專利名稱：多糖粘液形成菌的靶基因缺失的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鞘氨醇膠多糖制備領(lǐng)域。特別地，其涉及用于改進(jìn)制備鞘氨醇膠的菌株的定點(diǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
鞘氨醇單胞菌(sphingomonas)菌株，例如ATCC 53159和ATCC 31461產(chǎn)生大量的莢膜多糖。盡管在某些條 件下，多糖可以由細(xì)胞釋放[5，6]，但在具有豐富碳源的生長(zhǎng)過(guò)程中(如發(fā)酵)，多糖牢固附著于細(xì)胞表面。提高丟坦糖膠(diutan)和吉蘭糖膠(gellan)發(fā)酵產(chǎn)率的嘗試受到莢膜性質(zhì)的多糖的限制，所述莢膜性質(zhì)的多糖可以破壞營(yíng)養(yǎng)素的吸收。另外，如果用于多糖的生物合成的位點(diǎn)數(shù)量有限，就會(huì)有由各細(xì)胞能產(chǎn)生多糖的最大量。已經(jīng)觀察到多糖吉蘭糖膠與細(xì)胞凝集有關(guān)，這是由于不產(chǎn)生任何多糖的突變體在懸浮液中均勻地生長(zhǎng)[3]。這些細(xì)胞凝集塊可以干擾多種技術(shù)，例如通過(guò)光密度測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞的離心(例如用于分離DNA或蛋白質(zhì))，以及用于多糖純化的細(xì)胞分離或裂解。先前尚未確定與鞘氨醇單胞菌中多糖附著于細(xì)胞表面有關(guān)的附著機(jī)制和基因。已經(jīng)分離了以粘液形式產(chǎn)生多糖的鞘氨醇單胞菌菌株ATCC31461、ATCC 31555、ATCC 31554和ATCC 21423的誘導(dǎo)突變體，但是未確定突變基因，且未公開(kāi)誘導(dǎo)和篩選突變體的方法。已經(jīng)分離了用于吉蘭糖膠[3，8]、丟坦糖膠[I]和鞘氨醇膠S-88[9]生物合成的基因。許多這些基因的功能通過(guò)生物化學(xué)試驗(yàn)給出或者通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)例如GenBank中的已知功能的基因的同源性給出。例如，已經(jīng)鑒定了與四糖重復(fù)單元[7，8]的裝配和前體dTDP-L-鼠李糖[3，9]的合成有關(guān)的基因。預(yù)期僅影響多糖附著于細(xì)胞表面的基因仍具有產(chǎn)生多糖的表型(即固體培養(yǎng)基和粘性發(fā)酵液上的粘液樣菌落)。除了不在基因簇中的用于吉蘭糖膠合成的四種基因外，還描述了跨越21kb的18種用于吉蘭糖膠生物合成的基因的基因簇。Harding N.E., Y.N.Patel, and R.Coleman,2004。伊樂(lè)藻鞘氨醇單胞菌ATCC 31461中具有吉蘭糖膠多糖生物合成所需的基因的結(jié)構(gòu)。J Ind Microbiol Biotech 31:70_82，參考文獻(xiàn)3。其DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號(hào)AY217008)?；虼刂械幕蛴術(shù)elM、gelN以及gell。構(gòu)建了大多數(shù)相鄰基因gelM和gelN的缺失。通過(guò)插入滅活gell基因。gelM-gelN缺失株和gell突變株顯示產(chǎn)生數(shù)量有所減少的吉蘭糖膠和更具流動(dòng)性的發(fā)酵液，且顯示所產(chǎn)生的吉蘭糖膠具有與野生株的吉蘭糖膠相同的組成。多糖至細(xì)胞的附著未有報(bào)道。伊樂(lè)藻鞘氨醇單胞菌的gelR、gelS及gelG基因似乎以與S_88sps基因簇中相同的順序存在于操縱子中，但不鄰近18個(gè)基因的基因簇中的基因(參考文獻(xiàn)3)。GelR蛋白較其S-88同源物稍小(659和670個(gè)氨基酸相比)，具有49%的同源性，且與表層蛋白和其他膜蛋白具有同源性。gelR、gelS及gelG基因的DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號(hào)AY220099)。該報(bào)道中未構(gòu)建gelR的突變(參考文獻(xiàn)3)。Yamazaki等報(bào)道在基因spsR中具有突變的菌株仍為粘液樣，表明它們產(chǎn)生多糖，但多糖不具有流變學(xué)或附著于細(xì)胞的特征([9]和 T.J.Pollock 等，DNA segments and methods for increasingpolysaccharide production.U.S.Patent N0.5, 854, 034)。Yamazaki描述了四種鞘氨醇單胞菌菌株的典型突變體，其產(chǎn)生作為粘液而非附著于細(xì)胞的多糖。美國(guó)專利第6，605，461號(hào)。Yamazaki未描述如何篩選粘液表型的誘變培養(yǎng)物。Yamazaki未鑒定出哪個(gè)基因或哪些基因被誘變。Sa-Correia綜述了關(guān)于吉蘭糖膠合成的基因的分離的工作。Sa-Correia 1.,A.M.Fialho, P.Videira, L.M.Moreira, A.R.Marques and H.Albano。Gellan gumbiosynthesis in Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461:Genes, enzymes andexopolysaccharide production engineering.J Ind Microbiol Biotechnol.29:170-176。Sa-Correia描述了某些基因的部分測(cè)序，包括urf32和urf26(=上述的參考文獻(xiàn)3的gelM和gelN)。這些基因的完整序列于2003年4月存放于GenBank (GenBank登錄號(hào)AY242074)。這些基因的功能未有報(bào)道。在GenBank遞交中，僅分別將基因urf32和urf26指定為推定的膜蛋白和推定的運(yùn)輸?shù)鞍?。未存放gell或gelR的序列。Coleman描述了用于丟坦糖膠生物合成的基因的分離和某些基因功能的研究。