雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系酸堿性置換的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，該微反應(yīng)器以陽(yáng)離子交換材料和陰離子交換材料作為固定相，將兩種固定相順序填充于同一容器內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)樣品原位捕集、pH置換、還原、烷基化、酶解的樣品預(yù)處理過(guò)程。該裝置具有回收率高、簡(jiǎn)單、高效、快速等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，可實(shí)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)原位富集、pH置換、還原、烷基化、酶解的樣品預(yù)處理過(guò)程，并且與分離、檢測(cè)系統(tǒng)聯(lián)用，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)膜蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的分離、鑒定。 【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞膜是細(xì)胞對(duì)外界的屏障和細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的樞紐，它將細(xì)胞與周圍環(huán)境隔離開(kāi)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組對(duì)執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換、細(xì)胞識(shí)別與免疫應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控以及能量傳遞等功能起著重要作用。真核生物中1/3的蛋白均整合在膜上。膜蛋白質(zhì)在藥物研究中也起著相當(dāng)重要的作用，在已知的和正在研究的藥物靶標(biāo)中大約有70%為膜蛋白質(zhì)。然而，由于膜蛋白質(zhì)疏水性強(qiáng),導(dǎo)致其溶解性和酶解效率較差，對(duì)目前通用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。
[0003]甲酸是一種很好的膜蛋白質(zhì)增溶劑，后續(xù)的酶解通常采用化學(xué)裂解劑溴化氰或酸性胃蛋白酶。然而，溴化氰是一種劇毒試劑，且只能在甲硫氨酸處裂解，產(chǎn)生的肽段較大，不利于質(zhì)譜檢測(cè)。胃蛋白酶是一種非特異性的蛋白質(zhì)水解酶，因此在質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索時(shí)，產(chǎn)生的理論酶切肽段列表太大,對(duì)用于數(shù)據(jù)檢索的服務(wù)器要求高,數(shù)據(jù)檢索時(shí)間過(guò)長(zhǎng),數(shù)據(jù)檢索的假陽(yáng)性率高，嚴(yán)重地影響了膜蛋白質(zhì)的鑒定。胰蛋白酶專一性強(qiáng)，酶切后得到的肽片段大小適中，分子質(zhì)量在500-3000Da之間，非常適合質(zhì)譜的檢測(cè)范圍，是蛋白質(zhì)鑒定中應(yīng)用最多的蛋白水解酶。因此，將甲酸的強(qiáng)溶解能力和胰蛋白酶的特異性酶切相結(jié)合，對(duì)于膜蛋白質(zhì)分析有著重要意義。
[0004]目前，有文獻(xiàn)通過(guò)將甲酸溶解后的膜蛋白質(zhì)溶液，用碳酸氫銨調(diào)節(jié)pH至pH=8后，進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)的酶解(Cruz, S.D., Xenarios, 1., Langridge, J., Vilbois, F., Parone,P.A.，Martinou, J.C.，J.Biol.Chem.2003，42，41566 41571.)。這種方法的問(wèn)題在于:一、操作不方便；二、膜蛋白質(zhì)的濃度被嚴(yán)重稀釋；三、酸、堿性置換過(guò)程易造成膜蛋白質(zhì)的再次析出；四、離心管內(nèi)進(jìn)行操作，內(nèi)壁吸附損失較大；五、無(wú)法實(shí)現(xiàn)在線分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器(圖1)，通過(guò)該微反應(yīng)器富集膜蛋白質(zhì)樣品，在不稀釋樣品的前提下，便捷、高回收率、原位地實(shí)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)樣品所處環(huán)境酸、堿性的置換，確保酸性條件下溶解和堿性條件下酶解的兼容(圖
2)。此外，該樣品預(yù)處理過(guò)程均在毛細(xì)管柱原位進(jìn)行，可實(shí)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理的在線、自動(dòng)化操作。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器:
[0008]包括中空的容器，于中空的容器內(nèi)順次填充陰離子交換材料、陽(yáng)離子交換材料、或順次填充陽(yáng)離子交換材料、陰離子交換材料，于中空的容器內(nèi)部空腔的一端或兩端設(shè)置有柱塞；所述中空的容器為圓柱、圓錐或圓盤形容器，中空容器的內(nèi)部空腔徑向橫截面直徑為50u m_5cm0
[0009]容器為:20-1000 ill移液器槍頭，l-20ml固相萃取(SPE)管，l_20ml注射器針管，50-500 u m內(nèi)徑毛細(xì)管或注射器濾膜腔體。
[0010]柱塞是在微反應(yīng)器內(nèi)原位合成的整體柱柱塞或孔徑為3nm-20 u m的篩板。
[0011]同一容器內(nèi)包含陰離子交換材料、陽(yáng)離子交換材料；
[0012]陽(yáng)離子交換材料為含有磺酸基團(tuán)和/或磷酸基團(tuán)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料、或含有羧基基團(tuán)的弱陽(yáng)離子交換材料；陰離子交換材料為含有季銨基團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換材料、或含有仲胺和/或叔胺基團(tuán)的弱陰離子交換材料；材料可以是顆粒材料或者整體材料。
[0013]陽(yáng)、陰離子交換材料的搭配可以是:強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料和強(qiáng)陰離子材料；強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料和弱陰離子交換材料；弱陽(yáng)離子交換材料和強(qiáng)陰離子交換材料；弱陽(yáng)離子交換材料和弱陰離子交換材料。
[0014]所述雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的應(yīng)用:
[0015]1)在帶有柱塞的橫截面直徑為50μm_5cm的圓柱、圓錐或圓盤形容器內(nèi)順次填充陰、陽(yáng)離子交換材料或陽(yáng)、陰離子交換材料；
[0016]2)采用pH為1-7的酸性溶液或pH為大于7-14的溶有質(zhì)量或體積濃度為I % -30%的表面活性劑或去垢劑的堿性溶液溶解膜蛋白質(zhì)樣品，將樣品溶液通過(guò)微反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)的原位捕集；
[0017]3)然后，通入pH為大于7-14的堿性溶液或pH為1_7的酸性溶液進(jìn)行微反應(yīng)器內(nèi)溶液體系的PH值的置換；
[0018]4)之后，用還原劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原，隨后用烷基化試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基化處理，最后在PH為大于7-14的堿性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解或pH為1-7的酸性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解；
[0019]5)酶解完成后，用200-2000mM的鹽溶液將膜蛋白質(zhì)的酶解肽段從微反應(yīng)器上洗脫下來(lái)，收集洗脫液，用液相色譜法分離，質(zhì)譜、紫外或熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。
[0020]pH為1-7的酸性溶液可為甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；
[0021]表面活性劑為十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton X-100、chaps、Rapigest SF、或NP-40d ;去垢劑可為尿素、硫脲、或鹽酸胍；
[0022]pH為大于7-14的堿性溶液可為碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液；
[0023]溶解蛋白質(zhì)的溶劑可以是pH為1-7的酸性溶劑，也可以是pH為大于7-14的堿性溶劑；
[0024]如果是酸性條件下捕集，則填裝順序?yàn)?載流液流入端為陽(yáng)離子交換材料，載流液流出端為陰離子交換材料；
[0025]如果是堿性條件下捕集，則填裝順序?yàn)?載流液流入端為陰離子交換材料，載流液流出端為陽(yáng)離子交換材料。
[0026]若在酸性條件下捕集，則用pH為大于7-14的堿性溶液置換pH值，溶液濃度范圍在1-1OOmM之間；
[0027]若在堿性條件下捕集，則用pH為1-7的酸性溶液置換pH值，溶液濃度范圍在1-1OOmM 之間。
[0028]還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)或(6-巰基乙醇；濃度為1-200mM。
[0029]烷基化試劑為碘代乙酸或碘乙酰胺；濃度為l_200mM ；
