病毒清除方法
【專利摘要】本發(fā)明提供分離感興趣的多肽(例如抗體)與病毒的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括用具有特定范圍電導(dǎo)率值的洗脫緩沖液從蛋白A樹脂中洗脫感興趣的多肽，其最大限度地減少與感興趣的多肽共同洗脫的病毒的量。
【專利說明】病毒清除方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及使用蛋白A色譜法純化多肽以提高病毒清除率的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]感興趣的多肽例如抗體通常在活細(xì)胞中生產(chǎn)。表達(dá)感興趣的多肽的細(xì)胞系必須通過復(fù)合培養(yǎng)基來維持。因此，感興趣的多肽的純化包括將多肽與培養(yǎng)基的成分(elements)、細(xì)胞組分(components)及細(xì)胞系的其它副產(chǎn)物分離。
[0004]尤其是，當(dāng)從動(dòng)物或人細(xì)胞系生產(chǎn)多肽時(shí)，生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)考慮病毒污染是不可避免的。病毒可存在于原始物質(zhì)中，通過多肽生產(chǎn)過程引入或在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)(Valdes，R.等，J.B1technol.96 (3):251-8 (2002))。將病毒雜質(zhì)從最終生物制品中去除或滅活是至關(guān)重要的(U.S.Department of Health and Human Services,Guidance for industry:Q5AViral safety evaluat1n of b1technology products derived from cell line of human oranimal origin.1998)。因此，需要改進(jìn)的方法以從多肽制品，例如治療性多肽中去除污染的病毒。
[0005]發(fā)明概述
[0006]大體上，本發(fā)明提供使用蛋白A色譜法從感興趣的多肽中去除污染的病毒的方法。在一個(gè)這種方面中，本發(fā)明提供將感興趣的多肽與病毒分離的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括將具有大約3.0至大約lOmS/cm電導(dǎo)率的洗脫緩沖液施加到具有吸附至樹脂上的感興趣的多肽和病毒的蛋白A樹脂中。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括將包含硫酸鹽(例如大約50或大約10mM硫酸鈉)的洗脫緩沖液施加到具有吸附至樹脂上的感興趣的多妝和病毒的蛋白A樹脂中。在一些實(shí)施方式中，從樹脂中洗脫感興趣的多妝將感興趣的多肽與至少一部分病毒分離。
[0007]在一方面，本發(fā)明提供純化感興趣的多肽的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括在使得感興趣的多肽結(jié)合至蛋白A樹脂上的條件下，將包含感興趣的多肽和病毒的溶液施加到蛋白A樹脂中。在一些實(shí)施方式中，所述樹脂用清洗緩沖液清洗。在一些實(shí)施方式中，所述清洗步驟從樹脂中洗脫一個(gè)或多個(gè)污染物。在一些實(shí)施方式中，省略此清洗步驟。在一些實(shí)施方式中，用具有大約3.0至大約lOmS/cm電導(dǎo)率的洗脫緩沖液將感興趣的多肽從樹脂中洗脫以提供回收的組合物。在一些實(shí)施方式中，用包含硫酸鹽(例如大約50或大約10mM硫酸鈉)的洗脫緩沖液將感興趣的多肽從樹脂中洗脫以提供回收的組合物。
[0008]在一方面，本發(fā)明的特征在于另一種純化感興趣的多肽的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括在使得感興趣的多肽結(jié)合至蛋白A樹脂上的條件下，將包含感興趣的多肽和病毒的溶液施加到蛋白A樹脂中。在一些實(shí)施方式中，所述樹脂用清洗緩沖液清洗。在一些實(shí)施方式中，所述清洗步驟從樹脂中洗脫一個(gè)或多個(gè)污染物。在一些實(shí)施方式中，省略此清洗步驟。在一些實(shí)施方式中，用第一洗脫緩沖液將感興趣的多肽從樹脂中洗脫以提供回收的組合物。在一些實(shí)施方式中，測(cè)定回收的組合物中病毒的量。在一些實(shí)施方式中，如果病毒的測(cè)定量高于要求量，則用具有比第一洗脫緩沖液更高導(dǎo)電率的第二洗脫緩沖液重復(fù)該方法。在一些實(shí)施方式中，如果病毒的測(cè)定量高于要求量，則用具有比第一洗脫緩沖液更多硫酸鹽(例如硫酸鈉)的第二洗脫緩沖液重復(fù)該方法。在一些實(shí)施方式中，使用來自該方法的第一循環(huán)的回收組合物重復(fù)該方法以提高回收組合物的純度。在一些實(shí)施方式中，使用包含尚未經(jīng)蛋白A純化的感興趣的多肽的溶液重復(fù)該方法。此溶液可以與該方法的第一循環(huán)過程中所純化的溶液相同或不同。
