Cyaa攜帶的多肽及其在誘導治療性和預防性免疫應答中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是基于CyaA-攜帶的多肽的方法，用于通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和用于通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)，所述免疫應答通過將所述載體攜帶的多肽給藥于所述寄主后獲得，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
【專利說明】CYAA攜帶的多肽及其在誘導治療性和預防性免疫應答中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明的目的是一種基于CyaA-攜帶的多肽的方法，用于通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和用于通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)，所述免疫應答通過將所述載體攜帶的多肽給藥于所述寄主后獲得，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。在一個【具體實施方式】中，本發(fā)明的目的是一種基于CyaA-攜帶的多肽的方法，用于(i)通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對所述哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和(ii)通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)；和(iii)通過誘導針對包含在所述多肽中的所述第一組表位的T細胞記憶性免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，所述免疫應答通過將所述載體攜帶的多肽給藥于所述寄主獲得，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
【背景技術】
[0002]導致百日咳的病原體，百日咳博代桿菌(Bordetella pertussis)產生的關鍵毒素是腺苷酸環(huán)化酶(CyaA)。小鼠模型顯示:在肺部定植的早期階段，CyaA對于細菌是必須的(Goodwin and Weiss 1990)。CyaA在入侵真核細胞中展示了獨特的機制,它通過特定模式把它的催化區(qū)遞送到細胞質溶膠中(Simsova, Sebo et al.2004)。解毒并重組的CyaA蛋白作為疫苗載體顯示了精確導向表達CDllb/CD18的抗原呈遞細胞(APC)，例如樹突狀細胞或朗格漢斯細胞的能力(Guermonprez et al.2001)。這些常駐APC是在皮下免疫途徑隨后啟動的抗原特異性T細胞應答 的關鍵天然細胞(Merad，Ginhoux et al.2008)。和⑶Ilb+APC特異性結合后，攜帶病毒性抗原或腫瘤性抗原的CyaA以特定的方式遞送它的抗原性物質(Preville, Ladant et al.2005)?；谶@個獨特的技術,本發(fā)明 申請人:已經研制了臨床階段的用于治療已感染HPV病人的二價疫苗:ProCervix。ProCervix是二價治療性疫苗,通過兩種不同CyaA疫苗的混合物制備而成:一種疫苗嵌有HPV16的E7蛋白，另一種帶有HPV18的E7蛋白。
[0003]事實上，人乳頭瘤病毒(HPV)感染一般是長期持續(xù)存在的，而且受損的寄主免疫應答可能導致宮頸癌，特別是高風險的HPV時，如HPV18和HPV16。HPV的E7腫瘤蛋白在病毒的整個復制周期中都會表達，因此選擇它們作為T細胞介導的免疫治療的靶標(Iwasaki2010)。B細胞介導的針對病毒衣殼蛋白的免疫顯示其足以實現預防HPV感染(Stanley2010)。然而，先天性的和T細胞介導的免疫對于治療已感染病毒的病人是非常關鍵的(Frazer 2009)。此外，目前已有的HPV預防性疫苗對于治療已感染HPV的病人和治愈疾病是非常低效的，因此，要增加研發(fā)能夠誘導針對HPV抗原的抗原特異性T細胞應答的治療性疫苗的重要性(Trimble and Frazer 2009)。
[0004]預防性疫苗是基于B細胞介導的免疫研發(fā)的。相比之下，治療性疫苗目的在于通過誘導強有效的促炎CD4+和CD8+T細胞應答，以獲得對慢性感染(病毒、細菌等)或癌癥的有效治療(Bachmann and Jennings 2010)。在小鼠模型和病人中的很多研究結果表明:誘導抗原特異性的T細胞免疫和預防病變細胞、已感染的細胞或腫瘤細胞是相關聯的(Pulendran, Li et al.2010 ；Sallusto, Lanzavecchia et al.2010)。通過定性和定量測量患有腫瘤的小鼠在接種治療性疫苗后的CD8+T細胞應答，可以預測治療結果，即:腫瘤在個體動物中的進化或退化(Rosato，Zoso et al.2006)。成功的治療性疫苗接種可以完全消除病變細胞，這種免疫治療處理的關鍵方面是它能夠產生長期記憶性T淋巴細胞的潛力以保護病人免于第二次病原體感染。記憶性T淋巴細胞可以分為兩個主要的細胞亞群:TEM(效應記憶性T細胞)和TeM(中樞記憶性T細胞)。Tem是適合消滅病原體的免疫應答的克隆收縮(clonal contraction)階段產生的第一類記憶性T細胞。Tem是⑶62LXCR7—T并偏好存在于外周組織，如皮膚、腸和肺部，在那里它們?yōu)榧闹魈峁┑谝坏婪谰€(Woodland andKohlmeier 2009)。最后，Tem逐漸朝向Tcm表型分化:CD62L+CCR7+。這些T淋巴細胞優(yōu)先位于次級淋巴器官中(Kaech,Hemby et al.2002 ；Ahmed,Bevan et al.2009)。然而，Tem和 Tcm在血液循環(huán)中都被發(fā)現過。CD8記憶性應答功效的關鍵方面是CD8+記憶性T淋巴細胞獲得裂解潛力的速度，并因此通過相同病原體的新的感染消滅感染的細胞以防止感染擴散和相應的疾病發(fā)展。已顯示:小鼠能夠通過抗原特異性CD8+T細胞應答的發(fā)展來清除淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)急性感染，成熟的記憶性CD8+T細胞能夠快速清除已感染的細胞(Barber et al.,2003)?
[0005]基于這些認識，發(fā)明人把涉及T細胞介導的免疫應答的治療性疫苗接種方法擴展到設計了治療性和預防性治療病理狀態(tài)的新概念，通過以設計的含有載體表位的多價免疫組合物的形式聯合給藥活性成分。
[0006]特別地，發(fā)明人設計的多價治療性疫苗適合在單個病人中，誘導針對所診斷的病理狀態(tài)進行免疫治療，并增加針對抗原或和所述治療的病理不相關的表位強有力的預防應答，和可選地增加針對所述治療的病理復發(fā)的保護性和預防性應答。
[0007]事實上，使用基于CyaA的多價治療方法突出了 CyaA攜帶的多肽具備治療以及可能消除已確定的感染或癌癥的潛能，并同時為相同的病人提供針對所述預防性保護尋求的包含在多肽中的靶表位的強大的免疫應答，優(yōu)選的是保護性T細胞記憶性應答，以及可選地，針對所述已確定的感染或癌癥復發(fā)的保護性和預防性應答。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1百日咳博代桿菌(B.pertussis)、副百日咳博代桿菌(B.parapertussis)和支氣管敗血性博代桿菌(B.Bronchiseptica)中腺苷酸環(huán)化酶(CyaA)的蛋白序列(SEQ IDNO:I到3),和百日咳博代桿菌(B.pertussis)、副百日咳博代桿菌(B.parapertussis)和支氣管敗血性博代桿菌(B.Bronchiseptica)中腺苷酸環(huán)化酶(CyaA)的核苷酸序列(SEQID NO:4 到 6)。
[0009]圖2百日咳博代桿菌(B.pertussis)、副百日咳博代桿菌(B.parapertussis)和支氣管敗血性博代桿菌(B.Bronchiseptica)中腺苷酸環(huán)化酶(CyaA)的蛋白序列比對。
[0010]圖3pkTRACE5的不意圖，其中，它相關的限制性位點和被插入的序列表不為CyaA-HPV16E7D30-42 (A)和 CyaA-HPV18E7D32_42 (B)。
[0011 ] 圖4 (A) pTRACE5的不意圖，其中，它相關的限制性位點和被插入的序列表不為CyaA-CysOVA ； (B)pkTRACE5的示意圖，其中，它相關的限制性位點和被插入的序列表示為CyaA-MAGEA397_178/19(l_295。*MAGE-A3190_295 代表融合到 MAGE-A3 的第 242 到 295 位氨基酸殘基的第190到221位殘基。編號97、178、190、221、242和295表示MAGE-A3全部序列中的氨基酸殘基位點；(C) CyaA-MAGE A3載體的蛋白序列(SEQ ID NO:7)。MAGEA3序列已用下劃線標出。限制性位點已加粗=Nhel (AS)、KpnlA (GT)、Agel (TG)和 Spel (TS)。
[0012]圖5在第11天接種含有佐劑的ProCervix治療性免疫疫苗消除了確定的TC-1誘導的實體瘤。在監(jiān)控后期:接種PBS+Aldara?的一組小鼠顯示3/10的小鼠出現腫瘤退化(A),只接種8yg ProCervix疫苗的一組小鼠顯示0/10的小鼠出現腫瘤退化(B)。接種ProCervix疫苗聯合Aldara?佐劑(外用咪喹莫特)(C)或Poly-1CLC (D)顯示7/10的小鼠出現腫瘤退化。
[0013]圖6在第50天接種含有佐劑的ProCervix治療性免疫疫苗能夠同時導致小鼠的存活率高和高比例的不成瘤小鼠。在第50天，接種ProCervix+Aldara?或ProCervix+Poly-1CLC的小鼠顯示沒有腫瘤(A)。關于在第50天的存活率:在第11天時接受ProCervis+Aldara?和 ProCervix+Poly-1CLC 的小鼠的存活率分別為 100%和 70% ⑶。
[0014]圖7無腫瘤的小鼠免疫接種含有佐劑的ProCervix疫苗治療六天后，顯示具有功能性的HPV16E749_57和HPV18E7AS43_49特異性記憶性CD8+T細胞。在第60天把在不同組的不成瘤的小鼠以1:1:1比例靜脈注射CFSEhiHPV16E749_57脈沖靶細胞，CFSEin非脈沖靶細胞和CFSE1()HPV18E7as43_ 49脈沖靶細胞。過夜后，小鼠被施以安樂死，收集脾臟并通過FACS分析檢測抗原特異性體內細胞毒性。每個點代表從單個小鼠獲得的結果；空心圓代表HPV18已7_3_49脈沖靶細胞殺傷的比例；實心圓代表HPV16 E749_57脈沖靶細胞殺傷的比例。橫線代表每組小鼠的平均值。
[0015]圖8接種疫苗的總體示意圖(D代表天數)；該表格總結所接種的細胞和疫苗的性質和位置(/:沒有接種)。
[0016]圖9接種嵌有HPV16E7抗原的CyaA雙價疫苗聯合Aldara?佐劑的治療性疫苗，導致消除了 TC-1誘導產生的實體瘤。從第O天(Dtl)到第100天(D1J，記錄每組10只小鼠右腋(right flank)的腫瘤樣TCl細胞的體積(mm3)。第I組小鼠接種安慰劑，第2組小鼠接種安慰劑 +Aldara?，第 3 組小鼠接種 CyaA-MAGEA397_178/19(l_295/CyaA-HPV16 E7 疫苗聯合Aldara?佐劑，第4組小鼠接種CyaA-cys0VA/CyaA_HPV16 E7疫苗聯合Aldara?佐劑，第5組和第6組小鼠接種ProCervix疫苗聯合Aldara?佐劑。每幅圖右側的編號對應每組中每只小鼠指定的編號。