R.Coleman,2001,Cloning and analysis of Sphingomonas sp.ATCC53159polysaccharidegenes.Master’ s Thesis, San Diego State University。描述了 dpsM 和 dpsN 基因(由Coleman命名為orf3和orf4)，但未指明功能。描述了來(lái)自鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31554的用于S-88多糖的生物合成的基因族。Yamazaki M.，L.Thorne, M.Mikolajczak, R.ff.Armentrout 和 T.J.Pollock.1996.Linkage of genes essential for synthesis of a polysaccharide capsule inSphingomonas strain S88.J Bacteriol 178:2676_2687 和美國(guó)專利第 5，854，034 號(hào)。未描述基因 urf32 和 urf 26 的功能(dpsM、gelM 和 dpsN、gelN 的同源物)和 spsl (gell、dpsl的同源物)。將spsR基因(gelR、dpsR的同源物)描述為編碼與細(xì)菌和真菌多糖裂解酶大不相似的蛋白。其DNA序列存放于GenBank中(登錄號(hào)U51197)。本領(lǐng)域仍需要改進(jìn)制備工業(yè)上實(shí)用的鞘氨醇膠的方法和改進(jìn)鞘氨醇膠的性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和/或N的全部或部分；誘導(dǎo)所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N ;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述突變的片段已經(jīng)整合入基因組并置換所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本發(fā)明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。本發(fā)明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA的兩個(gè)非連續(xù)片段，其中所述片段側(cè)鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和/或N ;將所述兩個(gè)非連續(xù)片段連接在一起；將所述連接的非連續(xù)片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N ;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述連接片段已經(jīng)整合入基因組并置換所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本發(fā)明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。本發(fā)明提供了一種組合物，其含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予流體對(duì)于由菌株ATCC 53159產(chǎn)生的等量丟坦糖膠增加的粘度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少30%。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少40%。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少50%。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少60%。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少70%。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少80%。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC53159 至少 90%。本發(fā)明提供了一種分離和 純化的鞘氨醇菌屬細(xì)菌，其含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的缺失。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以是伊樂(lè)藻菌種。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以不是伊樂(lè)藻菌種。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以是與作為ATCC53159存放的細(xì)菌相同的菌種的鞘氨醇單胞菌亞種。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是丟坦糖膠。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是吉蘭糖膠。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以不是吉蘭糖膠。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是韋蘭糖膠。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是鼠李糖膠。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了一種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有本段上述的所有細(xì)菌，并且已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以不含有外源性DNA。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部gelM缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部gelN缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部dpsM缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部dpsN缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部gelM和gelN缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。
