自卵黃萃取γ-卵黃球蛋白(IgY)的方法
【專利摘要】一種自卵黃萃取γ-卵黃球蛋白(IgY)的方法，包括：(A)提供一緩沖鹽類溶液、一卵黃樣品及一無機(jī)鹽類；(B)使用該緩沖鹽類溶液稀釋該卵黃樣品，攪拌一預(yù)定時(shí)間后，離心以獲得一上清液；以及(C)使用該無機(jī)鹽類對(duì)該上清液進(jìn)行鹽析沉淀，以獲得一高純度的γ-卵黃球蛋白；其中，該緩沖鹽類溶液的酸堿值(pH)于4.6至5.4的范圍內(nèi)，且該緩沖鹽類溶液的濃度于0.05-0.15M的范圍內(nèi)，及該無機(jī)鹽類的飽和度為30％至60％。
【專利說明】自卵黃萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明系關(guān)于一種自卵黃萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，尤其指一種可簡單、快速地萃取出高純度Y-卵黃球蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)遭遇外來特定抗原時(shí)，常會(huì)誘發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生多種辨識(shí)該抗原不同表位(epitopes)的抗體分子,這些抗體分子的集合統(tǒng)稱為多株抗體(polyclonalantibodies);由于抗體與其辨識(shí)的抗原表位間具有強(qiáng)結(jié)合力與高專一性，故常被應(yīng)用于特定抗原分子的鑒定、分析與純化等用途。目前于基礎(chǔ)研究、一般檢驗(yàn)、與醫(yī)藥治療上，多株抗體已成為不可或缺的工具之一。
[0003]由于動(dòng)物體內(nèi)被誘發(fā)表現(xiàn)的抗體多分布于血液之中，故多株抗體的生產(chǎn)上，通常會(huì)選用中、大體型的兔和羊等動(dòng)物，伴隨的缺點(diǎn)在于:飼養(yǎng)動(dòng)物的空間需求與飼養(yǎng)耗費(fèi)較高，且哺乳動(dòng)物彼此間的親源關(guān)系較接近，不適合用來制造哺乳動(dòng)物的保守性蛋白質(zhì)(conserved proteins)的抗體。此外,對(duì)動(dòng)物重復(fù)進(jìn)行侵入性抽血的方式是常被動(dòng)物福利團(tuán)體爭議的行為，因?yàn)閯?dòng)物可能會(huì)遭受痛苦、較易被感染而造成身體虛弱甚至死亡。
[0004]雞只(Gal Ius gal lus)受到免疫刺激后產(chǎn)生的抗體分子以Y -卵黃球蛋白(Y-livetin, IgY)為主，IgY不僅是雞血中含量最豐富的抗體分子，也是卵黃中唯一存在的抗體種類；又，雞只的飼養(yǎng)成本較低，產(chǎn)蛋效率又高，且每顆卵黃的IgY含量可高達(dá)約lOOmg，甚至比雞血中的IgY濃度更高。此外，相較于哺乳類之間，鳥類與哺乳類有較大的親緣差距，故成功產(chǎn)生對(duì)應(yīng)哺乳動(dòng)物保守性蛋白質(zhì)的抗體的機(jī)會(huì)較高；又IgY與哺乳類的免疫球蛋白G (Immunoglobulin G, IgG)分子在Fe部位的序列上有顯著差異,不會(huì)與哺乳類動(dòng)物的補(bǔ)體、類風(fēng)濕性因子、及Fe受體等成分發(fā)生作用，故可降低分析哺乳動(dòng)物樣品(尤其是人體樣品)時(shí)的偽陽性反應(yīng)。因此，利用雞只卵黃來生產(chǎn)IgY多株抗體不但生產(chǎn)成本較低、產(chǎn)量較高且穩(wěn)定、可以對(duì)應(yīng)的哺乳動(dòng)物抗原種類較多元、分析應(yīng)用時(shí)的偽陽性結(jié)果較少、更可免去對(duì)動(dòng)物抽血的需求,而減少社會(huì)團(tuán)體的不必要爭議。
[0005]但由于卵黃中含有豐富的脂質(zhì)(高達(dá)34% )和其他多種蛋白質(zhì)，使IgY的純化不易，導(dǎo)致目前IgY的應(yīng)用仍不夠普遍。再者，因IgY與IgG在Fe部位的胺基酸序列差異，也使得廣泛應(yīng)用于純化IgG的A/G蛋白質(zhì)管柱并無法被用來吸附分離IgY。現(xiàn)有的卵黃IgY萃取方法，皆以去脂步驟開始，包括水稀法、PEG沉淀法、氯仿沉淀法、膠液沉淀法等；隨后再由鹽析、或過濾、或離子交換管柱、或特定吸附管柱、或前述方法的不同組合將IgY進(jìn)一步純化；過程步驟不僅繁瑣且耗時(shí)冗長。
