蛋白質(zhì)表達(dá)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其包含：-至少一個(gè)重組啟動(dòng)子可操作地連接于編碼多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因，所述多肽或蛋白質(zhì)支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成，所述至少一個(gè)基因位于未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞的天然基因組基因座，其中編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的天然存在的啟動(dòng)子通過在所述天然存在的啟動(dòng)子內(nèi)的至少一個(gè)突變而失活，和，-分泌盒，其包含編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的重組核酸分子，以及使用這類細(xì)胞生成感興趣的重組蛋白質(zhì)或多肽的方法。
【專利說明】蛋白質(zhì)表達(dá)
[0001]本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其能夠過表達(dá)至少一種支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)。
[0002]分子伴侶(chaperone),特別是蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(F1DI),是特別存在于真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的眾所周知的酶。分子伴侶協(xié)助細(xì)胞內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)如蛋白質(zhì)和多肽的折疊或解折疊和裝配或解體。例如，PDI能催化蛋白質(zhì)和多肽內(nèi)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵的形成、破裂和重排。PDI在蛋白質(zhì)表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樵撁肛?fù)責(zé)在真核細(xì)胞中表達(dá)的含二硫鍵蛋白質(zhì)的正確折疊。許多在重組蛋白質(zhì)表達(dá)中常規(guī)使用的原核生物，包括大腸桿菌(E.coli)，缺少PDI活性。
[0003]為了表達(dá)正確折置的包含二硫鍵的多妝和蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域中提出在緊接感興趣的多肽或蛋白質(zhì)處還表達(dá)roi。PDi在重組宿主細(xì)胞中的共表達(dá)不僅產(chǎn)生正確折疊的產(chǎn)物，而且還負(fù)責(zé)比不表達(dá)PDI或以比共表達(dá)roi的那些細(xì)胞表達(dá)更低量roi的細(xì)胞更高的產(chǎn)物產(chǎn)率(參見例如W094/08012)。而且，發(fā)現(xiàn)天然表達(dá)roi的真核細(xì)胞中增加的roi形成導(dǎo)致顯著增加的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的生物合成，盡管存在如ButZ JA等(BiotechBioeng84(2003):292-304)中報(bào)告的例外。[0004]在W093/25676中，提出將包含編碼HH的基因的重組表達(dá)盒整合到宿主細(xì)胞，特別是酵母細(xì)胞的基因組中。例如，這類表達(dá)盒到酵母細(xì)胞基因組中的整合不是價(jià)值不高的。在整合方法的過程中，高度可能的是表達(dá)盒整合到基因組中超過一次且可能在不同位點(diǎn)。因此，生成具有相同特性的酵母細(xì)胞并非總是可能的。此外，本領(lǐng)域中還已知整合到酵母細(xì)胞基因組中的核酸分子的表達(dá)效率高度依賴于整合位點(diǎn)。這意味著表達(dá)盒在細(xì)胞內(nèi)一個(gè)基因座處的整合相比于其中表達(dá)盒整合到基因組內(nèi)另一個(gè)位點(diǎn)處的細(xì)胞將最可能產(chǎn)生不同的結(jié)果。包含這類重組PDI表達(dá)盒的酵母細(xì)胞仍然產(chǎn)生其編碼基因可天然見于細(xì)胞內(nèi)的PDI。因此，這類細(xì)胞在一方面從表達(dá)盒表達(dá)roi，另一方面表達(dá)天然存在于細(xì)胞基因中的PDI。這可能導(dǎo)致培養(yǎng)方法過程中細(xì)胞內(nèi)的不同PDI水平。而且，靶蛋白的生成可能由于對(duì)轉(zhuǎn)錄或翻譯的代謝性競爭受到從重組表達(dá)盒過表達(dá)PDI的負(fù)面影響(Butz JA等，BiotechBioeng84(2003):292-304)。
[0005]使用如W093/25676中提出的重組表達(dá)盒的一個(gè)別的和重要的缺點(diǎn)是需要用至少兩種核酸構(gòu)建體來共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，一種攜帶編碼roi的基因，而另一種包含編碼要在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的感興趣的至少一種蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因(Gupta CS等，J MolEndocrin22(1999):273-283)。共轉(zhuǎn)化需要提供一次性提供至少兩種不同的選擇標(biāo)志，這在實(shí)際中經(jīng)常導(dǎo)致克隆選擇過程中的假陽性克隆問題?；蛘?，可能需要系列轉(zhuǎn)化策略，使用分開轉(zhuǎn)化例如攜帶編碼roi的基因的核酸構(gòu)建體的第一次轉(zhuǎn)化，和攜帶編碼要在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的感興趣的至少一種蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的核酸構(gòu)建體的第二次轉(zhuǎn)化(Payne MS等，Genel94(1997): 179-182)。因此，傾向于有克隆變異。轉(zhuǎn)化攜帶編碼HH的基因以及要在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的感興趣的至少一種蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因兩者的一種核酸構(gòu)建體在實(shí)際中產(chǎn)生低轉(zhuǎn)化效率的限制，這是因?yàn)樵摵怂針?gòu)建體的大分子量。此外，潛在的質(zhì)粒不穩(wěn)定性，不管在整合還是染色體外形式中，均產(chǎn)生困難(Finnis CJA等，Microbial CellFactories9 (2010):87)。
[0006]Subramanian等(PNAS103 (2006):939-944)報(bào)告替換pbnl基因的啟動(dòng)子來研究缺少轉(zhuǎn)錄和因此由該基因編碼的蛋白質(zhì)的可獲性的后果。作者發(fā)現(xiàn)Pbnlp是降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的內(nèi)腔蛋白質(zhì)所需要的。
[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供允許以比本領(lǐng)域中已知方法高得多的產(chǎn)率來合成感興趣多肽或蛋白質(zhì)的手段和方法。
[0008]因此，本發(fā)明涉及用于生成感興趣的重組蛋白質(zhì)或多肽的方法，包括以下步驟:
[0009]-提供經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其包含:
[0010]a)分泌盒，其包含編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的重組核酸分子，和
[0011]b)至少一個(gè)重組啟動(dòng)子可操作地連接于編碼多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因，所述多肽或蛋白質(zhì)支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成，所述至少一個(gè)基因位于未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞的天然基因組基因座，其中所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的天然存在的啟動(dòng)子通過在所述天然存在的啟動(dòng)子內(nèi)的至少一個(gè)突變而失活，
[0012]- 在允許所述感興趣的蛋白質(zhì)或多肽和編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因表達(dá)的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，并
[0013]-從所述培養(yǎng)基分離感興趣的蛋白質(zhì)或多肽。
