Dpp-4抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種DPP-4抑制劑，該DPP-4抑制劑以式(1)：Xe-Pro/Ala/Hyp-Xa-Xb-Xc-Xd(式中，Xe表示等電點(diǎn)為5.9～6.3的氨基酸殘基，Pro/Ala/Hyp表示Pro、Ala或Hyp，Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly、Pro或缺失，Xc表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)所示的肽作為有效成分。該抑制劑通過增強(qiáng)腸促胰島素的作用，可以期待降低血糖值的作用，可以用作糖尿病治療藥，此外，通過對免疫系統(tǒng)等發(fā)揮作用，可用于皮膚疾病的治療等。
【專利說明】DPP-4抑制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及包含2~6個(gè)氨基酸的特定序列的肽的二肽基肽酶4抑制劑(以下，只稱作DPP-4抑制劑)。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病 是引起高血糖、糖尿、體蛋白的解體、酮病、酸中毒等全身性代謝障礙的慢性疾病。通常，糖尿病大致分為以下兩種類型:胰腺的β細(xì)胞因?yàn)槟撤N原因被破壞，調(diào)節(jié)血糖值的胰島素枯竭的I型；以及血中雖然存在胰島素，但胰島素的作用差，或者來自胰腺的β細(xì)胞的胰島素分泌量減少，其結(jié)果，血糖值的調(diào)節(jié)功能不全的2型。
[0003]近年來，作為調(diào)節(jié)血糖值的激素，身為消化道激素之一的腸促胰島素受到關(guān)注。腸促胰島素是隨著食物的攝取由消化道分泌、并與胰β細(xì)胞發(fā)生作用以促進(jìn)胰島素分泌的激素的總稱，已知有葡萄糖依賴性胰島素分泌刺激多肽(GIP:glucose-dependentinsulinotropic polypeptide)和膜高血糖素樣妝-1 (GLP-1:glucagon_like peptide-1)這兩種。分泌的腸促胰島素與胰腺β細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過胰島素分泌促進(jìn)和胰高血糖素的分泌抑制，顯示出降低血糖值的作用。腸促胰島素的胰島素分泌促進(jìn)作用依賴于血中葡萄糖濃度，只有在一定濃度以上的葡萄糖存在下才得以體現(xiàn)。即，通過現(xiàn)有的治療方法即胰島素直接給藥，出現(xiàn)所擔(dān)心的低血糖的危險(xiǎn)性小，可以期待著安全地糾正飯后高血糖。實(shí)際上，已知通過靜脈對2型糖尿病患者持續(xù)給予作為腸促胰島素之一的GLP-1，可促進(jìn)胰島素分泌，血糖控制得到明顯改善，顯示出GLP-1補(bǔ)充療法的有效性。
[0004]另一方面，GLP-1被生物體內(nèi)廣泛存在的二肽基肽酶4(EC3.4.14.5，以下只稱作DPP-4。)快速分解。因此，作為糖尿病治療方法，新開發(fā)了抑制DPP-4的活性以持續(xù)增強(qiáng)內(nèi)源性GLP-1的作用的藥物。需要說明的是，DPP-4雖然在T細(xì)胞等免疫系細(xì)胞表面作為CD26在細(xì)胞膜上表達(dá)，但作為可溶性蛋白還存在于血液中，是將GLP-1滅活的絲氨酸蛋白酶。其對從N末端起第2位具有Pro或Ala的生理活性肽具有特異性作用，使二肽從N末端游離出來。
[0005]基于這樣的DPP-4的作用，有包含從N末端起第2位配列有Pro的3~12個(gè)氨基酸的肽的DPP-4抑制劑(專利文獻(xiàn)I)。該DPP-4抑制劑是將奶酪懸浮于水性溶劑中，之后除去不溶性物質(zhì)后得到的水溶性組分中所含的肽，經(jīng)口攝取混合有該肽的飲品時(shí)，在生物體內(nèi)能夠降低血糖值。專利文獻(xiàn)I中記載的DPP-4抑制劑是由天然物質(zhì)得到的，所以毒性低、安全性高。
[0006]另外，還有由乳蛋白水解物構(gòu)成、且刺激GLP-1的分泌、以及具有DPP-4抑制作用的肽(專利文獻(xiàn)2)。專利文獻(xiàn)2中公開的肽優(yōu)選2~8個(gè)氨基酸的長度、且包含Pro作為第二 N末端殘基的肽。在實(shí)施例中，作為某乳蛋白水解物，評(píng)價(jià)了 500~2000Da的肽組合物的DPP-4抑制效果，但它們的組成或肽序列尚不明確。
[0007]而且，還有含有來自飲食用原材料的調(diào)制物作為有效成分的DPP-4抑制劑(專利文獻(xiàn)3)。該DPP-4抑制劑含有固體濃度為3.5mg/ml以下、DPP-4抑制率為60%以上的來自飲食用原材料的調(diào)制物作為有效成分。在專利文獻(xiàn)3的實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了以綠豆、大豆、膠原蛋白、海藻、茶、核桃、甜茶、石榴、葡萄籽等為來源的肽的DPP-4抑制率。
[0008]進(jìn)一步,還以來自膠原蛋白或明膠的、用Gly-X-Y-(Gly-Z-W)η (式中,η表示O~4的整數(shù)，X表示Pr0或Leu，Y、Z和W各自獨(dú)立表示相同或不同的任意的氨基酸殘基(其中，Gly除外)。)表示的肽作為DPP-4抑制劑(專利文獻(xiàn)4)。在實(shí)施例中，通過高效液相色譜法分級(jí)市售的膠原蛋白肽，鑒定了 DPP-4抑制活性優(yōu)異的組分的肽序列。
