專利名稱：用于從水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液的方法
用于從水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液的方法本申請涉及用于從水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液的方法，其包括以下步驟:提供含代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基；使水性培養(yǎng)基與疏水性有機溶液接觸；從水性培養(yǎng)基中分離疏水性有機溶液，其中與其野生型相比，所述細胞具有催化脂肪酸的β-氧化反應(yīng)的至少一種酶降低了活性。此外，本發(fā)明涉及代謝活性細胞用于從包含所述代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液的用途，與其野生型相比，所述細胞的催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng)的酶具有降低的活性，所述酶優(yōu)選選自FadA、FadB, FadD, FadL和FadE及其變體，更優(yōu)選FadE變體。由替代石化燃料的再生原料出發(fā)制備精細化工產(chǎn)品的方法的根本問題在于要將一旦得到的通常首先存在于大量的水相之中的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入疏水性有機相中。一方面，為了能夠?qū)崿F(xiàn)中間廣物或最終廣物的濃縮以及為了能夠?qū)崿F(xiàn)可能地在后續(xù)反應(yīng)步驟中在有機溶液中的合成處理，另一方面，為了通過去除所希望的產(chǎn)物來提高在水相中的反應(yīng)的產(chǎn)率，或者尤其是當(dāng)產(chǎn)物的存在由于對生產(chǎn)菌株的毒性或者對相關(guān)生物催化劑的抑制而通過該產(chǎn)品不利地影響反應(yīng)進展時，首先在技術(shù)上有意義的范疇內(nèi)實現(xiàn)該反應(yīng)，這種轉(zhuǎn)移是必要的。將通常以低 濃度存在的產(chǎn)物由大量的水相中直接加熱濃縮是不合適的。傳統(tǒng)以石油中所含烴類起始制成的工業(yè)上有大量需求的這樣的產(chǎn)品的例子是12-氨基月桂酸(ALS)或其甲酯(ALSME)。在生產(chǎn)例如用于生產(chǎn)基于尼龍的管道系統(tǒng)的聚合物時，ALS是一種重要的起始產(chǎn)物。傳統(tǒng)上，以石化原料起始，在具有低產(chǎn)率的過程中經(jīng)由月桂內(nèi)酰胺制備ALS，月桂內(nèi)酰胺通過以下步驟來合成:將丁二烯三聚化，隨后氫化形成環(huán)十二烷，接著氧化成環(huán)十二酮，與羥胺進行反應(yīng)，并隨后進行貝克曼重排。在W02009/077461中描述了一種用于生物技術(shù)制備ALS或ALSME的大有前景的新路線?？梢允褂萌缭贓P11154707中所述的一種液體離子交換劑，在兩相體系中進行基于該路線的生物技術(shù)方法。通過萃取將一種產(chǎn)物從水相加工進入到疏水性有機相中的前提條件首先是:該產(chǎn)物具有足夠的傾向，在包括不可相互混合的水性親水相和有機疏水相的兩相系統(tǒng)中進入到有機相中，這決定性地取決于各化合物的物理化學(xué)特性。具有高比例未被取代的烴的化合物或者僅由未被取代的烴構(gòu)成的化合物主要富集在疏水相之中，而具有高比例極性基團如含雜原子的官能團的化合物且非常特別是具有電荷的化合物主要或者實際上僅僅存在于水相之中，這使得轉(zhuǎn)移到有機相中變得困難。通常借助于分配系數(shù)，例如根據(jù)能斯特方程來描述平衡調(diào)節(jié)之后化合物在所述兩相系統(tǒng)中的分配a =C^1ZC相 2。一種特殊的分配系數(shù)是Kot也稱作P-值，該系數(shù)表征了辛醇相與水相之間化合物的分配平衡:Kow = P = C辛醇/C水從疏水相處理產(chǎn)物的另一個前提條件在于，分配已經(jīng)達到了通過上述方程描述的平衡狀態(tài)或者至少足夠接近 于平衡狀態(tài)。平衡的調(diào)節(jié)尤其通過兩個相之間接觸面的大小來確定，在生物技術(shù)方法中，這通常是非限制性的因素，因為通過由于維持高的代謝活性細胞密度總歸必要的措施諸如水性培養(yǎng)基與疏水性有機溶液的通氣和充分攪拌，已增加了接觸面。但在能夠有效處理這樣一種反應(yīng)混合物之前，將兩相分離是必要的，在所述混合物中所述疏水性有機溶液主要存在于膠束或者其它亞區(qū)室之中。將純水與純有機疏水性溶劑混合時，如果經(jīng)常自動形成兩個相而無其它協(xié)助的情況下，那么由于多種可能的相互作用，將不太容易從復(fù)雜的水性培養(yǎng)基中分離出有機疏水性溶液，并且在沒有技術(shù)支持的情況下，例如通過離心分離會持續(xù)數(shù)時甚至數(shù)天。對于通過生物技術(shù)工藝大規(guī)模生產(chǎn)工業(yè)需求的化學(xué)化合物而言，在開發(fā)和應(yīng)用用于節(jié)約資源而快速地生產(chǎn)和處理如ALS的化合物的方法時，在此背景下，相分離的過程是很重要的一個因素。如果在大型反應(yīng)器中必須從大體積的水相中提取總是溶解于疏水性有機溶液中的產(chǎn)物并且隨后對其進行處理，那么除了本來的與生產(chǎn)相關(guān)參數(shù)諸如底物的類型和數(shù)量、培養(yǎng)基的溫度和氧含量之外，也要優(yōu)化疏水性溶液的分離，以便節(jié)約資源并且使得整個過程盡可能環(huán)保。尤其要提及的是，許多大規(guī)模使用的疏水性有機溶劑至少在較長時間接觸的情況下對生物技術(shù)應(yīng)用的生物有毒性作用，且在這種背景下為保護生物技術(shù)使用的菌株，和為防止細胞溶解時釋放的不希望的副產(chǎn)物污染甚至分解目標產(chǎn)物，希望縮短水性培養(yǎng)基中的生物與溶劑之間的接觸時間。因此，本發(fā)明以下述目的為基礎(chǔ)，即提供用于在兩相體系中以生物技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品的改進的制備和生產(chǎn)方法，所述兩相體系包括含代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基和疏水性有機溶液。該目的尤其是要在給定的時間窗口之內(nèi)在過程的快速性和/或從水性培養(yǎng)基分離出疏水性有機溶液的程度方面更好分離出疏水性有機溶液和萃取溶于其中的以生物技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品。本發(fā)明基于的另一個目在于提供可用于生物技術(shù)的細胞，所述細胞對源自疏水性溶液的對這樣的細胞的毒性具有高耐受性。此外，本發(fā)明基于下述目的，即提供用于制備疏水性化合物的生物技術(shù)方法以及適用于該方法的細胞，在所述方法中降低了耗氧量。通過本申請的主題并且尤其也通過所附的獨立權(quán)利要求的主題達成了所述這些目的和另外的目的，其中由從屬權(quán)利要求得出實施方式。在第一方面中通過包括以下步驟的方法達成了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的目的a)提供包含代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基，b)使該水性培養(yǎng)基與疏水性有機溶液接觸，c)從水性培養(yǎng)基中分離疏水性有機溶液，其中，與其野生型相比，所述細胞具有至少一種降低了活性的催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng) 的酶。在第一方面的第一實施方式中，所述催化脂肪酸的氧化反應(yīng)的酶是選自下述的酶:FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其變體，優(yōu)選是FadE或其變體。在第一方面的第二實施方式中涉及一種方法，其中所述有機溶液包含至少一種選自下列的溶劑:其在室溫下為液態(tài)的取代和未被取代的鏈烷烴、環(huán)烷烴、環(huán)烯烴、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、雜環(huán)烷烴、雜環(huán)烯烴和雜芳基化合物。