[0009]在本發(fā)明的任一方面的一些實(shí)施方式中，回收組合物中病毒的量至少小于施加到樹脂中的溶液中病毒的量的大約10、102、10' 104、15或16倍中的任一倍數(shù)。在一些實(shí)施方式中，回收組合物中病毒的量小于施加到樹脂中的溶液中病毒的量的大約12至大約16倍，例如大約13至大約16倍、大約14至大約16倍或大約14至大約15倍。在一些實(shí)施方式中，兩種或更多種病毒的量減少。
[0010]在本發(fā)明任一方面的一些實(shí)施方式中，所述洗脫緩沖液的電導(dǎo)率為大約3至大約
3.5,大約3.5至大約4,大約4至大約4.5,大約4.5至大約5,大約5至大約5.5,大約5.5至大約6,大約6至大約6.5,大約6.5至大約7,大約7至大約7.5,大約7.5至大約8,大約8至大約8.5,大約8.5至大約9,大約9至大約9.5,或大約9.5至大約10mS/cm。在一些實(shí)施方式中，所述洗脫緩沖液的電導(dǎo)率為大約3.0至大約10mS/cm，例如大約3.5至大約
9.5,大約4至大約7,或大約5至大約6mS/cm。在一些實(shí)施方式中，該洗脫緩沖液包含硫酸鈉，例如大約50或大約10mM硫酸鈉。在一些實(shí)施方式中，洗脫緩沖液包含檸檬酸鈉，例如大約15、20或25mM檸檬酸鈉中的任一種。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該洗脫緩沖液包含檸檬酸鈉和硫酸鈉。在一些實(shí)施方式中，該洗脫緩沖液的pH為大約2至大約5.5，例如大約2.5至大約4.5或大約3至大約4。在一些實(shí)施方式中，該洗脫緩沖液的pH為大約2至大約2.5、大約2.5至大約3、大約3.0至 大約3.5、大約3.5至大約4、大約4至大約4.5、大約4.5至大約5或大約5至大約5.5。
[0011]在本發(fā)明的任一方面的一些實(shí)施方式中，感興趣的多肽包含抗體、抗體片段或包含抗體或抗體片段的融合多肽。在一些實(shí)施方式中，病毒吸附至蛋白A樹脂上，例如與樹脂的蛋白A或樹脂的固體載體部分相互作用的病毒，或結(jié)合至蛋白A或固體載體的病毒。在一些實(shí)施方式中，該病毒是感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如用于生產(chǎn)感興趣的多肽的細(xì)胞)的病毒。在一些實(shí)施方式中，該病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒或單鏈DNA病毒。在一些實(shí)施方式中，該病毒是微小病毒。
[0012]應(yīng)理解，可組合此處所述的各種實(shí)施方式中的一個(gè)、一些或全部特征以形成本發(fā)明的其它實(shí)施方式。本發(fā)明這些和其它方面在下面更詳細(xì)地描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1A表示使用不同洗脫緩沖液電導(dǎo)率，蛋白A洗脫池中的小鼠微小病毒(MMV)的
清除率。
[0014]圖1B表示使用不同洗脫緩沖液電導(dǎo)率，蛋白A洗脫池中的異嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)的清除率。
[0015]發(fā)明詳述
[0016]本發(fā)明涉及使用蛋白A色譜法純化感興趣的多肽以提高病毒清除率的方法。病毒可能會(huì)引入到用于生產(chǎn)多肽、培養(yǎng)基或生產(chǎn)感興趣的多肽的過程中的細(xì)胞系中(U.S.Department of Health and Human Services, Guidance for industry:Q5A Viralsafety evaluat1n of b1technology products derived from cell line of human oranimal origin.1998)。當(dāng)多肽樣品施加到蛋白A柱中時(shí),大多數(shù)污染的病毒無結(jié)合地流經(jīng)蛋白A柱。然而，一些病毒保留在柱上。出乎意料的是，通過將洗脫緩沖液的電導(dǎo)率從~lmS/cm增加至~6mS/cm,蛋白A色譜過程中病毒清除率增加至41ogs (表1)。增加的洗脫緩沖液電導(dǎo)率不影響感興趣的多肽從蛋白A柱的洗脫。
[0017]盡管不打算受任何特定理論所限制，但洗脫緩沖液中的鹽可促進(jìn)病毒與蛋白A柱之間的相互作用(例如病毒的疏水部分與蛋白A柱之間的相互作用)。由于這些相互作用(例如，疏水性相互作用或其它非特異性相互作用)，病毒可與柱結(jié)合更長(zhǎng)時(shí)間，而感興趣的多肽從柱中洗脫。如果需要，可優(yōu)化洗脫緩沖液電導(dǎo)率以進(jìn)一步減少與感興趣的多肽共洗脫的病毒的量。
[0018]表1.病毒清除率結(jié)果和洗脫緩沖液參數(shù)
【權(quán)利要求】
