專利名稱：莫匹羅星的一種純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種莫匹羅星純化的方法。
背景技術(shù)：
莫匹羅星又名假單抱菌酸A (pseudomonic acid A)、bactroban、BRL4910A,是一種天然產(chǎn)生的廣譜抗生素，由熒光假單孢菌浸沒發(fā)酵后產(chǎn)生，在結(jié)構(gòu)上較特殊，與其他抗生素無關(guān)聯(lián)。由熒光假單孢菌產(chǎn)生的這類物質(zhì)包括有假單孢菌酸A、B、C、D。假單孢菌A為其主要活性部分，占90-95%。莫匹羅星為細菌中異亮氯酰t-RNA合成酶的競爭抑制劑，抑制蛋白質(zhì)合成，其作用部位為細胞壁上的異亮氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸酶，使異亮氨酸和轉(zhuǎn)移核糖核酸不能形成異亮氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸，因而不能將異亮氨酸運至核糖體而轉(zhuǎn)入增長的蛋白鏈 中，致使蛋白合成停止。它能在皮膚表層達到并保持很高的藥物濃度，不易產(chǎn)生抗藥性，低濃度時有抑菌作用，高濃度時有殺菌作用。對革蘭陽性球菌有很強的抗菌活性，對某些革蘭陰性菌也有抗菌作用，對多種耐抗生素的菌株幾乎都敏感，與其他抗生素無交叉耐藥性。以莫匹羅星為原料生產(chǎn)獲得的藥劑作為一種新型的唯一專供局部應(yīng)用的抗生素，1985年起己在國外正式生產(chǎn)，對一些常見的皮膚細菌感染性疾病具有良好的療效，適用于各種細菌性皮膚感染，主要用于革蘭陽性球菌引起的皮膚軟組織感染，如膿皰瘡、癤毛囊炎等原發(fā)性感染以及濕疹、皮炎、潰瘍、外傷等皮膚病的繼發(fā)性感染。莫匹羅星由于與其他抗生素無交叉耐藥性而備受青睞，全球?qū)δチ_星的需求量極大，目前國內(nèi)外市場需求量大約為13噸左右，并會隨著時間的推移而繼續(xù)增加，因此對莫匹羅星原料藥的開發(fā)具有極為廣闊的市場前景。但由于其生產(chǎn)難度較高，許多年來國際市場上莫匹羅星原料均由史克公司獨家生產(chǎn)。目前，由莫匹羅星生產(chǎn)的中美史克“百多邦”軟膏已轉(zhuǎn)換為非處方藥物在市場上發(fā)售，其進一步拉動了莫匹羅星的需求量。美國專利(4222942)涉及一種分離莫匹羅星的方法，其通過在具有水介質(zhì)的與水不混溶的有機溶劑中萃取粗品莫匹羅星制劑的溶液，降低所述水溶液的PH，并用極性水不相溶的有機溶劑萃取該溶液，此后加入充分非極性的稀釋劑以降低所述極性有機溶劑的極性，但是該稀釋劑與所述極性有機溶劑是可混溶的，以便影響莫匹羅星的結(jié)晶。該專利涉及步驟多，產(chǎn)品收率低，溶劑使用量大，成本高。美國專利(6254921)公開了一種分離莫匹羅星的方法，其包括使用氯化脂肪烴或醋酸異丁酯萃取酸化的培養(yǎng)基，這樣可以獲得含有莫匹羅星的萃取物，并通過水相與有機相之間萃取物的分配從所述萃取物中提純莫匹羅星，所述有機相含有至少一種有機溶劑和蒸發(fā)用的有機溶劑。該專利有機溶劑的使用量大，產(chǎn)品純度低。丹麥阿爾法馬股份有限公司申請的專利(申請?zhí)?00680005554. 4)公開了一種莫匹羅星的提純方法，其包括引發(fā)或使得莫匹羅星從其水溶液中沉淀；回收沉淀物；將回收的沉淀物溶解在有機溶劑中。該專利產(chǎn)物收率低，同時產(chǎn)品純度不高。上述方法存在提取步驟多、有機溶劑使用量大、產(chǎn)品收率低、純度不高等不足，難以滿足莫匹羅星產(chǎn)業(yè)化推廣的需要。