[0006]因此，目前亟需發(fā)展一種簡單快速、便宜有效的卵黃IgY分離方法，以獲得回收量高且純度良好的IgY樣品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種自卵黃中萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，以簡單快速、成本低廉的方法獲得回收量高且純度良好的IgY樣品。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的自卵黃中萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，包括:
[0009]A)提供一緩沖鹽類溶液、一卵黃樣品、及一無機(jī)鹽類；
[0010]B)使用該緩沖鹽類溶液稀釋該卵黃樣品，攪拌一預(yù)定時(shí)間后，離心以獲得一上清液；以及
[0011]C)使用該無機(jī)鹽類對(duì)該上清液進(jìn)行鹽析沉淀，以獲得一 Y-卵黃球蛋白；
[0012]其中，該緩沖鹽類溶液的pH值為4.6至5.4范圍內(nèi)，且該緩沖鹽類溶液的濃度為0.05M至0.15M范圍內(nèi)，及該無機(jī)鹽類的飽和度為30%至60%。
[0013]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該卵黃樣品為雞蛋的卵黃。
[0014]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該緩沖鹽類溶液的濃度為0.08M至0.12M范圍內(nèi)。
[0015]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該緩沖鹽類溶液為醋酸系鹽類溶液或檸檬酸系鹽類溶液。
[0016]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該緩沖鹽類溶液為醋酸鈉溶液。
[0017]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，于步驟B)中，該緩沖鹽類溶液是以8至10倍稀釋倍率稀釋該卵黃樣品。
[0018]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該攪拌的預(yù)定時(shí)間為25分鐘以上。
[0019]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該無機(jī)鹽類為硫酸銨。
[0020]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該Y-卵黃球蛋白的純度為50%至95%。
[0021]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該Y-卵黃球蛋白的產(chǎn)率為45%至98%。
[0022]所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該卵黃樣品為雞蛋的卵黃；該緩沖鹽類溶液的濃度為0.08M至0.12M的范圍內(nèi)；該緩沖鹽類溶液為醋酸鈉溶液；于步驟(B)中，該緩沖鹽類溶液是以8至10倍稀釋倍率稀釋該卵黃樣品；該攪拌的預(yù)定時(shí)間為25分鐘或以上；且該無機(jī)鹽類為硫酸銨。
[0023]本發(fā)明的方法不僅步驟最為簡單、快速，卵黃IgY的回收率與純度亦佳，試劑成本更是低廉，且無需使用任何有機(jī)溶劑，較符合環(huán)保要求。由此，本發(fā)明除了可提供至一般實(shí)驗(yàn)室的IgY萃取使用外，亦可被應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)界的大規(guī)模IgY生產(chǎn)目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的SDS膠體電泳分析結(jié)果圖。
[0025]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的卵黃粗萃液的外觀照片。
[0026]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的SDS膠體電泳分析結(jié)果圖。
[0027]圖4是本發(fā)明實(shí)施例3的酸堿值變化結(jié)果圖。