[0009]另一方面，作為DPP-4抑制劑的作用，已知其抑制T淋巴球的增殖(非專利文獻(xiàn)I)。非專利文獻(xiàn)I指出:通過DPP-4抑制劑能夠緩和自身免疫性脊椎炎、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病等自身免疫疾病。另外，由于DPP-4與HIV-1對⑶4陽性T細(xì)胞的感染促進(jìn)有關(guān)，所以還有報(bào)道稱:通過DPP-4抑制劑和其他藥物的聯(lián)用，可以期待防御HIV-1的感染(非專利文獻(xiàn)2)。而且，還有報(bào)道稱:由于皮膚細(xì)胞表達(dá)DPP-4，所以DPP-4抑制劑對皮脂腺細(xì)胞或表皮細(xì)胞的增殖或分化或細(xì)胞因子的產(chǎn)生有影響(非專利文獻(xiàn)3)。使用DPP-4抑制劑抑制被痤瘡丙酸桿菌刺激的T淋巴細(xì)胞的增殖，引起成纖維細(xì)胞的TGF β的表達(dá)抑制、增殖抑制、基質(zhì)產(chǎn)生抑制，其結(jié)果暗示:使用DPP-4抑制劑，能夠治療青春痘、干癬、瘢痕疙瘩。
[0010]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011]專利文獻(xiàn)
[0012]專利文獻(xiàn)1:日本特開2007-39424號(hào)公報(bào)
[0013]專利文獻(xiàn)2:日本特表2009-517464號(hào)公報(bào)
[0014]專利文獻(xiàn)3: 日本特開2010-13423號(hào)公報(bào)
[0015]專利文獻(xiàn)4:國際公開第2008/066070號(hào)
[0016]非專利文獻(xiàn)
[0017]非專利文獻(xiàn)1:Role of dipeptidyl peptidase IV(DP IV)-like enzymes in Tlymphocyte activation investigations in DP IV/CD26_knockout mic, Clin Chem LabMed.2009 ；47(3):268-74.[0018]非專利文獻(xiàn)2 !Inhibition of human immunodeficiency virus typelinfectionin a T-cell line (CEM) by new dipeptidy1-peptidase IV (CD26)inhibitors.ResVirol.1997Jul-Aug ；148 (4):255-66.[0019]非專利文獻(xiàn)3:The ectopeptidases dipeptidyl peptidase IV(DP IV)andaminopeptidase N(APN) and their related enzymes as possible targets in thetreatment of skin diseases.Front Biosc1.2008Janl ；13:2364-75.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]發(fā)明所要解決的課題
[0021]上述專利文獻(xiàn)I~4中記載的DPP-4抑制劑均以奶酪或乳蛋白、其他飲食用原材料等天然物質(zhì)為原料，所以安全性優(yōu)異，但人們希望開發(fā)抑制效果更強(qiáng)的DPP-4抑制劑。
[0022]即，專利文獻(xiàn)I或?qū)＠墨I(xiàn)2只限定于特定的肽序列，其他序列中的DPP-4抑制效果尚不明確。另外，專利文獻(xiàn)I中記載的這些肽最初只限定于來自奶酪的水溶性組分的肽，所以關(guān)于其他序列的DPP-4抑制效果也尚不明確。另外，專利文獻(xiàn)2選擇2~8個(gè)氨基酸的長度、且包含Pro作為第一、第二、第三或第四N末端殘基、或者從C末端殘基或最后起第二位的C末端殘基中包含Pro的肽作為優(yōu)選的肽。上述文獻(xiàn)著眼于DPP-4對從N末端起第2位具有Pro或Ala的生理活性肽特異性地發(fā)揮作用的方面。但是，對于實(shí)施例中評(píng)價(jià)了DPP-4抑制效果的水解物，雖然評(píng)價(jià)了分子量分布與DPP-4抑制以及GLP-1分泌的關(guān)系，但使用的水解物的組成尚不明確。
[0023]專利文獻(xiàn)3也評(píng)價(jià)了豬或魚的膠原蛋白肽的DPP-4抑制率，但并不存在具體的關(guān)于肽序列的記載。而且，腸促胰島素作為DPP-4的底物被迅速分解，所以血中半衰期非常短。因此，通過DPP-4抑制劑來確保血中的腸促胰島素濃度時(shí)，要求其在血液中迅速發(fā)揮DPP-4抑制作用，要求DPP-4抑制劑的生物體吸收性優(yōu)異。
[0024]另一方面，專利文獻(xiàn)4的實(shí)施例中使用的肽是使用反相柱分離收集市售的膠原蛋白肽，并特定是DPP-4抑制活性優(yōu)異的肽，并沒有系統(tǒng)性地評(píng)價(jià)肽序列和DPP-4抑制活性。另外，最初原料的膠原蛋白是進(jìn)行膠原酶處理形成的市售的明膠。在利用膠原酶進(jìn)行的分解中，由于N末端為Gly的肽是主要成分，所以制備N末端為Gly以外的肽或C末端為Gly的肽，無法評(píng)價(jià)DPP-4抑制活性。
[0025]另一方面，如非專利文獻(xiàn)I~非專利文獻(xiàn)3所示，DPP-4抑制劑對免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，還可用于皮膚疾病的治療等醫(yī)療用途，因此其用途有可能擴(kuò)大。
[0026]在這樣的狀況下，希望開發(fā)來自安全性高的肽的DPP-4抑制劑。
[0027]解決課題的方法