在第一方面的第三實施方式中涉及一種方法，其中所述有機溶液包含具有多于12個碳原子的脂肪酸或其酯，優(yōu)選油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。在第一方面的第四實施方式中，所述細胞具有重組的烷烴羥化酶。在第二方面中，通過使用代謝活性細胞用于從包含所述代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液從而達成了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的目的，與其野生型相比，所述細胞具有至少一種降低了活性的催化脂肪酸的氧化反應(yīng)的酶，所述酶優(yōu)選選自FadA、FadB, FadD, FadE 和 FadL 及其變體，更優(yōu)選 FadE。在第三方面中通過使用敲除催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng)的酶作為代謝活性細胞的基因組成部分用于從包含所述代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液從而達成了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的目的，所述酶優(yōu)選選自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其變體，還更優(yōu)選FadE變體或其變體。在第四方面中通過一種細胞從而達成了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的目的，與其野生型相t匕，所述細胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶，其進一步包含重組的單加氧酶，更優(yōu)選包含烷烴羥化酶。在第四方面的第一實施方式中，所述目的通過一種細胞得以達成，其中所述催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng)的酶是選自FadA、FadB, FadD, FadE和FadL及其變體的酶，更優(yōu)選是FadE變體或其變體。在第五方面中通過反應(yīng)混合物從而達成了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的目的，所述反應(yīng)混合物包含具有代謝活性細胞的水溶液和疏水性有機溶液，其中，與其野生型相比，所述細胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶。在第五方面的第一實施方式中，通過一種反應(yīng)混合物達成了所述目的，其中，所述催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng)的·酶是選自FadA、FadB, FadD, FadE和FadL及其變體的酶，更優(yōu)選是FadE變體或其變體。在第五方面的第二實施方式中，通過一種反應(yīng)混合物達成了所述目的，其中，所述疏水性有機溶液包含選自下列的至少一種溶劑:在室溫下為液態(tài)的取代和未被取代的鏈烷烴、環(huán)烷烴、環(huán)烯烴、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、雜環(huán)烷烴、雜環(huán)烯烴和雜芳基化合物。在第五方面的第三實施方式中，通過一種反應(yīng)混合物達成了所述目的，其中，所述疏水性有機溶液包含具有多于12個碳原子的脂肪酸或其酯，優(yōu)選油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一實施方式中，通過一種方法、一種用途和一種反應(yīng)混合物達成了所述目的，其中所述代謝活性細胞是具有重組的烷烴羥化酶和轉(zhuǎn)氨酶，此外優(yōu)選選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和內(nèi)酰胺水解酶的至少一種酶的細胞。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一實施方式中，通過一種方法、一種用途和一種反應(yīng)混合物達成了所述目的，其中所述細胞是低級真核細胞或者是原核細胞，優(yōu)選是大腸桿菌。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一實施方式中，通過一種方法、一種用途和一種反應(yīng)混合物達成了所述目的，其中所述細胞是重組的細胞。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一實施方式中，通過一種方法、一種用途和一種反應(yīng)混合物達成了所述目的，其中，所述疏水性有機溶液構(gòu)成疏水性有機溶液和水性培養(yǎng)基的總體積的至少5%，優(yōu)選至少20%。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一實施方式中，通過一種方法、一種用途和一種反應(yīng)混合物達成了所述目的，其中，在接觸時，所述水性培養(yǎng)基的PH值在5 9，更優(yōu)選在6 8之間。本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，如果與其野生型相比，代謝活性細胞具有至少一種降低了活性的催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng)的酶，則能令人驚奇地從含所述代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基中分離出疏水性有機溶液。此外，本發(fā)明的發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)，在生物技術(shù)方法中，在可比較的目標產(chǎn)物的生產(chǎn)效率下，與其野生型相比，具有至少一種降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶的代謝活性細胞具有較小的耗氧量和較高的產(chǎn)物產(chǎn)率與耗氧量之比。并未意在綁定于任何一一種理論，本發(fā)明人推測，至少一種催化β -氧化反應(yīng)的酶的活性降低導(dǎo)致水性培養(yǎng)基中作為去垢劑起作用的不明代謝物的濃度降低，從而一方面在培養(yǎng)細胞時在攪動培養(yǎng)基的條件下疏水性溶液和位于水性培養(yǎng)基中對溶劑敏感的代謝活性細胞之間的接觸面減小，這導(dǎo)致細胞的溶劑應(yīng)激減少，且另一方面在斷開攪拌裝置之后促進形成分離相。