h，將反應(yīng)液加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3?6次，冷凍干燥即可得到克倫特羅-沙丁胺醇-萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物凍干粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多簇抗原制得的β_腎上腺素受體激動(dòng)劑寬譜特異性抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的β_腎上腺素受體激動(dòng)劑寬譜特異性抗體，其特征在于，所述的寬譜特異性抗體由β -腎上腺素受體激動(dòng)劑多簇抗原CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA、SAL-RAC-BSA或CL-SAL-RAC-BSA通過(guò)動(dòng)物免疫獲得。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK104280541SQ201410563668
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】邵科峰, 趙波, 張紅琳, 任鵬飛, 常其沛 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)