[0028]本發(fā)明人為了解決上述課題，參照膠原蛋白的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)合成了各種肽，評(píng)價(jià)DPP-4抑制劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn):即使從N末端起第2位的氨基酸殘基是Hyp，也能夠發(fā)揮DPP-4抑制活性；即使從N末端起第2位是Ρι.ο或Ala，也存在不具有DPP-4抑制活性的肽；以及從N末端起第3位的氨基酸殘基是Gly時(shí)，DPP-4抑制活性優(yōu)異等，完成了本發(fā)明。而且，本發(fā)明中使用的肽是包含2~6個(gè)氨基酸的特定序列的肽，所以血中的轉(zhuǎn)移性優(yōu)異，可以迅速發(fā)揮DPP-4抑制作用，并且由于是來自膠原蛋白的氨基酸序列，所以安全性優(yōu)異。
[0029]即，本發(fā)明提供DPP-4抑制劑，該DPP-4抑制劑以式(I):Xe-Pro/Ala/Hyp-Xa-Xb-Xc-Xd(式中,Xe表示等電點(diǎn)為5.9~6.3的氨基酸殘基,Pro/Ala/Hyp表示Pro、Ala或Hyp, Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失,Xb表示Gly、Pro或缺失,Xe表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)所示的肽作為有效成分。
[0030]另外，本發(fā)明還提供上述DPP-4抑制劑，其中，所述肽為下述式㈧或式⑶中的任意一種:
[0031]式(A):Gly_Pro/Ala-Xa-Xb-Xc-Xd (式中，Pro/Ala 表不 Pro 或 Ala, Xa 表不 Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)
[0032]式(B):Leu/Ile/Ala-Hyp/Pro-Xa-Xb-Xc (式中，Leu/Ile/Ala 表不 Leu> Ile 或Ala, Hyp/Pro表示Hyp或Pro, Xa表示Hyp、Pro、Ile和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。)
[0033]另外，本發(fā)明還提供上述DPP-4抑制劑，其中，所述肽為下述式(A-1)、式(A-2)、式(B-1)、 式(B-2)或式(B-3)中的任意一種:
[0034]式(A-1):Gly-Pro-Xa-Xb-Xc-Xd(式中，Xa 表示 Hyp 以外的等電點(diǎn)為 3.0 ~6.2的氨基酸殘基，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pix)或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)、[0035]式(A-2):Gly-Ala-Xa-Xb-Xc-Xd(式中，Xa表示等電點(diǎn)為5.8~6.2的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)、
[0036]式(B-1):Leu-Pro-Xa-Xb-Xc (式中，Xa 表示 Gly 或缺失，Xb 表示 Pro 或缺失，Xe表示Ala或缺失。)、
[0037]式(B_2):Leu/Ile-Hyp-Xa-Xb_Xc (式中，Leu/Ile 表不 Leu 或 lie, Xa 表不 Gly 或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。)、或
[0038]式(B-3):Ala-Hyp/Pro-Gly (式中，Hyp/Pro 表示 Hyp 或 Pro。)。
[0039]除此之外，本發(fā)明還提供上述DPP-4抑制劑，其中，所述肽為選自 Gly-Pro-Ala-Gly、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro> Gly-Pro-AIa-Gly-Pro-Arg>Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-1le、Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Val、Gly-Pro-1 Ie-GIy-Pro-VaI > Gly-Pro-Val > Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Glu、Gly-Ala、Gly-Ala-1le-Gly-Pro-Ala> Gly-Ala-1le-Gly-Pro-Ser> Gly-Ala~Val-Gly-Pro-Ala>Gly-Ala-Val-Gly-Pro、Leu-Pro> Leu-Pro-Gly、Leu-Pro-Gly-Pro-Ala、Ala-Pro-Gly、Ile-Hyp-Gly 和 Leu-Hyp-Gly-Pro-Ala 的任意一種以上。
[0040]而且，本發(fā)明還提供上述DPP-4抑制劑，其中，所述肽為式(A)所示的任意一種以上和式(B)所示的任意一種以上的混合物: [0041]式(A):Gly_Pro/Ala-Xa-Xb-Xc-Xd (式中，Pro/Ala 表不 Pro 或 Ala, Xa 表不 Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)
[0042]式(B):Leu/Ile/Ala-Hyp/Pro-Xa-Xb-Xc (式中，Leu/Ile/Ala 表不 Leu> Ile 或Ala, Hyp/Pro表示Hyp或Pro, Xa表示Hyp、Pro、Ile和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。)。