可將根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)用于改進所有生物技術(shù)方法，所述生物技術(shù)方法包括使用代謝活性細胞制備諸如精細 化學(xué)品之類的產(chǎn)物，該代謝活性細胞的培養(yǎng)在水性培養(yǎng)基中進行和使用疏水性有機溶液處理該產(chǎn)物。在一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，將術(shù)語“代謝活性細胞”理解為具有代謝活性的活細胞，優(yōu)選以活性形式表達或更優(yōu)選過表達與令人感興趣的產(chǎn)物的生物技術(shù)制備相關(guān)的酶的細胞。所述細胞可以是一種包括古生菌(Archaea)的原核生物，或者是真核生物，在原核生物的情況中優(yōu)選選自下述屬:假單胞菌屬(Pseudomonas)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和埃希氏菌屬(Escherichia)。在一種還更優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是細菌細胞，還更優(yōu)選是革蘭氏陰性細菌細胞，最優(yōu)選是大腸桿菌。在另一種優(yōu)選的實施方式中，涉及真核細胞，更優(yōu)選是真菌細胞，還更優(yōu)選是酵母細胞，最優(yōu)選是酵母菌(Saccharomyces)或者假絲酵母(Candida)、畢赤酵母(Pichia),尤其是熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。在一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，將術(shù)語“低級真核生物”理解為在其存在的所有階段中為單細胞的真核生物，與之相反的是高級真核生物，其生命的大部分以具有包含分化細胞的組織的多細胞生物的形式渡過。在具體的實施方式中，術(shù)語“細胞”與本發(fā)明中的術(shù)語“微生物”同義并且可交換使用。此外，所述細胞可以是分離的細胞或者多種細胞的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量適合于維持或者培養(yǎng)細胞，尤其是在生物技術(shù)上有重要意義的細胞的水性培養(yǎng)基。其中同樣包括完全培養(yǎng)基如LB-培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基如M9-培養(yǎng)基以及選擇性培養(yǎng)基，例如含高鹽濃度的并因此使得只有嗜鹽或者至少耐鹽的生物體才能生長的那些。在一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，將術(shù)語“水性培養(yǎng)基”理解為基于水的反應(yīng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基就其所有相關(guān)因素而言，尤其是PH-值、鹽含量和溫度，具有如此性質(zhì)，以至于其維持或者促進包含于其中的細胞優(yōu)選微生物的生活力，并且水性培養(yǎng)基和疏水性有機相均以液體形式存在?？梢栽谖⑸锖头肿由飳W(xué)教科書中獲悉各種在生物技術(shù)上有重要意義的細胞的溫度要求，例如Fuchs/Schlegl，2008。在一種優(yōu)選的實施方式中，在接觸時，所述水性培養(yǎng)基的pH-值在4 9之間，更優(yōu)選在4.5 8.5之間，最優(yōu)選在6.5 7.5之間。在另一種優(yōu)選的實施方式中,所述溫度在O 45°C之間,更優(yōu)選在15 40°C之間，最優(yōu)選在20 37°C之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多可使用的溶劑，以制備疏水性有機溶液。在一種優(yōu)選的實施方式中，如在.此所使用的一般，將術(shù)語“疏水性的”理解為，在液體狀態(tài)下，在液體水相存在下，形成單獨的與水相清楚劃清界限的液相的一種液體的特性。后者可以是連續(xù)的液相或者是乳狀液。在另一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，將術(shù)語“疏水性的”理解為基本上不溶于水的化合物的特性。最后，在另一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，如此理解該術(shù)語，使得這樣稱謂的化合物具有其常用對數(shù)大于0，優(yōu)選大于0.5,還更優(yōu)選大于I且最優(yōu)選大于2的P-值(J.Sangstar, Octanol-ffater PartitionCoefficients:Fundamentals and Physical Chemistry,卷 2Wiley Series in SolutionChemistry, John Wiley & Sons,Chichester, 1997)。優(yōu)選的有機溶劑包括,但并非局限于，選自下列的溶劑:在室溫下為液態(tài)的取代和未被取代的鏈烷烴、環(huán)烷烴、環(huán)烯烴、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、雜環(huán)烷烴、雜環(huán)烯烴和雜芳基化合物。所述疏水性有機溶劑也可以是包含多于一種的疏水性有機溶劑的混合物。脂肪酸的β -氧化是一種很普遍的代謝途徑，其完全一樣地允許原核生物和真核生物氧化脂肪酸并且使得其中所含的化學(xué)能可用于代謝(Fujita等人，2007)。就廣義而言，該氧化開始于將脂肪酸吸收到細胞之中，在大腸桿菌的情況中，通過引導(dǎo)脂肪酸通過革蘭氏陰性細菌細胞的外膜和內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運蛋白FadL(Black，1991)和將CoA酯形式的脂肪酸釋放到胞質(zhì)溶膠之中的FadD基因產(chǎn)物(Black等人，1992)。如果條件需要，在這里首先將脂肪酸在CoA脂肪酸酯的β -位置通過?；o酶A-脫氫酶，在大腸桿菌的情況中則通過FadE (Campbell和Cronan, 2002)氧化。或者也可以借助于2,4-二烯酰輔酶A-還原酶,在大腸桿菌的情況中則借助于FadH，由雙不飽和脂肪酸通過還原反應(yīng)形成類似的分子。隨后，多功能酶催化形成仲·醇的水合作用及其隨后的生成酮的氧化，所述多功能酶是烯酰輔酶A-水合酶/3-羥基酰基輔酶A-脫氫酶，在大腸桿菌的情況中則為FadB。在最后一步中，3-酮酯酰輔酶A-硫解酶，在大腸桿菌的情況中則為FadA，催化酮酯酰輔酶A的裂解，從而釋放出乙酰輔酶A和與起始分子相比縮短了兩個碳原子的CoA-酯。如果還不是乙酰輔酶A，則可以將后者重新送入到β_氧化循環(huán)之中，并且將其氧化縮短。FadR也參與調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化，F(xiàn)adR是Fad操縱子的調(diào)節(jié)子，其包含降解脂肪酸所需的基因，F(xiàn)adR沒有催化β_氧化反應(yīng)。