[0017]圖10接種基于CyaA的二價疫苗使得含有TCl誘導產生的腫瘤獲得痊愈的小鼠，能夠以抗原特異性模式獲得預防其他不相關的腫瘤攻擊。對于從TCl攻擊中存活的小鼠，從第60天(D6tl)到第100天(Dltltl)記錄其左腋中腫瘤樣細胞B16 MAGE A3的體積(a和c)或腫瘤樣細胞EG7-0VA的體積(b和d)。每幅圖右側的編號對應在TCl攻擊中每只小鼠之前指定的編號。
【發(fā)明內容】

[0018]本發(fā)明的目的是方法，用于(i)對哺乳動物寄主第一確定的病理狀態(tài)的進行免疫治療；和(ii)預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)；和(iii)可選地，防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)。該免疫應答(i)通過誘導針對包含在作為活性成分的多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來治療所述經診斷的病理狀態(tài)；(ii)通過誘導針對包含在作為活性成分的多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答以預防所述第二確定的狀態(tài)的發(fā)生或發(fā)展；(iii)可選地，通過誘導針對所述第一組表位中的T細胞記性憶免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，所述免疫應答通過將所述載體攜帶的多肽給藥于所述寄主獲得，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。這些途徑包括:
[0019](I)作為活性成分的載體攜帶的多肽，其中所述攜帶多肽的載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中；
[0020](2)包含或者含有這種活性成分的組合物，包括包含如(I)中定義的載體攜帶的多肽以及藥學上可接受的載體或配方的組合物；和
[0021] (3)組合物包含含有第一組表位的第一載體攜帶的多肽和含有第二組表位的的第二另外的載體攜帶的多肽。
[0022]因此，在第一個實施方式中，本發(fā)明涉及載體攜帶的多肽，其中所述攜帶多肽的載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，用于(i)通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對所述哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和(ii)通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)和(iii)可選地，通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞記憶性免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，所述免疫應答通過將所述載體攜帶的多肽給藥于所述寄主獲得，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定病理狀態(tài)的所述預防。
[0023]該發(fā)明涉及一種組合物，包含與藥學上可接受的載體聯用的載體攜帶的多肽，其中所述攜帶多肽的載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，用于(i)通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對所述哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和(ii)通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)，和(iii)可選地，通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞記憶性免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，所述免疫應答通過將所述組合物給藥于所述寄主獲得，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的組合物含有的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
[0024]本發(fā)明同樣涉及一個組合物，可選地結合藥學上可接受的載體，包含:
[0025](a)第一載體攜帶多肽，所述攜帶多肽的第一載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，其中第一組表位包含在所述第一載體中的所述多肽中；[0026](b)第二另外載體攜帶的多肽，其中所述攜帶多肽的第二載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，其中第二組表位包含在所述第二載體中的所述多肽中；和
[0027](c)可選地，一種或多種與(a)和(b)不同的另外的載體攜帶的多肽，
[0028]用于(i)和所述第一組表位相關的病理聯合免疫治療中；和(ii)和所述第二組表位相關的免疫預防治療和(iii)可選地，預防所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的組合物含有的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
[0029]在【具體實施方式】中，所述含有(a)，(b)和(C)的組合物用于⑴通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對所述哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和(ii)通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)，和(iii)可選地，通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞記憶性免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，所述免疫應答通過將所述組合物給藥于所述寄主獲得。
[0030]術語“CyaA”源自博代桿菌屬(Bordetella)，特別是源自百日咳博代桿菌(Bordetella.pertussis)、副百日咳博代桿菌(Bordetella.parapertussis)和支氣管敗血性博代桿菌(Bordetella.bronchiseptica)的腺苷酸環(huán)化酶(或腺苷酸環(huán)化酶)。百日咳博代桿菌(Bordetella.pertussis)的腺苷酸環(huán)化酶蛋白是有1706個殘基(SEQ ID NO:1)的毒素，包含有400個氨基酸殘基的N端催化結構域和有1306個殘基的C末端。C末端負責把毒素結合到靶細胞膜上并隨后將催化部分遞送到目標細胞質溶膠中。百日咳博代桿菌(Bordetella.pertussis)中CyaA的序列見圖1。副百日咳博代桿菌(B.parapertussis)和支氣管敗血性博代桿菌(B.bronchiseptica)的CyaA蛋白含有1740個氨基酸,它們各自的序列(SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3)見圖1。
[0031]術語“CyaA片段”是指CyaA蛋白中的一部分，可選地，包含CyaA蛋白全長序列中的C端的全部或一部分，所述片段能夠將所述多肽呈遞到哺乳動物寄主中的免疫系統中，即，能夠導致誘導針對包含在載體攜帶的多肽中的表位的特異性免疫應答或者有助于所述應答。特別地，所述CyaA片段能夠特異性地結合到表達CDllb的細胞和可選地，將所述多肽遞送到細胞質溶膠中。所述片段包含一個截短的(從N端和/或C端末端刪除)CyaA蛋白，或內部刪除氨基酸殘基的全長蛋白。因此，根據本發(fā)明，CyaA蛋白中的特定片段包含百日咳博代桿菌(B.pertussis)CyaA蛋白第372到1706位氨基酸殘基(刪除前371位氨基酸殘基)。另一特定片段是百日咳博代桿菌(B.pertussis)CyaA蛋白中的第225到234位氨基酸殘基被刪除，因此獲得包含第I到第224位氨基酸殘基和第235到1706位氨基酸殘基(內部刪除)的片段。術語“特異性地”在本發(fā)明中指，腺苷酸環(huán)化酶或它的片段當用作載體分子時，優(yōu)選導向表達CDlIb的細胞，因此，相比其他細胞(不表達CDlIb)，以一種選擇性方式提供導向位于所述細胞表面或細胞內部的多肽的方式。
[0032]術語“CyaA”也包含CyaA蛋白或它的修飾后片段，優(yōu)選通過一個或多個氨基酸替換，氨基酸內部插入或氨基酸內部刪除，以獲得解毒的或無毒的產品或沒有酶活性的產品(侵入性和細胞毒性)。因此，這樣的CyaA蛋白(或它的片段)沒有催化活性，但是其將所述多肽呈遞到哺乳動物寄主的免疫系統中，和可選地特異結合到CDllb/CD18受體和/或把初始CyaA蛋白的催化區(qū)域易位的過程沒有受到影響。無毒的CyaA蛋白已知的例子是百日咳博代桿菌(Bordetella.pertussis)的CyaA,其中將二肽Leu-Gln插入到天冬氨酸188和異亮氨酸189位氨基酸殘基(催化位點的必要部分)之間的框中。根據Ladant etal.(1992)所述的方法，可以檢測該CyaA蛋白(或它的片段)中缺失的毒性或酶活性。特別是根據EP 03291486或WO 02/22169中所述的方法，可以檢測該CyaA蛋白(或它的片段)靶向⑶Ilb/⑶18細胞的能力。此外，通過WO 02/22169中所述的方法可以檢測該CyaA蛋白(或它的片段)將抗原多肽轉運到靶細胞的胞質溶膠內的能力。
[0033]在進一步具體的實施方式中，術語“CyaA”同樣包含:經翻譯后修飾的CyaA蛋白(或它的片段)，例如通過翻譯后軟脂?；?palmitoyation)其至少一個殘基，特別是兩個內在賴氨酸殘基(860位和983位賴氨酸)。這些翻譯后修飾可以通過cyaA基因和cyaC基因共同表達獲得。因此，包含在載體攜帶的多肽中的CyaA蛋白或它的片段，可能是細胞中，特別是在重組細胞中，cyaA和cyaC基因共表達獲得的CyaA蛋白或它的片段。
[0034]在本申請中用到的術語“載體”或“載體分子”包含此處描述的修飾的或沒有修飾的的全長CyaA蛋白，或它的片段。
[0035]術語“⑶Ilb表達細胞”是指其表面表達⑶Ilb/⑶18受體的細胞(⑶Ilb+)。具體的，這些細胞是粒細胞/中性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、T CD8+的亞類、B細胞的亞類、朗格漢斯細胞、樹突狀細胞和髓樣樹突狀細胞。
[0036]術語“載體攜帶的多肽”是指CyaA蛋白(或它的片段)其攜帶至少一種與CyaA蛋白異種的多肽，特別是和文中定義的CyaA片段不同的多肽，尤其是不能和CyaA產生免疫交叉反應的多肽。術語“至少一種”是指一種或多種多肽，具體是:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種多肽，優(yōu)選1、2或3種多肽。
[0037]術語“攜帶”包含與根據本發(fā)明的CyaA蛋白或它的片段以及多肽相關的多種多樣的結構。這些結構可以通過以 下方法實現:
[0038]-根據本發(fā)明，把至少一種多肽化學耦聯到CyaA蛋白或它的片段。化學耦聯多肽到CyaA或它的片段的方法在本領域是已知的，包括例如通過二硫鍵，優(yōu)選通過使用N-吡啶磺基活化的巰基的二硫鍵。由于天然的CyaA蛋白的一級序列中沒有半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基被基因導入CyaA蛋白，特別是它的催化區(qū)域，優(yōu)選導入到如下定義的許可位點中(例如235位)或者CyaA的一個末端；和
[0039]-把至少一種多肽通過基因連接或基因融合到CyaA蛋白或它的片段。該基因連接或基因融合包括把編碼至少一種根據本發(fā)明的多肽的核苷酸通過基因插入整合到到編碼CyaA蛋白或它的片段的核苷酸中(即CyaA蛋白的構架沒有移動)，優(yōu)選地，插入到CyaA蛋白的催化區(qū)域，從而獲得重組蛋白。因此，至少一種多肽能夠插入到CyaA蛋白的任意許可位點(見WO 93/21324)。此處所用到的術語“許可位點”是指多肽可以插入同時基本不會影響腺苷酸環(huán)化酶的預期功能特性的位點，即不會影響CyaA蛋白呈遞所述多肽到哺乳動物寄主的免疫系統的能力，特別是不會影響與CDllb/CD18受體特異性結合的能力，和可選地，不會影響把多肽轉移到靶細胞細胞質溶膠的能力。百日咳博代桿菌(Bordetella.pertussis)腺苷酸環(huán)化酶的許可位點包括但不限于:107-108 (甘氨酸-組氨酸),132-133 (甲硫氨酸-丙氨酸)，137-138 (纟顏氨酸-丙氨酸)，224-225 (精氨酸-丙氨酸)，228-229 (谷氨酸-丙氨酸)，232-233 (甘氨酸-亮氨酸)，235-236 (精氨酸-谷氨酸)，317-318 (絲氨酸-丙氨酸)和335-336 (甘氨酸_谷氨酰胺)(Sebo et al.，1985 ；Glaseret al., 1988)。對于另外的博代桿菌屬(Bordetella sp.),相應的許可位點可以通過比對序列來定義并決定相應的殘基(圖2)。根據另一個實施方式，基因連接也包括將編碼至少一種多肽的核苷酸融合到CyaA蛋白或它的片段的一個末端和/或其它末端。
[0040]當一種CyaA蛋白(或它的片段)攜帶超過一種多肽時，這些多肽可能全部通過化學耦聯攜帶，或全部通過基因連接攜帶(優(yōu)選全部為基因插入)，或它們中的一種是通過化學耦聯攜帶的，而其他的則通過基因連接攜帶。在具體的實施方式中，當全部的多肽都通過基因插入到CyaA，優(yōu)選插入到CyaA的許可位點時，這些多肽插入到不同的位點，優(yōu)選插入到不同的許可位點。在另一個具體的實施方式中，當全部的多肽都通過基因插入到CyaA，優(yōu)選插入到CyaA的許可位點時，這些多肽插入到相同的位點，優(yōu)選插入到相同的許可位點。
[0041]術語“多肽”是指氨基酸連接在一起而形成的，并且至少有9個氨基酸殘基，特別是長度為9到500個殘基，9到200個殘基，9到100個殘基，9到50個殘基，或長度為30或50到500個或到200個殘基，或100到500個殘基，或100到200個氨基酸殘基。在本發(fā)明中，術語“多肽”是指多肽一旦被載體分子攜帶，能夠誘導針對包含在該多肽中的表位的免疫應答，特別是T細胞免疫應答。包含在載體分子中的多肽可能源自腫瘤抗原，即腫瘤或癌細胞表達的多肽，不論該腫瘤是自體誘導或經病原體誘導產生的；腫瘤抗原可以是自體(特別是來自人類)或來自誘導產生腫瘤的病原體。
[0042]術語“腫瘤抗原”包含以下幾組腫瘤抗原，本發(fā)明中包含在載體分子中的多肽從以下幾組中選擇至少一組:(a)瘤胎腫瘤抗原，(b)腫瘤病毒(oncoviral)腫瘤抗原，(c)過表達/累積腫瘤抗原，在正常組織中廣泛表達和在腫瘤中過表達，(d)腫瘤特異性共享抗原或癌-睪丸共享抗原，在很多腫瘤中表達但不在正常組織中表達(包括BAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族和XAGE家族)，(e)細胞系限制性腫瘤抗原，(f)突變的腫瘤抗原，由在機體中廣泛表達的基因點突變造成的；和(g)腫瘤抗原分化，在腫瘤起源但非腫瘤特異性的正常組織中表達。
[0043]在具體的實施方式中，當超過一種多肽在單個載體分子中用于誘導免疫治療應答，或在單個的載體分子中 用于誘導免疫預防應答時，所有的多肽都源自于腫瘤抗原。
[0044]在另一個實施方式中，包含在載體分子中的多肽可能或是源自病原體的抗原，SP由已感染的哺乳動物寄主中的病原體產生的抗原，也可能是在所述已感染的哺乳動物寄主細胞處理而成或是所述病原體的成分。病原體抗原可以是細菌抗原，病毒抗原，真菌抗原或寄生蟲抗原。在這些例子中，作為具體的實施方式，可以區(qū)分涉及腫瘤發(fā)生(致癌病原體)的病原體以及不涉及腫瘤發(fā)生的病原體。病原體的例子是細胞內病原體，特別是可以在它們的寄主體內誘導T細胞免疫應答的病原體。因此，這些多肽可能源自但不限于:衣原體(Chlamydia)、痕原蟲(Plasmodium)、利什曼蟲(Leishmania)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、腺病毒(adenoviruses)、埃博拉病毒(EBV)、皰疫病毒(herpes virus)、人體T細胞白血病病毒(HTLV.1)和巨細胞病毒(CMV)。在具體的實施方式中，包含在載體分子中的多肽可能源自病原體的表面蛋白(如HIV的包膜蛋白)或源自可以和已感染的細胞的系統相互作用的多肽。(例如人乳頭狀瘤病毒(HPV)的E6或E7蛋白)。[0045]在具體的實施方式中，當超過一種多肽用于單個載體分子或和載體的組合中時，全部的多肽都源自病原體的抗原，可能是截然不同的病原體、屬或種。
[0046]在具體的實施方式中，包含在載體分子中的多肽全部源自細菌抗原，全部源自病毒抗原，全部源自真菌抗原或全部源自寄生蟲抗原。在另一個實施方式中，包含在此處描述的載體分子中的不同的多肽獨立地源自細菌抗原，病毒抗原，真菌抗原或寄生蟲抗原。在另一個實施方式中，在單個載體分子或載體的組合中的多肽，源自腫瘤和源自病原體。
[0047]術語“源自”是關于由載體分子攜帶的多肽，意思是全長抗原蛋白或抗原蛋白的片段，或由抗原蛋白的若干部分融合形成的合成的、非天然的攜帶表位的多肽，或由一個或若干個來自若干蛋白的部分融合形成的合成的、非天然的多肽，條件是該片段或該合成的、非天然的多肽，一旦由載體分子攜帶，能夠誘導針對包含在該片段或多肽中的抗原決定簇的免疫應答，特別是T細胞免疫應答。根據該定義，由載體分子攜帶的多肽是或包含獨特的表位，或是或包含一組表位。術語“表位組”包含至少一種表位，即一種或多種表位，特別是10到500種表位，50到200種表位，80到150種表位。在具體的實施方式中，術語“表位組”指1，2，3，4，5，6，7，8，9或10種表位。在具體的實施方式中，由載體分子攜帶的多肽是或包含多表位，即多肽含有至少兩個表位，特別是至少兩個T細胞表位。本發(fā)明中的表位是線性或構象的，優(yōu)選線性的，是涉及誘導細胞介導的免疫應答，特別是T細胞免疫應答的任意氨基酸序列。相應地，此處描述的載體攜帶的多肽中的表位包含由寄主中的抗原呈遞細胞處理過的表位，特別是可以與主要組織相容性復合體I型分子結合被識別的T表位，例如靶細胞是CD8+T淋巴細胞的表位，或可以與主要組織相容性復合體II型分子結合被識別的T表位，例如靶細胞是CD4+T淋巴細胞的表位。在具體的實施方式中，多肽也包含涉及體液應答的B表位。在具體的實施方式中，載體分子攜帶多肽由若干不同的或若干相同的表位組成，或包含若干不同的或若干相同的表位。
[0048]根據本發(fā)明，載體攜帶的多肽包含至少兩組不同的表位，即一組表位能夠誘導T細胞免疫反應用于對哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，然而第二組表位能夠誘導T細胞記憶性免疫應答用于預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)。在具體的實施方式中，第一組表位除了誘導T細胞應答，從而為哺乳動物寄主經診斷的第一確定的病理狀態(tài)提供免疫治療，可選地，還可以誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞記憶性免疫應答，從而防止第一確定的病理狀態(tài)復發(fā)。
[0049]根據本發(fā)明，所述載體攜帶的多肽中缺失第二組表位時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。這意味著文中定義的第二組表位對于獲得預防第二確定的病理狀態(tài)是必須的。
[0050]在具體的實施方式中，第二組表位(存在于載體攜帶的多肽中)是必須的也足以獲得對第二確定的病理狀態(tài)的預防；在這個實施方式中，唯一的第二組表位在誘導免疫應答中的貢獻足以獲得對第二確定的病理狀態(tài)的預防。換句話說，給藥于所述第二組表位和所述預防應答之間的關系之間存在因果關系。
[0051]在另一個實施方式中，第二組表位(存在于載體攜帶的多肽中)對于獲得針對第二確定的病理狀態(tài)的預防是必須的，但僅第二組表位不足以獲得該預防或需要借助第一組表位的貢獻，意思是針對第二確定的病理狀態(tài)的預防可以通過以下由第二組表位誘導的免疫應答和由第一組表位誘導的免疫應答產生的協同作用獲得。在后一個例子中，兩組表位的貢獻對于獲得預防第二確定的病理狀態(tài)時必須的。
[0052]第二組表位對于預防[術語預防定義見下文]第二確定的病理狀態(tài)的必要貢獻可以通過本發(fā)明中載體攜帶的多肽的給藥對以下兩組哺乳動物特別是以下兩組小鼠的第二確定的病理狀態(tài)的效應對比來證明:(1)給藥本申請中不包含第二組表位的載體攜帶的多肽的哺乳動物和(2)給藥本申請中包含第二組表位的載體攜帶的多肽的哺乳動物。
[0053]“其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防”，正如上述表述所理解的，它排除了文中定義的第一組表位足以(即單獨的)獲得針對第二確定的病理狀態(tài)的預防。
[0054]因此，在具體的實施方式中，第一組表位的氨基酸序列(或由第一組表位組成的多肽)和第二組表位的氨基酸序列(或由第二組表位組成的多肽)是不同的。術語“不同”是指雙方序列，通過計算多肽的全長序列(總體對比計算，例如通過Needleman和Wunsch算法)相差至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，或至少95 %。在另一種定義或具體的實施方式中，所述“不同的序列”至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%的第一組表位的序列不同于第二組表位的序列。在進一步具體的實施方式中，第一和第二組表位(或由第一組表位組成的多肽和由第二組表位組成的多肽)沒有共同的表位序列。在具體的實施方式中，針對第一組表位的T細胞免疫應答能夠有效預防和所述第一組表位相關的病理狀態(tài)，但不能有效預防或不能特別有效預防和第二組表位相關的病理狀態(tài)。因此，在具體的實施方式中，針對一組表位產生的T細胞免疫應答對該組表位是特異性的，即針對此組表位產生的免疫應答涉及的T細胞不能識別其他組的表位。