[0043]發(fā)明效果
[0044]根據(jù)本發(fā)明，提供安全性優(yōu)異、并且DPP-4抑制活性也優(yōu)異的新的DPP-4抑制劑?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0045]圖1是顯示實(shí)施例6中合成的肽(Gly-Pro-1le-Gly-Pro-Val)的DPP-4抑制曲線的圖。
[0046]圖2是顯示實(shí)施例17中合成的肽(Leu-Pro-Gly)的DPP-4抑制曲線的圖。
[0047]圖3是顯示氨基酸的等電點(diǎn)的一覽表。
【具體實(shí)施方式】
[0048]第一本發(fā)明涉及DPP-4抑制劑，該DPP-4抑制劑以式(I):Xe-Pro/Ala/Hyp-Xa-Xb-Xc-Xd(式中,Xe表示等電點(diǎn)為5.9~6.3的氨基酸殘基,Pro/Ala/Hyp表示Pro、Ala或Hyp, Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失,Xb表示Gly、Pro或缺失,Xe表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)所示的肽作為有效成分。
[0049]人的DPP-4是由766個(gè)氨基酸構(gòu)成的IlOkDa的膜蛋白，是在氨基側(cè)末端配置有P螺旋結(jié)構(gòu)域、在羧基側(cè)末端配置有α/β水解酶結(jié)構(gòu)域、且所述α/β水解酶結(jié)構(gòu)域中存在3個(gè)催化殘基(Ser630、His740、Asp708)的酶。在血中，胞外區(qū)和膜結(jié)合區(qū)被切斷，以可溶型的形式存在。鑒于使二肽從自N末端起第2位具有Pro或Ala的肽中游離出來的特異性，例如如上述專利文獻(xiàn)I所示，從氨基末端起第2位配有Ala或Pro的各種肽作為DPP-4抑制劑被提案，測定其IC5(I。另外，已知抑二肽素A(Ile-PiO-1le)雖然是DPP-4的底物，但kcat和Km值均低，所以像抑制劑那樣發(fā)揮作用，在專利文獻(xiàn)I的實(shí)施例中，也同時(shí)記載著各種肽和抑二肽素A的IC5tl的測定值。
[0050]在這樣的狀況下，為了開發(fā)安全性優(yōu)異、并且DPP-4抑制效果也優(yōu)異的肽，作為含有大量的Pro的肽，參照膠原蛋白的氨基酸序列合成了各種肽。
[0051]需要說明的是，膠原蛋白是以3條多肽鏈的三重螺旋結(jié)構(gòu)作為基本單元，是構(gòu)成生物體的真皮、韌帶、肌腱、骨、軟骨等的蛋白。多個(gè)膠原蛋白分子締合形成膠原蛋白纖維。構(gòu)成膠原蛋白分子的氨基酸用-Gly-氨基酸X-氨基酸Y-表示，每3個(gè)Gly殘基重復(fù)，具有所謂的被稱作“膠原蛋白樣序列”的一級(jí)結(jié)構(gòu)。作為膠原蛋白所特有的氨基酸，有在Pro或Lys上加成有I個(gè)羥基的羥基脯氨酸(Hyp)或羥基賴氨酸(Hyl)等，在所述膠原蛋白樣序列中，存在具有Pro作為所述氨基酸X的序列、或作為氨基酸Y存在許多Hyp，通過該膠原蛋白樣序列維持著三重螺旋結(jié)構(gòu)。在加工強(qiáng)韌的膠原蛋白時(shí)，利用酸或堿、酶進(jìn)行水解，加工成明膠等。作為這樣的酶，有膠原酶并經(jīng)常使用，膠原酶主要是產(chǎn)生N末端為Gly的肽的肽鏈內(nèi)切酶，因此，現(xiàn)有的膠原蛋白分解物中，N末端為Gly的肽是主要成分。因此，本發(fā)明并不限于這樣的酶分解，為了研制DPP-4抑制活性優(yōu)異的肽，參照膠原蛋白的氨基酸序列選出一部分序列、或者改變所選出的一部分序列以合成各種肽，評(píng)價(jià)對DPP-4的抑制率。
[0052]本發(fā)明中評(píng)價(jià)的肽是參照膠原蛋白的氨基酸序列的肽，所以在生物體內(nèi)按照攝取膠原蛋白時(shí)的常規(guī)工序進(jìn)行代謝，安全性高。作為參考，將來自牛的I型膠原蛋白α?鏈的序列記載在SEQ ID Ν0:14中。該序列作為NCBI的檢索號(hào)ΝΡ001029211來注冊。需要說明的是，膠原蛋白中所 含的Hyp是在膠原蛋白生成后用脯氨酸羥化酶修飾Pro而得到的產(chǎn)物。SEQ ID NO:14是翻譯后修飾前的氨基酸序列，不包括Hyp。以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0053]本發(fā)明的DPP-4 抑制劑以式(I):Xe-Pro/Ala/Hyp-Xa-Xb-Xc-Xd(式中，Xe 表示等電點(diǎn)為5.9~6.3的氨基酸殘基，Pro/Ala/Hyp表示Pro、Ala或Hyp, Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly、Pro或缺失，Xe表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)所示的肽作為有效成分。研究氨基酸序列和DPP-4抑制活性時(shí)明確了:當(dāng)從N末端起第3位的氨基酸殘基為Hyp或Ρι.ο時(shí)，不管其他氨基酸殘基如何，DPP-4抑制活性均低或者不具有DPP-4抑制活性。另外，從N末端起第2位的氨基酸殘基為Pro、Ala或Hyp時(shí)，DPP-4抑制活性優(yōu)異，當(dāng)滿足上述條件時(shí)，N末端的氨基酸殘基可以在等電點(diǎn)為5.9~6.3的范圍內(nèi)廣泛選擇。作為Xe，優(yōu)選Gly、Ala、lie、Leu、Pro，更優(yōu)選為Gly、Ala、lie 或 Leu。