在一種優(yōu)選的實施方式中，將術(shù)語“催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶”理解為直接與脂肪酸底物或者與在降解成乙酰輔酶A的途徑中由此產(chǎn)生的分子相互作用的任何一種酶，優(yōu)選將所述產(chǎn)生的分子識別為底物，并且催化其在該降解途徑中更接近于乙酰輔酶A的代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選包括實現(xiàn)了將脂肪酸吸收到細胞之中的脂肪酸輸入蛋白(Importer)。按照上述定義，例如?；o酶A-脫氫酶就屬于這些酶，因為其與脂肪酸輔酶A-酯相互作用并且催化其生成烯酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，在β -氧化的代謝途徑上烯酰輔酶A比脂肪酸輔酶A-酯更接近于乙酰輔酶Α。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，將術(shù)語“催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng)的酶”理解為選自大腸桿菌的基因產(chǎn)物FadA、FadB、FadD,FadL和FadE和/或其變體或者得自其它生物的同源物的任何一種酶。大腸桿菌的基因產(chǎn)物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE及其變體以及大量其它生物技術(shù)可使用的生物體的同源物及其核酸-和多肽序列描述于現(xiàn)有技術(shù)中，例如登錄號為AP009048.1的FadA，登錄號為 BAE77457.1 的 FadB,登錄號為 BAA15609.1 的 FadD,登錄號為 BAA77891.2 的 FadE 以及登錄號為BAA16205.1的FadL。本發(fā)明的教導(dǎo)并非只能使用這里所述的生物大分子的確切氨基酸序列或核酸序列來實施或應(yīng)用于這里所述的生物大分子的確切氨基酸序列或核酸序列上，例如通過敲除編碼催化β_氧化反應(yīng)的酶的基因，而是也可以使用這類大分子的變體來實施或應(yīng)用于這類大分子的變體上，所述變體可以通過刪除、加成或取代一個或多于一個氨基酸或核酸來獲得。在一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，術(shù)語核酸序列或氨基酸序列的“變體”，在下文中與術(shù)語“同源體”含義相同并且可以互換，表示就相應(yīng)的最初的野生型核酸序列或氨基酸序列而言具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分值的同源性(這里與同一性同義使用)的另一種核酸序列或氨基酸序列，其中優(yōu)選刪除或取代那些與形成催化活性中心的氨基酸或者對于結(jié)構(gòu)和折疊而言必要的氨基酸不同的氨基酸，或者僅僅保守取代后者，例如谷氨酸替代天冬氨酸，或者亮氨酸替代纈氨酸?，F(xiàn)有技術(shù)描述了可使用的算法來計算兩個序列的同源性程度，例如Arthur Lesk (2008), Introduction tobioinformatics, 3rd edition。在本發(fā)明的另一種更優(yōu)選的實施方式中，氨基酸序列或核酸序列的變體優(yōu)選除了具有上述序列同源性之外，還基本上具有與野生型分子或最初的分子相同的酶的活性。例如，一種作為蛋白酶的酶活性多肽的變體具有與該多肽酶相同或者基本上相同的蛋白水解活性，也就是催化肽鍵水解的能力。在一種具體的實施方式中，術(shù)語“基本上相同的酶活性”表示就野生型多肽的底物而言的活性，其明顯高于本底活性，并且/或者比就相同底物而言的野生型多肽具有的Km-值和/或者值相差小于3個，更優(yōu)選2個，還更優(yōu)選一個數(shù)量級。在另一種優(yōu)選的實施方式中，所述核酸序列或氨基酸序列的“變體”包含該核酸序列或氨基酸序列的至少一個活性部分/或者片段。在另一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，術(shù)語“活性部分”表示具有小于氨基酸序列全長的長度或者編碼小于氨基酸序列全長的長度的氨基酸序列或核酸序列，其中所述具有長度小于野生型氨基酸序列的氨基酸序列或者經(jīng)編碼的氨基酸序列基本上具有與野生型多肽或其變體相同的酶活性，例如作為脂肪酸輸入蛋白、作為烯酰輔酶A-水合酶或FadE，或者作為乙酰輔酶A-?；D(zhuǎn)移酶或FadB。在一種具體的實施方式中，術(shù)語核酸的“變體”包括核酸、其互補鏈，優(yōu)選在嚴格條件下結(jié)合在野生型核酸上。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言雜交反應(yīng)的嚴格性可容易地確定，且通常取決于探針長度、洗滌時的溫度和鹽濃度。一般來說較長的探針需要較高的溫度用于雜交，相反對于較短的探針則較低的溫度即可。一般來說是否發(fā)生雜交取決于變性DNA融合在其周圍存在的互補鏈上的能力，更確切地說在低于熔融溫度的情況下。Ausubel等人于1995年比較詳細地描述了雜交反應(yīng)的嚴格性和相應(yīng)的條件。借助于雜交用于鑒別DNA序列的說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員尤其可參閱手冊BoehringerMannheim GmbH 公司(Mannheim,德國，1993)的手冊“The DIG System Users Guide forFilter Hybridization，，以及 Liebl 等人的文章(International Journal of SystematicBacteriology 41:255-260 (1991))。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述雜交在嚴格的條件下進行，這意味著僅在探針和靶序列(即用探針處理過的多核苷酸)至少70%相同時，才形成雜交物。已知，通 過改變緩沖液組成、溫度和鹽的濃度影響或確定包括洗滌步驟在內(nèi)的雜交嚴格性。通常，雜交反應(yīng)在比洗漆步驟嚴格性相對低的條件下進行(Hybaid HybridisationGuide,Hybaid Limited, Teddington,UK, 1996)。例如在大約 50°C 68°C溫度下可以將一種相當(dāng)于5xSSC緩沖液的緩沖液用于雜交反應(yīng)。在此也可以用具有與探針序列的同一性少于70%的多核苷酸雜交探針。這樣的雜交物較不穩(wěn)定，并被在嚴格條件下的洗滌去除。這可例如通過降低鹽濃度到2x SSC和任選地隨后到0.5x SSC來實現(xiàn)(The DIG System User' sGuide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim,德國，1995),其中以如下遞增的優(yōu)選順序調(diào)節(jié)溫度:大約50°C 68°C，大約52°C 68°C，大約54°C 68°C，大約56V 68°C，大約58V 68°C，大約60°C 68°C，大約62°C 68V’大約64V 68°C，大約66°C 68°C。優(yōu)選大約64°C 68°C或者大約66°C 68°C的溫度范圍。任選可以將鹽的濃度降低到相當(dāng)于0.2x SSC或者0.1x SSC的濃度。通過以大約I 2°C的步距將雜交溫度從50°C逐步提高到68°C，可例如以如下遞增的優(yōu)選順序分離出多核苷酸片段，所述片段與所用核酸分子序列的同一性至少為70 %或者至少80 %或者至少90 %，至少91 %，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或者至少99%。