專利名稱：青石斑魚b淋巴細(xì)胞刺激因子基因與蛋白質(zhì)的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及青石斑魚BAFF基因克隆、表達(dá)、蛋白純化及活性鑒定技術(shù)。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)成員生物學(xué)效應(yīng)包括促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及炎癥誘發(fā)等功能，在淋巴器官的形成，免疫細(xì)胞的激活及維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。近年來，很多具有重要功能的TNFSF被發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞刺激因子 (B lymphocyte stimulator, BLyS),又稱 TALL-I(TNF-and ApoL-related leukocyteexpressed ligand I)、BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)、THANK (TNF homologue that activates apoptosis、NF_KB and JNK),屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族，有研究表明人體內(nèi)BAFF的水平對(duì)維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的“穩(wěn)態(tài)”(homeostasis)非常重要，人BAFF表達(dá)缺陷將極大地降低人體免疫力，BAFF作為在人體免疫系統(tǒng)中起重要調(diào)控作用的一種特異的細(xì)胞因子，其活性的充分表達(dá)能夠很好地加強(qiáng)機(jī)體的自身免疫能力，直接或間接地提高體內(nèi)BAFF的水平將有助于對(duì)免疫缺陷疾病進(jìn)行治療，BAFF的重大理論意義和臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值在國際上引起了高度重視。鑒于魚類所處的進(jìn)化地位以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，魚類免疫系統(tǒng)日益為人所關(guān)注。對(duì)魚類免疫系統(tǒng)的研究不僅為高等生物免疫演化途徑提供重要的參考，同時(shí)也為日趨嚴(yán)重的魚類養(yǎng)殖的病害防治提供必要的免疫理論與應(yīng)用基礎(chǔ)。魚類與哺乳動(dòng)物在免疫器官組成上不同，腎臟和脾臟是其主要的免疫器官，因此，我們推測(cè)與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子TNF家族的成員在魚類免疫中有重要作用。石斑魚是重要的世界性海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類，本課題基于國內(nèi)外研究的現(xiàn)狀以及石斑魚的細(xì)菌感染相關(guān)疾病的思考，提出對(duì)石斑魚BAFF基因進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)、功能及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面進(jìn)行研究，針對(duì)免疫力低下和炎癥感染疾病的魚類，有望開發(fā)成相關(guān)的免疫增強(qiáng)劑和疫苗佐劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從中青石斑魚中獲得B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF) cDNA,并提供青石斑魚BAFF蛋白的表達(dá)及純化方法和活性檢測(cè)。本發(fā)明所述青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF) cDNA，序列如SEQ ID NO. I所示 青石斑魚BAFF cDNA的克隆方法如下
(1)提取青石斑魚脾臟組織總RNA，SMART RACE試劑盒(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA ；
(2)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因的中間片段
正義寡核苷酸引物Ea-M-F :5’ - TCAGAGGTGTGTCGCAGGAGA -3’ (SEQ ID NO. 5)
反義寡核苷酸引物=Ea-M-R :5，- TCCTGTGAAGCAGGTGTTGTA -3，(SEQ ID NO. 6)(3)根據(jù)中間片段序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因的3’端
3’端正義寡核苷酸外引物GSP-U3’ 5’-GATGCGTTGACCCTGACAAG GAATAGA AGG-3’ (SEQID NO. 7)
3’端正義寡核苷酸內(nèi)引物GSP-N3’ 5’-GGCAGGCTGGGCTGA GGAGAGGCTCT-3’ (SEQ ID