[0055]在具體的實施方式中，該多肽包含至少一種源自人乳頭狀瘤病毒株(HPV)的表位，特別是選自以下的HPV株:α -乳頭狀瘤病毒屬(Alpha-papiI1mavirus)、β _乳頭狀瘤病毒屬(Beta-papiI1ma virus)、Y-乳頭狀瘤病毒屬(Gamma-papiI1mavirus) >δ_乳頭狀瘤病毒屬(Delta-papi I 1mavirus)、ζ -乳頭狀瘤病毒屬(Zeta-papiI1mavirus)、η-乳頭狀瘤病毒屬(Eta-papiI1mavirus)、Θ-乳頭狀瘤病毒屬(Theta-papiI1mavirus)、ι -乳頭狀瘤病毒屬(lota-papiI1mavirus)、κ -乳頭狀瘤病毒屬(Kappa-papi I 1mavirus)、λ -乳頭狀瘤病毒屬(Lambda-papi I 1mavirus)、μ-乳頭狀瘤病毒屬(Mu-papiIlomavirus)、v -乳頭狀瘤病毒屬(Nu-papiI1mavirus)、ξ -乳頭狀瘤病毒屬(X1-papi I lomavirus)、Q _ 乳頭狀瘤病毒屬(Omikron-papi I lomavirus)和π-乳頭狀瘤病毒屬(P1-papi I lomavirus)。在具體的實施方式中，首選具有人類趨向性的乳頭狀瘤病毒，例如et-乳頭狀瘤病毒屬(Alpha-papi I lomavirus)、β-乳頭狀瘤病毒屬(Beta-papi I lomavirus)、Y -乳頭狀瘤病毒屬(Gamma-papi I lomavirus)、μ -乳頭狀瘤病毒屬(Mu-papi I lomavirus)或v-乳頭狀瘤病毒屬(Nu-papi I lomavirus)。在更具體的實施方式中，多肽包含至少一種來自et-乳頭狀瘤病毒屬(Alpha-papi I lomavirus),特別是來自et-乳頭狀瘤病毒屬(Alpha-papi I lomavirus)的第7和第9種人乳頭狀瘤病毒株(HPV)的表位(de Villiers et al.Virology 2004)。因此,多肽包含至少一種源自人乳頭狀瘤病毒株(HPV)高度致癌型種型的表位，例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52或HPV58。在這些種型中，對HPV18和HPV16特別感興趣的。在實施方式中，文中描述的載體分子攜帶的多肽源自從上述提及的類型中選出的不同的HPV株或HPV種型。在另一個具體的實施方式中，其源自L1、L2、El、E2、E4、E5、E6或E7蛋白的多肽，無論來自哪種HPV株或HPV種型，對于含有源自HPV株或HPV種型的E6或E7蛋白的表位的多肽都特別感興趣。在具體的實施方式，如文中描述的載體分子攜帶的多肽源自相同的HPV蛋白，但是源自從上述提及的類型中選出的不同的HPV株或HPV種型。在本發(fā)明的具體的實施方式中，HPV16的E6或E7蛋白和HPV18的E6或E7蛋白，優(yōu)選HPV16和HPV18的HPV模式種的E7蛋白用于設計多肽。根據本發(fā)明的具體的實施方式，載體分子攜帶若干多肽，優(yōu)選基因插入的多肽，每個都包含源自至少兩種截然不同HPV株或HPV種型中的一種或若干種HPV蛋白中的一種至若干種表位，或由源自至少兩種截然不同HPV株或HPV模式中的一種或若干種HPV蛋白中的一種至若干種表位組成。因此，具體的實施方式是載體分子攜帶的多肽是由攜帶一種多肽或若干多肽的CyaA蛋白或它的片段組成，其多肽包含源自HPV16和HPV18兩種HPV種型中的E6或E7蛋白表位。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種組合物，包含攜帶一到若干種多肽的第一載體分子，其多肽包含源自HPV16的E6或E7蛋白表位(第一載體攜帶的多肽包含第一組表位)和另一種包含一到若干種多肽的載體分子，其多肽包含源自HPV18的E6或E7蛋白表位(另一種載體分子攜帶的多肽包含第二組表位)。當單個的載體分子攜帶若干多肽時，這些多肽可能由相同蛋白的不同部分組成，如E7或E6蛋白，這些部分插入載體分子不同的位點，特別是許可位點。[0056]因此，本發(fā)明中使用的組合物包含載體攜帶的源自HPV16的E7蛋白的多肽，以及載體攜帶的源自HPV18的E7蛋白的多肽。該組合物的例子包含:[0057](a)第一載體分子攜帶第一多肽，該第一多肽是包含第I到29位殘基的片段，或是由源自HPV16的E7蛋白的第I到29位殘基組成的片段，該載體分子還攜帶第二多肽，該第二多肽是包含第43到98位殘基的片段，或是由源自HPV16的E7蛋白的第43到98位殘基組成的片段。在優(yōu)選的實施方式中，為HPV16的E7蛋白的前29位氨基酸殘基的第一多肽插入到CyaA第319位和320位密碼子之間，由HPV16的E7蛋白的第43到98位殘基組成的第二多肽插入到CyaA第224位和235位密碼子之間(例如:PKTRACE5-HPV16E7a3(i_42載體)；和[0058](b)分離的載體分子攜帶第一多肽，該第一多肽是包含HPV18的E7蛋白的第I到31位殘基的片段或是由HPV18的E7蛋白的第I到31位殘基組成的片段，該載體分子還攜帶第二多肽，該第二多肽是包含HPV18的E7蛋白的第43到105位殘基的片段或是由HPV18的E7蛋白的第43到105位殘基組成的片段。在優(yōu)選的實施方式中，為HPV18的E7蛋白的前31位氨基酸殘基的第一多肽插入到CyaA第319位和320位密碼子之間，由HPV18的E7蛋白的第43到105位氨基酸殘基組成的第二多肽插入到CyaA第224位和235位密碼子之間(例如:PKTRACE5-HPV18E7a32_42 載體)。[0059]在另一個實施方式中，包含至少一種源自MAGE A3腫瘤抗原表位的多肽，例如由MAGE A3的第97到178位殘基組成的多肽(SEQ ID NO:8)，或例如由MAGE A3的第190到221位殘基與第242到295位殘基(SEQ ID NO:9)融合而成的多肽。在具體的實施方式中，本發(fā)明中載體攜帶的多肽(或組合物中包含的多肽)由CyaA蛋白，優(yōu)選百日咳博代桿菌(Bordetella.pertussis)的CyaA組成,其中源自MAGE A3的兩個多肽插入到兩個不同的位點。這種載體攜帶的多肽由百日咳博代桿菌(Bordetella.pertussis)的CyaA組成，其中(I)由MAGE A3的第97到178位殘基組成的第一多肽插入到CyaA第319位和320位密碼子之間，和⑵由MAGE A3的第190到第221位殘基與第242到第295位殘基融合組成的第二多肽插入到CyaA第234位和235位之間。CyaA-MAGE A3載體的具體的例子見圖4C (SEQ ID NO:7)。
[0060]文中定義的載體攜帶的多肽，所述多肽或包含在組合物中，用于在相同的哺乳動物寄主，特別是人類寄主中:(i)通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對所述哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和(ii)通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)和(iii)可選地，通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞記憶性免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，所述免疫應答通過將所述載體攜帶的多肽給藥于所述寄主獲得，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定病理狀態(tài)的所述預防。根據本發(fā)明的實施方式，由載體分子攜帶的文中定義的多肽，根據所需求的表位類型而被選擇，表位可以分為以下兩組:
[0061]-第一組表位涉及源自抗原的多肽，該抗原能夠被表達或呈遞給感染特定病原體的哺乳動物寄主的免疫系統，發(fā)育成為特定的腫瘤或呈現第一確定的病理狀態(tài)，在給藥載體攜帶的多肽或文中定義的組合物之前，所述哺乳動物寄主已經被診斷所述特定感染、所述特定腫瘤或所述第一確定的病理狀態(tài)；和
[0062]-第二組表位涉及源自抗原的多肽，該抗原能夠被表達或呈遞給感染另一特定病原體的哺乳動物寄主的免疫系統，發(fā)育成為另一種特定的腫瘤或呈現第二確定的病理狀態(tài)，在給藥載體攜帶的多肽或或此定義的組合物之前，所述哺乳動物寄主沒有感染或沒有已經感染所述另一種特定病原體，沒有發(fā)展成所述另一種特定類型的腫瘤或沒有呈現所述第二確定的病理狀態(tài)。
[0063]該發(fā)明源于以下觀察:
[0064](i)通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對所述哺乳動物寄主中所診斷的第一 確定的病理狀態(tài)進行免疫治療；
[0065](ii)通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)；
[0066](iii)可選地，通過誘導針對包含在所述由載體分子攜帶的多肽中的第一組表位的T細胞記憶性免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)；
[0067]由相同的載體分子攜帶或由不同的載體分子攜帶的所述第二組表位，和第一載體分子在相同的組合物中同時被給藥。
[0068]因此，文中定義的載體分子或存在于組合物中的載體分子，或組合物中的載體分子攜帶至少一種，優(yōu)選一種，包含第一組表位的多肽和至少一種包含第二組表位的多肽。在其他實施方式中，文中定義的載體分子或組合物中的載體分子，或組合物中的載體分子攜帶(a) —種包含第一組表位的多肽和至少一種包含第二組表位的多肽，(b) —種包含第一組表位的多肽和至少一種包含第二組表位的多肽，該至少一種多肽可以選自I種、2種、3種、4種、5種或6種多肽，(c)至少一種包含第一組表位的多肽，該至少一種多肽可以是2種或3種多肽，和至少一種包含第二組表位的多肽，和(d)至少一種包含第一組表位的多肽，該至少一種多肽可以是2種或3種多肽，和至少一種包含第二組表位的多肽，該至少一種多肽可以是I種、2種、3種、4種、5種或6種多肽。[0069]當一種載體分子攜帶的多肽使用或用于組合物中時，該載體可能攜帶一種包含第一組表位和第二組表位的多肽，即所述第二組表位包含在和第一組表位相同的多肽中。
[0070]在另一個實施方式中，所述第一和第二組表位包含在不同的多肽中。包含第一組表位的多肽和包含第二組表位的多肽可能是由相同的載體分子攜帶。在另一個實施方式中，包含第一組表位的多肽和包含第二組表位的多肽可能由不同的載體分子攜帶，并包含在同一組合物中。當使用包含第一和第二不同的載體攜帶的多肽的組合物時，第一載體分子攜帶至少一種包含第一組表位的多肽，是指包含最低含量的第一組表位的多肽是由所述第一載體分子攜帶。在相同的組合物中，第二載體分子攜帶至少一種包含第二組表位的多肽，是指包含最低含量的第二組表位的多肽是由所述第二載體分子攜帶。最終，不管這些載體攜帶的多肽含有多少組表位，所述組合物可能可選地包含一種或多種(例如:1、2、3、4、5或6種)載體攜帶的多肽。
[0071]術語“免疫應答”，是指細胞介導的免疫應答，特別是T細胞介導的免疫應答。在具體的實施方式中，所述T細胞介導的免疫應答是細胞介導的細胞毒性免疫應答(CTL)，特別是CD8+免疫應答。例子是源于腫瘤抗原的多肽，該免疫應答優(yōu)選是腫瘤特異性細胞毒性免疫應答，涉及腫瘤特異性的細胞毒性淋巴細胞。在具體的實施方式中，所述T細胞介導的免疫應答是CD4+免疫應答，特別是輔助T細胞免疫應答。在具體的實施方式中，在給藥載體攜帶的多肽或文中定義的組合物之后產生的免疫應答，特別是針對第二組表位(如文中定義的)的免疫應答，是一種記憶性T細胞免疫應答。除了上述定義的細胞介導的免疫應答，術語“免疫應答”可能還包括體液免疫應答(產生抗體)。本申請中討論的免疫應答是通過本發(fā)明中載體攜帶的多肽或組合物中載體攜帶的多肽給藥于寄主中獲得。