本發(fā)明提供了一種制備鞘氨醇膠多糖的方法，其包括在適于制備鞘氨醇膠多糖的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的缺失的分離和純化的鞘氨醇菌屬細(xì)菌，由此在所述培養(yǎng)基中制備鞘氨醇膠多糖。所述方法還可以包括從所述培養(yǎng)基中的細(xì)菌分離鞘氨醇膠多糖的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離步驟可通過(guò)離心進(jìn)行。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離步驟可通過(guò)沉降進(jìn)行。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離步驟可包括使用堿處理培養(yǎng)基。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物理分離步驟可包括使用酶處理培養(yǎng)基。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是丟坦糖膠。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是吉蘭糖膠。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以不是吉蘭糖膠。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以是伊樂(lè)藻菌種。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以不是伊樂(lè)藻菌種。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以是與作為ATCC53159存放的細(xì)菌相同的菌種的鞘氨醇單胞菌亞種。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是韋蘭糖膠。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是鼠李糖膠。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部gelM缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部gelN缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部dpsM缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部dpsN缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部gelM和gelN缺失。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鞘氨醇菌屬細(xì)菌可以含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。本發(fā)明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因1的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I的全部或部分；誘導(dǎo)所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I ;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述突變的片段已經(jīng)整合入基因組并置換所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I。在本發(fā)明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。本發(fā)明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因1中的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段側(cè)鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I ;將所述突變的 片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I ;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述片段已經(jīng)整合入基因組并置換所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I。在本發(fā)明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。本發(fā)明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的全部或部分；誘導(dǎo)所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R ;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述突變的片段已經(jīng)整合入基因組并取代所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R。