專利名稱：一種提取黃連素的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物活性成分的提取領(lǐng)域，涉及采用纖維素酶去除植物細(xì)胞壁從而破碎細(xì)胞的一種提取純化方法，具體為一種提取黃連素的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)
黃皮樹(Phellodendron chinense Schneid.)為蕓香科(Ihitaceae )黃柏屬(Phellodendron Rupr.)植物。中藥川黃柏為黃皮樹的干燥樹皮。黃柏的化學(xué)成分主要有生物堿類、黃酮類、內(nèi)酯類、萜類、留醇類及揮發(fā)油類等，其中主要以生物堿類的原小檗堿類中的小檗堿為主。主要藥理作用抗菌、抗炎，降血壓、降血糖，抗腫瘤、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑制應(yīng)激性潰瘍，清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡等等。酶工程技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新型的工業(yè)技術(shù)，酶反應(yīng)具有溫和高效的優(yōu)點(diǎn)。纖維素酶是分解纖維素的一類酶，它能將纖維素分解為葡萄糖，而大部分中藥材的細(xì)胞壁都是由纖維素構(gòu)成，且有效成分往往被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)的細(xì)胞中，通過纖維素酶作用于中藥材細(xì)胞壁，以不同程度地分解細(xì)胞壁，改變細(xì)胞壁的通透性，從而提高細(xì)胞內(nèi)含物的提取率。從它被發(fā)現(xiàn)后，它的研究和應(yīng)用受到了國內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注，并取得了很大進(jìn)展。目前，纖維素酶已廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)藥、紡織、日用化工、造紙、石油開采、廢水處理及飼料等各個(gè)領(lǐng)域。纖維素酶具有對(duì)天然活性成分破壞小、對(duì)設(shè)備要求不高、能源消耗低等的優(yōu)點(diǎn)，故在植物天然產(chǎn)物的提取中具有不可比擬的優(yōu)勢。纖維素酶的在實(shí)際當(dāng)中應(yīng)用時(shí)，可縮短提取時(shí)間，減少溶劑使用量，節(jié)省資源能源，降低生產(chǎn)成本等。小檗堿，又稱黃連素，已成為一種常用藥，在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，關(guān)于小檗堿的提取已有諸多報(bào)道，目前幾種主要的提取方法有酸提法、堿提法、醇提法、酸醇法以及一些輔助提取技術(shù)如超聲波法、微波法等。申請(qǐng)?zhí)枮?00810069671. 8，名稱“一種黃連總生物堿提取工藝”以及申請(qǐng)?zhí)枮?00910191620. 7，名稱“黃連堿的提取方法”使用的都是是酸提法，但由于黃柏含有大量的粘液質(zhì)，給操作帶來了一些不方便；超聲波法、微波法雖具有廣闊的前景，但它對(duì)容器的要求較高，且可能會(huì)破壞有效成分等特點(diǎn)，故其對(duì)工程設(shè)備要求較高，要大規(guī)模用于生產(chǎn)，還要進(jìn)一步解決工程設(shè)備等問題，如申請(qǐng)?zhí)枮?2103880. 5，名稱“黃連總生物堿的提取工藝及其新用途”；醇提法與酸醇法一般為回流提取，雖提取率高，但要消耗大量的能源，增加了生產(chǎn)成本，如申請(qǐng)?zhí)枮?00410065893. 