[0072]術語“免疫治療”是指，通過誘導針對包含在所述被給藥的載體分子攜帶的多肽中的第一組表位的特別是T細胞免疫應答用于治療哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)。使用所述的載體攜帶的多肽或組合物的目的在于改善哺乳動物寄主的臨床狀態(tài)，該哺乳動物寄主已被診斷感染病原體或正處于病理狀態(tài)，例如腫瘤，或目的在于消除或降低該病的致病抗原或有機體。在感染病原體的情況下，免疫治療將導致感染部位或病原體復制部位的病原體數量顯著降低，特別是寄主的血漿或粘膜部位，也可能導致病原體數量，例如血漿數量，少于之前檢測的數 量，或者可能導致腫瘤大小降低或延緩腫瘤增長。
[0073]術語“免疫預防”或“預防”是指通過誘導針對文中定義的被給藥的載體分子攜帶的多肽中包含的第二組表位的特別是T細胞的免疫應答，預防或保護機體免于暴露、感染、發(fā)生或發(fā)展相同哺乳動物寄主第二確定的病理狀態(tài)、疾病或臨床癥狀。使用文中定義的載體攜帶的多肽或組合物導致了針對未來感染、未來病情惡化或疾病的預防性免疫應答，從而相應的防止所述哺乳動物寄主的病理狀態(tài)發(fā)生。
[0074]應答對于預防的功效可以通過檢測病理狀態(tài)的標記物檢測。在具體的實施方式中，選定相應的功效標準以滿足統計相關性，。
[0075]術語“防止復發(fā)”是指通過誘導免疫應答使得機體免于未來新的暴露，未來新的感染，第一確定的病理狀態(tài)未來新的開始或未來新的發(fā)展，該第一確定的病理狀態(tài)之前已經診斷并已通過給藥文中定義的載體攜帶的多肽或組合物治療。
[0076]術語“哺乳動物”包含全部的哺乳動物，特別是靈長類和人類(例如病人)。
[0077]應該理解，給藥文中定義的載體攜帶的多肽或組合物后，能夠在同一個哺乳動物寄主在特定的時間窗內誘導針對第一組表位的T細胞免疫應答和針對第二組表位的T細胞記憶性免疫應答和針對第一組表位可選地應答。因此，至少給藥一次文中定義的載體攜帶的多肽或組合物，導致誘導針對第一表位的T細胞免疫應答和針對第二組表位的T細胞記憶性免疫應答和針對所述第一組表位可選地記憶性T細胞免疫應答，這可以通過檢測給藥后I到12個月或更久時間(特別是2、3、6、9或12個月)證實，雖然涉及這兩種免疫應答中的一種或兩種的T細胞在給藥若干年后仍可以被證實。術語“至少給藥一次”或“給藥一次”是指將文中定義的載體攜帶的多肽或組合物給藥到哺乳動物寄主，尤其是病人，給藥一次或多次，優(yōu)選I到2次。每次給藥至少一種載體攜帶的多肽連同第二組表位中的至少一種表位同時給藥哺乳動物寄主，其中至少一種載體分子攜帶的至少一種多肽中包含第一組表位和第二組表位。在適當的情況下，第二次和隨后可能的給藥(加強免疫)可以采用與第一次給藥中載體攜帶的多肽或組合物中相同的多肽。以下報導的實驗表明免疫治療、預防和可選地防止復發(fā)，都可能通過單次給藥文中定義的載體攜帶的多肽或組合物獲得。
[0078]在具體的實施方式中，本發(fā)明涉及文中定義的載體攜帶的多肽或組合物，可以用于(i)感染病原體，特別是感染細菌或病毒后，哺乳動物寄主所診斷的第一確定的病理狀態(tài)的免疫治療；(ii)感染不同的病原體，特別是感染不同的細菌或病毒(或它們的不同株)后，針對第二病理狀態(tài)的預防；(iii)可選地，防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，其中當與所述不同病原體(例如:不同的細菌或不同的病毒)的相關的第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。在感染不同病毒株的具體的實施方式中，特別是不同的人乳頭瘤病毒(HPV)株和不同的人乳頭瘤病毒(HPV)型種類，本發(fā)明涉及文中定義的載體攜帶的多肽或組合物用于(i)對哺乳動物寄主中診斷的隨感染第一個病毒、第一個人乳頭瘤病毒(HPV)株或第一個人乳頭瘤病毒(HPV)型種類而來的第一病理狀態(tài)進行的免疫治療；(ii)預防隨感染第二種不同的病毒、第二種不同的HPV株或第二種不同的HPV型菌株而來的第二病理狀態(tài)；(iii)可選地，防止第一的病理狀態(tài)的復發(fā)，其中，當與所述第二種不同的病毒、第二種不同的HPV株或第二種不同的HPV型菌株相關的第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及如文中定義的載體攜帶的多肽或組合物，包含源自HPV16的E7蛋白的多肽和源自HPV18的E7蛋白的多肽，可以用于(I) (i)對哺乳動物寄主中診斷的隨感染HPV16而來的第一病理狀態(tài)進行的免疫治療；(ii)預防隨感染HPV18而來的第二病理狀態(tài)的預防；(iii)可選地，防止所述第一病理狀態(tài)的復發(fā)，其中，當源自HPV18的E7蛋白的多肽沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防；或(2) (i)對哺乳動物寄主中診斷的隨感染HPV18而來的第一病理狀態(tài)進行的免疫治療；(ii)預防隨感染HPV16而來的第二病理狀態(tài)；(iii)可選地，防止所述第一病理狀態(tài)的復發(fā)；其中，當源自HPV16的E7蛋白的多肽沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
[0079]在具體的實施方式中，本發(fā)明涉及文中定義的載體攜帶的多肽或組合物，可以用于(i)對哺乳動物寄主中診斷的隨感染第一種腫瘤細胞而來的第一病理狀態(tài)進行的免疫治療；(ii)預防隨感染第二種腫瘤細胞而來的第二病理狀態(tài)，其中該第二種腫瘤細胞的起源或組織學不同于第一種腫瘤細胞；和(iii)可選地，防止所述第一病理狀態(tài)的復發(fā)；其、中，當與所述第二種腫瘤細胞相關的第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
[0080]在【具體實施方式】中，本發(fā)明涉及文中定義的載體攜帶的多肽或組合物，可以用于(i)對哺乳動物寄主中診斷的隨感染病原體，特別是感染細菌或病毒而來的第一病理狀態(tài)進行的免疫治療；(ii)預防隨腫瘤細胞發(fā)展而來的第二病理狀態(tài)和(iii)可選地，防止所述第一病理狀態(tài)的復發(fā)，其中，當與所述腫瘤細胞相關的第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
[0081]在具體的實施方式中，本發(fā)明涉及文中定義的載體攜帶的多肽或組合物，可以用于(i)對哺乳動物中診斷的隨腫瘤細胞發(fā)展而來的第一病理狀態(tài)；(ii)預防隨病原體感染，特別是細菌或病毒感染而來的第二病理狀態(tài)；(iii)可選地，防止所述第一病理狀態(tài)的復發(fā)，其中，當與所述不同病原體(例如:不同的細菌或不同的病毒)相關的第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
[0082]本發(fā)明同樣涉及一種方法在相同哺乳動物中獲得，(i)特別是通過誘導針對第一組表位的T細胞免疫應答來對哺乳動物寄主所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療和(ii)特別是通過誘導針對第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防第二確定的病理狀態(tài)，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防，所述方法包括向哺乳動物寄主給藥至少一次:
[0083](I)載體攜帶的多肽，所述攜帶多肽的載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，所述第一組表位和第二組表位包含在由所述載體攜帶的至少一種多肽中，所述第二組表位中的至少一種表位和第一組表位中的表位不同；
[0084](2)組合物包含如(I)定義的載體攜帶的多肽以及藥學上可接受的載體；或
[0085](3)組合物包含 (a)第一載體攜帶的多肽，其中所述攜帶多肽的第一載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，所述第一組表位包含在由所述第一載體攜帶的至少一種多肽中，和(b)第二另外的載體攜帶的多肽，其中所述攜帶多肽的第二載體分子包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，所述第二組表位包含在由所述第二載體攜帶的至少一種多肽中。
[0086]在具體的實施方式中，本發(fā)明涉及在相同哺乳動物中獲得的方法，(i)特別是通過誘導針對第一組表位的T細胞免疫應答來對哺乳動物寄主所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，(ii)特別是通過誘導針對第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防第二確定的病理狀態(tài)和(iii)可選地，特別是通過誘導針對第一組表位的T細胞記憶性免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防，所述方法包括向哺乳動物寄主給藥至少一次:
[0087](I)載體攜帶的多肽，其中所述攜帶多肽的載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，所述第一組表位和第二組表位包含在所述載體攜帶的至少一種多肽中，所述第二組表位中的至少一種表位和第一組表位中的表位不同；
[0088](2)組合物包含如(I)定義的載體攜帶的多肽以及藥學上可接受的載體；或
[0089](3)組合物包含(a)第一載體攜帶的多肽，其中其中所述攜帶多肽的第一載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，所述第一組表位包含在由所述第一載體攜帶的至少一種多肽中，和(b)第二另外的載體攜帶的多肽，其中所述攜帶多肽的第二載體分子包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，所述第二組表位包含在由所述第二載體攜帶的至少一種多肽中。
[0090]文中定義的組合物，在具體的實施方式中，包含藥學上可接受的載體或配方，或生理上可接受的稀釋劑，該稀釋劑選自緩沖劑、鹽、磷酸鹽緩沖液、右旋糖、甘油、水、乙醇和類似物及組合物。
[0091]而且，用于獲得免疫治療和預防的文中定義的載體攜帶的多肽或組合物可能結合或混合在一起使用，或用于獲得免疫治療和預防的文中定義的組合物可能進一步包含至少一種免疫增強劑，例如至少一種佐劑，優(yōu)選一種佐劑，和/或表面活性劑和/或免疫調制劑物質(例如細胞因子或趨化因子)。
[0092]本領域已知的各種佐劑包括弗氏完全佐劑(complete freund，sadjuvant-CFA),弗氏不完全佐劑(Incomplete freund ' s a djuvant)、蒙坦得(montanide) ISA(不完全seppic佐劑)、胞壁酰肽例如胞壁酰二肽(MDP)MDP-Lys (L18)(Na-乙酰胞壁-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-NeSteoroy1-L-賴氨酸)、硫酸鋅、膠體氫氧化鐵、磷酸鈣或氯化鈣、CpG寡脫氧核苷酸(CPG 0DN)例如CPG ODN 1826和CPG 0DN2007,MF59 是在包含 5% 的角藍烯(w/V)、0.5% 的 Tween φ 80 (w/v) >0.5% Span (w/v)(在水中)和TLR4配體(例如MPL, GLA) TLR3配位體(例如Hiltonol ? )、多糖(例如菊粉)和脂質體(例如陽離子脂質體，ISCOMs)的水包油乳化液中穩(wěn)定的清潔劑。