NO. 8)3’ 端反義寡核苷酸引物UPM 5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (SEQ ID NO. 9)
(4)根據(jù)中間片段序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因的5’端
5’ 端正義寡核苷酸引物UPM 5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (SEQ ID NO. 9)
5’ 端反義寡核苷酸外引物GSP-U5’ 5’ -AGGGGATACCTGTGTGTG GCTCCGACTT-3’ (SEQID NO. 10)
5’端反義寡核苷酸內(nèi)引物GSP-N5’ 5’-GAGTCCCAGGTTGG TGCAGAGGCTCTT-3’ (SEQ IDNO. 11)
(5)用上述引物PCR，我們得到該基因的中間片段、3’端和5’端PCR產(chǎn)物。將上述引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆入PMD-19T載體，并進(jìn)行測(cè)序堿基序列測(cè)定。根據(jù)中間片段與3’端以及中間片段與5’端之間的重復(fù)部分將這三段拼接起來，拼接后我們得到了青石斑魚BAFF基因的全長(zhǎng)cDNA序列。對(duì)該基因開放閱讀框(OFR)分析表明，該基因氨基酸序列具有TNF家族基因的共有特征，一個(gè)跨膜區(qū)、一個(gè)弗林酶切位點(diǎn)、三個(gè)保守的半胱氨酸殘基以及3D結(jié)構(gòu)顯示出的BAFF特有的“D-E Loop”。講該基因序列與其它已知物種BAFF序列比對(duì)，該基因核苷酸序列與人、斑馬魚、鱸魚的相似性分別是45. 48%,60. 81%,84. 8%，青石斑魚與同屬于鱸形目的鱸魚相似度是最高的。本發(fā)明還公開了青石斑魚BAFF全長(zhǎng)⑶S序列，其碥碼的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。基因胞外功能區(qū)核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示。以及該基因編碼的胞外功能區(qū)氨基酸序列，如SEQ ID NO. 4所示。對(duì)該基因的進(jìn)一步研究表明；該基因主要表達(dá)于青石斑魚主要免疫器官脾臟及腎臟中，通過現(xiàn)有基因工程方法將該基因的胞外功能區(qū)克隆連接到pET28a原核質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21 (DE3)中表達(dá)，本發(fā)明通過多次預(yù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)摸索出了合適的表達(dá)條件(調(diào)節(jié)IPTG的濃度、溫度及轉(zhuǎn)速使融合蛋白盡可能多的以可溶形式表達(dá))，超聲破碎后離心收集上清過Ni+-NTA柱純化，梯度洗脫之后我們得到了青石斑魚BAFF胞外功能區(qū)融合蛋白(His6-EasBAFF)。并進(jìn)行Western-blot鑒定。體外WST-8染料生物活性檢測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白不僅能促進(jìn)青石斑魚淋巴細(xì)胞的存活，對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞也有明顯的促存活效應(yīng)，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。


圖I pET28a_EasBAFF表達(dá)載體的構(gòu)建。圖2 SDS-PAGE分析His6-EasBAFF在大腸桿菌中的表達(dá)。I重組蛋白非誘導(dǎo)；2重組蛋白誘導(dǎo)22 h ；3純化后蛋白His6-EasBAFF ;4western blotting 鑒定結(jié)果。
圖3 WST-8染料檢測(cè)His6-EasBAFF對(duì)青石斑魚淋巴細(xì)胞的促存活作用。圖4 WST-8染料檢測(cè)His6-EasBAFF對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞的促存活作用。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。 下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例I
青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)全長(zhǎng)cDNA的獲得，青石斑魚購自南京惠民橋市場(chǎng)。(I) 提取總RNA :應(yīng)用RNA抽提試劑盒(TIANGEN)按照其操作手冊(cè)提取青石斑魚脾臟組織總RNA，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量和純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。SMART RACE試劑盒(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA(5，RACE和3’ RACE模板)。(2.75 μ I RNA (合成 5’RACE 模版 cDNA 時(shí)，加入 I. 75 μ I RNA), I. O μ I 5’-CDSPrimer A 或 3’ -CDS primer (72 °C孵育 3 min, 42 °C孵育 2 min,冷卻后 14000 g 瞬離10 秒)加入 I. O μ I SMARTer II A oligo (合成 3’ -RACE-Ready cDNA 時(shí)不加),2. O μ I