[0014]本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其包含:
[0015]-至少一個(gè)重組啟動(dòng)子可操作地連接于編碼多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因，所述多肽或蛋白質(zhì)支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成，所述至少一個(gè)基因位于未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞的天然基因組基因座，其中所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的天然存在的啟動(dòng)子通過在所述天然存在的啟動(dòng)子內(nèi)的至少一個(gè)突變而失活，和
[0016]-分泌盒，其包含編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的重組核酸分子。
[0017]本發(fā)明的一個(gè)別的方面涉及經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其包含至少一個(gè)重組啟動(dòng)子可操作地連接于編碼多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因，所述多肽或蛋白質(zhì)支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成，所述至少一個(gè)基因位于未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞的天然基因組基因座，其中所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的天然存在的啟動(dòng)子通過在所述天然存在的啟動(dòng)子內(nèi)的至少一個(gè)突變而失活。
[0018]令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)包含重組啟動(dòng)子可操作地連接于至少一個(gè)天然存在于宿主細(xì)胞基因組中且編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)重組多肽或蛋白質(zhì)生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞不能生成感興趣的重組蛋白質(zhì)或多肽或至少以低于可比宿主細(xì)胞的程度，如果天然存在的啟動(dòng)子仍然有活性(為其天然活性的最大10%,優(yōu)選最大5%，更優(yōu)選最大2%，甚至更優(yōu)選最大至少I %，通過測量轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的基因產(chǎn)物測定的)或至少以全長存在于新引入啟動(dòng)子的上游的話。因此，需要通過突變所述啟動(dòng)子來使天然存在的啟動(dòng)子失活。這類失活導(dǎo)致本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中沒有與其天然連接的基因的可測量的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。然而，術(shù)語“失活”還包括殘余啟動(dòng)子活性，為其天然活性的最大10%，優(yōu)選最大5%，更優(yōu)選最大2%，甚至更優(yōu)選最大至少1%。啟動(dòng)子活性可通過使用本領(lǐng)域中已知的方法測量轉(zhuǎn)錄的基因和/或翻譯的基因產(chǎn)物來簡單測定。[0019]依照本發(fā)明，所述酵母細(xì)胞可包含一種或多種(優(yōu)選一種)重組啟動(dòng)子可操作地連接于一種或多種天然存在的基因，其編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)。同一種啟動(dòng)子能可操作地連接于超過一種(即不同的)天然存在的基因，其編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)。另一方面，還可以提供一種細(xì)胞，其包含編碼支持多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的一種或多種天然存在的基因，超過一個(gè)拷貝的同一種啟動(dòng)子與該基因可操作地連接。這意味著本發(fā)明的酵母細(xì)胞可包含例如一個(gè)啟動(dòng)子可操作地連接于編碼支持多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的一個(gè)基因，而另一個(gè)啟動(dòng)子可操作地連接于編碼支持多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的另一個(gè)基因。當(dāng)然，還可以將一種特定的啟動(dòng)子可操作連接至編碼支持多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的多于一個(gè)基因。[0020]“編碼支持多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的基因”是編碼活性支持細(xì)胞內(nèi)多肽和蛋白質(zhì)的重組和/或天然表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的基因。如果所述多肽或蛋白質(zhì)不表達(dá)或以相比于參照細(xì)胞(例如野生型細(xì)胞)更低的程度表達(dá)，那么天然和/或重組蛋白質(zhì)或多肽要么完全不表達(dá)或分泌，要么以比其中這些表達(dá)或分泌支持性多肽或蛋白質(zhì)以正常水平存在于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞低得多的程度表達(dá)或分泌。
[0021]如本文中使用的，術(shù)語“重組啟動(dòng)子”指不天然存在于基因組中基因上游區(qū)中的啟動(dòng)子，所述基因編碼支持宿主細(xì)胞內(nèi)重組多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)，從而控制所述基因的轉(zhuǎn)錄。重組啟動(dòng)子可以是源自相同或另一種酵母細(xì)胞的啟動(dòng)子，或源自任何其他來源的異源啟動(dòng)子，只要該重組啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞中是功能性的(即能夠控制與其可操作連接的基因的轉(zhuǎn)錄)。當(dāng)然，術(shù)語“啟動(dòng)子”還包括野生型啟動(dòng)子的片段，只要所述片段能控制與所述啟動(dòng)子片段可操作連接的基因的轉(zhuǎn)錄速率。
[0022]“天然基因組基因座”意指天然存在的基因組序列。
[0023]術(shù)語“可操作地連接”指其中轉(zhuǎn)錄和任何翻譯調(diào)控元件共價(jià)連接至編碼序列，其相對(duì)于編碼序列的排布使得以處于和通過宿主細(xì)胞的作用所述調(diào)控元件能指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的任何配置。
[0024]如本文中使用的，術(shù)語“盒”指能夠表達(dá)特定基因的核苷酸序列，如果將所述基因插入以可操作地連接于核苷酸序列中存在的一種或多種調(diào)控序列的話。如此，例如，所述表達(dá)盒可包含期望經(jīng)由葡萄糖誘導(dǎo)表達(dá)的異源基因。因此，本發(fā)明的表達(dá)盒可用于在誘導(dǎo)時(shí)促進(jìn)任意數(shù)目的異源基因的表達(dá)。此外，本發(fā)明的盒含有核酸延伸，其編碼允許與其融合的多肽或蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)肽。這類盒依照本發(fā)明意圖為“分泌盒”。分泌信號(hào)序列可以是在酵母細(xì)胞中用作分泌信號(hào)或本領(lǐng)域中常規(guī)已知的任意序列(例如α因子或α交配因子)。依照本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述至少一個(gè)重組啟動(dòng)子使得所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞相比于所述未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞能夠多產(chǎn)生至少100%，優(yōu)選至少200%，更優(yōu)選至少300%的支持多肽或蛋白質(zhì)生物合成的所述多肽或蛋白質(zhì)。
[0025]可操作地連接于編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的至少一個(gè)重組啟動(dòng)子可以是可誘導(dǎo)的或組成性啟動(dòng)子(在酵母細(xì)胞中)。相應(yīng)的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的。依照本發(fā)明使用的合適的啟動(dòng)子允許細(xì)胞產(chǎn)生比野生型酵母細(xì)胞多至少100% (200%,300%,400%,500%,...)的所述多肽或蛋白質(zhì)，所述野生型酵母細(xì)胞包含天然存在的啟動(dòng)子，其與編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因關(guān)聯(lián)。