1.分離感興趣的多肽與病毒的方法，所述方法包括將具有大約3.5至大約9.5mS/cm電導(dǎo)率的洗脫緩沖液施加到具有吸附至樹脂上的感興趣的多肽和病毒的蛋白A樹脂中，其中從所述樹脂中洗脫感興趣的多肽將感興趣的多肽與至少一部分病毒分離。
2.純化能夠結(jié)合蛋白A樹脂的感興趣的多肽的方法，所述方法包括: a.在使得感興趣的多肽結(jié)合至蛋白A樹脂上的條件下將包含感興趣的多肽和病毒的溶液施加到蛋白A樹脂中； b.用清洗緩沖液清洗樹脂；和 c.用具有大約3.5至大約9.5mS/cm電導(dǎo)率的洗脫緩沖液將感興趣的多肽從樹脂中洗脫以提供回收的組合物。
3.純化能夠結(jié)合蛋白A樹脂的感興趣的多肽的方法，所述方法包括: a.在使得感興趣的多肽結(jié)合至蛋白A樹脂上的條件下將包含感興趣的多肽和病毒的溶液施加到蛋白A樹脂中； b.用清洗緩沖液清洗樹脂； c.用第一洗脫緩沖液將感興趣的多肽從樹脂中洗脫以提供回收的組合物； d.測(cè)量回收的組合物中 病毒的量；和 e.如果步驟(d)中病毒的量大于要求量，則用具有高于步驟(C)中使用的第一洗脫緩沖液的電導(dǎo)率的第二洗脫緩沖液重復(fù)步驟(a)至(C)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中使用回收的組合物重復(fù)步驟(a)至(C)。
5.權(quán)利要求3的方法，其中使用包含尚未經(jīng)蛋白A純化的感興趣的多肽的溶液重復(fù)步驟(a)至(C)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述洗脫緩沖液的電導(dǎo)率為大約5至大約6mS/cm。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述洗脫緩沖液的電導(dǎo)率為大約5至大約6mS/cm。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二洗脫緩沖液的電導(dǎo)率為大約5至大約6mS/cm。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述洗脫緩沖液包含硫酸鈉。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述洗脫緩沖液包含硫酸鈉。
11.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二洗脫緩沖液包含硫酸鈉。
12.權(quán)利要求2的方法，其中所述回收的組合物中病毒的量至少小于步驟(a)的溶液中病毒的量的14倍。
13.權(quán)利要求3的方法，其中所述回收的組合物中病毒的量至少小于步驟(a)的溶液中病毒的量的14倍。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述回收的組合物中病毒的量至少小于步驟(a)的溶液中病毒的量的15倍。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述回收的組合物中病毒的量至少小于步驟(a)的溶液中病毒的量的15倍。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH為大約2.5至大約4。
17.權(quán)利要求2的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH為大約2.5至大約4。
18.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二洗脫緩沖液的pH為大約2.5至大約4。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述感興趣的多肽為抗體、抗體片段或包含抗體或抗體片段的融合多肽。
20.權(quán)利要求2的方法，其中所述感興趣的多肽為抗體、抗體片段或包含抗體或抗體片段的融合多肽。
21.權(quán)利要求3的方法，其中所述感興趣的多肽為抗體、抗體片段或包含抗體或抗體片段的融合多肽。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒。
23.權(quán)利要求2的方法，其中所述病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒。
24.權(quán)利要求3的方法，其中所述病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒為單鏈DNA病毒。
26.權(quán)利要求2的方法，其中所述病毒為單鏈DNA病毒。
27.權(quán)利要求3的方法，其中所述病毒為單鏈DNA病毒。
【文檔編號(hào)】C07K1/00GK104039825SQ201280051988
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月1日
【發(fā)明者】O.加爾佩里納 申請(qǐng)人:人類基因科學(xué)公司