另外的用于雜交的說明是以所謂的試劑盒形式市購可得的(例如Roche Diagnostics GmbH公司德國曼海姆的DIG Easy Hyb，目錄號1603558)。在一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，術(shù)語核酸的“變體”包括在遺傳密碼的簡并度范疇內(nèi)編碼與最初的核酸相同的氨基酸序列或者該氨基酸序列的變體的任意核酸序列。隨著現(xiàn)代遺傳學(xué)、微生物學(xué)和分子生物學(xué)方法的發(fā)展，提供了很多可用來常規(guī)測定和影響存在于活細胞中的酶的活性的工具給本領(lǐng)域技術(shù)人員。為了確定以懸浮液、顆粒形式存在或者能夠以經(jīng)過處理的形式從細胞培養(yǎng)中除去的酶的活性，可以使用酶標準測試法并評價，如同教科書(例如Comish-Bowden, 1995)中所述的一樣?，F(xiàn)有技術(shù)公開了許多專門適合于測定催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶的活性的測試方法，例如在Kameda &Nunn(1981)、Marrakchi 等人(2003)、Lobo 等人(2001)和 Xu 等人(2011)中。在現(xiàn)有技術(shù)中，例如在Maniatis等人(1989)中或者在Fuchs & Schlegl (2007)中，也描述了通?？捎糜诮档图毎忻傅幕钚缘姆椒?，例如通過暴露在放射性輻射下使得細胞非定向突變，隨后富集或者篩選突變體；通過定 向引入點突變或者通過敲除整合在細胞中染色體的用于編碼活性酶的基因。在Fad-基因產(chǎn)物的特殊情況下，轉(zhuǎn)錄阻抑物例如FadR的過度表達(Fujita等人，2007)也有助于降低活性。也可以基于RNA-干擾(Tuschl，2001)或者使用特異性抑制劑來降低活性。在一種優(yōu)選的實施方式中，表述“其中與其野生型相比，所述細胞具有降低了活性的酶”，如在此所使用的一般，表示相對于野生型細胞中相同的酶的活性，在經(jīng)修飾的細胞中酶的活性降低。在一種優(yōu)選的實施方式中，相對的活性的減少以如下遞增的優(yōu)選順序為:5、10、20、40、50、75、90、95、99%或更高百分比。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，相對于背景不再檢測出酶的活性。在根據(jù)本發(fā)明的方法的第二步驟中，水性培養(yǎng)基與疏水性有機溶液接觸。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，如在此所使用的一般，術(shù)語“接觸”表示水性培養(yǎng)基與有機溶液直接接觸，而無中間插入的水性培養(yǎng)基和/或者疏術(shù)性有機溶液無法逾越的機械屏障，例如無機膜。例如可將水性培養(yǎng)基引入發(fā)酵罐中，并且將有機溶液加入到同一個發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基之中，使得兩種液體可以混合。在一種優(yōu)選的實施方式中，至少部分在攪動、通入氣體或者采取適合于增大兩相接觸面積的類似措施下進行接觸。在第二步驟之后，從水性培養(yǎng)基中分離出疏水性有機溶液。由于該系統(tǒng)固有的形成兩相的能力，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是易于進行的過程，其可簡單地通過靜置容器且隨后潷析其中一相來進行。或者可使用分液漏斗。在沸點差別足夠大的情況中，也存在通過施加負壓抽出在較低溫度下沸騰的相的可能性，該相通常是有機相?？梢允褂萌鐨浠}、無水氯化鈣、硅膠、無水硫酸鈉、氫氧化鈉等無機干燥劑去除殘留在有機相中的少量水?？梢允褂贸Ｒ姷氖杷杂袡C溶劑進行根據(jù)本發(fā)明的方法，所述溶劑包括在室溫下為液態(tài)的取代和未被取代的鏈烷烴、環(huán)烷烴、環(huán)烯烴、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、雜環(huán)烷烴、雜環(huán)烯烴和雜芳基化合物。本身并非液體的疏水性有機溶劑也適合，只要它是作為一個整體的為液態(tài)的溶劑混合物的一部分。在此可任選考慮，很多溶劑對代謝活性細胞或多或少有毒性作用。如果細胞至少應(yīng)當(dāng)暫時保持其代謝活性，那么就應(yīng)使用毒性作用適度或者根本沒有毒性作用的疏水性有機溶劑的濃度。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，所述溶劑是具有至少八個碳原子、優(yōu)選至少十二個碳原子的飽和或不飽和脂肪酸，例如月桂酸、油酸或芥酸或者其甲酯。在另一種優(yōu)選的實施方式中，所述溶劑是式為CH3-(CH2)x-COOH的脂肪酸，式中乂可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或者更多。在另一種優(yōu)選的實施方式中，涉及具有雙鍵的不飽和脂肪酸，尤其優(yōu)選在位置9具有一個雙鍵，特別優(yōu)選油酸。在另一種特別優(yōu)選的實施方式中，所述溶劑是己酸。應(yīng)如此安排疏水性有機溶液的體積，使得有機相可容易地被分離出來，且在一種優(yōu)選的實施方式中，有機相構(gòu)成水性培養(yǎng)基和疏水性有機溶液的總體積的2 98%，優(yōu)選5 95%，還更優(yōu)選為10 40%，最優(yōu)選為20 30%。通常選擇能夠制備特別需要的產(chǎn)物的細胞作為代謝活性細胞。特別有利的是，為此使用重組的細胞。在一種優(yōu)選的實施方式中，將術(shù)語“重組”如在此一般理解為，被稱為重組體、引入到“重組細胞”之中的核酸分子并非是取自自然、而是使用分子生物學(xué)或者化學(xué)合成方法制備的核酸分子，或者被稱為重組體的細胞包括重組核酸分子或者由其編碼的多肽。用于制備重組核酸分子和細胞的常規(guī)分子生物學(xué)方法描述在現(xiàn)有技術(shù)中，例如在Sambrook 等人(1989)或者 Schlegl & Fuchs (2007)中。此外,如果所述細胞具有或者,特別優(yōu)選過度表達,生成產(chǎn)物或者產(chǎn)物的前體或中間體的酶，則是特別有 利的。這可通過將包含編碼所述酶的核酸分子的載體通過轉(zhuǎn)換或諸如此類的引入細胞之中，或者將對酶進行編碼的核酸分子摻入細胞的基因組成，例如染色體之中來實現(xiàn)。對于許多生物技術(shù)上重要的細胞種類例如大腸桿菌來說，可用于表達或者過表達核酸分子的合適的方法和載體是已知的，例如PET或pGEX型的載體，以及適合于其表達的細胞(Moffatt & Studier (1986), Rosenberg 等人(1987)和 Studier 等人(1990)。如果使用代謝活性細胞，以代謝疏水性有機溶劑，或者使用疏水性有機溶劑作為底物來催化化學(xué)反應(yīng)，則特別適用根據(jù)本發(fā)明的方法。所述酶包括烷烴羥化酶。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，如用于此的“烷烴羥化酶”是催化將烷烴氧化成醇、醛/酮和/或氧化成羧酸、優(yōu)選主要氧化成醇的酶。在現(xiàn)有技術(shù)中已描述了大量烷烴羥化酶，例如在Grant等人(2011)或者Koch等人(2009)中。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，所述烷烴羥化酶是“alkB型的烷烴羥化酶”。