4，名稱為“黃連、吳茱萸總生物堿的提取方法及其制劑”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是針對(duì)以上技術(shù)問題，提供以纖維素酶去除植物細(xì)胞壁，增大活性物質(zhì)的浸出速率和浸出量，盡可能地提高資源利用率，同時(shí)節(jié)省資源能源，降低生產(chǎn)成本、簡便而高效的一種提取黃連素的改進(jìn)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為
一種提取黃連素的改進(jìn)方法，包括以下步驟。A.粉碎將黃柏進(jìn)行粉碎；黃柏，為蕓香科植物黃皮樹或黃檗的干燥樹皮，將其粉碎后的粉屑過20目篩或切成3— 5 mm細(xì)絲；
B.沖蒸將步驟A中的黃柏粉屑采用蒸汽蒸煮，蒸煮的時(shí)間為10—30min，蒸汽溫度保持95— 105°C;通過高溫蒸汽對(duì)黃柏中可能存在的不利于纖維素酶酶反應(yīng)的因子進(jìn)行滅活，如一些抑制纖維素酶發(fā)揮作用的抑制因子，同時(shí)也殺滅可能分解氧化黃柏小檗堿的酶以提高提取速率與產(chǎn)品得率；
C.冷卻將步驟B中的黃柏粉屑經(jīng)自然冷卻至30—50 V ;較高的溫度會(huì)影響酶的活 性；
D.溶酶稱取一定量的纖維素酶并溶于水中，配制成質(zhì)量百分含量為10%。一20%。的纖維素酶溶液；
E.浸泡將步驟C中的黃柏粉屑與步驟D中的纖維素酶溶液按1:2—1:4的比例混合好，黃柏粉屑采用的是質(zhì)量來進(jìn)行比例混合的，其單位為g，纖維素酶溶液在比例中采用的是體積進(jìn)行配比的，其單位為ml，混合后在30— 50°C的溫度下保溫4一6h ；
F.浸提I:將步驟E中的黃柏粉屑與纖維素酶混合后的物料與澄清石灰水，按料液質(zhì)量g與料液體積ml為1:5— 1:9的比例進(jìn)行混合,浸提4一6 h后,經(jīng)紗布過濾,進(jìn)行固液分離，得黃柏殘?jiān)秃S柏總生物堿的石灰水溶液I ;
作為優(yōu)選，此步驟中的黃柏粉屑與纖維素酶混合后的物料與澄清石灰水，料液質(zhì)量g與料液體積ml的比例按1:6—1:8配比時(shí)為最佳，當(dāng)料液比大于1:8時(shí)，其提取量切線斜率會(huì)變小，即在當(dāng)下料液比，單位料液比的石灰水溶液所提的生物堿量最高，且所用溶劑的量最小；
G.浸提II:將步驟F中的黃柏殘?jiān)馁|(zhì)量g與澄清石灰水的體積ml，按1:5—1:9的比例進(jìn)行混合，浸提6— 8 h，經(jīng)紗布過濾，再次進(jìn)行固液分離，得黃柏殘?jiān)秃S柏總生物堿的石灰水溶液II ；
H.浸提III:將步驟G中的黃柏殘?jiān)馁|(zhì)量g與澄清石灰水的體積ml按1:4一 1:7的比例進(jìn)行混合，浸提4一6h，經(jīng)紗布過濾，進(jìn)行固液分離，棄黃柏殘?jiān)蛴糜趧e的用途，得含黃柏總生物堿的石灰水溶液III ；
I.將步驟F中的石灰水溶液I和步驟G中的石灰水溶液II進(jìn)行混合，加入10%(W/V)固體工業(yè)食鹽,攪拌溶解,冷藏6-10小時(shí)；
J.取步驟I中的沉淀，加熱水溶解，趁熱過濾，濾液用2mol/L的HCl，調(diào)節(jié)其pH值為I一2，然后再加入10% (W/V)固體工業(yè)食鹽，攪拌溶解，冷藏6-10小時(shí)；
K.取J中的晶體，用少量蒸溜水沖洗并將pH值控制為5—6，這里的蒸餾水為冰水或冷水，然后在60 °C以下干燥，即得鹽酸小檗堿精品，小檗堿的含量在94%左右；干燥采用裝置為真空干燥箱。步驟C和E中的30— 50 °C為纖維素酶的適應(yīng)的反應(yīng)溫度，旨在提高反應(yīng)速率，以縮短反應(yīng)時(shí)間；