[0054]作為上述式(I)所示的肽，可以是式(A):Gly-Pro/Ala-Xa-Xb-Xc-Xd(式中，Pro/Ala表示Pro或Ala, Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)。
[0055]N末端為Gly時(shí)，Xa優(yōu)選為Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基。DPP-4具有使二肽從自N末端起第2位具有Pro或Ala的肽中游離出來的特異性，所以推測:從N末端第2位的氨基酸殘基為Pro或Ala的肽具有DPP-4抑制活性。但是明確了:即使第2位的氨基酸殘基為Pro或Ala，但若從N末端起第3位的氨基酸殘基為Hyp或Pro，則DPP-4抑制活性極低、或者完全不存在。
[0056]而且，從N末端起第2位的氨基酸殘基為Pro時(shí)，作為Xa，優(yōu)選Ala、Gln、Glu、He、Leu,Val等的等電點(diǎn)為ρΗ3.0~6.2的Hyp以外的氨基酸殘基。特別優(yōu)選為Ala、Gln、Glu、lie、Leu、Val。
[0057]另一方面，從N末端起第2位的氨基酸殘基為Ala時(shí)，作為Xa，有Val、Leu或Ile等的等電點(diǎn)為PH5.8~6.2的氨基酸殘基或缺失。如后述的實(shí)施例所示，這與從N末端起第4位以后的氨基酸序列無關(guān)，是DPP-4抑制活性優(yōu)異的緣故。需要說明的是，在本發(fā)明中，氨基酸的等電點(diǎn)依據(jù)圖3所示的數(shù)值。
[0058]在上述式(A)中，Xb表示Gly或缺失，當(dāng)Xb缺失時(shí)，形成三肽。
[0059]Xe表示Pro或缺失，Xe缺失時(shí)，形成四肽。另外，Xd可以是任一種氨基酸殘基，或者可以缺失。本發(fā)明中使用的上述通式(A)所示的肽從N末端起具有Gly-Pro/Ala-的序列，如后述的實(shí)施例所示， 在2~6個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)，隨著肽鏈的變長，DPP-4抑制活性有上升的趨勢，但若超過5個(gè)氨基酸殘基，則活性上升率不變。這意味著:DPP-4抑制活性由N末端起第4位的序列決定,與從N末端起第6位氨基酸殘基的種類無關(guān)。結(jié)合作為Xd的各種氨基酸殘基來評(píng)價(jià)DPP-4抑制活性時(shí)，在結(jié)合親水性且等電點(diǎn)超過pHIO的Arg、作為亞氨基酸的一種的Hyp、疎水性且等電點(diǎn)在弱酸性側(cè)的lie、Val、Ser, Ala等范圍寬的氨基酸殘基的肽中，發(fā)揮DPP-4抑制活性。
[0060]作為本發(fā)明中使用的式⑷所示的肽，可以是式(A-1) =Gly-Pro-Xa-Xb-Xc-Xd(式中，Xa表示Hyp以外的等電點(diǎn)為3.0~6.2的氨基酸殘基，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)。
[0061]作為上述式(A-1)所示的Xa,優(yōu)選Ala、Gin、Glu、lie、Val或Leu,作為Xd,優(yōu)選Ala、Hyp、Leu、Val> Arg 或缺失。
[0062]另外，作為本發(fā)明中使用的式㈧所示的肽，可以是式(A-2):Gly-Ala-Xa-Xb-Xc-XcK式中，Xa表示等電點(diǎn)為5.8~6.2的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)。
[0063]作為上述式(A-2)所示的乂3,優(yōu)選1^11、116、'\^11或缺失,作為父(1,優(yōu)選六13、561'或缺失。
[0064]本發(fā)明的DPP-4抑制劑中，作為上述式(A)所示的肽，有Gly-Pro-Ala_Gly、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro、 GIy-Pro-Ala_GIy_Pro_Arg、 GIy-Pro-AIa-GIy-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-1Ιθλ Gly-Pro-Leu-GIy-Pro-Va1、Gly-Pro-1Ie-GIy-Pro-Val、Gly-Pro-ValΛ Gly-Pro-Gln、 Gly-Pro-Glu、 Gly-Ala、 Gly-Ala-1le-Gly-Pro-Ala、Gly-Ala-1le-Gly-Pro-SerλGly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala、Gly-Ala-Val-Gly-Pro。
[0065]另外，本發(fā)明的DPP-4 抑制劑可以是式(B):Leu/Ile/Ala-Hyp/PiO-Xa-Xb-Xc (式中，Leu/Ile/Ala 表不 Leu、Ile 或 Ala，Hyp/Pro 表不 Hyp 或 Pro, Xa 表不 Hyp、Pro、Ile 和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。)所示的肽。
[0066]膠原蛋白中包含-Gly-氨基酸X-氨基酸Y-所示的膠原蛋白樣序列，但在N末端不限于Gly的情況下評(píng)價(jià)DPP-4抑制活性時(shí)，明確了當(dāng)從N末端起第3位的氨基酸殘基為Gly時(shí)DPP-4抑制活性優(yōu)異。此時(shí)，N末端的氨基酸殘基為Leu、Ile或Ala，隨著肽鏈變長，DPP-4抑制活性有增加的趨勢。從N末端起第2位的氨基酸可以是Pro也可以是Hyp。DPP-4具有使二肽從自N末端起第2位具有Ρι.ο或Ala的肽中游離出來的特異性，但在N末端為Phe、Pro或Ala時(shí)，即使從N末端起第2位的氨基酸為Pro或Hyp，DPP-4抑制活性也低或完全不存在。這意味著:DPP-4抑制活性還受到N末端的氨基酸殘基種類的影響。但是，SP使在這種情況下，若結(jié)合Gly作為從N末端起第3位的氨基酸殘基，則DPP-4抑制活性提高。Xa缺失時(shí)形成二肽，Xb缺失時(shí)形成三肽。需要說明的是，若參照膠原蛋白的氨基酸序列，則在式⑶中無法假設(shè)Xa的氨基酸殘基為lie，Xa為Hyp、Pro、Ile和Arg以外的氨基酸殘基或缺失。