在本發(fā)明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。本發(fā)明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段側(cè)鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R ;將所述片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R ;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述片段已經(jīng)整合入基因組并取代所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R。在本發(fā)明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種制備細(xì)菌的方法。所述細(xì)菌是鞘氨醇單胞菌屬，并含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M、N、I或R基因的一種或多種基因的突變。在某些出版物中(例如參考文獻(xiàn)8和9)，所述基因M和N還分別稱為urf2、urf26基因(未知的閱讀框)。分離了鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段。所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因 簇的基因M和/或N或I或R的全部或部分。誘導(dǎo)所述片段中的片段以形成突變的片段。將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌。所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分離了所述第二種細(xì)菌的子代，其中突變的片段整合入所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因組并置換的野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇單胞菌可以是伊樂(lè)藻菌(伊樂(lè)藻菌)或者不是伊樂(lè)藻菌。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，提供了制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的另一種方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有選自鞘氨醇多糖生物合成基因簇的基因M、N、I和R的一種或多種基因的突變。分離了鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA的兩個(gè)非連續(xù)片段。所述片段側(cè)鄰或包括鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N。相似地，可分離側(cè)鄰基因I或R的片段。將所述兩個(gè)非連續(xù)片段連接在一起。將所述連接的非連續(xù)片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌。所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分離了所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述連接的片段整合入所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因組并置換野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇單胞菌可以是伊樂(lè)藻菌或者不是伊樂(lè)藻菌。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種組合物。所述組合物含有吉蘭糖膠多糖，所述吉蘭糖膠多糖賦予改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)，包括凝膠強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種組合物。所述組合物含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予液體較由ATCC53159菌株產(chǎn)生的等重的丟坦糖膠增加的粘度。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案，提供了分離和純化的鞘氨醇單胞菌屬的細(xì)菌。所述細(xì)菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M、N、I或R的一種或多種基因的突變。所述細(xì)菌可以在適于產(chǎn)生鞘氨醇膠多糖的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生鞘氨醇膠多糖。所述細(xì)菌的培養(yǎng)物發(fā)酵液可以直接或在使用乙醇沉淀之后用作增粘劑或膠凝劑?？蛇x地，所述培養(yǎng)物發(fā)酵液可進(jìn)行下述步驟:在其用作增粘劑或膠凝劑之前從所述培養(yǎng)物發(fā)酵液去除細(xì)菌或從所述發(fā)酵液回收。所述鞘氨醇單胞菌可以是伊樂(lè)藻菌或者不是伊樂(lè)藻菌。一經(jīng)閱讀該說(shuō)明書，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的這些和其他實(shí)施方案提供了本領(lǐng)域用于制備增粘劑和膠凝劑的新的方法、菌株以及組合物。附圖簡(jiǎn)述