[0026]鑒定特定蛋白質(zhì)或多肽在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)速率的方法是本領(lǐng)域中公知的，且可能涉及細(xì)胞的破壞和特異性結(jié)合所述至少一種蛋白質(zhì)或多肽的抗體。
[0027]可使用常規(guī)方法，利用常規(guī)和確立的營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)攜帶如上文限定的核酸分子的本發(fā)明酵母細(xì)胞。為了生成感興趣的重組蛋白質(zhì)或多肽，細(xì)胞必須“在允許”所述多肽和蛋白質(zhì)“表達(dá)的條件下”培養(yǎng)。這意味著可向培養(yǎng)基添加或除去物質(zhì)(物質(zhì)的除去可通過改變培養(yǎng)基進(jìn)行)來活化啟動(dòng)子，其可操作地連接于編碼支持多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)和/或感興趣的蛋白質(zhì)或多肽的基因。
[0028]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)(天然和/或重組)多肽或蛋白質(zhì)生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因是分子伴侶。
[0029]如本文中使用的，“分子伴侶”指協(xié)助其他大分子蛋白質(zhì)性結(jié)構(gòu)的折疊或解折疊和裝配或解體，但當(dāng)該結(jié)構(gòu)在已完成折疊和/或裝配過程、施行其正常生物學(xué)功能時(shí)不存在于這些結(jié)構(gòu)中的多肽和蛋白質(zhì)。分子伴侶的一個(gè)主要功能是預(yù)防新合成的多肽鏈和裝配的亞基聚集成無功能的結(jié)構(gòu)。依照本發(fā)明的“分子伴侶”還包括“蛋白質(zhì)折疊酶”如蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶。本發(fā)明的分子伴侶優(yōu)選存在于適當(dāng)?shù)募?xì)胞區(qū)室中(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和/或高爾基體和/或分泌的重組蛋白質(zhì)的分泌途徑沿途的囊泡)。
[0030]有利地，將野生型分子伴侶啟動(dòng)子以及編碼支持多肽或蛋白質(zhì)生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的其他啟動(dòng)子失活不對(duì)經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞的存活性有負(fù)面影響。如果所述啟動(dòng)子的失活是致死的或顯著降低宿主細(xì)胞的存活性，那么分子伴侶啟動(dòng)子當(dāng)然不應(yīng)以本文中描述的方式修飾。 [0031]“分子伴侶啟動(dòng)子失活”意指野生型分子伴侶啟動(dòng)子的體內(nèi)活性降低至野生型宿主細(xì)胞啟動(dòng)子活性的最大10%，優(yōu)選最大5%，更優(yōu)選最大2%。測定啟動(dòng)子活性的方法是本領(lǐng)域中公知的且可能牽涉特定標(biāo)志蛋白質(zhì)或多肽的使用。然而，特別優(yōu)選本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾細(xì)胞中的野生型分子伴侶啟動(dòng)子完全失活，從而不能在細(xì)胞中確定啟動(dòng)子活性。
[0032]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述分子伴侶選自下組:蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶、結(jié)合蛋白Kar2/BiP和鈣聯(lián)接蛋白(calnexin),由此特別優(yōu)選二硫化物異構(gòu)酶。
[0033]依照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述重組啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的經(jīng)遺傳修飾或未經(jīng)修飾的酵母啟動(dòng)子。
[0034]為了控制編碼支持酵母細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)生物合成的多肽或蛋白質(zhì)(優(yōu)選蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶)的至少一個(gè)基因的表達(dá)速率，使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是有利的。當(dāng)然可以使用任意種類的啟動(dòng)子，只要該啟動(dòng)子能控制與其可操作連接的基因在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。然而，特別優(yōu)選使用源自酵母細(xì)胞的啟動(dòng)子。
[0035]本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子可以是未經(jīng)修飾的野生型啟動(dòng)子，其直接源自相應(yīng)來源。當(dāng)然還可以使用包含至少一個(gè)突變的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子的優(yōu)勢在于，在啟動(dòng)子內(nèi)引入突變允許修飾體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，得到相比于相應(yīng)的野生型啟動(dòng)子在特定的培養(yǎng)點(diǎn)具有更低或更高活性的啟動(dòng)子。如本文中使用的，“經(jīng)遺傳修飾的啟動(dòng)子”因而指已通過任何本領(lǐng)域中公知的適宜的常規(guī)或分子生物學(xué)方法修飾過的啟動(dòng)子，通過DNA技術(shù)，如通過定點(diǎn)誘變、缺失或插入，或通過常規(guī)的使用化學(xué)劑或輻照的誘變，接著通過篩選或選擇在轉(zhuǎn)錄機(jī)制中修飾過的細(xì)胞(參見例如W02006/089329)。[0036]或者，當(dāng)然還可能使用在宿主細(xì)胞中組成性作用的啟動(dòng)子。在一些情況中，使用重組啟動(dòng)子的分子伴侶的組成性表達(dá)還導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)或多肽的增加的形成。用于酵母細(xì)胞的組成性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的。
[0037]依照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，要可操作地連接于編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)生物合成的多肽或蛋白質(zhì)(優(yōu)選roi)的至少一個(gè)基因的酵母啟動(dòng)子選自下組:AOXl啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、FDH啟動(dòng)子、FLD啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子和HIS4啟動(dòng)子。
[0038]特別優(yōu)選使用未突變或經(jīng)突變的AOXl啟動(dòng)子。
[0039]啟動(dòng)子，特別是可誘導(dǎo)啟動(dòng)子內(nèi)的突變可能產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的啟動(dòng)子，其展現(xiàn)出相比于野生型啟動(dòng)子改變的特性。特定的突變可能導(dǎo)致啟動(dòng)子在誘導(dǎo)條件下顯示比未經(jīng)修飾啟動(dòng)子更高的活性(即與其可操作連接的基因的轉(zhuǎn)錄速率增加)。當(dāng)然，還可以提供顯示相反效果的突變。特別優(yōu)選的要遺傳修飾的AOXl啟動(dòng)子部分顯示于Inan M等(BiotechnolBioeng2006 ；93:771-778)，特別是在W02006/089329中(通過提述并入本文)。
[0040]要用于本發(fā)明的野生型AOXl啟動(dòng)子(SEQ ID N0.1)的優(yōu)選變體包含至少一個(gè)在選自下組的位點(diǎn)和核苷酸范圍內(nèi)的突變(例如缺失、插入、核苷酸交換):
[0041]a)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)，