[0093]在具體的實施方式中，至少一種佐劑選自具備活化T細胞免疫應答，特別是T細胞記憶性免疫應答能力的分子。優(yōu)選的佐劑是指能夠結合或拮抗免疫細胞(例如APC)中的TLR (To 11樣受體)3、4、7、8和/或9。在具體的實施方式中，佐劑是TLR配體，選自下組:TLR3型配體例如Poly-1CLC、TLR4配體、TLR9配體例如CpG和TLR7/8型配體例如咪喹莫特。購買的佐劑咪喹莫特為包含5%咪喹莫特(Aldara?)的乳液狀，而Poly-1CLC則為oncovir公司(Inc，WA，US)出售的 Hiltonol ?。
[0094]術語“聯合的”是指文中定義的載體攜帶的多肽或組合物聯合免疫增強劑在不同的時間和/或以不同的給藥方式，優(yōu)選在同一個接觸位點共同接觸寄主。在具體的實施方式中，文中定義的載體攜帶的多肽或組合物注射到寄主，免疫增強劑(如佐劑)則在局部，例如經皮，施用到寄主(皮膚表面)。例如，文中定義的載體攜帶的多肽或組合物注射到寄主，免疫增強劑(如佐劑)隨后施用在寄主的皮膚上的注射位點。相比而言，“混合的”是指文中定義的載體攜帶的多肽或組合物和免疫增強劑在給藥時存在于相同的配方中。
[0095]值得注意的是在本申請中，當免疫增強劑(例如佐劑)和文中定義的載體攜帶的多肽或組合物是混合的或聯合的時，至少每次向寄主給藥本發(fā)明中的載體攜帶的多肽或組合物時都會用到免疫增強劑。在具體的實施方式中，本發(fā)明中載體攜帶的多肽或組合物每天給藥兩次，每次給藥當天在本發(fā)明載體攜帶的多肽或和組合物給藥的位點施用免疫增強劑(或者混合在一起或者聯合在一起，優(yōu)選經皮)。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明的載體攜帶的多肽和組合物每天給藥兩次，每次給藥當天和每次給藥次日在給本發(fā)明載體攜帶的多肽或和組合物的位點施用免疫增強劑(混合的或者聯合的，優(yōu)選經皮)。在具體的實施方式中，文中定義的載體攜帶的多肽或組合物每天給藥兩次，在每次給藥當天和每次給藥次日在給藥本發(fā)明載體攜帶的多肽或和組合物的位點經皮施用佐劑(優(yōu)選咪喹莫特，例如 Aldara?)。
[0096]此外，為獲得免疫治療和預防以及可選地預防再次發(fā)生，文中定義的載體攜帶多肽或組合物是指可能在給藥方案中另外和其他適于治療病原體感染、腫瘤細胞或與這個感染或腫瘤相關的病理狀態(tài)，例如抗癌或抗病毒的相關的活性化合物，聯合使用或混合使用。
[0097]文中定義的載體攜帶的多肽或組合物可以通過不同方式注射到病人體內:如皮下(s.c.)，皮內(1.d.)，肌肉(1.m.)或靜脈(1.V.)注射，口服和粘膜給藥，特別是鼻腔給藥或鼻腔吸入。在具體的實施方式中，文中定義的載體攜帶的多肽或組合物通過皮內注射。
[0098]在具體的實施方式中，文中定義的載體攜帶的多肽或組合物和至少一種免疫增強劑混合使用或聯合使用，或者沒有和任何免疫增強劑混合或聯合，不論采取哪種給藥途徑，獨立于哺乳動物寄主(第一次)確定的的病理狀態(tài)，都在同一個位點給藥，即對于腫瘤，是在除了腫瘤發(fā)展以外的位點(例如除了粘膜)；對于病原體，是在除了病原體復制位點以外的位點。
[0099]文中定義的載體攜帶的多肽或組合物可以固體形式(扁囊劑、粉末、膠囊、丸狀、栓劑、速釋片劑、腸溶性片劑、緩釋片劑)，粉狀，優(yōu)選冷凍干燥之后的形式(凍干的形式或凍干的粉狀)，它需要在注射前使用稀釋液重新配制，或液體形式，例如可注射的溶液或可注射的混懸液。
[0100]用于給藥的載體攜帶的多肽的量(劑量)取決于被治療的個體，包括患者的病情、個體免疫系統狀態(tài)，給藥途徑和寄主個體大小。傳統的劑量范圍包括I到1200μ g、100到1000 μ g,200 到 1000 μ g,500 到 1000 μ g。具體劑量選自下組:100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000 μ g。在另一個實施方式中，載體攜帶的多肽的傳統劑量范圍從I到100 μ g、l到50 μ g和I到10 μ g。本領域的技術人員可以根據具體情況修改這些例子。
[0101]每個特定實施方式可能會結合任一個具體的實施方式。
[0102]例子
[0103]A.材料與方法
[0104]小鼠
[0105]從Charles River實驗室購買六周齡雌性C57BL/6型小鼠(H_2b)。小鼠培養(yǎng)在無病原體環(huán)境中，可以自由飲水和攝食。動物和及其照料的步驟遵循Genticel指南，其符合國家和國際法規(guī)和政策，并經當地倫理委員會審核。
[0106]腫瘤細胞系
[0107]通過HPV16的E6和E7的致癌基因和活化的人類C-Ha-Ras致癌基因轉化小鼠肺部原代細胞C57BL/6制備TC-1 (組織培養(yǎng)一號)腫瘤細胞(Lin，Guarnieri et al.1996)。該研究使用的細胞從美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC)獲得。TCl細胞在每次實驗之前解凍，然后在至少注射10天前培養(yǎng)并體外擴增。
[0108]EG7是由卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)-轉染EL4淋巴瘤鼠科細胞系(C57BL/6的遺傳學背景)獲得的，它用于誘導實體瘤表達卵清蛋白。該模型的介紹非常廣泛并作為癌癥的鼠科腫瘤模型(Schreiber, Deyev et al.2009)。EG7細胞在每次實驗前解凍,然后在至少注射10天前培養(yǎng)并體外擴增。
[0109]腫瘤細胞接種
[0110]在第O天，于C57BL/6小鼠右腋皮下注射用IOOul PBS IX稀釋的TC-1細胞(用于HPV_TUR008研究的每只小鼠注射0.5xl06個細胞，用于其它研究的每只小鼠注射IxlO6個細胞)。一些實驗中，小鼠在第60天右腋皮下注射稀釋在lOOulPBS IX的EG7細胞。
[0111]制備載體
[0112]-重組CyaA-HPV16Ε7Δ30-42 (Cl6-1)和 CyaA-HPV18Ε7Λ32_42 (Cl8-1)(圖 3Α 和圖 3Β)的構建和純化已在 EP 1576967Β1 中介紹。在 Genticel，CyaA_HPV16E7A3(l_42(C16-1)和CyaA-HPV18Ε7Δ 32-42 (Cl8-1)兩個半成品以1:1比例混合在一起，從而獲得ProCervix，然后分裝等份存儲在_80°C。
[0113]-CyaA-CysOVA 嵌有卵清蛋白(OVA)的 0VA257_264 (SIINFEKL)H_2b 的限制性表位。它被編碼為 BTpr_103，HPV043_Cova_PB_8M 批次在 Genticel 純化。CyaA-CysOVA 這個批次的特點是小鼠在Genticel (內部結果)表現免疫原性(圖4)。
[0114]-CyaA-MAGEA397_178/190_295 載體(圖 4C 和 SEQ ID NO:7)包含兩種多肽:
[0115](I)MAGE A397_178表位插入到百日咳博代桿菌(B.pertussis)CyaA蛋白第319和320 位殘基之間:LGDNQMPKAGLLIIVLAIIAREO)CAPEEKIPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO:8);和
[0116](2)由MAGEA3的第 190到221位殘基和MAGEA3的第242到295位殘基融合的MAGE-A3190_295*的表位，插入到CyaA蛋白第224位和235位殘基之間:TFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIF(SEQ ID NO:9)。
[0117]接種疫苗
[0118]在第11天，腫瘤測量之后，含有可檢測的實體瘤的小鼠通過皮下注射耳朵皮膚接種疫苗(兩只耳朵都注射)。在一些實驗中，小鼠在接種腫瘤細胞TC-1后，分別在第11天和第39天兩次接種疫苗。至于ProCervix,小鼠給藥5 μ g的CyaA-HPV16Ε7Λ3(1_42和5 μ g的CyaA-HPV 18Ε7Λ32_42。
[0119]佐劑分子
[0120]Aldara?是一種分子活化先天免疫的藥劑學配方，它通過優(yōu)先結合TLR7進入免疫細胞，例如APC。這個活化分子是咪喹莫特，它是一個小的合成的化合物。Aldara?市面上是一種在250mg單劑量使用包裝中含5%咪喹莫特的乳液(12.5mg的活性咪喹莫特)。誘導小鼠在接種ProCervix疫苗后出現佐劑效應的劑量是每個免疫位點接種25mg的Aldara?，所以每個注射位點各自接種了 1.25mg的活性咪喹莫特(每只小鼠接種50mg)。免疫接種當天和免疫接種24h之后在局部(經皮)施用Aldara?。準備單個管子，每支管裝有25mgAldara?用于耳朵皮膚上(每只小鼠準備兩支管)。為了能夠精細測量Aldara?乳液在每個ProCervix注射位點(對應于每只小鼠的每只耳朵)的真實含量；每支eppendorf小管在添加乳液前后都要稱量。耳朵皮膚施用Aldara?乳液之后,重新稱量印pendorf小管的重量，從而計算涂抹到皮膚中的大概乳液含量。對于每支小管中全部乳液涂抹至少15秒直到皮膚完全滲透。[0121]Poly-1CLC(TLR3激動劑)由Oncovir公司提供(Inc，WA，US)的小瓶裝，其中含有Iml的2mg/ml的乳白色的無菌溶液。Poly-1CLC留在原始的容器并保存在+4°C。用于注射的Poly-1CLC包含穩(wěn)定在1.5mg/ml的聚-L-賴氨酸和0.9%氯化鈉溶液中的5mg/ml羧甲基纖維素鈉中的2mg/ml的Poly-1C，然后用氫氧化鈉調pH值到7.6-7.8。 [0122]測量腫瘤
[0123]評估小鼠中腫瘤發(fā)展情況需要考慮多種不同參數:
[0124]-腫瘤大小:從接種腫瘤細胞第5天開始直到第60天，采用卡規(guī)一周兩次人工測量腫瘤大小。腫瘤體積通過以下公式計算:體積=(長度X寬度2)/2 ；
[0125]-小鼠存活率:基于倫理學原因，患有嚴重非正常腫瘤(最低尺寸:2000mm3)和壞死性腫瘤、或腫瘤引發(fā)活動障礙的小鼠被施以安樂死；和
[0126]-未患腫瘤的小鼠數量:該信息表明治療性疫苗接種已經誘導了全部的腫瘤退化(沒有明顯的腫瘤)。
[0127]測量⑶8 T細胞記憶性細胞毒性反應
[0128]檢測CD8+體內細胞毒性的方法已經廣泛介紹過(Barchet，Oehen et al.2000 ；Ingulli 2007)。簡單地說，取自首次接受實驗小鼠的同源脾細胞用不同濃度的CFSE (羧基熒光素琥珀酰亞胺酯，分子探針invitrogen公司)標記，并采用相關的H_2b限制性肽體外脈沖或不脈沖。肽脈沖的靶細胞群和肽沒有脈沖的靶細胞群體通過靜脈過繼轉移到同源的接種過疫苗的寄主，肽脈沖到脾臟的靶細胞的缺失通過流式細胞儀(BD FACSCalibur)檢測。殺傷細胞的百分比通過脈沖過的靶細胞占未脈沖過的靶細胞百分比的比率的降低來評估，并通過初始比值修正(見下文)。細胞制劑在注射前采用流式細胞儀分析，以檢測CFSE在不同靶細胞的負載并獲得計算體內殺傷的參考值(每個細胞種群的實際比例)。三個靶細胞群體然后以1:1:1的比例通過靜脈注射到每個接種過疫苗的小鼠。體內殺傷的比例通過已在其他地方介紹過的以下公式計算(Barber, Wherry et al.2003)
[0129]
殺傷比例=100- ([(%肽脈沖的接種過疫苗的/ %肽未脈沖的接種過疫苗的)/ (%注射前肽脈沖
的/%注射前肽未脈沖的))X 100)
[0130]IFN-YELISpot (酶聯免疫斑點)實驗
[0131]通過IFN-YELISpot實驗在離體被再次刺激的脾細胞中檢測HPV16 E 749_57和HPV18E7AS43_49 IFN-產生特異性CD8+T細胞的頻率:
[0132]-ELISpot在單個小鼠中進行，而非在合并的脾臟中。