5X First-Strand Buffer, I. 0 μ I DTT (20 mM)，1.0 μ I dNTP Mix (10 mM), 0. 25 μ IRNase Inhibitor (40U/μ I), I. 0 μ I SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U) (42°C孵育90 min, 70 °C熱激10 min)加入120 μ I EDTA Buffer稀釋。分裝成小管后_20°C保存。(2) 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因中間片段，再根據(jù)得到的該基因中間片段設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增5’端和3’端(引物如上述)。(3) 以上述引物PCR擴(kuò)增該基因，利用逆轉(zhuǎn)錄所得5’ RACE、3’ RACE模板進(jìn)行PCR。① 青石斑魚BAFF基因中間片段的克??；體系為50 μ 1,10 μ mol/L Ea_M_F、Ea-M-R 各 2 μ 1,2. 5 mmol/L dNTP 8 μ 1，2XGC buffer II 25 yl，cDNA 模板 3 μ I,DreamTaq 酶 O. 5 μ l,ddH20 9.5 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?4 ° C 5 min, (94 ° C 30 s，58 ° C30 s，72。Cl min)，30 個(gè)循環(huán)，最后 72。C 延伸 7 min。②青石斑魚3’端的克隆；體系為50 μ 1,10 μ mol/L GSP-U3’、UPM各2 μ I,
2.5mmol/L dNTP 8 μ 1，2XGC buffer II 25 yl，3，RACE cDNA 模板 3 μ I, DreamTaq酶 0.5 μ l,ddH20 9.5 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?4 ° C 5 min, (94 ° C 30 S，53 ° C 30 S，72° C 2 min)，30個(gè)循環(huán)，最后72 ° C延伸10 min。以該反應(yīng)PCR產(chǎn)物為模版，將上游引物改為GSP-N3’退火溫度提高到63 ° C，其余條件不變，進(jìn)行二次PCR。③青石斑魚5’端的克??；體系為50 μ 1,10 μ mol/L UPM> GSP-U5’各2 μ I,
2.5mmol/L dNTP 8 μ 1，2XGC buffer II 25 yl，3，RACE cDNA 模板 3 yl，DreamTaq 酶
0.5 μ I JnddH2O 9.5 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?4 ° C 5 min, (94 ° C 30 s，53 ° C 30 s，72° C 2 min)，30個(gè)循環(huán)，最后72 ° C延伸10 min。以該反應(yīng)的PCR產(chǎn)物為模版，將下游引物改為GSP-N5’退火溫度提高到62 ° C，其余條件不變，進(jìn)行二次PCR.以上反應(yīng)完成后將產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，用割膠回收試劑盒回收得到PCR產(chǎn)物，克隆入pMD19-T載體，經(jīng)含Amp抗生素(50 mg/ml)的瓊脂糖平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑出陽性克隆送往上海英駿測(cè)序公司進(jìn)行堿基序列測(cè)定。多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)序之后，將中間片段、5’端序列、3’端序列拼接，我們確定了該基因的全長(zhǎng)cDNA序列，如SEQ ID NO. I所示。實(shí)施例2
青石斑魚BAFF重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化鑒定；