[0067]作為本發(fā)明中使用的式⑶所示的肽，可以優(yōu)選使用式(B-1):Leu-Pro-Xa-Xb-Xc (式中,Xa表示Gly或缺失,Xb表示Pro或缺失,Xe表示Ala或缺失。)。
[0068]另外，作為本發(fā)明中使用的式⑶所示的肽，可以是式(B-2) =Leu/Ile-Hyp-Xa-Xb-Xc (式中，Leu/IIe 表不 Leu 或 lie, Xa 表不 Gly 或缺失，Xb 表不 Pro 或缺失，Xe表示Ala或缺失。)。
[0069]而且，作為本發(fā)明中使用的式⑶所示的肽，可以是式(B-3) =Ala-Hyp/Pro-Gly (式中，Hyp/Pro 表示 Hyp 或 Pro。)。
[0070]本發(fā)明的DPP-4抑制劑中，作為上述式(B)所示的肽，有Leu-Pro、Leu-Pro-Gly,Leu-Pro-Gly-Pro-Ala、Ala-Pro-Gly、Ile-Hyp-Gly 和 Leu-Hyp-Gly-Pro-Ala。
[0071]本發(fā)明的DPP-4抑制劑中使用的上述肽可以是構(gòu)成醫(yī)學(xué)上可接受的鹽的肽。需要說明的是，醫(yī)學(xué)上可接受的鹽是指，藥理學(xué)上可接受且對給藥的受試者基本無毒的作為本發(fā)明化合物的鹽的形式。作為上述肽的藥學(xué)上可接受的鹽，有鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、鈣鹽等無機(jī)鹽；乙酸鹽、丙酸鹽、羥基乙酸鹽、乳酸鹽、羥基丁酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、己二酸酸、酒石酸、枸櫞酸鹽、戊二酸鹽等有機(jī)酸鹽；鹽酸鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、羧酸鹽、膦酸鹽、磺酸鹽等加成鹽。
[0072]如上所述，本發(fā)明的DPP-4抑制劑是參照膠原蛋白的氨基酸一級(jí)序列來選擇DPP-4抑制效果優(yōu)異的抑制劑、或者改變一部分序列而得到的抑制劑，可以通過肽合成來制備。但是，也可以是通過其他方法制備的抑制劑。
[0073]本發(fā)明的DPP-4抑制劑，通過口服給藥，可以在生物體內(nèi)通過抑制DPP-4來降低血糖值，可以用作糖尿病的預(yù)防藥、治療藥?？诜o藥時(shí)，作為本發(fā)明的DPP-4抑制劑的劑型，除了直接使用肽以外，還可以混合其他的賦形劑以制成片劑、細(xì)粒劑、丸劑、錠劑等，也可以裝在膠囊中制成膠囊劑，更可以制成液體制劑等?？诜o藥時(shí)，考慮到治療或預(yù)防的目的、癥狀、體重、年齡等條件，可以適當(dāng)選擇。另外，還可以作為補(bǔ)充物來攝取。
[0074]關(guān)于本發(fā)明的DPP-4抑制劑的給藥量，可以根據(jù)給藥形式、給藥目的、受試者的年齡等適當(dāng)選擇。通常，口服給藥時(shí)，成人每天0.001~100mg/kg,優(yōu)選0.01~50mg/kg,更優(yōu)選為0.1~20mg/kg。當(dāng)為注射劑時(shí)，成人每天例如0.0001~50mg/kg,優(yōu)選0.001~20mg/kg,特別優(yōu)選為 0.01 ~10mg/kg。
[0075]作為這樣的肽，可以優(yōu)選使用式(A):Gly-Pro/Ala-Xa-Xb-Xc_Xd(式中，Pro/Ala表示Pro或Ala, X a表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。)所示的任意一種以上和式⑶:LeU/Ile/Ala-Hyp/Pro-Xa-Xb-Xc (式中，Leu/Ile/Ala 表不 Leu、Ile 或 Ala, Hyp/Pro 表不 Hyp 或 Pro,Xa表示Hyp、Pro、Ile和Arg以外的氨基酸殘基或缺失,Xb表示Pro或缺失,Xe表示Ala或缺失。)所示的任意一種以上的混合物作為DPP-4抑制劑。這是由于:雖然均來自膠原蛋白的氨基酸序列，但式(A)的N末端為Gly，而式(B)的N末端為Gly以外的氨基酸殘基，所以攝取后的代謝速度等不同，可以期待并用效果的緣故。
[0076]本發(fā)明的DPP-4抑制劑，可以將其混合在食品中經(jīng)口攝取。作為這樣的混合有本發(fā)明的DPP-4抑制劑的食品，有包含野菜或果實(shí)、乳酸菌等的果汁等飲料、果凍、酸奶、布丁、冰激凌等半流動(dòng)性食品等，此外還可以混合在其他食材中制成固體食品。
[0077]另外，還指出DPP-4抑制劑具有T淋巴細(xì)胞的增殖效果，其緩和自身免疫性脊椎炎、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病等自身免疫疾病。因此，本發(fā)明的DPP-4抑制劑也有可能能夠用于上述疾病。此時(shí)的用途并不限于內(nèi)服，還可以是注射到炎癥部位等的外科處方。
[0078]實(shí)施例
[0079]接下來，例舉實(shí)施例以具體說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例對本發(fā)明沒有任何限制。