[0133]-小鼠在靜脈灌輸同源的帶有CFSE的靶脾細胞之前收到(由于體內殺傷實驗，見上文)。簡單來說，從接種過疫苗的小鼠中獲得的全部的脾細胞沒有受到刺激或采用5%C02和I μ g/ml如下所述的多肽在37°C再次刺激20h:
[0134]-帶有HPV16E 749_57肽(H_2b限制性相關的表位)的IxlO6個細胞/孔
[0135]-帶有0VA257_264(H-2b限制性非相關的表位)的IxlO6個細胞/孔
[0136]-帶有HPV18E7AS43_49(H_2b限制性相關的表位)0.25xl06個細胞/孔
[0137]IFN- Y分泌通過夾心酶聯免疫斑點監(jiān)控，通過使用鏈霉親和素-AKP的BCIP/NBT顯示所述夾心酶聯免疫斑點。數據采用Bioreader 5000-Pro S(Biosys)進行分析。
[0138]治療性/預防性疫苗接種
[0139]如下文所述的治療計劃，已概括成圖8。
[0140]在第O天，兩組小鼠(組I和組2)右腋接種TC-1細胞(每只小鼠IxlO6個細胞)。然后，小鼠接受兩次接種，在第11天第一次接種，第39天第二次接種，采用安慰劑(PBS IX+尿素)(組I)或者安慰劑+Aldara?(組2)。組I和組2都是陰性對照。
[0141]在第O天，四組小鼠(組3至組6)右腋接種TC-1細胞(每只小鼠IxlO6個細胞)(組3至組6);然后，小鼠接受兩次接種，在第11天第一次接種，第39天第二次接種，采用CyaA-MAGEA397_178/190_295/CyaA-HPV16 E7 (每種基于 CyaA 的載體 5 μ g)聯合 Aldara? (組 3)，采用 CyaA-cys0VA/CyaA_HPV16 E7 (每種基于 CyaA 的載體 5 μ g)聯合 Aldara? (組 4)或采用聯合Aldara?-佐劑的ProCervix疫苗(組5和組6，作為TC-1腫瘤消除的陽性對照)。監(jiān)控這些小鼠的右腋一直到第100天(圖9)。在第60天，存活的小鼠接種第二種腫瘤細胞系，如表達MAGEA3的B-16腫瘤細胞(組3和組5)或EG7腫瘤細胞(表達卵清蛋白的惡性同源細胞)(組4和組6)。監(jiān)控這些小鼠的左腋一直到第100天。
[0142]當使用它時,Aldara?在局部(經皮)施用在接種疫苗的位點，在接種疫苗當天以及接種疫苗次日(即第12天和第40天)。
[0143]B.結果
[0144]帶有表達HP V E7的實體瘤的小鼠接種ProCervix后顯示腫瘤退化率高和存活率提聞
[0145]在第11天，接種PBS和Aldara?的小鼠不能抑制腫瘤生長，10只小鼠中只有2只小鼠在第50天前完全消除了腫瘤(圖5A和圖6A)。該組小鼠在第50天時，有4只小鼠存活(圖6B ;停止監(jiān)控腫瘤大小)。本研究中沒有包含只用PBS治療的小組，因此，和小鼠對抗腫瘤的自然應答相比，很難清楚確定Aldara?的影響。然而，很明顯的是Aldara?的作用要遠遠低于ProCervix聯合Aldara?佐劑(見下文)。這表明即使是Aldara?對腫瘤進展具有旁觀者效應，可能是由于先天免疫激活和導致的炎癥過程(促炎細胞因子等。(Schonand Schon 2008))，它不足以單獨使用作為治療方案來治療HPV誘導的實體瘤。
[0146] 在第11天采用無佐劑的ProCervix接種的小鼠,在第50天同樣表現有重大的腫瘤增長，并沒有小鼠消除腫瘤(圖5B和6A)。該組只有兩只小鼠在第50天存活(圖6B)。局部應用佐劑咪喹莫特(Aldara?)并接種ProCervix的治療性疫苗可以誘導顯著的腫瘤退化(圖5D)并導致高的存活率(圖6B)，在研究末期大部分小鼠都是不成瘤的(圖6A)。對于ProCervix疫苗聯合Aldara?佐劑的小組,在明顯控制(腫瘤大小降低到50mm3以下)一段時期之后，我們觀察到10只小鼠中有3只小鼠中出現腫瘤逃逸。這種逃逸發(fā)生在第30天至第40天并伴隨重大增長直到第50天。該現象可能是由于腫瘤發(fā)展的逃逸機制，在該研究中應該將此考慮到治療方案的修改中，但是正如之前描述的TC-1細胞(Zwaveling，Farreira Mota et al.2002),它更可能是由于腫瘤細胞表面缺失MHC-1類分子。治療性免疫接種ProCervix聯合Poly-1CLC佐劑的提供了關于腫瘤退化和存活率的類似結果(圖5C和6)。這些結果表明ProCervix聯合Poly-1CLC佐劑或咪喹莫特(Aldara?)局部佐劑的治療性免疫接種帶有表達HPV 16E7實體瘤的小鼠可以獲得強大的治療效應。
[0147]ProCervix治療性免疫接種促進HPV16 E7和HPV18 E7特異性的功能記憶性CTL(細胞毒性T淋巴細胞)的發(fā)育
[0148]根據RafieldAhmed和其同事的描述，在急性感染病毒LCMV (淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒)的小鼠動物模型中，記憶性CD8+T細胞能夠在體內展示快速裂解的潛能(Barber，Wherry et al.2003)?；谶@些觀察,第11天給藥ProCervix后,我們決定調查小鼠是否已經完全清除TC-1誘導的實體瘤，在消除腫瘤后是否顯示功能性的抗原特異性的記憶性CD8+T細胞。
[0149]為此，在接種TC-1細胞之后第60天，每組中剩余的不成瘤的小鼠過繼轉移帶有CFSE的同源脾細胞，以并行測量體內記憶性CD8+T細胞的細胞毒性(如上材料和方法部分中所述)對以下兩種H-2b限制性表位:HPV16 E749_57和HPV18 E7AS43_49的抵抗。在免疫接種ProCervix聯合Aldara?佐劑或Poly-1CLC佐劑的小鼠組中,選擇5只不成瘤小鼠(在該組中隨機選擇)進行該體內殺傷實驗。在所有受測的小鼠中，全部消除腫瘤的小鼠都檢測到強烈的抗HPV16 E 749_57脈沖的靶細胞的細胞毒性(圖7)。每組之間沒有差異。在接種安慰劑聯合Aldara?的一組小鼠檢測HPV16 E7特異性細胞毒性反應是由于該試驗使用兩只不患腫瘤的小鼠(其他小鼠由于腫瘤生長而導致在第60天時死亡)。該數據表明這兩只小鼠能夠產生足夠強的HPV16 E7特異性免疫應答以清除TC-1誘導的實體瘤。有趣的是，只有免疫接種帶有佐劑的ProCervix疫苗的小鼠同樣展示HPV18 E7脈沖的靶細胞。由于TC-1細胞不表達HPV18抗原，這些數據更有意義，因此表明報導的HPV18特異性的細胞毒性只可能是由于疫苗誘導的記憶性T細胞。事實上，在只用Aldara?佐劑治療的小鼠中沒有觀察到針對HPV18E7-脈沖的靶細胞的體內細胞毒性(圖7)。
[0150]總之，我們的數據表明ProCervix僅一次注射在誘導功能性的⑶8_依賴的抗HPV16 E7和HPV18 E7抗原的記憶性應答是非常高效的。ProCervix疫苗一次注射能夠誘導一批抗原特異性的記憶CD8+T淋巴細胞的分化，使得接種疫苗的小鼠不僅能夠長期抵抗來自表達HPV16 E7的同源移植的細胞的第二次攻擊(腫瘤表達的抗原)，而且能夠同時保護細胞抵抗來自表達HPV18 E7的同源移植的細胞的新攻擊(非腫瘤表達的抗原，僅由CyaA-HPV 18Ε7Δ32_42 載體傳遞)。
[0151]CyaA-HPV16E 7A3Q_42/CyaA-MAGE A3 二價治療性疫苗接種能夠消除表達HPV16 E7的實體瘤，并能抵抗MAGE-A3誘導的腫瘤的發(fā)育
[0152]接種CyaA-HPV16E7A3Q_42/CyaA_MAGE A3+Aldara 透皮佐劑(組 3)的小鼠和接種ProCervix聯合Aldara佐劑的小鼠(組5和組6)在40天內清除了 TCl-誘導的實體瘤:組3中的IO只小鼠中有9只(圖9c);組5中的IO只小鼠中有8只，組6中的IO只小鼠中有9只(圖9e和f)。強大的清除腫瘤的能力證實能夠保持100天。相比之下，接種安慰劑的小鼠，使用或不使用佐劑(分別為組I和組2)作為陰性對照，形成TCl-誘導的實體瘤的小鼠為:組I中的10只小鼠中有9只(圖9a)和組2中的10只小鼠中有8只(圖9b)。
[0153]在第60天，組3和組5中存活的小鼠在它們的左腋接種表達MAGE A3蛋白的B16-腫瘤細胞。在已清除TCl-誘導的腫瘤細胞并免疫接種CyaA-HPV16E7A3(l_42/CyaA-MAGEA3聯合Aldara?佐劑的小鼠中，沒有小鼠顯示在攻擊后形成B16-MAGE A3腫瘤(9只小鼠中沒有小鼠形成B16-MAGE A3腫瘤，圖10a)，這表明這些小鼠受保護免于B16-MAGE A3誘導的實體瘤的攻擊。
[0154]相比之下，已清除TCl-誘導的腫瘤細胞并免疫接種ProCervix聯合Aldara?佐劑的小鼠形成了 B16-MAGE A3腫瘤(8只小鼠中有6只小鼠形成B16-MAGEA3腫瘤；圖1Oc)，表明ProCervix(HPV16E7/HPV18 E7)不能提供針對B16-MAGE A3腫瘤細胞攻擊的記憶性T細胞免疫保護。因此，組3中觀察到的防止MAGE-A3誘導的腫瘤的發(fā)育是通過在免疫接種過CyaA-MAGE A3的小鼠中誘發(fā)針對MAGE A3特異性的T細胞介導的記憶性應答獲得，其中組5中誘導的T細胞介導的記憶性應答是針對抗原(HPV18E7)，該抗原和B16-MAGEA3腫瘤細胞在本質上是不相關的。
[0155]總之，這些實驗表明CyaA 二價疫苗一次給藥之后，可能用于消除TC-1細胞(HPV18 E7-特異性免疫應答)，和阻止B16-MAGE A3腫瘤細胞的形成(MAGE A3-特異性T細胞介導的記憶性應答)。此外，第60天獲得的結果表明針對B16-MAGE A3腫瘤細胞獲得的預防效應不會損害針對TC-1細胞獲得的治療效應(第100天消除TCl細胞；圖9c)。CyaA-HPV16E7.3o-42/CyaA-cysOVA 二價治療性疫苗能夠消除表達HPV16 E7的實體瘤并提供防止EG7-0VA誘導的腫瘤發(fā)育的保護
[0156]免疫接種CyaA-HPV16E7A3(l_42/CyaA-cyS0VA 聯合 Aldara? 透皮佐劑的小鼠(組 4)和接種ProCervix聯合Aldara佐劑的小鼠(組5和組6)在40天內清除TCl-誘導的實體瘤:組4中的10只小鼠中有9只(圖9d) -M 5中的10只小鼠中有8只，組6中的10只小鼠中有9只(圖9e和f)。強大的清除腫瘤的能力證實能夠保持100天。相比之下，接種安慰劑的小鼠，使用或不使用佐劑(分別為組I和組2)作為陰性對照，形成TCl-誘導的實體瘤的小鼠為:組I中的10只小鼠中有9只(圖9a)和組2中的10只小鼠中有8只(圖9b)。
[0157]在第60天，組4和組6中存活的小鼠在它們的左腋接種(表達卵清蛋白的惡性同源細胞)EG7-0VA腫瘤細胞。在第6組的小鼠6004在第60天后形成腫瘤(圖9f)，以致于它同該組其他9只沒有形成腫瘤的小鼠一樣接種EG7-0VA 了腫瘤細胞。已清除TCl-誘導的腫瘤并接種CyaA-HPV16E7,3(l_42/CyaA-Cys0VA聯合Aldara?佐劑的小鼠，沒有小鼠顯示在攻擊后形成EG7-0VA腫瘤(9只小鼠中O只形成EG7-0VA腫瘤；圖1Ob)，表明這些小鼠被保護免于EG7-0VA腫瘤細胞的攻擊。相比 之下，已清除TCl-誘導的腫瘤細胞并免疫接種ProCervix聯合Aldara?佐劑的小鼠形成了 EG7-0VA腫瘤(10只小鼠中有8只小鼠形成EG7-0VA腫瘤；圖1Od)，表明ProCervix (HPV16E7/HPV18E7)不能提供針對EG7-0VA腫瘤細胞的記憶T細胞免疫保護。因此，組4中觀察到的防止EG7-0VA-誘導的實體瘤細胞的發(fā)育是通過在免疫接種過CyaA-HPV16E7,3(l_42/CyaA-Cys0VA的小鼠中誘發(fā)OVA-特異性的T細胞介導的記憶性應答獲得，其中，組6中誘導的T細胞介導的記憶性應答是針對抗原(HPV18E7)，該抗原和EG7-0VA腫瘤細胞在本質上是不相關的。