[0030]pH為大于7-14的堿性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解選擇胰蛋白酶、內(nèi)肽酶Arg-C、內(nèi)肽酶lys-C、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶中的一種或幾種；用量為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量的1/100-1/10 ；
[0031]pH為1-7的酸性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解選擇胃蛋白酶或溴化氰試劑；用量為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量的1/100-1/10。鹽溶液為碳酸氫銨溶液、氯化鈉溶液、乙酸銨溶液、磷酸鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液。
[0032]膜蛋白質(zhì)捕集于微反應(yīng)器后，后續(xù)的膜蛋白質(zhì)的還原、烷基化、酶解過(guò)程均在微反應(yīng)器內(nèi)原位進(jìn)行。
[0033]1、雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的構(gòu)建:在一根毛細(xì)管中，原位合成整體材料作為柱塞，然后順次填裝強(qiáng)陰離子交換材料和強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料作為微反應(yīng)器的固定相。
[0034]2、酸、堿性的置換:膜蛋白質(zhì)樣品溶解于甲酸溶液，并捕集于雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器后，通入l_50 mM碳酸氫銨緩沖液,可便捷、高回收率地將微反應(yīng)器溶液體系置換為堿性環(huán)境，從而有利于后續(xù)膜蛋白質(zhì)的還原、烷基化及酶解過(guò)程。反應(yīng)體系酸、堿性置換過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，同時(shí)可保持樣品的高回收率。
[0035]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0036]1.雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的制備簡(jiǎn)單。在同一容器中，順序填裝保留機(jī)理具有正交性質(zhì)的兩種離子交換填料或原位順序合成保留機(jī)理具有正交性質(zhì)的離子交換整體材料，即可制得雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器。
[0037]2.操作方便、快捷。利用在同一容器內(nèi)填裝保留機(jī)理具有正交性質(zhì)的兩種離子交換材料，通入相應(yīng)PH值的緩沖液，即可方便、高回收率地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)樣品溶解酸、堿性和蛋白質(zhì)樣品處理所需堿、酸性間的置換，并且用PH試紙即可檢測(cè)置換過(guò)程中pH的狀態(tài)。
[0038]3.高回收率。采用兩種保留機(jī)理正交的離子交換材料，可保證膜蛋白質(zhì)樣品在pH置換過(guò)程中，很好地保留在微反應(yīng)器中。從而，避免PH值置換過(guò)程中，因膜蛋白質(zhì)保留行為的變化造成的損失(圖3)。此外，整個(gè)樣品預(yù)處理過(guò)程均在微反應(yīng)器內(nèi)原位進(jìn)行，避免了轉(zhuǎn)移、試管內(nèi)壁吸附等造成的損失，回收率高(圖4)。
[0039]4.利用雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，在膜蛋白質(zhì)樣品無(wú)需稀釋的情況下，實(shí)現(xiàn)了膜蛋白質(zhì)的甲酸溶解和胰蛋白酶酶切兩種策略的兼容。本發(fā)明使用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲酸溶解膜蛋白質(zhì)，稀釋至甲酸濃度至1%后，將膜蛋白質(zhì)樣品捕集于雙相柱上，通入碳酸氫銨緩沖液，將PH值置換到7-8，滿足后續(xù)膜蛋白質(zhì)的還原、烷基化及胰蛋白酶酶切過(guò)程所需緩沖條件。
[0040]5.樣品預(yù)處理時(shí)間短。本發(fā)明基于微反應(yīng)器的原位樣品預(yù)處理，無(wú)需其他的轉(zhuǎn)移、凍干等過(guò)程，整個(gè)樣品預(yù)處理時(shí)間可控制在2-4小時(shí)內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041]圖1為雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器示意圖。1:載流液流出端；2:親水性柱塞；3 --強(qiáng)陰離子交換填料；4:強(qiáng)陽(yáng)離子交換填料；5:載流液流入端；
[0042]圖2為雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的樣品預(yù)處理流程圖。7:膜蛋白質(zhì)樣品；8:甲酸溶解膜蛋白質(zhì)樣品；9:置換pH值于7-8，并完成還原、烷基化及蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶解過(guò)程。