步驟H中的H中的含黃柏總生物堿的石灰水溶液III，由于所含的生物堿的濃度較低，會(huì)給下一步的沉淀純化帶來麻煩，或濃縮會(huì)增加生產(chǎn)成本，其不利于沉淀結(jié)晶，同時(shí)也會(huì)消耗大量的工業(yè)食鹽、鹽酸，故將H中的石灰水溶液III進(jìn)入下一生產(chǎn)循環(huán)的步驟F，在步驟F中作為石灰水浸提液使用。 浸提是指將藥材中的可溶物轉(zhuǎn)移到適宜溶劑中的過程，本申請(qǐng)中的浸提是將黃柏中的小檗堿與Ca(OH)2反應(yīng)生成的鹽溶于水溶液中的過程。本提取方法通過高溫蒸汽將可能存在的影響酶反應(yīng)的因素和可能造成黃柏小檗堿的損失的因素去除，盡可能地提高資源利用率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果為
(一).浸提率高、提取周期縮短、溶劑使用量較小。利用纖維素酶降解細(xì)胞壁，使細(xì)胞壁受到不同程度的破壞，以增加細(xì)胞的通透率，提高細(xì)胞中活性成分的浸提率，縮短提取時(shí)間，并相對(duì)減少了溶劑的使用量，提高了生產(chǎn)效率，較未使用酶處理提高了 3—5個(gè)百分點(diǎn)?！?br> (二).節(jié)能環(huán)保、綠色安全。酶反應(yīng)的條件溫和，對(duì)工程設(shè)備要求不高，操作簡捷；酶反應(yīng)所需的物質(zhì)不會(huì)給環(huán)境帶來壓力，從而降低對(duì)能源消耗、對(duì)環(huán)境的污染。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。實(shí)施例I :
應(yīng)用纖維素酶提取黃柏鹽酸黃連素的方法
步驟一黃柏的粉碎、沖蒸；
將黃柏采用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，使粉碎后的粉屑過20目篩，然后將黃柏粉屑用溫度為95°C的蒸汽蒸30 min ;再將蒸煮后的黃柏粉屑經(jīng)自然冷卻至40°C ；
步驟二 酶反應(yīng)；
稱取一定量的纖維素酶，使其與水溶液配制成質(zhì)量百分含量為15%。的纖維素酶溶液；然后將冷卻的黃柏粉屑的質(zhì)量g與纖維素酶溶液的體積量ml按1:2的比例進(jìn)行混合，同時(shí)在40 °C的條件下保溫5 h；
步驟三石灰乳浸提；
F.將步驟E中黃柏粉屑與纖維素酶溶液混合的物料的質(zhì)量g與澄清石灰水的體積ml按1:8的比例進(jìn)行混合，浸提6 h后，經(jīng)紗布進(jìn)行過濾后，進(jìn)行固液分離，得黃柏殘?jiān)秃S柏總生物堿的石灰水溶液I;
G.浸提II:將步驟F中黃柏殘?jiān)馁|(zhì)量g與澄清石灰水的體積ml按1:8的比例進(jìn)行混合，然后浸提8 h，經(jīng)紗布過濾，進(jìn)行固液分離，得黃柏殘?jiān)秃S柏總生物堿的石灰水溶液II ；
H.浸提III:將步驟G中黃柏殘?jiān)馁|(zhì)量g與澄清石灰水的體積ml按1:6的比例進(jìn)行混合，然后進(jìn)行浸提4 h，經(jīng)紗布過濾，進(jìn)行固液分離，棄黃柏殘?jiān)蛴糜趧e的用途，得含黃柏總生物堿的石灰水溶液III ;其中所述的石灰水溶液III將進(jìn)入下一個(gè)生產(chǎn)周期的F中的用于浸提用的石灰水溶液；
步驟四沉淀結(jié)晶
I.將F中的石灰水溶液I和G中的澄清石灰水溶液II合并，加入10%(W/V)固體工業(yè)食鹽，攪拌溶解，冷藏8h;
J.取I中的沉淀，加熱水溶解，趁熱過濾，濾液加濃HCl調(diào)pH=2，同時(shí)增加10% (W/V)固體工業(yè)食鹽，攪拌溶解，冷藏8h ；
步驟五干燥
K.取J中的晶體，用少量蒸溜水洗將含晶體的溶液的pH值調(diào)節(jié)至6，然后在60°C以下干燥，即得鹽酸小檗堿精品。實(shí)施例二