[0028]圖5是本發(fā)明實(shí)施例4的SDS膠體電泳分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】[0029]本發(fā)明提供一種自卵黃中萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，包括:
[0030] (A)提供一緩沖鹽類溶液、一卵黃樣品、及一無機(jī)鹽類；
[0031](B)使用該緩沖鹽類溶液稀釋該卵黃樣品，攪拌一預(yù)定時(shí)間后，離心以獲得一上清液；以及
[0032](C)使用該無機(jī)鹽類對(duì)該上清液進(jìn)行鹽析沉淀，以獲得一純度提升的Y -卵黃球蛋白樣品。
[0033]其中，該卵黃樣品無特別限制，可視實(shí)驗(yàn)所需或材料取得的便利性而選用；較佳可使用雞蛋的卵黃，其IgY含量高達(dá)約lOOmg，且雞蛋的取得相當(dāng)便利。
[0034]在本發(fā)明的萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法中，該緩沖鹽類溶液的濃度是于0.05M至0.15M的范圍內(nèi)，較佳地是于0.08M至0.12M的范圍內(nèi)。再者，該緩沖鹽類溶液不受限，可為酸解離常數(shù)(PKa)值約為5.0的醋酸系鹽類溶液或檸檬酸系鹽類溶液；較佳可使用醋酸鈉溶液。此外，該緩沖鹽類溶液的酸堿值(PH)為4.6至5.4的范圍內(nèi)，可達(dá)到最佳的去脂效果。與公知的酸水相比，該緩沖鹽類溶液具有較佳的酸堿緩沖效率，可減少去脂作用所需的時(shí)間，提升萃取Y-卵黃球蛋白的時(shí)效，亦可省去實(shí)驗(yàn)期間測量與調(diào)整PH的步驟，進(jìn)而減少電極的去蛋白操作次數(shù)以延長其使用壽命。
[0035]于步驟⑶中，該緩沖鹽類溶液較佳是以8至10倍稀釋倍率稀釋該卵黃樣品，然而此稀釋倍率可依其他實(shí)驗(yàn)條件而做適當(dāng)?shù)卣{(diào)整；若稀釋倍率過高，后續(xù)加工程序繁復(fù)，會(huì)造成較高的成本耗費(fèi)。并且，該攪拌的預(yù)定時(shí)間可為25分鐘或以上，即此步驟(B)的攪拌時(shí)間最短僅需25分鐘，即可完成去脂作用。
[0036]此外，該無機(jī)鹽類可使用如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等公知鹽類，較佳可選用硫酸銨；該無機(jī)鹽類吸引大量水分子與該無機(jī)鹽類離子水合，使蛋白質(zhì)表面暴露出來的疏水性區(qū)域增加，最后蛋白質(zhì)彼此間由疏水性作用力而結(jié)合，進(jìn)一步自溶液中沉淀。
[0037]在該無機(jī)鹽類的飽和度為30%至60%的情況下，所獲得的該Y-卵黃球蛋白的純度為50%至95%、產(chǎn)率為45%至98%。由此，使用飽和度近30%的該無機(jī)鹽類進(jìn)行鹽析沉淀時(shí)，所獲得的該Y-卵黃球蛋白的純度較高(約95%)、產(chǎn)率適中(約45%);反之，使用飽和度近60%的該無機(jī)鹽類進(jìn)行鹽析沉淀時(shí)，所獲得的該Y-卵黃球蛋白的純度適中(約50%)、產(chǎn)率較高(約98%)。故各實(shí)驗(yàn)室可依據(jù)Y-卵黃球蛋白的后續(xù)用途而適當(dāng)?shù)剡x擇該無機(jī)鹽類的飽和度，例如若需在短時(shí)效內(nèi)快速獲得高純度的IgY樣品，則可選擇30%飽和度的硫酸銨添加量；若后續(xù)需要由抗原管柱來進(jìn)一步純化專一的IgY抗體，則可選擇60%飽和度的硫酸銨先沉淀大部分的IgY，再進(jìn)行后續(xù)專一性抗體的純化。
[0038]由此，在本發(fā)明的萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法中，可使用濃度于0.08M至0.12M的范圍內(nèi)、且酸堿值(pH)于4.6至5.4的范圍內(nèi)的醋酸鈉溶液，以8至10倍稀釋倍率稀釋雞蛋的卵黃，攪拌至少25分鐘后，離心以獲得一上清液；再使用飽和度系為30%至60%的硫酸銨對(duì)該上清液進(jìn)行鹽析沉淀，以獲得純度為50%至95%、產(chǎn)率為45%至98%的Y-卵黃球蛋白。