[0042]b)Seq ID N0.1的核苷酸170至235、核苷酸170至191、核苷酸192至213、核苷酸192至210、核苷酸207至209、核苷酸214至235、核苷酸304至350、核苷酸364至393、核苷酸434至508、核苷酸509至551、核苷酸552至560、核苷酸585至617、核苷酸621至660、核苷酸625至683、核苷酸736至741、核苷酸737至738、核苷酸726至755、核苷酸784至800或核苷酸823至861、及其組合，其中包含上文所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)的啟動(dòng)子延伸包含Seq ID N0.1的Hapl核苷酸54至58、Seq ID N0.1的Hsf核苷酸142至149 和 517 至 524,Seq ID N0.1 的 Hap234 核苷酸 196 至 200,206 至 210 和 668 至 672,SeqID N0.1 的 abaA 核苷酸 219 至 224、Seq ID N0.1 的 Stre 核苷酸 281 至 285、Seq ID N0.1的 Rapl 核苷酸 335 至 339、Seq ID N0.1 的 Adrl 核苷酸 371 至 377、Seq ID N0.1 的 MatlMC核苷酸 683 至 687、Seq ID N0.1 的 Gcrl 核苷酸 702 至 706 和 Seq ID N0.1 的 QA-1F 核苷酸 747 至 761。
[0043]Seq ID N0.1:巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的 AOXl 啟動(dòng)子
[0044]ggtaccagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgaga
agatcaaaaaacaactaattattgaaagaattcaacc
[0045]所述酵母啟動(dòng)子優(yōu)選為在SEQ ID N0.1的核苷酸170至235或694至723或694至723和737至738內(nèi)包含至少一個(gè)突變的AOXl啟動(dòng)子。
[0046]包含Seq ID N0.1的核苷酸170至235內(nèi)的至少一個(gè)突變的AOXl啟動(dòng)子在甲醇誘導(dǎo)條件下相比于野生型AOXl啟動(dòng)子顯示高得多的表達(dá)速率。包含SeqID N0.1的核苷酸694至723或694至723和737至738內(nèi)的至少一個(gè)突變的AOXl啟動(dòng)子在去阻遏條件下相比于野生型AOXl啟動(dòng)子顯示高得多的表達(dá)速率(參見例如W02006/089329)。
[0047]AOXl啟動(dòng)子的突變優(yōu)選為野生型AOXl啟動(dòng)子的前述核苷酸內(nèi)的缺失、取代、插入、倒置和/或倍增(multiplication)。
[0048]為了修飾巴斯德畢赤酵母野生型AOXl啟動(dòng)子的特征，可以有幾種突變類型。包含上文所述區(qū)域以及以下一種或多種的啟動(dòng)子延伸可部分或完全缺失，部分或完全用其他核苷酸或核酸序列取代，通過插入單個(gè)核苷酸或核酸序列破壞，部分或完全倒置或倍增:轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)、Seq ID N0.1的Hapl核苷酸54至58、Seq ID N0.1的Hsf核苷酸142 至 149 和 517 至 524、Seq ID N0.1 的 Hap234 核苷酸 196 至 200、206 至 210 和 668 至672、Seq ID N0.1 的 abaA 核苷酸 219 至 224、Seq ID N0.1 的 Stre 核苷酸 281 至 285、SeqID N0.1 的 Rapl 核苷酸 335 至 339、Seq ID N0.1 的 Adrl 核苷酸 371 至 377、Seq ID N0.1的 MatlMC 核苷酸 683 至 687、Seq ID N0.1 的 Gcrl 核苷酸 702 至 706 和 Seq ID N0.1 的QA-1F核苷酸747至761。所有這些突變均導(dǎo)致啟動(dòng)子活性中的變化，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)特征和/或?qū)甾D(zhuǎn)錄因子的識(shí)別/結(jié)合位點(diǎn)受到所述突變影響。然而，這些變化可能導(dǎo)致所述啟動(dòng)子相比于野生型啟動(dòng)子的增加或降低的活性。
[0049]在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞選自下組:畢赤酵母屬(Pichia)菌種、漢遜酵母屬(Hansenula)菌種如多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、酵母屬(Saccharomyces)菌種、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)菌種、亞羅酵母屬(Yarrowia)菌種如解脂亞羅酵母(Yarrowia Iipolytica)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)菌種和曲霉屬(Aspergillus)菌種。
[0050]依照本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述酵母細(xì)胞是甲基營養(yǎng)型酵母細(xì)胞，優(yōu)選選自由畢赤酵母屬的酵母組成的組，優(yōu)選為巴斯德畢赤酵母、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)和多形漢遜酵母。
[0051]所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的天然存在的分子伴侶啟動(dòng)子的至少一個(gè)突變是缺失。
[0052]天然存在的啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞內(nèi)的失活可以多種方式進(jìn)行。例如，可以在所述啟動(dòng)子內(nèi)引入點(diǎn)突變。合適的突變可容易地通過在所述啟動(dòng)子內(nèi)引入潛在的突變，然后測試啟動(dòng)子的體內(nèi)活性來鑒定。然而，使啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞內(nèi)失活的最有效的方式是使啟動(dòng)子的至少一部分缺失。因此，特別優(yōu)選將天然存在于宿主細(xì)胞中的啟動(dòng)子至少部分缺失。缺失可發(fā)生在啟動(dòng)子的任何部分，其中特別優(yōu)選缺失那些見于緊接編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的基因的起始密碼子的部分(即所述基因的5’區(qū))。
[0053] 依照本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)生物合成的多肽或蛋白質(zhì)(優(yōu)選蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶)的天然存在的至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子的至少50個(gè)核苷酸,優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸,甚至更優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸是缺失的。
[0054]特別優(yōu)選缺失編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的基因的起始密碼子的上游區(qū)(即所述基因的5’端)中的至少前50個(gè)，優(yōu)選至少前100個(gè)，更優(yōu)選至少前200個(gè)，甚至更優(yōu)選至少前500個(gè)連續(xù)的核苷酸。
[0055]為了在酵母細(xì)胞中表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)或多肽，所述細(xì)胞還包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子可操作地連接于啟動(dòng)子，優(yōu)選為可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
[0056]可操作地連接于編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子可以與可操作地連接于編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子的啟動(dòng)子相同。然而，優(yōu)選至少一個(gè)編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的基因和編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的基因由不同啟動(dòng)子控制。在此背景中，術(shù)語“不同啟動(dòng)子”意指啟動(dòng)子的活性不同而彼此有差異。因此，在培養(yǎng)包含所述啟動(dòng)子的細(xì)胞時(shí)，可以使用源自相同的野生型啟動(dòng)子、展現(xiàn)出改變的效果的經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾的啟動(dòng)子。這允許獨(dú)立地調(diào)控生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)和感興趣蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)。獨(dú)立調(diào)控生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)和感興趣蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)是有利的，因?yàn)樗试S優(yōu)化感興趣蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)速率。