根據(jù)已知的BAFF序列設(shè)計(jì)引物Eas-F、Eas-R。其中Eas-F的5’端具有/酶切位點(diǎn)，Eas-R的5’端具有歷fli////酶切位點(diǎn)，以青石斑魚第一鏈cDNA為模版，Eas-F, Eas-R為引物(Eas-F 5，-GGAATTCCATATGTTGGTCTCTGGATCAGAAA CA-3，(SEQ ID NO. 12) ,Eas-R 5，-CCCAAGCTTTTAAGCCAGCTTGACAGCA-3’ (SEQ ID NO. 13) )，PCR 擴(kuò)增該基因功能區(qū)(IOXpfuBuffer 5 μ I, dNTP (2.5 mM) 4 μ I, Eas-F(10 μ mol/L) 2 μ I, Eas-R(10 μ mol/L) 2μ IjH2O 33. 5 μ l,cDNA 3 μ l，pfu Taq O. 5 μ I)反應(yīng)條件如下94 ° C 5 min, (94 ° C30 s，55。C 30 s，72。Cl min)，30 個(gè)循環(huán)，最后 72。C 延伸 7 min，之后將 PCR 產(chǎn)物割膠回收，回收產(chǎn)物和pET28a載體用Λ汝/和HindIII酶切，Τ4 DNA Ligase連接，得到圖I所示的重組質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5a中，獲得含pET28a_EasBAFF重組菌株。挑選陽性重組菌株測(cè)序，測(cè)序正確的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)提取pET28a-EasBAFF重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，挑選陽性菌株誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過多次預(yù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)IPTG濃度為O. 2 mM,誘導(dǎo)溫度16 °C，轉(zhuǎn)速130 rpm誘導(dǎo)22 h，有較多的目的蛋白以可溶形式表達(dá)。4 °C,8000 rpm離心收菌，冰上超聲破碎(160W，工作4 S，暫停8 S，共120次)表達(dá)菌體，4 °C, 12, 500 Xg, 20 min離心超聲破碎液后，棄沉淀，上清過 Ni+-NTA 柱。簡(jiǎn)要過程是Binding Buffer(20 mmol/L Imidazole, O. 5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris HCl，pH 8. 0)平衡Ni+-NTA柱后，將含有可溶性重組蛋白的上清 mmol/L Tris HCl，pH 8. 0)洗去雜蛋白，再用不同濃度的咪唑Tis HCl洗脫，目的蛋白主要在洗脫濃度為 250 mmol /T, Imidazole, 0. 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl’pH 8.0洗脫下來。分管收集洗脫目的蛋白，20 mmol/L Tris HCl透析過夜除鹽。SDS-PAGE檢測(cè)各收集管蛋白純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。如圖2 (條帶3)所示，表達(dá)得到的目的蛋白經(jīng)Ni+-NTA柱純化得到純度達(dá)95%的目的蛋白。Western 印記分析
Western-blot中所用一抗為鼠抗His6單抗，二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG。其簡(jiǎn)要步驟是將樣品先進(jìn)行SGS-PAGE，以浸入式法將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，用記號(hào)筆標(biāo)記蛋白marker各條帶，然后依次經(jīng)5 %脫脂奶粉室溫封閉I h，與一抗孵育I h，與HRP標(biāo)記的二抗IgG孵育I h，每步完成后均嚴(yán)格洗膜，最后加TMB避光顯色。結(jié)果如圖2 (條帶4)所示在目的蛋白位置出現(xiàn)了特異性條帶。將獲得的目的蛋白分裝后保存于-70 °C。實(shí)施例3
His6-EasBAFF對(duì)青石斑魚淋巴細(xì)胞和小鼠B淋巴細(xì)胞的促存活作用；淋巴細(xì)胞分離液(BD Pharmingen, USA)分離青石斑魚淋巴細(xì)胞，磁珠(MiltenyiBiotech)分離小鼠B淋巴細(xì)胞。將分離得到的小鼠B細(xì)胞和青石斑魚淋巴細(xì)胞分別用RPMI1640 (10 %FCS, 100U/ml Penicillin/streptomycin)培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 5X IO6 個(gè) /ml，在96孔板中每孔加入200 μ I細(xì)胞懸液，置于37 V (石斑魚淋巴細(xì)胞置于25 °C)、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中適應(yīng)3-4小時(shí)。分組依次加入重組蛋白His6-EasBAFF,重組蛋白的終濃度依次是2、4、6、8、10、12 μ g/ml,以PBS、小鼠BAFF蛋白(msBAFF)作為對(duì)照。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后，向96孔板中每孔加入20 μ I的WST-8孵育I. 5小時(shí)。用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處吸光值。結(jié)果顯示His6-EasBAFF能夠明顯促進(jìn)體外青石斑魚淋巴細(xì)胞和小鼠B淋巴細(xì)胞的存活。結(jié)果如圖3、圖4所示。 實(shí)施例4