[0039]與公知技術(shù)相比，現(xiàn)今最常用的PEG沉淀法或水稀法，均需搭配其他多重的步驟，并且耗時(shí)冗長，才能獲得純度及產(chǎn)率可與使用本發(fā)明方法所得的Y-卵黃球蛋白相比擬的Y -卵黃球蛋白；近期發(fā)展較快速方法是以含果膠(gum pectin)、卡拉膠(K -carrageenan)和氯化鈣(CaCl2)的溶液進(jìn)行卵黃的去脂作用，再搭配兩次不同飽和度的硫酸銨沉淀步驟，可于5小時(shí)內(nèi)從I顆卵黃中分離得到60mg、純度達(dá)80%的IgY樣品，且試劑花費(fèi)僅需約5美元。然而，本發(fā)明的萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法為一僅有兩步驟的萃取方法，先以醋酸鈉溶液進(jìn)行卵黃的去脂作用，再由硫酸銨鹽析沉淀IgY樣品，完成萃取僅需約兩小時(shí)，即可從卵黃中分離得到高純度及高產(chǎn)率的IgY，比已知技術(shù)更加快速，并且試劑花費(fèi)估計(jì)僅為1.5美元。
[0040]以下實(shí)施例使用的雞蛋來源為實(shí)驗(yàn)室自行飼養(yǎng)的白色萊亨蛋用雞(WhiteLeghorn laying hens)。敲破蛋殼，將分離的卵黃置于不銹鋼濾網(wǎng)中，再將濾網(wǎng)浸入去離子水中，以洗去卵黃表面殘留的蛋白液；隨后以紙巾從濾網(wǎng)外側(cè)將多余的水分吸干，再用解剖針搓破卵黃膜，并以量筒收集卵黃液。以下實(shí)施例使用的雞蛋其卵黃液體積約為13至15mL0
[0041]以下實(shí)施例使用的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)兩兩比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是以Student’ s T_test來分析其是否具顯著差異；對(duì)多組比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，則是以單因子變異數(shù)分析(ANOVA)來檢測組間的差異性，并以P < 0.05做為顯著的標(biāo)準(zhǔn)。
[0042][實(shí)施例1-粗萃取卵黃IgY的攪拌時(shí)間測試]
[0043][卵黃IgY的粗萃取]
[0044]取定量體積的卵黃液，加入9倍體積的0.1M，pH5.0的醋酸鈉溶液，混合均勻后，置于4°C中以四種不同攪拌時(shí)間(0.5h、lh、3h、6h)攪拌，接著以12，000Xg，4°C離心30分鐘，而收集到的上清液即為卵黃的粗萃液(crude extract)，量測體積后，加入NaN3至最終濃度為0.02% (w/v)，并保存于4°C中供后續(xù)分析使用。
[0045][IgY的定量分析]
[0046]以酵素連結(jié)免疫吸附法(enzyme-linkedimmuno-sorbent assay ；ELISA)來測定分析樣品中的IgY含量。首先將IgY標(biāo)準(zhǔn)品(Jackson，003-000-003)與待測樣品分別以0.2M硼酸鹽進(jìn)行一系列稀釋，再各取50 μ L分注至ELISA盤(Costar Eff-01959-20)的樣品孔中，經(jīng)6h(室溫)或隔夜(4°C)的吸附作用后，以洗滌緩沖液(wash buffer)沖洗三次，再加入180 μ L封閉緩沖液(blocking buffer)，并于室溫下反應(yīng)兩小時(shí)或于4°C中隔夜反應(yīng)；之后，以洗漆緩沖液沖洗三次，并于各孔加入50 μ L兔子抗雞IgY(rabbit ant1-chickenIgY, Jackson 303-005-003 ；1μ g/ml)，在室溫下反應(yīng)2h后，以洗滌緩沖液沖洗三次，再于各孔中加入50 μ L山羊抗兔子抗體-堿性磷酸酶(goat ant1-rabbit antibody-alkalinephosphatase, Sigma A3687 ;使用10，000倍稀釋液)，隨后于室溫下反應(yīng)兩小時(shí)，以洗滌緩沖液沖洗三次，各孔分別加入50 μ L ρΝΡΡ受質(zhì)以進(jìn)行30至60分鐘的呈色反應(yīng)，最后以酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader, BIO-TEK MQX220)測定吸光值(OD405_490)。利用系列稀釋的IgY標(biāo)準(zhǔn)品讀值，推估待測樣品的IgY含量。
[0047][蛋白質(zhì)定量]