[0057]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子是載體的部分或整合到所述基因組中。
[0058]編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子可以是載體的部分或通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的相應(yīng)手段和方法整合到基因組中。要使用的手段和方法還取決于宿主細(xì)胞且必須據(jù)此進(jìn)行選擇(參見例如“Pichia Protocols”，Cregg JM, Humana Press;第2版(August8,2007))。
[0059]本發(fā)明的核酸分子還包含信號(hào)序列，其允許感興趣的蛋白質(zhì)或多肽分泌到培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基的上清液中。
[0060]如本文中使用的，術(shù)語“信號(hào)序列”指指導(dǎo)生物學(xué)活性分子的分泌的區(qū)段。本發(fā)明中使用的信號(hào)序列可以是多核苷酸，其編碼啟動(dòng)蛋白質(zhì)跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?。信?hào)序列的非限制性例子是MFa (交配因子α信號(hào)序列)、Kl殺傷毒素信號(hào)、轉(zhuǎn)化酶分泌信號(hào)肽、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)的殺傷毒素信號(hào)序列、Pichiaacaciae的殺傷毒素信號(hào)序列、葡萄有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)的殺傷毒素信號(hào)序列、異常畢赤(漢遜)酵母(Pichia(Hansenula)anomala)的殺傷毒素信號(hào)序列。本發(fā)明的優(yōu)選信號(hào)序列是MFa (交配因子α信號(hào)序列)。優(yōu)選地，為了靶蛋白的正確折疊和易位，引入MFa信號(hào)肽。MFa是來自a因子的前原區(qū),編碼具有165個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),前原a因子，其包含19個(gè)氨基酸的信號(hào)序列(前區(qū))和原區(qū)，接著是成熟的13個(gè)氨基酸a因子序列的4個(gè)串聯(lián)重復(fù)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述信號(hào)序列包含或組成為以下氨基酸序列(SEQ ID N0.11):
[0061 ] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLE⑶FDVAV LPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA
[0062]編碼所述信號(hào)序列的核酸與以下核苷酸序列(SEQ ID N0.12)具有至少95%，優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選100%的同一性:
[0063]atgagattcccatctattttcaccgctgtcttgttcgctgcctcctctgcattggctgcccctgttaacactaccactgaagacgagactgctcaaattccagctgaagcagttatcggttactctaccttgagggtgatttcgac
gtcgctgttttgcctttctctaactccactaacaacggtttgttgttcattaacaccactatcgcttccattgctgc
taaggaagagggtgtctctctcgagaagaagaggccgaagct
[0064]如本文中使用的，術(shù)語“載體”理解為意指包含能納入宿主細(xì)胞和整合到宿主細(xì)胞基因組中或作為附加體DNA自主復(fù)制的核苷酸序列的任何核酸分子。這類載體包括線性核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、RNA載體、病毒載體等。合適的表達(dá)載體可包含表達(dá)調(diào)控因子如啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷酸化信號(hào)、增強(qiáng)子和選擇標(biāo)志。
[0065]本發(fā)明的核酸分子到酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化可通過本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行，其可根據(jù)宿主細(xì)胞適宜地選擇。這些方法包括但不限于，電穿孔、原生質(zhì)體融合方法、磷酸鈣沉淀和氯化沉淀、用碳化娃纖維攪動(dòng)、和PEG-、硫酸右旋糖苷-和Lipofectamine-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
[0066]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及依照本發(fā)明的細(xì)胞用于生成感興趣的重組蛋白質(zhì)或多肽的用途。
[0067]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中生成至少一種重組蛋白質(zhì)或多肽的方法，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼至少一種重組蛋白質(zhì)或多肽的至少一個(gè)基因，其中至少一個(gè)編碼支持重組或天然多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)或天然存在于所述宿主細(xì)胞的分子伴侶的基因的表達(dá)相比于野生型宿主細(xì)胞增加。
[0068]本發(fā)明的再一個(gè)方面涉及用于生成重組或天然蛋白質(zhì)或多肽的方法，包括培養(yǎng)依照本發(fā)明的細(xì)胞的步驟。
[0069]用于生成重組蛋白質(zhì)或多肽的方法是本領(lǐng)域中公知的。依照本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞特別適用于表達(dá)這類蛋白質(zhì)和多肽，因?yàn)槠湓试S以有效得多的方式控制至少一個(gè)編碼支持重組多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)(優(yōu)選分子伴侶，更優(yōu)選roi)的基因以及感興趣的蛋白質(zhì)和多肽的表達(dá)速率。具體地，可以在培養(yǎng)的各個(gè)階段控制至少一種分子伴侶，優(yōu)選roi的表達(dá)速率，因此當(dāng)至少一種分子伴侶在細(xì)胞中的水平達(dá)到預(yù)確定量時(shí)測定時(shí)間點(diǎn)。
[0070]本發(fā)明的方法還可包括從培養(yǎng)基的上清液分離感興趣蛋白質(zhì)或多肽的步驟，如果所述蛋白質(zhì)或多肽是從細(xì)胞分泌的話。
[0071]本發(fā)明的細(xì)胞可用任何已知的培養(yǎng)方法培養(yǎng)，如分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)。適用于選擇的酵母菌株的培養(yǎng)條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地調(diào)整。通常而言，使用的培養(yǎng)基應(yīng)含有細(xì)胞生長和存活所需的所有營養(yǎng)。
[0072]本發(fā)明還在以下附圖和實(shí)施例中例示，然而，不受其限制。
[0073]圖1顯示用于天然蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(roi)啟動(dòng)子和PDI基因之間的特定突變的AOXl啟動(dòng)子的啟動(dòng)子整合盒的“Flipper構(gòu)建體”的質(zhì)粒圖譜。
[0074]圖2顯示PDI啟動(dòng)子的啟動(dòng)子整合策略的圖表。
[0075]圖3顯示通過特定突變的AOXl啟動(dòng)子用于天然蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子替換盒的“Flipper構(gòu)建體”的質(zhì)粒圖譜。