[0080]DPP-4抑制活性的測定方法
[0081](l)DPP-4抑制率的測定方法
[0082]將Img試樣溶解在lml50mM的Tris-鹽酸緩沖液(ρΗ7.5)中，將所得的35 μ I樣品液和15 μ I溶解在50mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)中的DPP_4( '> ^公司制、來自豬腎臟；8.6mU/ml)在微板孔(NUNC公司制、商品名“237015”)中混合，在37°C下培養(yǎng)10分鐘。
[0083]向其中添加50 μ I預(yù)先保溫在37 °C的底物溶液(將甘氨酰Pro-4-甲基香豆素-7-酰胺(Gly-Pro-MCA)溶解在50mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)中使?jié)舛冗_(dá)到10 μ M的溶液)并進(jìn)行混合，在37°C下反應(yīng)20分鐘。
[0084]使用酶標(biāo)儀型熒光檢測器(- n f電器公司制、商品名“SH-9000”)，隨時(shí)間測定通過DPP-4而游離的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的熒光強(qiáng)度。需要說明的是，在激發(fā)波長380nm、測定波長460nm下進(jìn)行測定。需要說明的是，使用等量的50mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)代替樣品來作為對照，測定其熒光強(qiáng)度。
[0085]DPP-4的活性用反應(yīng)時(shí)間中的熒光強(qiáng)度變化量的平均梯度表示，關(guān)于DPP-4抑制率，以對照為100%，從所述對照中減去樣品的活性而得到的值作為抑制率(％)而算出。
[0086](2) IC50值的測定方法
[0087]根據(jù)上述的DPP-4抑制率的測定方法，使樣品濃度在0.001~7.2 μ mo I/ml之間變化，得到抑制率，算出DPP-4活性的50%抑制濃度(IC5tl值)。
[0088](實(shí)施例1)
[0089]利用使用了 7 4 F' K 4才7 f Λ文' 公司制的肽自動(dòng)合成裝置(433Α)的Fmoc固相合成法,合成表1所示的Gly-Pro-Ala-Gly-Pro。
[0090]進(jìn)行合成時(shí)，將位于寡肽的C-末端的氨基酸擔(dān)載在樹脂上，利用使N-末端的每一個(gè)氨基酸伸長的逐步延伸法進(jìn)行合成，伸長反應(yīng)中的肽耦合反應(yīng)使用二異丙基碳化二亞胺(DIC)和1-羥基苯并三唑(HOBt)作為縮合劑。需要說明的是，伸長的N-末端氨基酸的氨基用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)起來，但由于寡肽的構(gòu)成氨基酸中不包含具有反應(yīng)活性的側(cè)鏈，所以特別是沒有對側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)。
[0091 ] 首先，將用Fmoc保護(hù)位于寡肽C-末端的Pro的N-末端、并將C-末端擔(dān)載在樹脂上而得到的0.5g Fmoc-Pro-Wang樹脂(0.5-0.8mmol/g、Bachem公司制)擔(dān)載在樹脂上。將其裝入肽自動(dòng)合成裝置的反應(yīng)容器中，使用20%哌啶-DMF溶液進(jìn)行10分鐘的Fmoc的脫保護(hù)。用DMF清洗樹脂I分鐘，之后在反應(yīng)溶液中分別加入Immol的Fmoc-Gly-OH、DIC和HOBt。反應(yīng)I小時(shí)后，確認(rèn)沒有檢測到未反應(yīng)的N-末端，用DMF清洗I分鐘。再用20%哌啶-DMF進(jìn)行Fmoc的脫保護(hù)，用DMF清洗樹脂后，分別加入Immol的Fmoc-Ala-OH、DIC和HOBt進(jìn)行反應(yīng)。以下，按照相同的方法，對Pro、Gly也進(jìn)行上述操作，使每一個(gè)氨基酸伸長。得到的Fmoc-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Wang樹脂用20%哌唳-DMF溶液進(jìn)行10分鐘的脫保護(hù)，之后減壓干燥。得到的干燥樹脂用TFA(10mLX3次)進(jìn)行處理，將寡肽粗產(chǎn)物從樹脂中洗脫到TFA中。
[0092]在室溫下減壓餾去所得的TFA溶液，之后在冰冷下向殘余物中加入IOmL 二乙醚，得到沉淀物。沉淀物進(jìn)一步用二乙醚(10mLX5次)清洗，將沉淀物減壓干燥。此時(shí)得到的粗產(chǎn)物的重量為38.5mg(收率為29.8% )。將得到的粗產(chǎn)物溶解在純凈水中，利用反相高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分離收集，進(jìn)行純化。得到的純化物通過薄層色譜法(TLC)、HPLC確認(rèn)純度后，通過Edman法確定氨基酸序列，再使用質(zhì)量分析裝置(MALD1-T0F)確認(rèn)是目標(biāo)分子量。
[0093]最終的目的物的重量為30.7mg,收率為23.8%。
[0094]使用所得的肽測定DPP-4抑制率和IC5tl值。結(jié)果見表1。
[0095](實(shí)施例2~實(shí)施例9)