在此背景下，本發(fā)明利用莫匹羅星的結(jié)構(gòu)特點，采用復(fù)合溶劑提取及調(diào)節(jié)pH值去除發(fā)酵液中的小分子，通過納濾、離子交換、柱層析及重結(jié)晶，完成莫匹羅星的純化，為我國莫匹羅星生產(chǎn)技術(shù)的改進，產(chǎn)業(yè)水平的提高提供一定的技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出莫匹羅星的一種純化方法，可有效提高莫匹羅星產(chǎn)品的提取率和產(chǎn)品純度，降低生產(chǎn)成本。莫匹羅星的一種純化方法，主要通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)(I)發(fā)酵液酸化處理莫匹羅星發(fā)酵液內(nèi)加入乙酸或鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至3. 0-6. 5之間。(2)有機溶劑抽提酸化處理的發(fā)酵液離心去除上清液，沉淀部分加入2倍體積的甲醇，攪拌均勻后浸泡4h,抽濾后留濾液備用。⑶納濾濃縮有機溶劑抽濾獲得濾液進行納濾濃縮，操作參數(shù)為納濾膜的截流分子量為500-600，進口及出口溫度均為常溫，進料速度I. O I. 5L/h，操作壓力O. I IMPa，濾液備用。
(4)離子交換將聚苯乙烯二乙烯苯磺酸鹽DOW[XFS. 43278. 002]強酸鈉型樹脂加入納濾濃縮液中，室溫攪拌6-8h，去離子水沖洗樹脂，后用ρΗΙΟ. 0-11. O的氫氧化鈉溶液解吸，收集解吸
液，備用。(5)納濾濃縮離子交換獲得解吸液進行納濾濃縮，操作參數(shù)為納濾膜的截流分子量為500-600，進口及出口溫度均為常溫，進料速度I. O I. 5L/h，操作壓力O. I IMPa，濾液備用。(6)結(jié)晶將經(jīng)離子交換處理的解析液經(jīng)納濾濃縮至40% -50%后，加入4-5倍體積的甲醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得莫匹羅星晶體，備用。(7)柱層析將獲得莫匹羅星晶體溶解后與少量硅膠混合后揮干后上硅膠柱，依次用丙酮、甲醇水體積比為I : I I : I. 5(V/V)、甲醇HCl (O. 2M)體積比為I : O. 5 I : I. 5的洗脫劑洗脫硅膠柱，得到莫匹羅星三組分的混合物，后以甲酸銨(4g/L)甲醇的混合液為流動相，進行柱層析，混合流動相內(nèi)酸銨(4g/L)甲醇的體積比為I : 3 I : 5，收集洗脫液，備用。(8)納濾濃縮柱層析獲得洗脫液進行納濾濃縮，操作參數(shù)為納濾膜的截流分子量為500-600，進口及出口溫度均為常溫，進料速度I. O I. 5L/h，操作壓力O. I IMPa，濾液濃縮，精濾去除雜質(zhì)后，干燥，獲得莫匹羅星純品。到目前為止，發(fā)酵法是莫匹羅星實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)唯一可行的方法。但發(fā)酵液過濾產(chǎn)生的濾液、樹脂脫色提純后得到的解析液中產(chǎn)物的濃度很低，現(xiàn)有工藝通常都采用溶劑萃取、薄膜蒸發(fā)、減壓蒸餾等工藝進行純化、濃縮。本成果采用納濾膜對發(fā)酵濾液、離子交換及柱層析得到的解析液進行濃縮，可大大節(jié)省能源消耗，降低生產(chǎn)成本。同時，由于納濾膜濃縮技術(shù)操作在常溫下進行，對莫匹羅星無破壞作用，無二次污染，大大提高了產(chǎn)品的收率及產(chǎn)品的質(zhì)量，本發(fā)明主要先進性表現(xiàn)在以下幾點(I)利用莫匹羅星的結(jié)構(gòu)特點，先用復(fù)合溶劑提取，后通過改變?nèi)芤簆H值，使莫匹羅星變成溶于水的鈉鹽，進入水相，使小分子得以去除。(2)進一步采用超濾技術(shù)，去除色素、蛋白和多糖等雜質(zhì)，后調(diào)節(jié)溶液pH值，進行反萃取，最后通過柱層析純化和重結(jié)晶得到高純度的莫匹羅星產(chǎn)品。(3)在產(chǎn)品的分離純化過程中引入了先進的納濾膜濃縮純化技術(shù)，產(chǎn)品產(chǎn)率及提取收率大于75%。 (4)在產(chǎn)品精制的過程中綜合使用了離子交換技術(shù)、溶媒結(jié)晶技術(shù)和層析技術(shù)等，獲得的莫匹羅星產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)，純度大于98%。
四

圖I :莫匹羅星純化工藝技術(shù)路線圖