[0158]總之，這些實驗表明二價CyaA疫苗一次給藥之后，可能用于消除TC-1細胞(HPV18E7-特異性的免疫應答)，和阻止EG7-0VA誘導的實體瘤的形成。而且，第60天后獲得的結果表明針對EG7-0VA腫瘤細胞的預防效果不會損害針對TC-1細胞的治療效應(第100天消除TCl細胞；圖9(1)。
[0159]C.結論
[0160]本申請中引入的新概念:ProCervix 二價疫苗治療性免疫接種,在一方面能夠治療例如感染HPV16的病人并消除感染，在另一方面，提供針對HPV16 E7和HPV18 E7抗原的T細胞介導的記憶性應答，因此確保ProCervix免疫接種的病人能夠長期抵抗HPV16可能造成的再次感染以及隨后的HPV18感染。
[0161]通過另外兩種其他的二價疫苗免疫接種(CyaA-HPV16E7,3(l_42/CyaA-MAGE A3和CyaA-HPV16E7.3o-42/CyaA-CysOVA)已證實:一方面，治療感染HPV的小鼠(消除TCl細胞)，另一方面，分別保護機體防止形成B16-MAGEA3腫瘤或EG7-0VA腫瘤細胞。
[0162]使用患有宮頸癌的臨床前小鼠模型[TC-1腫瘤細胞(Lin,Guarnieri et al.1996 ；Zwaveling, Ferreira Mota et al.2002)],表明患有表達 HPV16 E7 的實體瘤的小鼠治療性免疫接種ProCervix疫苗聯合佐劑分子[TLR激動劑如Aldara?(Johnston andBystryn 2006 ；Heib,Becker et al.2007 ；Schon and Schon 2008)或Poly_ICLC(Longhi，Trumpfheller et al.2009)]會引起高效的腫瘤退化。
[0163]而且，已表明，疫苗誘導的腫瘤清除和在腫瘤已完全清除的小鼠中長期存在的HPV16E7-特異性CTL記憶性應答有關。出乎意料的是，同樣證實這些不成瘤的小鼠中，ProCervix治療性免疫接種會平行地產生功能性的HPV18 E7-特異性的CTL記憶性應答。HPV16 E7和HPV18 E7記憶性CTL都表現出體內裂解的潛力。
[0164]觀察驚人地發(fā)現CyaA攜帶的多肽能夠產生針對哺乳動物寄主中第二組表位的預防性的T細胞記憶性應答(預防性免疫應答)，同時通過誘導針對第一組表位的T細胞免疫應答來對哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療。事實上，已知不同表位之間都存在競爭，或者是關于接近APC，經APC處理或呈遞以及細胞因子的可獲得性。該現象導致出現優(yōu)勢抗原表位和亞優(yōu)勢表位的層級，并使得T細胞免疫應答被激活和其他T細胞免疫應答被抑制。該現象在目前環(huán)境中可以預料到，其中T細胞在給藥載體攜帶的多肽之前能夠識別已經存在病人體內的第一組表位(因為第一組中的一種至多種表位已經呈遞給寄主的免疫系統)，然而關于第二組表位的初始T細胞需要活化。有趣的是，本發(fā)明表明，和所預料的相比，針對包含在CyaA攜帶的多肽中的第二組表位的預防性的免疫應答似乎并不討厭針對第一組表位的治療性的免疫應答。這些結果表明第一組表位誘導的免疫應答和第二組表位誘導的免疫應 答之間不存在競爭。因此，發(fā)明人表明CyaA攜帶的多肽足以在哺乳動物寄主所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療高效地誘導T細胞免疫應答，以及在相同的哺乳動物寄主預防第二確定的病理狀態(tài)的復發(fā)中誘導T細胞記憶性免疫應答。
[0165]參考書目:
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【權利要求】
1.一種載體攜帶的多肽，其特征在于，所述攜帶多肽的載體包含在適合將所述多肽呈遞給哺乳動物寄主的免疫系統的CyaA蛋白或它的片段中，用于(i)通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對所述哺乳動物寄主中所診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和(ii)通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)，所述免疫應答通過將所述載體攜帶的多肽給藥于所述寄主后獲得，其中，當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
2.如權利要求1所述的載體攜帶的多肽，其特征在于，可以進一步用于(iii)通過誘導針對包含在所述多肽中的所述第一組表位的T細胞記憶性免疫應答來防止所述第一確定的病理狀態(tài)的復發(fā)。
3.如權利要求1或2所述的載體攜帶的多肽，其特征在于，所述第二組表位包含在包含第一組表位的多肽中。
4.如權利要求1或2所述的載體攜帶的多肽，其特征在于，所述第一組表位和第二組表位包含在不同的多肽中。
5.如權利要求1到4中任一項所述的載體攜帶的多肽，其特征在于，一個載體分子攜帶所有的多肽。
6.一種組合物，其以與藥學上可接受的載體或配方的組合形式包含至少一種如權利要求I到5中任一項所述的載體攜帶的多肽，用于(i)通過誘導針對包含在所述多肽中的第一組表位的T細胞免疫應答來對所述哺乳動物寄主中診斷的第一確定的病理狀態(tài)進行免疫治療，和(ii)通過誘導針對包含在所述多肽中的第二組表位的T細胞記憶性免疫應答來預防在相同哺乳動物寄主中的第二確定的病理狀態(tài)，所述免疫應答通過將所述組合物給藥于所述寄主后獲得，其中， 當所述第二組表位沒有包含在所述被給藥的組合物的載體攜帶的多肽中時，觀察不到針對第二確定的病理狀態(tài)的所述預防。
7.如權利要求6所述的組合物，其包含至少兩種載體攜帶的多肽，其特征在于，第一組表位包含在第一載體攜帶的多肽中，第二組表位包含在另外的載體攜帶的多肽中。
8.如權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述第一組表位包含在由所述第一載體攜帶的多肽所攜帶的另外的多肽中，和/或第二組表位包含在由所述另外的載體攜帶的多肽所攜帶的另外的多肽中。
9.如權利要求1到5中任一項所述的載體攜帶的多肽或如權利要求6到8中任一項所述的組合物，其特征在于，所述CyaA是博代桿菌屬(Bordetella) CyaA,特別是源自百日咳博代桿菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博代桿菌(Bordetella parapertussis)或支氣管敗血性博代桿菌(Bordetella bronchi sept ica)。
10.如權利要求1到9中任一項所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述CyaA片段能夠特異性地結合到⑶I Ib表達細胞并可選地將所述多肽遞送到細胞質溶膠中，例如由第I到224位殘基和第235到1706位殘基組成的百日咳博代桿菌CyaA片段。
11.如權利要求1到10中任一項所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述CyaA蛋白或CyaA片段是解毒的、無毒的或沒有酶活性的，例如百日咳博代桿菌CyaA，其中二肽Leu-Gln被插入到第188位殘基和第189位殘基之間的框中。
12.如權利要求1到11中任一項所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述至少一種、優(yōu)選全部的多肽由所述CyaA蛋白或作為基因融合而來的CyaA片段所攜帶。
13.如權利要求12所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述至少一種、優(yōu)選全部的多肽被基因插入到CyaA中、特別是CyaA的許可位點中。
14.如權利要求1到13中任一項所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述至少一種、優(yōu)選全部的多肽源自腫瘤抗原或源自病原體抗原。
15.如權利要求14所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述至少一種、優(yōu)選全部的抗原源自細菌抗原、病毒抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原。
16.如權利要求15所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述至少一種、優(yōu)選全部的病毒抗原是來源于選自 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52 或 HPV58的HPV型種類的抗原。
17.如權利要求16所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述第一組表位構成了 HPV16的E7蛋白的抗原片段，第二組表位構成了 HPV18的E7蛋白的抗原片段。
18.如權利要求8到16中任一項所述的組合物，包含: (a)由插入到CyaA第319位和320位密碼子之間的HPV16-E7的前29個氨基酸殘基和插入到CyaA第224位和235位密碼子之間的HPV16-E7的第43到98位殘基組成的第一載體攜帶的多肽；和 (b)由插入到CyaA第319位和320位密碼子之間的HPV18-E7的前31個氨基酸殘基和插入到CyaA第224位和235位密碼子之間的HPV18-E7的第43到105位殘基組成的另外的載體攜帶的多肽。
19.如權利要求14所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述至少一種、優(yōu)選全部的多肽源自MAGEA3腫瘤抗原。
20.如權利要求19所述的載體攜帶的多肽或組合物，其特征在于，所述載體攜帶的多肽由百日咳博代桿菌(B.pertussis) CyaA組成,其中: (1)由MAGEA3的第97到178位殘基組成的第一多肽插入到CyaA第319位和320位密碼子之間；和 (2)由與MAGEA3的第242到295位殘基融合的第190到221位殘基組成的第二多肽插入到CyaA第224位和235位密碼子之間。
21.如權利要求17或18所述的載體攜帶的多肽或組合物，用于: (1)(i)對哺乳動物寄主中診斷的隨感染HPV16而來的第一病理狀態(tài)進行的免疫治療；和(ii)預防隨感染HPV18而來的第二病理狀態(tài)；和(iii)可選地，防止所述第一病理狀態(tài)的復發(fā)，其中，當源自HPV18的E7蛋白的多肽沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到所述針對第二確定的病理狀態(tài)的預防；或 (2)(i)對哺乳動物寄主中診斷的隨感染HPV18而來的第一病理狀態(tài)進行的免疫治療；和(ii)預防隨感染HPV16而來的第二病理狀態(tài)；(iii)可選地，防止所述第一病理狀態(tài)的復發(fā)；其中，當所述源自HPV16的E7蛋白的多肽沒有包含在所述被給藥的載體攜帶的多肽中時，觀察不到所述針對第二確定的病理狀態(tài)的預防。
22.如權利要求6到21中任一項所述的組合物，其特征在于，進一步包含至少一種佐劑，和可選地抗腫瘤或抗病毒的活性化合物。
【文檔編號】C07K14/025GK103476424SQ201280014867
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年1月24日 優(yōu)先權日:2011年1月24日
【發(fā)明者】邁克爾·埃斯奎爾, 瑪麗·莫默特, 安妮·古比耶, 尤蘭達·米賽利 申請人:讓蒂塞勒公司