將實(shí)施例I獲得的青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA通過現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組青石斑魚BAFF蛋白，作為魚類免疫增強(qiáng)劑。在養(yǎng)殖中應(yīng)用。按照本發(fā)明的方法可以通過現(xiàn)有基因工程技術(shù)，修飾青石斑魚BAFF基因并用于所述研究和生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子基因cDNA，其特征在于，它的序列如SEQID NO. I所/Jn ο
2.—種權(quán)利要求I所述青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子基因cDNA的克隆方法，其特征在于包括以下步驟 (1)提取青石斑魚脾臟組織總RNA，轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA； (2)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因的中間片段 正義寡核苷酸引物Ea-M-F :5’ - TCAGAGGTGTGTCGCAGGAGA -3’ 反義寡核苷酸引物Ea-M-R:5’ - TCCTGTGAAGCAGGTGTTGTA -3’ (3)根據(jù)中間片段序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因的3’端 3’ 端正義寡核苷酸外引物GSP-U3’ 5’ -GATGCGTTGACCCTGACAAGGAATA GAAGG-3’ 3’ 端正義寡核苷酸內(nèi)引物GSP-N3’ 5’ -GGCAGGCTGGGCTGAGGAGAGGCT CT-3’ 3’ 端反義寡核苷酸引物UPM 5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3， (4)根據(jù)中間片段序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因的5’端 5’ 端正義寡核苷酸引物UPM 5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3， 5’ 端反義寡核苷酸外引物GSP-U5’ 5’ -AGGGGATACCTGTGTGTGGCTCCGACT T-3’ 5’ 端反義寡核苷酸內(nèi)引物GSP-N5’ 5’ -GAGTCCCAGGTTGGTGCAGAGGCTCTT-3’ (5)將上述引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆入PMD-19T載體，并進(jìn)行測(cè)序堿基序列測(cè)定；得到了青石斑魚BAFF基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
3.—種重組表達(dá)載體pET28-EasBAFF的構(gòu)建方法，其特征在于是根據(jù)權(quán)利要求I所述青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA序列設(shè)計(jì)引物Eas-F、Eas-R,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID NO. 3所示的青石斑魚BAFF基因胞外功能區(qū)，將PCR產(chǎn)物割膠回收，回收產(chǎn)物和pET28a載體用和歷酶切，Τ4 DNA Ligase連接酶切后的載體和PCR產(chǎn)物，得到pET28-EasBAFF ;所述引物 Eas-F、Eas-R 序列分別如 SEQ ID NO. 12 和 SEQ ID NO. 13 所示。
4.一種權(quán)利要求I所述青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA的重組應(yīng)用，是通過基因工程方法，生產(chǎn)重組His6-EasBAFF蛋白，作為魚類免疫增強(qiáng)劑或相關(guān)疾病的免疫佐劑。
全文摘要
青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)基因與蛋白制備技術(shù)，涉及青石斑魚BAFF基因克隆、表達(dá)、蛋白純化及活性鑒定技術(shù)。通過RT-PCR和RACE技術(shù)我們得到了青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子的全長(zhǎng)cDNA。它具有SEQIDNO.1所示的序列，該基因CDS開放閱讀框碥碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。將胞外功能區(qū)可溶段連接到pET28a原核質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，Ni+-NTA柱純化后得到的重組蛋白His6-EasBAFF，實(shí)驗(yàn)證明該融合蛋白能夠明顯促進(jìn)青石斑魚淋巴細(xì)胞以及小鼠B淋巴細(xì)胞的存活。
文檔編號(hào)C07K14/525GK102816771SQ20121033268
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者張雙全, 田愛英 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)