圖1.鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31554,ATCC 31461和ATCC 53159中多糖生物合成的基因簇的比較。圖2.S60WTC gelM-gelN突變體的粘液形成特征。圖3.S60WTC gelN和gell突變體的粘液形成特征。圖4.dp SN的缺失位點(diǎn)的DNA序列(SEQ ID NO: 19)，和融合肽的氨基酸序列(SEQID NO:20)。

圖5A-5C.dp SN突變體的粘液形成特征。圖6A-6B.dpsM突變體的粘液形成特征。
具體實(shí)施例方式在兩種鞘氨醇單胞菌菌株中，已經(jīng)鑒定了控制多糖附著于細(xì)菌細(xì)胞的的基因。gelM(dpsM)和gelN(dpsN)任一者或二者的缺失或gell的失活導(dǎo)致多糖作為粘液釋放至培養(yǎng)基中而非作為莢膜多糖附著于細(xì)胞表面。粘液型多糖的形成使得細(xì)菌培養(yǎng)物易于處理，改進(jìn)了在發(fā)酵過(guò)程中的混合，可以增加產(chǎn)量，且在某些情況下，改進(jìn)多糖的流變學(xué)性質(zhì)。定點(diǎn)誘變基于多種原因較隨機(jī)誘變用于篩選粘液形成突變體更有利，所述多種原因包括速度和無(wú)關(guān)突變的避免。發(fā)現(xiàn)基因gelR的失活可以改進(jìn)粘液形式的膠凝多糖的流變學(xué)性質(zhì)(凝膠強(qiáng)度)?？梢詫?duì)任何鞘氨醇單胞菌菌株中的dpsM、dpsN、gelM、gelN和gell的直向同源物進(jìn)行滅活以獲得粘液形成表型?？梢詫?duì)gelR的直向同源物進(jìn)行滅活以防止多糖降解，從而導(dǎo)致改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)。合適的鞘氨醇單胞菌包括但不限于產(chǎn)生鼠李糖膠(rhamsan，ATCC 31961)、韋蘭糖膠(welan，ATCC 31555)、吉蘭糖膠(ATCC 31461)和丟坦糖膠(ATCC53159)的那些菌株，以及產(chǎn)生多糖的菌株 S7(ATCC 21423)、S88 (ATCC 31554)、S198 (ATCC31853)和 NWll (ATCC 53272)。ATCC 號(hào)指美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏所(American Type CultureCollection)的菌株的存放號(hào)。這些細(xì)菌通過(guò)伊樂(lè)藻菌ATCC 31461和鞘氨醇單胞菌ATCC53159來(lái)舉例說(shuō)明，但也可以使用其他菌株?？墒褂玫暮线m的鞘氨醇單胞菌包括adhaesiva鞘氨醇單胞菌，aerolata鞘氨醇單胞菌，alaskensis鞘氨醇單胞菌，aquatilis鞘氨醇單胞菌，aromaticivorans鞘氨醇單胞菌，asaccharolytica鞘氨醇單胞菌，aurantiaca鞘氨醇單胞菌，莢膜鞘氨醇單胞菌，chlorophenolica鞘氨醇單胞菌，chungbukensis鞘氨醇單胞菌，下水道鞘氨醇單胞菌，海膽鞘氨醇單胞菌，伊樂(lè)藻鞘氨醇單胞菌，faeni鞘氨醇單胞菌，herbicidovorans鞘氨醇單胞菌，koreensis鞘氨醇單胞菌，macrogoItabidus鞘氨醇單胞菌，mali鞘氨醇單胞菌，melonis鞘氨醇單胞菌,游泳池鞘氨醇單胞菌，parapaucimobilis鞘氨醇單胞菌，paucimobilis鞘氨醇單胞菌，pituitosa鞘氨醇單胞菌，樓桃鞘氨醇單胞菌，玫瑰鞘氨醇單胞菌，sanguinis鞘氨醇單胞菌,鞘氨醇單胞菌，stygda鞘氨醇單胞菌，subarctica鞘氨醇單胞菌，suberifaciens鞘氨醇單胞菌，地下鞘氨醇單胞菌，tae jonensis鞘氨醇單胞菌，terrae鞘氨醇單胞菌，trueperi鞘氨醇單胞菌，ursincola鞘氨醇單胞菌，wittichii鞘氨醇單胞菌，xenophaga鞘氨醇單胞菌，yabuuchiae鞘氨醇單胞菌，以及矢野鞘氨醇單胞菌?？筛鶕?jù)基因定位和鞘氨醇膠生物合成基因簇中的結(jié)構(gòu)、根據(jù)總的同源性和/或根據(jù)結(jié)構(gòu)域同源性鑒定直向同源物。通常，與dpSM、dpSN、gelM、gelN、gelI或gelR基因之一的總的同源性的水平將大于44%，常大于55%、66%、77%、88%或98%。直向同源物理想地與這四種基因的至少之一具有大于80%的同源性。定點(diǎn)誘變可用于在所需的已知靶基因或基因組區(qū)產(chǎn)生突變。這消除了隨機(jī)誘導(dǎo)的誘變或自發(fā)誘變的試驗(yàn)與誤差。缺失的形成確保了突變將不會(huì)復(fù)原，例如可能在點(diǎn)(替代)突變和插入突變中可見(jiàn)的。缺失也具有不應(yīng)用外源性DNA的益處，例如藥物抗性標(biāo)記或其他環(huán)境不需要的標(biāo)記?；蚪MDNA的分離片段是不連接在正常情況下與其結(jié)合的基因組DNA的DNA，其含有鞘氨醇膠生物合成基因簇的M和/或N、I或R或側(cè)鄰的DNA。作為非限制性實(shí)施例，所分離的DNA可通過(guò)由天然來(lái)源純化、通過(guò)合成或通過(guò)擴(kuò)增來(lái)獲得。所分離的DNA通常位于體外的DNA片段上，但是所分離的DNA還可以位于載體上，例如質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，其含有鞘氨醇單胞菌基因組的所需部分。側(cè)鄰的DNA通常來(lái)自緊鄰M和/或N、I或R的約500bp基因或約l_2kb基因內(nèi)的基因組區(qū)。