[0043]圖3為SDS-PAGE評(píng)價(jià)雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，酸性上樣、置換pH至堿性過(guò)程中的樣品保留情況。以酸性、中性、堿性蛋白質(zhì)BSA、Myo, CytC的混合物作為樣品。條帶1:Marker ;條帶 2:BSA、Myo、Cyt C 三個(gè)蛋白質(zhì);
[0044]條帶3:雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的上樣流出液；條帶4:SCX微反應(yīng)器的上樣流出液；條帶5:雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器pH置換的流出液；條帶6 =SCX微反應(yīng)器pH置換的流出液。
[0045]圖4用反相捕集柱除鹽的峰面積評(píng)價(jià)微反應(yīng)器樣品預(yù)處理的回收率。A:自由溶液酶解等濃度的BSA、Myo, Cyt C蛋白溶液，酶解產(chǎn)物的反相除鹽峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B:4y g等濃度BSA、Myo、Cyt C蛋白用甲酸溶解，經(jīng)雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器樣品預(yù)處理后，所得酶解產(chǎn)物的回收率。
【具體實(shí)施方式】
[0046]1.雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的制備:按圖1所示，在200iim 1.d.毛細(xì)管中，原位合成親水性整體柱塞2，步驟如下:(I)毛細(xì)管預(yù)處理。將毛細(xì)管分別用濃度為IM的氫氧化鈉溶液、水、濃度為IM的鹽酸溶液、水、甲醇沖洗，然后70°C下氮?dú)獯蹈?；然?將Y-MAPS(Y-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷)的無(wú)水甲醇溶液(體積比1:1)灌入毛細(xì)管內(nèi)，用硅膠將兩端密封后，在室溫下靜置反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用無(wú)水甲醇將毛細(xì)管內(nèi)殘留的Y-MAPS沖洗干凈，室溫下氮?dú)獯蹈伞?2)親水性柱塞的制備。稱取PEGDA (聚乙二醇二丙烯酸酯)0.1500g, AIBN (偶`氮二異丁氰)0.0015g，正丙醇0.3500g，混勻得到聚合溶液，吹氮?dú)?0s，以除去其中的氧氣，將預(yù)處理過(guò)的毛細(xì)管一端浸入聚合溶液中，聚合溶液通過(guò)毛細(xì)虹吸作用吸入預(yù)處理過(guò)的毛細(xì)管中約5cm后，用硅膠將兩端密封，放入水浴鍋中50°C反應(yīng)24小時(shí)。柱塞合成后，順序填裝2厘米的強(qiáng)陰離子交換填料3 (日本東曹達(dá)，TSK-GELSuperQ-5PW，10iim，1000 A)和2厘米的強(qiáng)陽(yáng)離子交換填料4 (日本東曹達(dá)，TSK-GELSP-5Pff,lOum,1000 A)0
[0047]2.評(píng)價(jià)雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的樣品預(yù)處理的效率:以酸、中、堿性三種標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA、Myo、Cyt C的混合物作為樣品。用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲酸溶液等質(zhì)量濃度溶解，90°C下熱變性IOmin后，將上述溶液稀釋至甲酸濃度為1% (體積分?jǐn)?shù))，以滿足強(qiáng)陽(yáng)離子交換填料的解離條件。隨后，將蛋白質(zhì)樣品捕集于微反應(yīng)器，用5mM碳酸氫銨緩沖液置換pH值于7.5。繼而，通入IOOmM 二硫蘇糖醇(DTT)溶液，在室溫下反應(yīng)30min進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原處理后，通入IOmM碘乙酰胺(IAA)溶液，室溫下避光反應(yīng)30min后進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基化處理。最后，通入2mg/mL的胰蛋白酶的5mM碳酸氫銨溶液,液封住毛細(xì)管兩端,37°C酶解1_2小時(shí)。酶解結(jié)束后，將微反應(yīng)器用二通與反相分離柱(內(nèi)徑75 ii m 1.d.,長(zhǎng)17cm,含2cm的噴針，填料為美國(guó)菲羅門，Luna C18(2),5um, 100人)串連，與質(zhì)譜聯(lián)用，對(duì)酶解肽段進(jìn)行一維液相分離、質(zhì)譜鑒定。