AlkB是得自惡臭假單胞菌的AlkBGT體系的一種氧化還原酶，其因其羥化酶活性而眾所周知。這取決于兩種另外的多肽，AlkG和AlkT。AlkT被表征為FAD依賴性紅素氧還蛋白還原酶，其將電子從NADH轉(zhuǎn)移到AlkG上。AlkG是一種紅素氧還原蛋白，一種含鐵的氧化還原蛋白，可用作AlkB的直接電子供體。在一種優(yōu)選的實施方式中，如在此使用的術(shù)語“alkB型烷烴羥化酶”被理解為膜結(jié)合的烷烴羥化酶。在另一種優(yōu)選的實施方式中，將同一術(shù)語“alkB型烷烴羥化酶”理解為多肽，所述多肽具有遞增優(yōu)選的至少75、80、85、90、92、94、96、98或者99%的與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)Gpol (數(shù)據(jù)庫代碼:CAB54050.1，該代碼以及本文中使用的所有其它數(shù)據(jù)庫代碼均源自于2011年11月9日發(fā)布的NCBI的基因庫蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)的AlkB的序列的序列同源性。這里所使用的術(shù)語“序列”可以涉及多肽的氨基酸序列和/或者對其進行編碼的核酸序列?？梢允紫仁褂迷摲椒ㄑ趸㈦S后胺化脂肪酸或其酯。例如國際專利申請W02009/077461中所述的一種酶系統(tǒng)就適合于此。在該情況下，所述代謝活性細胞是具有重組烷烴羥化酶和轉(zhuǎn)氨酶的細胞，除此之外，優(yōu)選選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和內(nèi)酰胺水解酶的至少一種酶。在一種優(yōu)選的實施方式中，將在此使用的術(shù)語“醇脫氫酶”理解為將醒或酮氧化成相應(yīng)伯醇或仲醇的酶。實例包括真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Ralstonia eutropha)(ACB78191.1)、乳酸短乳桿菌(Lactobacillus brevis) (ΥΡ_795183.I)、高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefiri) (ACF95832.1)的醇脫氫酶，得自馬肝的，異氧硝化-好氧反硝化菌(Paracoccus pantotrophus) (ACB78182.1)和矢野口鞘氨醇菌(Sphingobiumyanoikuyae) (EU427523.1)的醇脫氫酶及其各自的變體。在一種優(yōu)選的實施方式中，將在此所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)氨酶”理解為催化α -氨基從供體分子優(yōu)選氨基酸轉(zhuǎn)移到受體分子優(yōu)選α_酮羧酸的酶。例如可以使用紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum) ATCC12472 (數(shù)據(jù)庫代碼NP_901695)的轉(zhuǎn)氨酶。在一種優(yōu)選的實施方式中，將在此使用的“丙氨酸脫氫酶”理解為催化在消耗水和NAD+的條件下L-丙氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸、氨和NADH的酶。例如可以使用源自枯草桿菌(Bacillus subtilis)(數(shù)據(jù)庫代碼L20916)、豆科根瘤菌(RhizobiumIeguminosarum)(數(shù)據(jù)庫代碼 CP001622)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolytikus)(數(shù)據(jù)庫代碼 AF070716)、結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(數(shù)據(jù)庫代碼 X63069)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)(數(shù)據(jù)庫代碼AB013821)的丙氨酸脫氫酶。本發(fā)明不僅涉及根據(jù)本發(fā)明的方法，也涉及敲除催化脂肪酸的氧化反應(yīng)的酶作為代謝活性細胞的 基因組成部分，用于從包含所述代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液的用途，所述酶優(yōu)選選自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL，更優(yōu)選FadE。如果在任意一種方法中存在將疏水性有機溶液從包含代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基中分離的必要性，則根據(jù)本發(fā)明，使用敲除了至少一種催化脂肪酸的氧化反應(yīng)的酶，所述酶選選自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL，更優(yōu)選FadE，來替代沒有相應(yīng)的脂肪酸代謝修飾的代謝活性細胞，即與其野生型相比，催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶的活性沒有改變或甚至提高的細胞，所述酶優(yōu)選選自FadA、FadB、FadD, FadE和FadL，更優(yōu)選FadE。無論是否要使用所述代謝活性細胞來制備脂肪酸或者其衍生物或者可以經(jīng)由β -氧化代謝途徑降解的其它分子，均可使用這種Fad基因的敲除。在一種優(yōu)選的實施方式中，在此所使用的術(shù)語“敲除”可理解為，與其野生型細胞相比，減少基因或者其基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯，例如通過刪除基因的一部分或者整個基因，通過在適當(dāng)?shù)奈稽c插入終止密碼子，通過去除啟動子的必要部分，或者通過去除核糖體結(jié)合位點。在一種最優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括步驟:a)提供含代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基；b)使所述水性培養(yǎng)基與疏水性有機溶液接觸和C)從所述水性培養(yǎng)基中分離出疏水性有機溶液，其中與其野生型相比，所述細胞具有降低的FadE變體或其變體的活性，所述代謝活性細胞是大腸桿菌的重組菌株，該菌株具有重組的烷烴羥化酶，優(yōu)選源自惡臭假單胞菌的AlkBGT或其變體，以及重組的轉(zhuǎn)氨酶，并且所述疏水性有機溶劑包括得自月桂酸或己酸或其甲酯與一種不飽和脂肪酸的混合物，所述不飽和脂肪酸優(yōu)選油酸或芥酸，最優(yōu)選油酸，其中優(yōu)選油酸或芥酸與月桂酸或己酸或其甲酯的比例為20: 80 80: 20，優(yōu)選 20: 80 40: 60。