五具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明進一步說明。實施例一量取100L發(fā)酵液，加入IM鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至4.0，攪拌20min后，3000r/min離心分離獲得菌絲體，備用。酸化處理后獲得菌絲體加入2倍體積的甲醇，攪拌均勻后浸泡4h，抽濾后留濾液備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第一次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，有機溶劑抽濾獲得濾液的進料速度I. OL/h，操作壓力O. 5MPa，收集納濾濃縮液，備用。向納濾濃縮液中加入5%的聚苯乙烯二乙烯苯磺酸鹽D0W[XFS. 43278. 002]強酸鈉型樹脂，室溫攪拌6h，去離子水沖洗樹脂，后用ρΗΙΟ. O的氫氧化鈉溶液解吸，收集解析液，備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第二次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，收集獲得離子交換解吸液的進料速度I. 2L/h，操作壓力O. 6MPa，解析液濃縮至40%后收集納濾濃縮液，加入4倍體積的甲醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得莫匹羅星晶體，備用。將獲得莫匹羅星晶體溶解后與少量硅膠混合后揮干后上硅膠柱，依次用丙酮、甲醇水體積比為I : I. 3(V/V)、甲醇HCl (O. 2M)體積比為I : I的洗脫劑洗脫硅膠柱，得到莫匹羅星三組分的混合物，后以甲酸銨(4g/L)甲醇的混合液為流動相，進行柱層析，混合流動相內(nèi)酸銨(4g/L)甲醇的體積比為I : 4，收集洗脫液，備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第三次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，柱層析獲得洗脫液的進料速度I. 5L/h，操作壓力O. 8MPa，解析液濃縮至40%后收集納濾濃縮液，精濾去除雜質(zhì)后干燥獲得莫匹羅星純品，產(chǎn)品收率達到75. 8%，產(chǎn)品純度為 98. 2%。實施例二量取100L發(fā)酵液，加入IM鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至4. 5，攪拌20min后，3000r/min離心分離獲得菌絲體，備用。酸化處理后獲得菌絲體加入2倍體積的甲醇，攪拌均勻后浸泡4h，抽濾后留濾液備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第一次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，有機溶劑抽濾獲得濾液的進料速度I. 2L/h，操作壓力O. 6MPa，收集納濾濃縮液，備用。
向納濾濃縮液中加入5%的聚苯乙烯二乙烯苯磺酸鹽D0W[XFS. 43278. 002]強酸鈉型樹脂，室溫攪拌8h，去離子水沖洗樹脂，后用ρΗΙΟ. 5的氫氧化鈉溶液解吸，收集解析液，備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第二次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，收集獲得離子交換解吸液的進料速度I. 2L/h，操作壓力O. 8MPa，解析液濃縮至45%后收集納濾濃縮液，加入5倍體積的甲醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得莫匹羅星晶體，備用。