[0076]圖4顯示PDI啟動(dòng)子的啟動(dòng)子替換策略的圖表。 [0077]圖5顯示表達(dá)運(yùn)鐵蛋白的菌株CBS7435muts(突變體)(實(shí)線)和CBS7435突變體PDI平臺(tái)(虛線) 分別的(直接施用)上清液的電泳圖疊加(GXII，Caliper LifeSciences, USA)。
[0078]圖6顯示表達(dá)非糖基化運(yùn)鐵蛋白的菌株CBS7435突變體(實(shí)線)和CBS7435突變體PDI平臺(tái)(虛線)分別的(直接施用)上清液的電泳圖疊加(GXII，Caliper LifeSciences, USA)。
[0079]圖7顯示表達(dá)HSA-干擾素(alpha2a)的菌株CBS7435突變體(點(diǎn)線)、共表達(dá)重組蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(存在I個(gè)拷貝；使用與CBS7435突變體PDI平臺(tái)菌株中相同的啟動(dòng)子)的CBS7435突變體菌株(實(shí)線)和CBS7435突變體PDI平臺(tái)(帶菱形實(shí)線)分別的(直接施用)上清液的電泳圖疊加(GXII, Caliper Life Sciences, USA)。
[0080]圖8顯示表達(dá)Fab的菌株CBS7435突變體(實(shí)線)、共表達(dá)重組Kar2 (存在I個(gè)拷貝；使用與CBS7435突變體Kar2平臺(tái)菌株中相同的啟動(dòng)子)的CBS7435突變體菌株(點(diǎn)線)和CBS7435突變體Kar2平臺(tái)(帶環(huán)實(shí)線)分別的(直接施用)上清液的電泳圖疊加(GXII, Caliper Life Sciences, USA)。
實(shí)施例
[0081]策略:
[0082]在以下特定實(shí)施例中使用的轉(zhuǎn)化DNA構(gòu)建體組成為同源啟動(dòng)子的前700_1000bp和強(qiáng)烈受調(diào)控的、特定突變的AOXl啟動(dòng)子(驅(qū)動(dòng)Flp重組酶的表達(dá))，接著是轉(zhuǎn)錄終止子和抗性標(biāo)志盒，再接著是受不同調(diào)控的、特定突變的AOXl啟動(dòng)子和同源基因的前500-1000bp。重組酶識(shí)別 位點(diǎn)置于同源啟動(dòng)子的前100-300bp之后(基于以下假設(shè)，即天然PDI啟動(dòng)子可由約1000bp組成)，且在第二特定AOXl啟動(dòng)子的直接上游(和限制標(biāo)志盒的下游)。
[0083]在轉(zhuǎn)化構(gòu)建體到設(shè)想基因座(其由同源側(cè)翼區(qū)預(yù)確定)中的基因組插入后，使菌落處于含甲醇培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)由上游強(qiáng)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的重組酶基因的轉(zhuǎn)錄。Flp重組酶作用于Flp重組酶識(shí)別位點(diǎn)且由此切除大部分同源啟動(dòng)子、強(qiáng)可誘導(dǎo)AOXl啟動(dòng)子變體以及整個(gè)抗性標(biāo)志盒，留下同源啟動(dòng)子的剩余部分和受不同調(diào)控的、特定突變的AOXl啟動(dòng)子(驅(qū)動(dòng)感興趣的同源基因)。
[0084]為了使用上文所述策略來驗(yàn)證PDI基因轉(zhuǎn)錄本水平的顯著增加，人血清運(yùn)鐵蛋白的合成基因以及沒有N-糖基化基序的突變變體非糖基化運(yùn)鐵蛋白是理想的模式蛋白質(zhì):沒有從重組表達(dá)盒的PDI的共表達(dá)，兩種蛋白質(zhì)均不能分泌。原因最可能是對(duì)于會(huì)適應(yīng)于分泌的完整蛋白質(zhì)要形成的大量數(shù)目的19個(gè)二硫鍵，其不能由天然存在的位于ER的roi蛋白質(zhì)充分地催化。明顯地，在通過異源過表達(dá)供應(yīng)額外的酶后，運(yùn)鐵蛋白和非糖基化運(yùn)鐵蛋白在ER內(nèi)的翻譯后修飾作用達(dá)到允許正確折疊的蛋白質(zhì)分泌的程度。
[0085]菌株
[0086]標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)規(guī)程依照Ausubel, F.M.，等(2003)Current Protocols inMolecular Biology ；John ffiley&Sons, New York, US 實(shí)施。
[0087]將大腸桿菌DH5 a (NEB, USA)用于所有大腸桿菌克隆實(shí)驗(yàn)。
[0088]具有突變體表型(Aaoxl基因型)的巴斯德畢赤酵母菌株CBS7435用作所有酵母實(shí)驗(yàn)的宿主(參見例如Cregg和Madden于Stewart, Russell, Klein和Hiebsch (編)Biological Research on Industrial Yeast, vol II(1987), CRC Press, ppl-18)。[0089]化學(xué)物和培養(yǎng)基
[0090]除非另外明確說明，所有化學(xué)物均分別購自Carl Roth GmbH (Germany)和Becton, Dickinson and Company(USA)0 無菌水購自 Fresenius Kabi(Austria)0
[0091]除非特別提述，所有培養(yǎng)基和成分均依照來自畢赤酵母蛋白質(zhì)表達(dá)試劑盒(Invitrogen, USA)的方案制備。
[0092]巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化，畢赤酵母生長條件和選擇陽性克隆
[0093]依照“畢赤酵母表達(dá)試劑盒”(Invitrogen)使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔方案來轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。將質(zhì)粒DNA(1-1Oyg)使用限制酶例如BglII或SacI (均購自NEB，USA)線性化以將表達(dá)質(zhì)粒添加到巴斯德畢赤酵母的基因組，并經(jīng)由滲析使用硝化纖維濾器(0.0025 μ m, Millipore, USA)對(duì)無菌水在室溫脫鹽達(dá)60分鐘。
[0094]轉(zhuǎn)化后，將100 μ I等分試樣鋪板于用100 μ g/ml Zeocin補(bǔ)充的YPD瓊脂板并在30°C溫育2天。
[0095]表達(dá)盒在巴斯德畢赤酵母基因組中的存在由菌落PCR確認(rèn)。將Zeocin抗性的克隆再鋪板于非選擇性培養(yǎng)基上用于菌落PCR分析。將單個(gè)菌落重懸于100μ I無菌水中，加熱至95°C達(dá)5分鐘，并以最大速度在臺(tái)面式離心機(jī)中離心I分鐘。將10 μ I上清液充當(dāng)50 μ I 反應(yīng)的模板，反應(yīng)含有 0.2mM dNTP、Ix 反應(yīng)緩沖液(Qiagen, Germany)、1.2U HotStarTaq 聚合酶(Qiagen)、各 200nM 的引物 PPDI5_for (5，-ccaaaaccaggtgtgtcaatc-3，)和PDIgene_rev (5，-cgactggtctgagtgctagg-3，)。將以下程序用于 PCR:95°C 15 分鐘，30 個(gè)循環(huán)的95°C 30秒，61°C I分鐘和72°C 3.5分鐘，接著是72°C 10分鐘的最終延伸步驟。所得PCR產(chǎn)物的身份通過DNA測序驗(yàn)證。
[0096]在以下任一種中生長酵母培養(yǎng)物:YPD培養(yǎng)基(1% w/v酵母提取物,2% w/v蛋白胨和2% w/v葡萄糖)、最小右旋糖(MD)培養(yǎng)基(1.34%酵母氮基YNB，4x10-5%生物素和1%葡萄糖)、最小甲醇(MM)培養(yǎng)基(1.34% YNB，4x10-5%生物素和0.5%甲醇)、緩沖的MD (BMD)培養(yǎng)基(含有200mM磷酸鈉緩沖液pH6.0)或緩沖的麗培養(yǎng)基，相比于麗具有雙倍(BMM2含有I %甲醇)或10倍(BMM10含有5%甲醇)濃度的甲醇，依照(Weis等，F(xiàn)EMSYR2004)。用于板的培養(yǎng)基通過添加瓊脂至1.5% w/v凝固化。
[0097]規(guī)模擴(kuò)大
[0098]巴斯德畢赤酵母發(fā)酵類似于Cino, J.High Yield Protein Production fromPichia pastoris Yeast:A Protocol for Benchtop Fermentation, New BrunswickScientific, Edison, NJ中記載的方案進(jìn)行。在甘油給料結(jié)束時(shí)，開始甲醇給料，目標(biāo)是通過調(diào)整給料速率保持甲醇濃度(線下甲醇分析)為約1%。或者，代替甲醇給料，在整個(gè)工藝時(shí)間均用甘油給料，以與甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵的經(jīng)典甘油補(bǔ)料分批時(shí)段中相同的速率。PH值設(shè)為5.5且通過氨控制。溶解氧保持高于30%，主要通過攪拌速度控制，并通過通風(fēng)速率支持。溫度設(shè)為20-28°C。細(xì)胞干重量如記載于Whittaker, Μ.Μ.和Whittaker, J.Μ.(2000)Protein, Expr.Purif.20, 105-111 的測定。