應(yīng)用纖維素酶提取黃柏鹽酸黃連素的方法
步驟一與實(shí)施例一中步驟一相同；
步驟二 與實(shí)施例一中步驟二相同；
步驟三
F.浸提I:將E中黃柏粉屑與澄清石灰水按料液比1:8混合，浸提8 h ；
G.浸提II:將F中黃柏殘?jiān)c澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提8 h；
H.浸提III:將G中黃柏殘?jiān)c澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提5h ；
其余與與實(shí)施例一中步驟三相同；
步驟四與實(shí)施例一中步驟四相同。實(shí)施例三
應(yīng)用纖維素酶提取黃柏鹽酸黃連素的方法
步驟一與實(shí)施例一中步驟一相同；
步驟二
D.溶酶稱取纖維素酶加水溶液配制成10%。的酶溶液；
E.浸泡將C中的黃柏粉屑與D中的纖維素酶溶液按1:3混合好，同時(shí)在40°C時(shí)保溫
4 h ；
其余與實(shí)施例一中步驟二相同；
步驟三
F.浸提I:將E中黃柏粉屑與澄清石灰水按料液比1:7混合，浸提7 h ;
G.浸提II:將F中黃柏殘?jiān)c澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提7 h；
H.浸提III:將G中黃柏殘?jiān)c澄清石灰水按料液比1:5混合，浸提4 h ;
其余與與實(shí)施例一中步驟三相同；
步驟四與實(shí)施例一中步驟四相同。實(shí)施例四
應(yīng)用纖維素酶提取黃柏鹽酸黃連素的方法
步驟一與實(shí)施例一中步驟一相同；
步驟二 與實(shí)施例三中步驟二相同；
步驟三與實(shí)施例一中步驟三相同；
步驟四與實(shí)施例一中步驟四相同。實(shí)施例五
應(yīng)用纖維素酶提取黃柏鹽酸黃連素的方法
步驟一與實(shí)施例一中步驟一相同；步驟二
D.溶酶稱取纖維素酶配并制成10%。的酶溶液；
E.浸泡將C中的黃柏粉屑與D中的纖維素酶溶液按1:4混合好，同時(shí)在40°C保溫4
h ；
其余與實(shí)施例一中步驟二相同；
步驟三
F.浸提I:將E中黃柏粉屑與澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提7 h ；
G.浸提II:將F中黃柏殘?jiān)c澄清石灰水按料液比1:8混合，浸提7 h； H.浸提III:將G中黃柏殘?jiān)c澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提4 h ；
其余與與實(shí)施例一中步驟三相同；
步驟四與實(shí)施例一中步驟四相同。檢測結(jié)果(以鹽酸黃連素計(jì))如下
權(quán)利要求
1. 一種提取黃連素的改進(jìn)方法，其特征在于包括以下步驟 A.粉碎將黃柏進(jìn)行粉碎； B.沖蒸將步驟A中的黃柏粉屑采用蒸汽蒸煮； C.冷卻將步驟B中的黃柏粉屑經(jīng)自然冷卻至30—50 0C ； D.溶酶稱取纖維素酶并溶于水中，配制成質(zhì)量百分含量為10%。一20%。的纖維素酶溶液； E.浸泡將步驟C中的黃柏粉屑的質(zhì)量g與步驟D中的纖維素酶溶液體積ml按1:2—1:4的比例混合好，同時(shí)在30— 50°C的溫度下保溫4一6 h ； F.浸提I:將步驟E中的黃柏粉屑與纖維素酶混合后的物料與澄清石灰水，按物料質(zhì)量g與料液體積ml為1:5—1:9的比例進(jìn)行混合，浸提4一6 h后，經(jīng)紗布過濾后，再進(jìn)行固液分離，得黃柏殘?jiān)秃S柏總生物堿的石灰水溶液I ; G.浸提II:將步驟F中的黃柏殘?jiān)馁|(zhì)量g與澄清石灰水的體積ml，按1:5—1:9的比例進(jìn)行混合，浸提6— 8 h，經(jīng)紗布過濾，再次進(jìn)行固液分離，得黃柏殘?jiān)秃S柏總生物堿的石灰水溶液II ； H.