將獲得莫匹羅星晶體溶解后與少量硅膠混合后揮干后上硅膠柱，依次用丙酮、甲醇水體積比為I : 1.2(V/V)、甲醇HCl (O. 2M)體積比為I : I. 2的洗脫劑洗脫硅膠柱，得到莫匹羅星三組分的混合物，后以甲酸銨(4g/L)甲醇的混合液為流動相，進行柱層析，混合流動相內(nèi)酸銨(4g/L):甲醇的體積比為I : 3，收集洗脫液，備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第三次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，柱層析獲得洗脫液的進料速度I. 5L/h，操作壓力I. OMPa，解析液濃縮至40%后收集納濾濃縮液，精濾去除雜質(zhì)后干燥獲得莫匹羅星純品，產(chǎn)品收率達到75. 5%，產(chǎn)品純度為 98. 5%。實施例三量取100L發(fā)酵液，加入IM乙酸，調(diào)節(jié)pH值至4. 2，攪拌20min后，3000r/min離心分離獲得菌絲體，備用。酸化處理后獲得菌絲體加入2倍體積的甲醇，攪拌均勻后浸泡4h，抽濾后留濾液備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第一次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，有機溶劑抽濾獲得濾液的進料速度I. OL/h，操作壓力O. 4MPa，收集納濾濃縮液，備用。向納濾濃縮液中加入5%的聚苯乙烯二乙烯苯磺酸鹽D0W[XFS. 43278. 002]強酸鈉型樹脂，室溫攪拌7h，去離子水沖洗樹脂，后用ρΗΙΟ. O的氫氧化鈉溶液解吸，收集解析液，備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第二次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，收集獲得離子交換解吸液的進料速度I. 2L/h，操作壓力O. 5MPa，解析液濃縮至40%后收集納濾濃縮液，加入4倍體積的甲醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得莫匹羅星晶體，備用。
將獲得莫匹羅星晶體溶解后與少量硅膠混合后揮干后上硅膠柱，依次用丙酮、甲醇水體積比為I : I (V/V)、甲醇HCl (O. 2M)體積比為I : I. 5的洗脫劑洗脫硅膠柱，得到莫匹羅星三組分的混合物，后以甲酸銨(4g/L)甲醇的混合液為流動相，進行柱層析，混合流動相內(nèi)酸銨(4g/L):甲醇的體積比為I : 5，收集洗脫液，備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第三次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，柱層析獲得洗脫液的進料速度I. 4L/h，操作壓力O. 7MPa，解析液濃縮至40%后收集納濾濃縮液，精濾去除雜質(zhì)后干燥獲得莫匹羅星純品，產(chǎn)品收率達到75. 2%，產(chǎn)品純度為 98. 6%。實施例四量取100L發(fā)酵液，加入IM乙酸，調(diào)節(jié)pH值至3. 5，攪拌20min后，3000r/min離心分離獲得菌絲體，備用。酸化處理后獲得菌絲體加入2倍體積的甲醇，攪拌均勻后浸泡4h， 抽濾后留濾液備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第一次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，有機溶劑抽濾獲得濾液的進料速度I. OL/h，操作壓力O. 3MPa，收集納濾濃縮液，備用。向納濾濃縮液中加入5%的聚苯乙烯二乙烯苯磺酸鹽D0W[XFS. 43278. 002]強酸鈉型樹脂，室溫攪拌8h，去離子水沖洗樹脂，后用ρΗΙΟ. O的氫氧化鈉溶液解吸，收集解析液，備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第二次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，收集獲得離子交換解吸液的進料速度I. 2L/h，操作壓力O. 5MPa，解析液濃縮至40%后收集納濾濃縮液，加入5倍體積的甲醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得莫匹羅星晶體，備用。