本領(lǐng)域任何已知的方法可用于將突變引入所分離的片段，所述片段含有鞘氨醇膠生物合成基因簇的基因M和/或N、I或R的全部或部分。例如，可使用限制性內(nèi)切酶和再連接非連續(xù)的核苷酸而引入缺失?？赏ㄟ^(guò)擴(kuò)增和連接基因的兩個(gè)非連續(xù)片段或側(cè)鄰靶基因的DNA的兩個(gè)非連續(xù)片段來(lái)形成缺失?？梢允褂煤怂醿?nèi)切酶消化和連接在所分離的片段中產(chǎn)生插入?；瘜W(xué)誘變可用于基因組DNA的分離片段?？蛇x擇任何誘變方法并根據(jù)具體情況而使用。在誘導(dǎo)突變之后，基因組DNA的片段可再導(dǎo)入受者細(xì)菌。通常情況下，但不是一定，受者將是與片段的供者相同的物種?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法用于將外源性DNA導(dǎo)入細(xì)菌。合適的方法包括但不限于電穿孔、接合、原生質(zhì)體形成、氯化鈣沉淀和轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)?？筛鶕?jù)具體情況選擇和使用任何核酸導(dǎo)入方法。如果導(dǎo)入受者細(xì)菌中的突變基因組DNA片段不具有復(fù)制自身的途徑，那么它必須在受者細(xì)菌中整合入復(fù)制子以得到維護(hù)。通常,這種整合事件將整合整個(gè)攝入的質(zhì)粒?？梢詸z測(cè)導(dǎo)入的DNA上的標(biāo)記，以鑒定所述DNA已經(jīng)整合。為了檢測(cè)整合的實(shí)現(xiàn)，可以篩選或選擇所導(dǎo)入的DNA上的標(biāo)記的喪失。實(shí)現(xiàn)該目的的合適的標(biāo)記為本領(lǐng)域已知，且任何標(biāo)記可用作此處的指示物。為了確定其中所導(dǎo)入的鞘氨醇膠基因取代了受者的野生型基因的分離株，可通過(guò)例如PCR測(cè)定DNA的大小或序列。如下文所證明的，通過(guò)鞘氨醇膠生物合成基因簇的基因M和/或N產(chǎn)生粘液形式的鞘氨醇膠，突變體可以較附著于細(xì)菌細(xì)胞上的形式具有改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)。所述改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)通過(guò)相同重量的材料提供更具粘力的能力而得到反映。所述改進(jìn)可以是輕度的，例如至少5 %、10 %、15 %、20 %或25 %，或其可為更顯著的，相對(duì)于由形成莢膜的親代產(chǎn)生的鞘氨醇膠改進(jìn)至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %。流變學(xué)性質(zhì)可使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)測(cè)定。合適的技術(shù)包括但不限于自來(lái)水溶液中的低切變率粘度(LowShear Rate Viscosity, LSRV),和高鹽溶液中的海水粘度(Sea Water Viscosity, SWV)。由例如gelN突變體產(chǎn)生的粘液形式的吉蘭糖膠和推定的裂解酶基因gelR的突變相結(jié)合導(dǎo)致高凝膠強(qiáng)度的吉蘭糖膠的形成。凝膠強(qiáng)度通常大于1000，而莢膜菌株通常產(chǎn)生凝膠強(qiáng)度為600至900但小于1000的吉蘭糖膠。根據(jù)本發(fā)明的純化細(xì)菌是已經(jīng)被微生物學(xué)純化的細(xì)菌，例如使用液體稀釋技術(shù)或于固體培養(yǎng)基上劃線以形成單菌落。微生物學(xué)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于該目的。根據(jù)本發(fā)明的突變體可使用用于親代菌株相同或相似的技術(shù)來(lái)培養(yǎng)和增殖。所述突變體的液體培養(yǎng)物性質(zhì)可以得到改進(jìn)，允許增加通風(fēng)和混合。所述突變體的培養(yǎng)物發(fā)酵液也可以提供較附著形式的多糖具有較高效的回收。另外，所述突變體還可以提供較附著形式的多糖具有改進(jìn)的澄明度的產(chǎn)物。細(xì)菌可任選通過(guò)過(guò)濾、離心或通過(guò)沉降從所述突變體產(chǎn)生的多糖去除。所述培養(yǎng)物發(fā)酵液可根據(jù)需要在去除細(xì)菌之前或之后被化學(xué)、酶或溫度(熱或冷)處理。涉及吉蘭糖膠附著于細(xì)胞表面的伊樂(lè)藻菌ATCC 31461的基因?yàn)間elM和gelN(圖1,SEQ ID NO:13)和gell ( 圖1，SEQ ID NO:25)。已經(jīng)構(gòu)建了具有大部分基因gelM和gelN缺失從而產(chǎn)生粘液形成表型的菌株。已經(jīng)構(gòu)建了 gelN特定缺失,并構(gòu)建了基因gell的插入。這兩種突變均產(chǎn)生了粘液形成表型。在SEQ ID N0:13中，gelM和gelN的編碼序列分別位于核苷酸501-1382和1366-2064。在SEQ ID NO:25中，gell的編碼序列分別位于核苷酸501-1403。編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO:26。發(fā)現(xiàn)基因gelR的缺失導(dǎo)致粘液形式的吉蘭糖膠的凝膠強(qiáng)度改進(jìn)。在SEQ ID N0:27中，gelR的編碼序列分別位于核苷酸478-2457。編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO:28。涉及丟坦糖膠附著于細(xì)胞表面的鞘氨醇單胞菌ATCC53159的基因?yàn)閐psM和dpsN(圖1，SEQ ID NO:14)，并根據(jù)與gell的同源性推測(cè)dpsl。已經(jīng)構(gòu)建了 dpsM和dpsN的各基因的缺失，兩者均產(chǎn)生了粘液形成表型。在SEQ ID NO: 14中，dpsM和dpsN的編碼序列分別位于核苷酸456-1337和1321-2019。編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO:18和17。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，用于吉蘭糖膠合成的相同或相似的方法也可以用于丟坦糖膠合成?；騞psl和dpsR的這種突變可容易構(gòu)建。在SEQ ID NO:29中，dpsl的編碼序列分別位于核苷酸501-1472。編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO:30。在SEQ ID NO:31中，dpsR的編碼序列分別位于501-2498。