浸提III:將步驟G中的黃柏殘?jiān)馁|(zhì)量g與澄清石灰水的體積ml按1:4一1:7的比例進(jìn)行混合，浸提4一6h，經(jīng)紗布過濾，進(jìn)行固液分離，棄黃柏殘?jiān)蛴糜趧e的用途，得含黃柏總生物堿的石灰水溶液III ； I.將步驟F中的石灰水溶液I和步驟G中的石灰水溶液II進(jìn)行混合，加入10%(W/V)固體工業(yè)食鹽，攪拌溶解，冷藏6-10小時(shí)進(jìn)行沉淀； J.取步驟I中的沉淀物，加60— 80°C熱水溶解，趁熱過濾，濾液加濃HCl，然后調(diào)節(jié)濾液的PH值為I一2，然后再加入10% (W/V)固體工業(yè)食鹽，攪拌溶解，冷藏6-10小時(shí)進(jìn)行結(jié)晶; K.取J中的晶體，用少量蒸溜水沖洗并將pH值控制為5— 6，然后在60 °C以下干燥，即得鹽酸小檗堿精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取黃連素的改進(jìn)方法，其特征在于步驟A中的黃柏粉屑過20目篩或切成3— 5 mm細(xì)絲。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的提取黃連素的改進(jìn)方法，其特征在于所述的步驟J中加入的濃HCl的濃度為2mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的提取黃連素的改進(jìn)方法，其特征在于所述的步驟H中的含黃柏總生物堿的石灰水溶液III將進(jìn)入下一個(gè)生產(chǎn)周期的F步驟中，用于F步驟中浸提用的石灰水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的提取黃連素的改進(jìn)方法，其特征在于所述的步驟K中的蒸餾水為冰水或冷水，干燥采用的裝置為真空干燥箱。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的提取黃連素的改進(jìn)方法，其特征在于所述的步驟B中蒸汽蒸煮的時(shí)間為10 — 30 min，蒸汽溫度保持在95— 105°C。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物活性成分的提取領(lǐng)域，涉及采用纖維素酶去除植物細(xì)胞壁從而破碎細(xì)胞的一種提取純化方法，具體為一種提取黃連素的改進(jìn)方法。本改進(jìn)方法的步驟為先將黃柏進(jìn)行粉碎、然后沖蒸、再和酶反應(yīng)、采用石灰乳浸提、然后沉淀結(jié)晶、干燥等步驟。本提取方法浸提率高、提取周期縮短、溶劑使用量較小。利用纖維素酶降解細(xì)胞壁，使細(xì)胞壁受到不同程度的破壞，以增加細(xì)胞的通透率，提高細(xì)胞中活性成分的浸提率，縮短提取時(shí)間，并相對(duì)減少了溶劑的使用量，提高了生產(chǎn)效率；節(jié)能環(huán)保、綠色安全。酶反應(yīng)的條件溫和，對(duì)工程設(shè)備要求不高，操作簡捷；酶反應(yīng)所需的物質(zhì)不會(huì)給環(huán)境帶來壓力，從而降低對(duì)能源消耗、對(duì)環(huán)境的污染。
文檔編號(hào)C07D455/03GK102807565SQ20121026481
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者丁春邦, 李旭, 李倩倩, 陳浩然, 馮士令, 郭軍偉, 陳彬, 王順堯, 周永紅 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 雅安太時(shí)生物科技有限公司