[0099]測定 分泌的靶蛋白
[0100]在分別以小規(guī)?；蛟谏锓磻?yīng)器中培養(yǎng)后，通過微流體毛細(xì)管電泳(GXII, Caliper Life Sciences, USA)依照制造商用法說明書分析上清液樣品(通過離心分離細(xì)胞獲得)。將靶蛋白峰與內(nèi)部以及外部標(biāo)準(zhǔn)的比較得到培養(yǎng)上清中的靶蛋白產(chǎn)率。[0101]實(shí)施例1:構(gòu)建在天然蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)啟動(dòng)子與PDI基因之間特定突變的AOXl啟動(dòng)子的啟動(dòng)子共整合盒
[0102]轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建體組成為同源PDI啟動(dòng)子的前500bp (從3’端)(基于以下假定，即天然PDI啟動(dòng)子可能組成為約1000bp)和驅(qū)動(dòng)Flp重組酶表達(dá)的特定受調(diào)控的、突變的AOXl啟動(dòng)子(W02006/089329 ;源自SEQ ID N0.1)，接著是CYCl轉(zhuǎn)錄終止子和Zeocin抗性盒(在大腸桿菌中由EM72啟動(dòng)子，巴斯德畢赤酵母中由ILV5啟動(dòng)子和AOD轉(zhuǎn)錄終止子的功能性)，再接著是同源PDI基因的前500bp。重組酶識(shí)別位點(diǎn)置于特定的AOXl啟動(dòng)子之后，且在同源PDI基因的直接上游(圖1)。該DNA片段用DNA2.0 (Menlo Park, USA)定制為合成生成的DNA。
[0103]實(shí)施例2:啟動(dòng)子整合構(gòu)津體到CBS7435突變體中的轉(zhuǎn)化，確認(rèn)基因組布局，在甲醇培養(yǎng)基上增殖和盒切除及確認(rèn)
[0104]在轉(zhuǎn)化并在瓊脂板上選擇后，通過菌落PCR確認(rèn)20個(gè)菌落攜帶正確基因組取向的整合的轉(zhuǎn)化盒。[0105]將克隆轉(zhuǎn)移至最小甲醇瓊脂板達(dá)5天(直至形成大的單一菌落)，以總共連續(xù)3次。之后，通過在含選擇標(biāo)志(Zeocin)的YPhyD板上相反-再劃線來檢查FRT位點(diǎn)之間DNA區(qū)(大部分同源啟動(dòng)子區(qū)，強(qiáng)可誘導(dǎo)的AOXl啟動(dòng)子和Flp重組酶，抗性標(biāo)志盒)的切除:陽性克隆，即那些發(fā)生切除的，不能在這些板上生長。菌落PCR證實(shí)了同源PDI啟動(dòng)子在特定突變的AOXl啟動(dòng)子上游，直接繼之以剩余FRT位點(diǎn)和(完整)PDI基因的存在(圖2，SEQ ID N0.2)。
[0106]SEQ ID N0.2:對(duì)基因組PDI基因座獲得的序列
[0107]粗體:天然PDI啟動(dòng)子區(qū)(未修飾菌株中天然PDI基因的上游1000bp)
[0108]斜體:突變的AOXl啟動(dòng)子
[0109]正常體:天然PDI基因(前892個(gè)堿基)，有5’ kozak序列
[0110]下標(biāo):FRT位點(diǎn)
[0111]aagggagacatattcggctattgtttactttgcgcccacagtagcgttaagaaacattgtttgttcgatttattgggctgttgataaattcaattgattacgttcgcatactagctatcataaactaagcaccaccttacaccactttctcactgaagattttcgacatcaaatttctcttggatcaccatcaaccttgtgtctacatgtccttgtctttgaacctaaatcagatagccgtgcgggttgtgggcatattgcctcgtattccggagattcacattgccattcctaatatttttcagcgacgcaccgaagcttctacagagactcacgatcctcgcatactagagctgatagaaaatctacaggatgccgaggttcctccattcttcattgataacggtatacttaaagcagcaccaaaaaagaaggtttctcatatgaaaagacgccagaaattatatggtccaggaaaaaaacaactctctttactacaaaatttgaacaggtgtcctgcctgcggaaactacaaacgatcacacaccctctgcatgcattgcgtaggacaaatcaggagacattggaacgactctgttcctcaacaggaggcatttcgtgaagagtttgttaatcctttggatgagaagattctttatccaggaaagaaagaactgcccgatgaacgaactttacgtaagaaggagtggctgaagagaagaccccgaacactccctgttgaatagaacacgaacactgtaaatagaataaaagaaaacttggatagtagaacttcaatgtagtgtttctattgtcttacgcggctctttagattgcaatccccagaatggaatcgtccatctttctcaacccactcaaagataatctaccagacatacctacgccctccatcccagcaccacgtcgcgatcacccctaaaacttcaataattgaacacgtactgatttccaaaccttcttcttcttcctatctataagaagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattgaaagaagttcctatactttctagagaataggaacttccgaaacgatgcaattcaactggaatattaaaactgtggcaagtattttgtccgctctcacactagcacaagcaagtgatcaggaggctattgctccagaggactctcatgtcgtcaaattgactgaagccacttttgagtctttcatcaccagtaatcctcacgttttggcagagttttttgccccttggtgtggtcactgtaagaagttgggccctgaacttgtttctgctgccgagatcttaaaggacaatgagcaggttaagattgctcaaattgattgtacggaggagaaggaattatgtcaaggctacgaaattaaagggtatcctactttgaaggtgttccatggtgaggttgaggtcccaagtgactatcaaggtcaaagacagagccaaagcattgtcagctatatgctaaagcagagtttaccccctgtcagtgaaatcaatgcaaccaaagatttagacgacacaatcgccgaggcaaaagagcccgtgattgtgcaagtactaccggaagatgcatccaacttggaatctaacaccacattttacggagttgccggtactctcagagagaaattcacttttgtctccactaagtctactgattatgccaaaaaatacactagcgactcgactcctgcctatttgcttgtcagacctggcgaggaacctagtgtttactctggtgaggagttagatgagactcatttggtgcactggattgatattgagtccaaacctctatttggagacattgacggatccaccttcaaatcatatgctgaagctaacatccctttagcctactatttctatgagaacgaagaacaacgtgctgctgctgccgatattattaaaccttttgctaaagagcaacgtggcaaaattaact
[0112]實(shí)施例3:在小規(guī)模中甲醇誘導(dǎo)條件下運(yùn)鐵蛋白在具有升高水平的同源
[0113]PDI的菌株中的分泌性生成
[0114]將編碼運(yùn)鐵蛋白的基因(SEQ ID N0.3)以及非糖基化運(yùn)鐵蛋白的基因(SEQ IDN0.4 ;非糖基化運(yùn)鐵蛋白通過雙位點(diǎn)定向誘變生成以將兩個(gè)N-糖基化基序突變)整合到未處理的宿主CBS7435突變體(在特定突變的AOXl啟動(dòng)子(W02006/089329)的控制下，該啟動(dòng)子包含Seq ID N0.1的核苷酸170至235的缺失(如W02006/089329中鑒定的))和具有潛在升高水平的同源PDI的相應(yīng)菌株(如上文描述的)的基因組中。兩種運(yùn)鐵蛋白變體遺傳信息的存在由菌落PCR證實(shí)(前向引物結(jié)合PA0X1，反向引物結(jié)合前80bp內(nèi)的兩個(gè)運(yùn)鐵蛋白基因)。在小規(guī)模中培養(yǎng)時(shí)，基礎(chǔ)菌株CBS7435突變體宿主和具有潛在升高水平的同源PDI的菌株均不能以任何形式分泌運(yùn)鐵蛋白(達(dá)到通過微流體毛細(xì)管電泳可檢測的水平)。
[0115]引物序列(SEQID N0.8)
[0116]5，CAGCACACCATCTAACAG3，
[0117]SEQ ID N0.3:運(yùn)鐵蛋白
[0118]gttccagataagactgttagatggtgtgctgtttcagagcatgaggctactaaatgtcaatcttttagagatcacatgaagtctgtcatcccatctgatggtccatccgtggcttgtgtgaagaaagcttcttaccttgattgtatccgggccatcgctgctaacgaagctgacgcagtcaccttggacgcgggtttagtgtacgacgcatatctagccccaa