編碼的氨基酸序列示于SEQ IDN0.32。上述公開(kāi)內(nèi)容大體上描述了本發(fā)明。本文所公開(kāi)的所有參考文獻(xiàn)明確地通過(guò)引用并入。通過(guò)參考本文提供的下述具體實(shí)施例，可以獲得更完整的理解，所述實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，不意于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1——吉蘭糖膠粘液形成突變體的制備對(duì)于伊樂(lè)藻鞘氨醇單胞菌的突變體的構(gòu)建，使用了名為SeOwtc1的ATCC 31461的衍生物，其具有改進(jìn)的DNA攝取。該菌株可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。PCR擴(kuò)增用于擴(kuò)增側(cè)鄰基因gelM-gelN的區(qū)域。見(jiàn)參考文獻(xiàn)3。通過(guò)雙交換同源性重組，將擴(kuò)增的片段克隆至pL02載體中并通過(guò)接合導(dǎo)入S60wtc中以置換具有缺失的基因組上的基因gelM和gelNo載體pL02不在S60wtc中復(fù)制,所以對(duì)于卡那霉素抗性的最初選擇選擇了其中質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合入染色體的那些菌落。所述載體還含有基因sacB。該基因賦予了對(duì)蔗糖的敏感性。這種對(duì)蔗糖的選擇性可用于篩選喪失質(zhì)粒的分離株并保留缺失或野生型基因的一個(gè)拷貝。 C伊樂(lè)藻菌ATCC 31461具有低的DNA攝取效率，特別是大質(zhì)粒(約10_7)。分離具有增加的DNA攝取效率的ATCC 31461的自發(fā)突變體。懷疑這些少數(shù)的細(xì)胞為成功的質(zhì)粒受者,例如廣泛宿主范圍的質(zhì)粒PLAFR3,表現(xiàn)受者群體具有增加的攝取該質(zhì)粒DNA能力的突變。為了使得質(zhì)粒喪失，在非選項(xiàng)性條件下增殖三種含有PLAFR3的轉(zhuǎn)接合子(即無(wú)四環(huán)素抗生素)，連續(xù)傳代約30代。檢測(cè)了三種獨(dú)立的質(zhì)粒處理的菌株(即來(lái)自每一起始轉(zhuǎn)接合子的四環(huán)素敏感性衍生物)，所有三種顯示的增加的接合率(4.2X 10_3、0.6X 10_2以及
1.5X 10_2)，表現(xiàn)與野生型菌株相比具有IO5倍的增加。該增加的接合率是穩(wěn)定的且可再生的。這些菌株之一被命名為S60wtc。見(jiàn)參考文獻(xiàn)3。)使用提供轉(zhuǎn)移功能的pRK2013，并使用于YM_Sm(25ug/ml)_Km(7.5ug/ml)培養(yǎng)基上選擇的轉(zhuǎn)接合子，通過(guò)三親代偶配將含有g(shù)elM-gelN缺失區(qū)域的質(zhì)粒導(dǎo)入S60wtc。鏈霉素防止大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)。分離卡那霉素抗性質(zhì)粒整合體。蔗糖敏感性用于選擇消除載體的第二重組事件。在非選擇性條件下，即無(wú)抗生素，將五個(gè)分離株傳代兩次。然后將整分等份鋪于含有8%蔗糖的培養(yǎng)基上。分離蔗糖抗性菌落，并檢測(cè)卡那霉素敏感性。分離基因組DNA，并使用PCR測(cè)定哪些Kms分離株保留了缺失。對(duì)于缺失的預(yù)期大小的擴(kuò)增片段由四種菌株的基因組DNA產(chǎn)生。于YM培養(yǎng)基上純化這四種缺失菌株。四種菌株均顯示比野生型粘性較小、較軟、較平坦且黃色較深。實(shí)施例2——gelM-gelN缺失菌株的特征在搖瓶發(fā)酵中評(píng)價(jià)gelM-gelN缺失分離株。與較堅(jiān)固、粘度較大的S60wtc發(fā)酵液相比，Λ gelM-gelN培養(yǎng)物發(fā)酵液為液體且光滑。與S60wtc纖維相比，由突變菌株使用異丙醇沉淀產(chǎn)生較長(zhǎng)、較厚的纖維。然而，缺失突變體的全部可沉淀物質(zhì)的產(chǎn)量減少22%，且僅產(chǎn)生30%的野生型的發(fā)酵液粘度。所產(chǎn)生的吉蘭糖膠具有正常的糖、甘油和乙?；〈M成。使用幾種技術(shù)評(píng)價(jià)突變體的粘液形成特征，包括顯微鏡評(píng)價(jià)、細(xì)胞凝集、細(xì)胞沉淀物形成以及熱沉降試驗(yàn)，如圖2所示。熱沉降試驗(yàn)包括在高壓滅菌器中加熱吉蘭糖膠發(fā)酵液10分鐘以熔化吉蘭糖膠，然后將熱發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至大試管中并在95°C過(guò)夜培養(yǎng)(以維持發(fā)酵液為液體)。對(duì)于莢膜菌株，細(xì)胞附著多糖并保持懸浮。對(duì)于粘液形成菌，細(xì)胞未附著多糖并在過(guò)夜培養(yǎng)過(guò)程中沉降。通過(guò)該試驗(yàn)顯示gelM-gelN缺失菌株為粘液形成菌株。
對(duì)于離心試驗(yàn)，在含有I %葡萄糖的DM2培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)菌株并在Eppendorf離心機(jī)中以最大速度進(jìn)行離心?；騡elM-N的失活導(dǎo)致細(xì)胞表面多糖的附著完全喪失，使得細(xì)胞可通過(guò)離心而沉淀。通過(guò)顯微鏡評(píng)價(jià),大部分S60wtc Δ gelM_N細(xì)胞游離并具有動(dòng)力，而S60wtc處于樹膠基質(zhì)中。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，S60wtcAgelM-N細(xì)胞在懸浮液中生長(zhǎng)，而S60wtc細(xì)胞形成凝塊。實(shí)施例3——吉蘭糖膠粘液形成突變體的構(gòu)建構(gòu)建了 gelN的缺失用于吉蘭糖膠生物合成。將PCR引物設(shè)計(jì)成擴(kuò)增gelN基因的上游DNA片段(500bp)和下游DNA片段(40Ibp) [3]。使用的引物示于表I中。表1.用于構(gòu)建gelN缺失突變體的引物