在一種最優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法是用于制備ω-氨基羧酸的方法，包括步驟:a)提供含代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基；b)使所述水性培養(yǎng)基與疏水性有機溶液接觸；c)從所述水性培養(yǎng)基 中分離出疏水性有機溶液，其中，與其野生型相比，所述細胞具有至少一種降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶，其中所述細胞優(yōu)選是大腸桿菌，且所述催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng)的酶是FadE，并且除此之外所述還通過基因技術(shù)改變了所述的細胞，使其能夠生成比其野生型更多的ω-氨基羧酸，由此優(yōu)選，其具有包含烷烴羥化酶，優(yōu)選源自惡臭假單胞菌的AlkBGT，任選醇脫氫酶和ω -轉(zhuǎn)氨酶的重組酶體系。在另一種最優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種細胞，其中，與其野生型相比，所述細胞具有至少一種降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶，其中所述細胞優(yōu)選是大腸桿菌，且所述催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶是FadE，并且除.此之外所述還通過基因技術(shù)改變了所述的細胞，使其能夠生成比其野生型更多的ω-氨基羧酸，由此優(yōu)選，其具有包含烷烴羥化酶，優(yōu)選源自惡臭假單胞菌的AlkBGT，任選醇脫氫酶和ω -轉(zhuǎn)氨酶的重組酶體系。以下將通過附圖和非限制性實施例來闡述本發(fā)明，可以從這些附圖和示例中獲得本發(fā)明的其它特征、實施方式、方面和優(yōu)點。附

圖1 展示了在制備 ALSME 時使用 AFadE-突變體 W3110 Λ FadE [alkB_alaD_TA](以下也稱作“AFadE”)(左側(cè))以及和除了缺少AFadE-缺失之外相同的菌株W3110[alkB-alaD-TA](以下也稱作野生型(“WT”)(右側(cè))在相分離時的區(qū)別。箭頭所指為十分鐘之后在突變體的情況中有機相和水相明顯的分離，相反，在使用另一菌株時，相同時間之后還是不能辨識相分離。附圖2展示了與附圖1相同的實驗，除了降發(fā)酵后的反應(yīng)介質(zhì)裝入離心管中。附圖3展示了在與附圖1中相同的實驗中兩種菌株的以0TR(oxygen transferrate/氧傳遞速率)形式的氧輸入量和以CTR(carbon dioxide transfer rate/二氧化碳傳遞速率)形式的二氧化碳排出量，。附圖4展示了在與附圖1中相同的實驗中在培養(yǎng)基中隨時間變化的ALSME的濃度。附圖5展示了如實施例2中所述的月桂酸甲酯(LSME)的反應(yīng)中各種產(chǎn)物的濃度，即氨基月桂酸(ALS)、氨基月桂酸甲酯(ALSME)、ω-羧基月桂酸(DDS)、ω-羧基月桂酸甲酯(DDSME)、ω-羥基月桂酸(HLS)、ω-羥基月桂酸甲酯(HLSME)和ω-氧代月桂酸(OLS)。作為菌株研究ΔFadE-(附圖5a)、野生型(W3110)(附圖5b) >ΔFadL-(附圖5c)以及具有Δ FadE和Δ FadL的菌株(附圖5d)。附圖6展示了實施例2中所述試驗的OTR-曲線(附圖6a)和CTR-曲線(附圖6b)。
附圖7展示了在實施例2中觀察到的在使用Λ FadE-、野生型(W3110)-、Δ FadL-和Λ FadE/ Δ FadL-菌株制備ALSME時在相分離時的區(qū)別。箭頭所指為十分鐘之后在突變體的情況中有機相和水相明顯的分離，相反，在使用野生型菌株時，相同時間之后還是不能辨識相分離。實施例1:以生物技術(shù)制備氨基月桂酸甲酯時使用ΛFadE-突變體加速分離水相與疏水相使用菌株W3110 AFadE[alkB-alaD-TA]和 W3110 [alkB-alaD-TA]在 DASGIP 的8聯(lián)平行發(fā)酵體系中將月桂酸甲酯生物轉(zhuǎn)化為氨基月桂酸甲酯。如W02009077461中所述，W3110[alkB-alaD-TA]是大腸桿菌W3110的一種菌株，包括一種基于pBR322的具有氧化-和轉(zhuǎn)氨化體系的質(zhì)粒，所述氧化-和轉(zhuǎn)氨化體系包括氧化還原酶AlkB、丙氨酸脫氫酶和轉(zhuǎn)氨酶。除了缺失編碼FadE的基因，W3110AFadE[alkB-alaD_TA]與后一種菌株相同，并因此該菌株沒有?；o酶A-脫氫酶活性。使用I升反應(yīng)器進行發(fā)酵。借助于兩點校準法，用pH4.0和pH7.0的標準溶液校準pH探針。將300mL飲用水注入反應(yīng)器中，在121°C溫度下高壓滅菌20分鐘，以保證無菌。接著使p02-探針在DASGIP體系上過夜(至少6小時)極化。次日早晨在凈化工作臺下移出水，并代之以含有100mg/L氨芐西林的300mL高細胞密度培養(yǎng)基。隨后用單點校準法(攪拌器:400rpm/供氣:10sL/h空氣)校準p02_探針，并且借助于就地清洗法對進料段、修正劑段和誘導(dǎo)劑段進行清洗。為此用70%乙醇、接著使用lMNaOH、然后使用滅菌去離子水沖洗軟管，最后灌入各自的培養(yǎng)基。將生產(chǎn)ALS和ALSME的大腸桿菌菌株首先由各自的低溫培養(yǎng)物在含有100mg/L氨芐西林的LB培養(yǎng)基中(25mL在IOOmL三角燒瓶中)，在37°C溫度和200rpm下過夜培養(yǎng)大約18小時。接著將每2 mL培養(yǎng)物用100mg/L氨芐西林接種在高細胞密度培養(yǎng)基中(葡萄糖15g/L(30mL/L單獨高溫高壓滅菌的500g/L母液，含有1% MgS04*7H20和2.2% NH4Cl)，(NH4)2SO4L 76g/L，K2HP0419.08g/L，ΚΗ2Ρ0412.5g/L，酵母萃取物 6.66g/L，二水合檸檬酸三鈉
2.24g/L，單獨高溫高壓滅菌的I %的母液的檸檬酸鐵銨溶液17mL/L，單獨高溫高壓滅菌的母液(HCl (37% )36.50g/L, MnCl2*4H20L 91g/L, ZnS04*7H20L 87g/L,乙二胺四乙酸二水合物 0.84g/L, H3BO30.30g/L, Na2Mo04*2H200.25g/L, CaCl2*2H204.70g/L, FeS04*7H2017.80g/L,CuC12*2H200.15g/L))的微量元素溶液5mL/L(每菌株25mL置于IOOmL三角燒瓶中)，然后在37°C /200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)5.5小時。在W3110AFadE[alkB-alaD_TA]的情況中，在600nm下的培養(yǎng)液的光密度測定為6.9，在13110[&11^-&1&014]的情況中為7.4。為了對光密度為0.1的反應(yīng)器接種，在5mL注射器中各抽取4.0mL或4.4mL( Λ FadE)(在無菌條件下)，并且借助于插管經(jīng)由用70%乙醇覆蓋的隔膜對反應(yīng)器進行接種。使用以下標準程序:
權(quán)利要求