【權(quán)利要求】
1.用于生成感興趣的重組蛋白質(zhì)或多肽的方法，包括以下步驟: -提供經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其包含: a)分泌盒，其包含編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的重組核酸分子，和 b)至少一個(gè)重組啟動(dòng)子可操作地連接于編碼多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因，所述多肽或蛋白質(zhì)支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成，所述至少一個(gè)基因位于未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞的天然基因組基因座，其中所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的天然存在的啟動(dòng)子通過在所述天然存在的啟動(dòng)子內(nèi)的至少一個(gè)突變而失活， -在允許所述感興趣的蛋白質(zhì)或多肽和所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因表達(dá)的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，并 -從所述培養(yǎng)基分離所述感興趣的蛋白質(zhì)或多肽。
2.依照權(quán)利要求1的方法，特征在于所述至少一個(gè)重組啟動(dòng)子使得所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞相比于所述未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞能夠多產(chǎn)生至少100%，優(yōu)選至少200 %，更優(yōu)選至少300 %的支持多肽或蛋白質(zhì)生物合成的所述多肽或蛋白質(zhì)。
3.依照權(quán)利要求1或2的方法，特征在于編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的多肽或蛋白質(zhì)的所述至少一個(gè)基因是分子伴侶(chaperone)。
4.依照權(quán)利要求3的方法，特征在于所述分子伴侶選自下組:蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶、結(jié)合蛋白Kar2/BiP和鈣聯(lián)接蛋白。
5.依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，特征在于所述重組啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的經(jīng)遺傳修飾或未經(jīng)修飾的酵母啟動(dòng)子。
6.依照權(quán)利要求5的方法，特征在于所述酵母啟動(dòng)子選自下組:A0X1啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、FDH啟動(dòng)子和FLD啟動(dòng)子。
7.依照權(quán)利要求6的方法，特征在于所述酵母啟動(dòng)子是AOXl啟動(dòng)子，其包含SEQIDN0.1的核苷酸170至235或694至723或694至723和737至738內(nèi)的至少一個(gè)突變。
8.依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，特征在于所述酵母細(xì)胞是甲基營養(yǎng)型酵母細(xì)胞，優(yōu)選選自由畢赤酵母(Pichia)屬的酵母組成的組，優(yōu)選為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)和多形漢遜酵母(HansenulapoIymorpha)。
9.依照權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，特征在于所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的所述天然存在的啟動(dòng)子的至少一個(gè)突變是缺失。
10.依照權(quán)利要求9的方法，特征在于所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的所述天然存在的啟動(dòng)子的至少50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸是缺失的。
11.一種經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其包含: -至少一個(gè)重組啟動(dòng)子可操作地連接于編碼多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因，所述多肽或蛋白質(zhì)支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成，所述至少一個(gè)基因位于未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞的天然基因組基因座，其中所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的天然存在的啟動(dòng)子通過在所述天然存在的啟動(dòng)子內(nèi)的至少一個(gè)突變而失活，和 -分泌盒，其包含編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的重組核酸分子。
12.依照權(quán)利要求11的細(xì)胞，特征在于所述至少一個(gè)重組啟動(dòng)子使得所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞相比于所述未經(jīng)遺傳修飾的野生型酵母細(xì)胞能夠多產(chǎn)生至少100%，優(yōu)選至少200%，更優(yōu)選至少300%的支持多肽或蛋白質(zhì)生物合成的所述多肽或蛋白質(zhì)。
13.依照權(quán)利要求11或12的細(xì)胞，特征在于編碼支持所述細(xì)胞內(nèi)多肽或蛋白質(zhì)的生物合成的所述多肽或蛋白質(zhì)的所述至少一個(gè)基因是分子伴侶。
14.依照權(quán)利要求13的細(xì)胞，特征在于所述分子伴侶選自下組:蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶、結(jié)合蛋白Kar2/BiP和鈣聯(lián)接蛋白。
15.依照權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)的細(xì)胞，特征在于所述重組啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的經(jīng)遺傳修飾或未經(jīng)修飾的酵母啟動(dòng)子。
16.依照權(quán)利要求15的細(xì)胞，特征在于所述酵母啟動(dòng)子選自下組:ΑΟΧ1啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、FDH啟動(dòng)子和FLD啟動(dòng)子。
17.依照權(quán)利要求16的細(xì)胞，特征在于所述酵母啟動(dòng)子是AOXl啟動(dòng)子，其包含SEQIDN0.1的核苷酸170至235或694至723或694至723和737至738內(nèi)的至少一個(gè)突變。
18.依照權(quán)利要求11至17中任一項(xiàng)的細(xì)胞，特征在于所述酵母細(xì)胞是甲基營養(yǎng)型酵母細(xì)胞，優(yōu)選選自由畢赤酵母屬的酵母組成的組，優(yōu)選為巴斯德畢赤酵母、博伊丁假絲酵母和多形漢遜酵母。
19.依照權(quán)利要求11至18中任一項(xiàng)的細(xì)胞，特征在于所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的所述天然存在的啟動(dòng)子的至少一個(gè)突變是缺失。
20.依照權(quán)利要求19的細(xì)胞，特征在于所述編碼生物合成支持性多肽或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因的所述天然存在的啟動(dòng)子的至少50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸是缺失的。
21.依照權(quán)利要求11至20中任一項(xiàng)的細(xì)胞，特征在于所述編碼感興趣的蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子是載體的部分或整合到所述基因組中。
22.依照權(quán)利要求11至21中任一項(xiàng)的細(xì)胞用于生成重組蛋白質(zhì)或多肽的用途。
【文檔編號(hào)】C07K14/55GK103906833SQ201280053604
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月31日
【發(fā)明者】R.韋斯, T.珀卡索弗 申請(qǐng)人:Vtu控股有限責(zé)任公司