將獲得莫匹羅星晶體溶解后與少量硅膠混合后揮干后上硅膠柱，依次用丙酮、甲醇水體積比為I : I. 3(V/V)、甲醇HCl (O. 2M)體積比為I : I的洗脫劑洗脫硅膠柱，得到莫匹羅星三組分的混合物，后以甲酸銨(4g/L)甲醇的混合液為流動相，進行柱層析，混合流動相內(nèi)酸銨(4g/L)甲醇的體積比為I : 4，收集洗脫液，備用。選用截流分子量為500-600的納濾膜進行第三次納濾濃縮，設(shè)定進口及出口溫度均為常溫，柱層析獲得洗脫液的進料速度I. 5L/h，操作壓力O. 8MPa，解析液濃縮至40%后收集納濾濃縮液，精濾去除雜質(zhì)后干燥獲得莫匹羅星純品，產(chǎn)品收率達到75. 3%，產(chǎn)品純度為 98. 1%。
權(quán)利要求
1.莫匹羅星的一種純化方法，其特征是利用莫匹羅星的結(jié)構(gòu)特點，采用復(fù)合溶劑提取及調(diào)節(jié)PH值去除發(fā)酵液中的小分子，通過納濾濃縮、離子交換、柱層析及重結(jié)晶，獲得高純度莫匹羅星產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求I中所述的調(diào)節(jié)pH值去除發(fā)酵液中的小分子，其特征在于調(diào)節(jié)溶液可選擇こ酸和鹽酸。
3.如權(quán)利要求I中所述的調(diào)節(jié)pH值去除發(fā)酵液中的小分子，其特征在于pH值的調(diào)節(jié)范圍為3. 0-6. 5。
4.如權(quán)利要求I中所述的納濾濃縮，其特征在于納濾膜的截流分子量為500-600，進ロ及出ロ溫度均為常溫，進料速度I. O I. 5L/h，操作壓カO. I IMPa。
5.如權(quán)利要求I所述的離子交換，其特征在于離子交換樹脂可采用聚苯こ烯ニこ烯苯磺酸鹽DOW[XFS. 43278. 002]和732型強酸鈉型樹脂，將樹脂加入莫匹羅星發(fā)酵濃縮液 中，室溫攪拌6-8h，去離子水沖洗樹脂，后用ρΗΙΟ. 0-11. O的氫氧化鈉溶液解吸。
6.如權(quán)利要求I所述的結(jié)晶，其特征在于將經(jīng)離子交換處理的解析液經(jīng)納濾濃縮至40%-50%后，加入4-5倍體積的甲醇，攪拌均勻后投入晶種，4°C靜置12h，獲得莫匹羅星晶體。
7.如權(quán)利要求I所述的柱層析，其特征在于將獲得莫匹羅星晶體溶解后與少量硅膠混合后揮干后上硅膠柱，依次用丙酮、甲醇水體積比為I : I I : 1.5(V/V)、甲醇HCl (O. 2M)體積比為I : 0.5 I : I. 5的洗脫劑洗脫硅膠柱，得到莫匹羅星三組分的混合物，后以甲酸銨(4g/L)甲醇的混合液為流動相，進行柱層析，混合流動相內(nèi)酸銨(4g/L)甲醇的體積比為I : 3 I : 5。
8.如權(quán)利要求I所述的莫匹羅星的一種純化方法，其特征在于制備獲得的莫匹羅星純度達到98%以上，提取率達到75%以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了莫匹羅星的一種純化方法，屬于生物技術(shù)范疇。本發(fā)明利用莫匹羅星的結(jié)構(gòu)特點，采用復(fù)合溶劑提取及調(diào)節(jié)pH值去除發(fā)酵液中的小分子，通過納濾、離子交換、柱層析及重結(jié)晶，獲得高純度莫匹羅星產(chǎn)品，經(jīng)檢測產(chǎn)品純度達到98％以上，可滿足醫(yī)藥行業(yè)的需求。本發(fā)明具有技術(shù)先進，工藝簡單、產(chǎn)率高、成本低、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，有利于我國莫匹羅星生產(chǎn)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化水平的提高。
文檔編號C07D407/06GK102863433SQ20121036095
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者王鵬, 叢倩千 申請人:北京仁峰科技有限公司