[0048]由Bradford測定法來估測分析樣品中的蛋白質(zhì)含量，并以牛血清白蛋白(BSA，Sigma A7906)做為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。先將BSA(2mg/mL)與待測樣品進(jìn)彳丁系列稀釋，并各取50 μ L分別加注于96孔盤中，隨后各孔加入200 μ L Bradford試劑，靜置十分鐘后，以酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader, BIO-TEK MQX220)測定OD595的讀值。取BSA系列稀釋樣品的讀值做一標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以估算待測樣品的蛋白質(zhì)濃度。
[0049]如下表一所示，四種不同攪拌時(shí)間(0.5h、lh、3h、6h)的處理下，每毫升卵黃所能萃得的IgY含量(6.0~7.2mg)及蛋白質(zhì)含量(21.7~24.9mg)，經(jīng)ANOVA分析后(p >0.05)并無統(tǒng)計(jì)上的差異，表示僅需0.5小時(shí)就足夠完成去脂程序。
[0050]表一
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種自卵黃中萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，包括: A)提供一緩沖鹽類溶液、一卵黃樣品、及一無機(jī)鹽類； B)使用該緩沖鹽類溶液稀釋該卵黃樣品，攪拌一預(yù)定時(shí)間后，離心以獲得一上清液；以及 C)使用該無機(jī)鹽類對(duì)該上清液進(jìn)行鹽析沉淀，以獲得一Y-卵黃球蛋白； 其中，該緩沖鹽類溶液的PH值為4.6至5.4范圍內(nèi)，且該緩沖鹽類溶液的濃度為0.05M至0.15M范圍內(nèi)，及該無機(jī)鹽類的飽和度為30%至60%。
2.如權(quán)利要求1所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該卵黃樣品為雞蛋的卵黃。
3.如權(quán)利要求1所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該緩沖鹽類溶液的濃度為0.08M至0.12M范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該緩沖鹽類溶液為醋酸系鹽類溶液或檸檬酸系鹽類溶液。
5.如權(quán)利要求4所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該緩沖鹽類溶液為醋酸鈉溶液。
6.如權(quán)利要求5所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，于步驟B)中，該緩沖鹽類溶液是以8至10倍稀釋倍率稀釋該卵黃樣品。
7.如權(quán)利要求1所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該攪拌的預(yù)定時(shí)間為25分鐘以上。
8.如權(quán)利要求1所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該無機(jī)鹽類為硫酸銨。
9.如權(quán)利要求1所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該Y-卵黃球蛋白的純度為50%至95%。
10.如權(quán)利要求1所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該Y-卵黃球蛋白的產(chǎn)率為45%至98%。
11.如權(quán)利要求1所述萃取Y-卵黃球蛋白(IgY)的方法，其中，該卵黃樣品為雞蛋的卵黃；該緩沖鹽類溶液的濃度為0.08M至0.12M范圍內(nèi)；該緩沖鹽類溶液為醋酸鈉溶液；于步驟(B)中，該緩沖鹽類溶液是以8至10倍稀釋倍率稀釋該卵黃樣品；該攪拌的預(yù)定時(shí)間為25分鐘或以上；且該無機(jī)鹽類為硫酸銨。
【文檔編號(hào)】C07K16/02GK103570829SQ201210271561
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月1日
【發(fā)明者】王玉麒, 汪宗明 申請人:王玉麒