[0048]作為對(duì)照組，我們用常規(guī)自由溶液酶解的方法對(duì)上述樣品(等質(zhì)量BSA、Myo、Cyt C的混合物)進(jìn)行樣品預(yù)處理。首先，用ImL碳酸氫銨緩沖液(50mM，pH 8)溶解Img BSA,Myo,Cyt C的混合物(三種蛋白按等質(zhì)量比混合),90°C下熱變性IOmin后,加入IOmM 二硫蘇糖醇(DTT )溶液，56 °C下，反應(yīng)2h進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原處理。隨后，通入25mM碘乙酰胺(IAA)溶液，室溫下避光反應(yīng)30min進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基化處理。最后，加入25ug的胰蛋白酶(溶于50mM碳酸氫銨溶液，pH 8)進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解。37°C酶解12小時(shí)后，加入終體積為I %的甲酸溶液終止酶解。
[0049]從雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器和自由溶液的樣品預(yù)處理結(jié)果看，采用以上兩種策略，蛋白質(zhì)的還原、烷基化效率(表1)及酶解效率(表2 )都是相當(dāng)?shù)摹?br> [0050]3.基于雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的鼠腦膜蛋白質(zhì)樣品的分析:用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲酸溶解鼠腦膜蛋白質(zhì)樣品，90°C下熱變性IOmin后，將上述溶液稀釋至甲酸濃度為1% (體積分?jǐn)?shù))，以滿足強(qiáng)陽(yáng)離子交換填料的解離條件。隨后，將膜蛋白質(zhì)樣品捕集于微反應(yīng)器，用5mM碳酸氫銨緩沖液置換pH值于7.5，通入IOOmM DTT溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原處理，在室溫下反應(yīng)30min后，通入IOmM IAA溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基化處理，室溫下避光反應(yīng)30min。隨后，通入2mg/mL的胰蛋白酶的5mM碳酸氫銨溶液，液封住毛細(xì)管兩端，37°C酶解2h。酶解結(jié)束后，將微反應(yīng)器用二通與強(qiáng)陽(yáng)離子交換捕集柱和反相分離柱(內(nèi)徑75 y m
1.d.，長(zhǎng)17cm，含2cm的噴針，填料為美國(guó)菲羅門，Luna C18(2),5um, 100人)串連，并與質(zhì)譜聯(lián)用，對(duì)鼠腦膜蛋白質(zhì)的酶解肽段進(jìn)行二維液相分離、質(zhì)譜鑒定。
[0051]4.數(shù)據(jù)分析:對(duì)采集的譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和數(shù)據(jù)分析。從結(jié)果看，鑒定到975個(gè)蛋白group,對(duì)應(yīng)于3841條非冗余肽段。其中，416個(gè)膜蛋白質(zhì),其比例占鑒定到的總蛋白質(zhì)的43%。此外， 鑒定到103條跨膜肽段。
[0052]表1BSA的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器較自由溶液的還原、烷基化結(jié)果
[0053]
【權(quán)利要求】
1.雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于: 包括中空的容器，于中空的容器內(nèi)順次填充陰離子交換材料、陽(yáng)離子交換材料、或順次填充陽(yáng)離子交換材料、陰離子交換材料，于中空的容器內(nèi)部空腔的一端或兩端設(shè)置有柱塞；所述中空的容器為圓柱、圓錐或圓盤形容器，中空容器的內(nèi)部空腔徑向橫截面直徑為50u m_5cm0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于:容器為:20-1000Ul移液器槍頭，l-20ml固相萃取(SPE)管，l-20ml注射器針管，50-500 u m內(nèi)徑毛細(xì)管或注射器濾膜腔體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于:柱塞是在微反應(yīng)器內(nèi)原位合成的整體柱柱塞或孔徑為3nm-20 u m的篩板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于:同一容器內(nèi)包含陰離子交換材料、陽(yáng)離子交換材料； 陽(yáng)離子交換材料為含有磺酸基團(tuán)和/或磷酸基團(tuán)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料、或含有羧基基團(tuán)的弱陽(yáng)離子交換材料；陰離子交換材料為含有季銨基團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換材料、或含有仲胺和/或叔胺基團(tuán)的弱陰離子交換材料；材料可以是顆粒材料或者整體材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器，其特征在于:陽(yáng)、陰離子交換材料的搭配可以是:強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料和強(qiáng)陰離子材料；強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料和弱陰離子交換材料；弱陽(yáng)離子交換材料和強(qiáng)陰離子交換材料；弱陽(yáng)離子交換材料和弱陰離子交換材料。