1.方法，其包括以下步驟 a)提供含代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基， b)使水性培養(yǎng)基與疏水性有機溶液接觸， c)從水性培養(yǎng)基中分離出疏水性有機溶液， 其中，與其野生型相比，所述細胞具有至少一種降低了活性的催化脂肪酸的氧化反應(yīng)的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述催化脂肪酸的氧化反應(yīng)的酶是選自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL或其變體的酶，優(yōu)選FadE或其變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述有機溶液包含至少一種選自下列的溶劑:在室溫下為液態(tài)的取代和未取代的鏈烷烴、環(huán)烷烴、環(huán)烯烴、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、雜環(huán)烷烴、雜環(huán)烯烴和雜芳基化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述有機溶液包含具有多于12個碳原子的脂肪酸或其酯，優(yōu)選油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項所述的方法，其中所述細胞具有重組的烷烴羥化酶。
6.代謝活性細胞的用途，所述細胞用于從含所述代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液，與其野生型相比，該細胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β -氧化反應(yīng)的酶，所述酶優(yōu)選選自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其變體，更優(yōu)選FadE。
7.敲除催化脂肪酸的氧化反應(yīng)的酶的用途，所述酶優(yōu)選選自FadA、FadB,FadD,FadE和FadL或其變體，更優(yōu)選FadE變體，其作為用于從含所述代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液的代謝活性細胞的基因組成的部分。
8.細胞，與其野生型相比，該細胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶，還包含重組的單加氧酶，更優(yōu)選包含烷烴羥化酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細胞，其中所述催化脂肪酸的β-氧化反應(yīng)的酶是選自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL變體或其變體的酶，更優(yōu)選是FadE或其變體。
10.反應(yīng)混合物，其包含具有代謝活性細胞的水溶液和疏水性有機溶液，其中與其野生型相比，所述細胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反應(yīng)的酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的反應(yīng)混合物，其中所述催化脂肪酸的β-氧化反應(yīng)的酶是選自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL或其變體的酶，更優(yōu)選是FadE或其變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10 11中任一項所述的反應(yīng)混合物，其中所述疏水性有機溶液包含選自下列的至少一種溶劑在室溫下為液態(tài)的取代和未取代的鏈烷烴、環(huán)烷烴、環(huán)烯烴、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、雜環(huán)烷烴、雜環(huán)烯烴和雜芳基化合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求10 12中任一項所述的反應(yīng)混合物，其中所述疏水性有機溶液包含具有多于12個碳原子的脂肪酸或其酯，優(yōu)選油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項所述的方法,根據(jù)權(quán)利要求6 7中任一項所述的用途，或者根據(jù)權(quán)利要求10 13中任一項所述的反應(yīng)混合物，其中所述代謝活性細胞是具有重組的烷烴羥化酶和轉(zhuǎn)氨酶的細胞，此外優(yōu)選包含選自醇脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和內(nèi)酰胺水解酶的至少一種酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求I 5和14中任一項所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求6 7和14中任一項所述的用途或者根據(jù)權(quán)利要求10 14中任一項所述的反應(yīng)混合物，其中所述細胞是低級真核細胞或者原核細胞，優(yōu)選是大腸桿菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求I 5和14 15中任一項所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求6 7和14 15中任一項所述的用途或者根據(jù)權(quán)利要求10 15中任一項所述的反應(yīng)混合物，其中所述細胞是重組細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求I 5和14 16中任一項所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求6 7和14 16中任一項所述的用途或者根據(jù)權(quán)利要求10 16中任一項所述的反應(yīng)混合物，其中所述疏水性有機溶液構(gòu)成疏水性有機溶液和水性培養(yǎng)基的總體積的至少5%，優(yōu)選至少20%。
18.根據(jù)權(quán)利要求I 5和14 17中任一項所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求6 7和14 ·17中任一項所述的用途或者根據(jù)權(quán)利要求10 17中任一項所述的反應(yīng)混合物，其中，在接觸時，所述水性培養(yǎng)基的pH值在5 9，更優(yōu)選在6 8之間。
全文摘要
本申請涉及用于從水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液的方法，其包括以下步驟提供含代謝活性細胞的水性培養(yǎng)基；使水性培養(yǎng)基與疏水性有機溶液接觸；從水性培養(yǎng)基中分離疏水性有機溶液，其中與其野生型相比，所述細胞具有至少一種降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反應(yīng)的酶。本發(fā)明還涉及一種代謝活性細胞用于從水性培養(yǎng)基中更好分離出疏水性有機溶液的用途，與其野生型相比，所述細胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反應(yīng)的酶，所述酶優(yōu)選選自FadA、FadB、FadD、FadL和FadE及其變體，更優(yōu)選FadE變體或其變體。
文檔編號C07C227/40GK103254089SQ20121059941
公開日2013年8月21日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者H-G·亨內(nèi)曼, S·沙費爾, M·韋澤爾, T·哈斯, J·吉倫, K·貝澤, S·哈夫凱姆艾爾, M·波埃特厄爾, F·厄爾哈特, M·席貝爾胡特 申請人:贏創(chuàng)工業(yè)集團股份有限公司