權(quán)利要求
1.一種粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其含有至少一種有利于粘液形式的多糖產(chǎn)生的基因修飾，其中所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株含有基因M、基因N或這兩個(gè)基因中的突變、插入或缺失。
2.權(quán)利要求1所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述基因M或N是gelM或gelN基因。
3.權(quán)利要求2所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述多糖是吉蘭糖膠。
4.權(quán)利要求1所述的粘液 形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述基因M或N是dpsM或dpsN基因。
5.權(quán)利要求4所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述多糖是丟坦糖膠。
6.權(quán)利要求3所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述吉蘭糖膠是粘液形式的多糖。
7.權(quán)利要求6所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述吉蘭糖膠含有比由野生型菌株ATCC 31461天然產(chǎn)生的吉蘭糖膠更長(zhǎng)或更厚的纖維。
8.權(quán)利要求5所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述丟坦糖膠是粘液形式的多糖。
9.權(quán)利要求8所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述丟坦糖膠含有比由野生型菌株ATCC 53159天然產(chǎn)生的丟坦糖膠更長(zhǎng)的纖維。
10.權(quán)利要求8所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述丟坦糖膠賦予流體對(duì)于由野生型鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 53159天然產(chǎn)生的等量丟坦糖膠增加的粘度。
11.權(quán)利要求10所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述增加的粘度為大于由野生型菌株ATCC 53159產(chǎn)生的等量丟坦糖膠至少30%。
12.權(quán)利要求10所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述增加的粘度為大于由野生型菌株ATCC 53159產(chǎn)生的等量丟坦糖膠至少50%。
13.權(quán)利要求10所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述增加的粘度為大于由野生型菌株ATCC 53159產(chǎn)生的等量丟坦糖膠至少80%。
14.權(quán)利要求10所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述增加的粘度為大于由野生型菌株ATCC 53159產(chǎn)生的等量丟坦糖膠至少90%。
15.權(quán)利要求1所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，還含有將所述菌株從莢膜形成菌轉(zhuǎn)變成粘液形成突變體的第二種基因突變、插入或缺失。
16.權(quán)利要求15所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述第二種基因突變、插入或缺失是在基因R中。
17.權(quán)利要求15所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述第二種基因突變、插入或缺失是在基因I中。
18.權(quán)利要求1所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株是野生型鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31461的變體，其中所述變體已被基因改造以消除geIM基因、geIN基因或這兩個(gè)基因的表達(dá)。
19.權(quán)利要求1所述的粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其中所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株是野生型鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 53159的變體，其中所述變體已被基因改造以消除dpsM、dpsN基因或這兩個(gè)基因的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多糖粘液形成菌的靶基因缺失。本發(fā)明涉及鞘氨醇膠多糖制備領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其含有至少一種有利于粘液形式的多糖產(chǎn)生的基因修飾，其中所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株含有基因M、基因N或這兩個(gè)基因中的突變、插入或缺失。
文檔編號(hào)C07G99/00GK103087941SQ201210328379
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2006年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月4日
發(fā)明者南茜·E·哈丁, 帕特洛·雅美尼, 拉塞爾·J·科爾曼 申請(qǐng)人:Cp凱爾科美國(guó)公司