6.一種權(quán)利要求1所述雙相柱膜蛋白質(zhì)微反應(yīng)器的應(yīng)用，其特征在于:` 1)在帶有柱塞的橫截面直徑為SOym-Scm的圓柱、圓錐或圓盤形容器內(nèi)順次填充陰、陽(yáng)離子交換材料或陽(yáng)、陰離子交換材料； 2)采用pH為1-7的酸性溶液或pH為大于7-14的溶有質(zhì)量或體積濃度為I% -30%的表面活性劑或去垢劑的堿性溶液溶解膜蛋白質(zhì)樣品，將樣品溶液通過(guò)微反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)的原位捕集； 3)然后，通入pH為大于7-14的堿性溶液或pH為1-7的酸性溶液進(jìn)行微反應(yīng)器內(nèi)溶液體系的pH值的置換； 4)之后，用還原劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的還原，隨后用烷基化試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基化處理，最后在pH為大于7-14的堿性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解或pH為1-7的酸性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解； 5)酶解完成后，用200-2000mM的鹽溶液將膜蛋白質(zhì)的酶解肽段從微反應(yīng)器上洗脫下來(lái)，收集洗脫液，用液相色譜法分離，質(zhì)譜、紫外或熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:pH為1-7的酸性溶液可為甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液； 表面活性劑為十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton X-100、chaps、Rapigest SF、或NP-40d ;去垢劑可為尿素、硫脲、或鹽酸胍； PH為大于7-14的堿性溶液可為碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液； 溶解蛋白質(zhì)的溶劑可以是PH為1-7的酸性溶劑，也可以是pH為大于7-14的堿性溶劑； 如果是酸性條件下捕集，則填裝順序?yàn)?載流液流入端為陽(yáng)離子交換材料，載流液流出端為陰離子交換材料； 如果是堿性條件下捕集，則填裝順序?yàn)?載流液流入端為陰離子交換材料，載流液流出端為陽(yáng)離子交換材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:若在酸性條件下捕集，則用pH為大于7-14的堿性溶液置換pH值，溶液濃度范圍在1-1OOmM之間； 若在堿性條件下捕集，則用PH為1-7的酸性溶液置換pH值，溶液濃度范圍在1-1OOmM之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于: 還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)或(6-巰基乙醇；濃度為l-200mM; 烷基化試劑為碘代乙酸或碘乙酰胺；濃度為l-200mM ； pH為大于7-14的堿性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解選擇胰蛋白酶、內(nèi)肽酶Arg-C、內(nèi)肽酶lys-C、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶中的一種或幾種；用量為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量的1/100-1/10 ； PH為1-7的酸性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的酶解選擇胃蛋白酶或溴化氰試劑；用量為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量的1/100-1/10 ;鹽溶液為碳酸氫銨溶液、氯化鈉溶液、乙酸銨溶液、磷酸鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:膜蛋白質(zhì)捕集于微反應(yīng)器后，后續(xù)的膜蛋白質(zhì)的還原、烷基化、酶解過(guò)程均在微反應(yīng)器內(nèi)原位進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK103665098SQ201210349969
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月20日
【發(fā)明者】張麗華, 趙群, 楊開(kāi)廣, 梁玉, 梁振, 張玉奎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所