[0096]使用Fmoc-Arg(Pbf)-Wang 樹脂、Fmoc-Hyp-Wang 樹脂、Fmoc-1le-Wang 樹月旨、Fmoc-Val-Wang 樹月旨、Fmoc-Gln-Wang、Fmoc-Pro-ffang 樹脂作為寡肽的 C-末端氛基酸，使用 Fmoc- Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-1le-OH 作為 Fmoc 基保護(hù)氨基酸，根據(jù)實(shí)施例1來合成表1所示的Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg (實(shí)施例 2)、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp(實(shí)施例 3)、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-1le (實(shí)施例4) > Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Val (實(shí)施例 5)、Gly-Pro-1Ie-Gly-Pro-Val (實(shí)施例 6)、Gly-Pro-Val (實(shí)施例 7)、Gly-Pro-Gln (實(shí)施例 8)、Gly-Pro-Ala-Gly (實(shí)施例 9)。
[0097]需要說明的是，實(shí)施例2的肽合成不同于實(shí)施例1，由于使用包含2個(gè)氨基的Arg，所以使用Arg側(cè)鏈的胍基已用Pbf基(2，2，4，6，7_五甲基二氫苯并呋喃_5_磺?；?保護(hù)起來的Fmoc-Arg (Pbf) -Wang樹脂，最后通過TFA除去Pbf基。
[0098]同樣，在實(shí)施例8的肽合成中，由于使用側(cè)鏈包含酰胺基的Gln，所以使用Gln側(cè)鏈的酰胺基已用Trt基(三苯甲基)保護(hù)起來的Fmoc-Gln (Trt) -Wang樹脂，最后通過TFA除去Trt基。
[0099]使用得到的肽，與實(shí)施例1同樣操作，測定DPP-4抑制率。結(jié)果見表1。另外，制作實(shí)施例6中合成的肽(Gly-Pro-1Ie-Gly-Pro-Val)的DPP-4抑制曲線。該抑制曲線見圖1o
[0100](實(shí)施例10~實(shí)施例15)
[0101]使用氨基已用Fmoc基保護(hù)起來的氨基酸，依照實(shí)施例1合成表1所示的實(shí)施例10~15的肽，制作DPP-4抑制曲線。結(jié)果見表1。需要說明的是，實(shí)施例10的肽合成與實(shí)施例I不同，由于使用包含2個(gè)羧基的Glu，所以使用Glu側(cè)鏈的羧基已用叔丁基(But基)保護(hù)起來的Fmoc-Glu (OBut) -Wang樹脂，最后通過TFA除去But基。
[0102]另外，關(guān)于實(shí)施例13的肽，使用Fmoc-Ser (But) -Wang樹脂作為寡肽的C-末端氨基酸，依照實(shí)施例1合成Gly-Ala-1le-Gly-Pro-Ser。需要說明的是，與實(shí)施例1不同，由于使用包含羥基的絲氨酸，所以使用Ser側(cè)鏈的羥基已用叔丁基(But基)保護(hù)起來的Fmoc-Ser (But) -Wang樹脂,最后通過TFA除去But基。
[0103](比較例I~比較例3)
[0104]使用氨基已用Fmoc基保護(hù)起來的氨基酸，依照實(shí)施例1合成表1所示的比較例I~比較例3的肽。使用得到的肽，測定DPP-4抑制率和IC5q值。結(jié)果見表1。需要說明的是，比較例I~比較例3的肽均為構(gòu)成SEQ ID NO:14的一部分氨基酸序列的肽。
[0105]需要說明的是，在本申請中，以滿足根據(jù)上述測定方法測定的DPP-4抑制率為30%以下、或IC5tl為ΙΟμ mol/ml以上的任一種肽作為比較例。
[0106][表1]
【權(quán)利要求】
1.一種DPP-4抑制劑，其以式1:Xe-Pro/Ala/Hyp-Xa-Xb-Xc-Xd所示的肽作為有效成分，式中，Xe表示等電點(diǎn)為5.9~6.3的氨基酸殘基,Pro/Ala/Hyp表示Pro、Ala或Hyp,Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly、Pro或缺失，Xe表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DPP-4抑制劑，其中，所述肽為式A或式B中的任一種:
式 A:Gly-Pro/Ala-Xa-Xb-Xc-Xd,式中，Pro/Ala 表不 Pro 或 Ala, Xa 表不 Hyp> Pro 和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失；
式 B: Leu/11 e/Al a-Hyp/Pro-Xa-Xb-Xc,式中，Leu/Ile/Ala 表不 Leu、Ile 或 Ala, Hyp/Pro表示Hyp或Pro, Xa表示Hyp、Pro、He和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DPP-4抑制劑，其中，所述肽為下述式中任意一種: 式A-1:Gly-Pro-Xa-Xb-Xc-Xd，式中，Xa表示Hyp以外的等電點(diǎn)為3.0~6.2的氨基酸殘基，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失； 式A-2:Gly-Ala-Xa-Xb-Xc-Xd，式中，Xa表示等電點(diǎn)為5.8~6.2的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失； 式B-1:Leu-Pro-Xa-Xb-Xc,式中，Xa表不Gly或缺失,Xb表不Pro或缺失,Xe表不Ala或缺失； 式 B_2:Leu/Ile-Hyp-Xa-Xb-Xc,式中，Leu/lle 表不 Leu 或 lie, Xa 表不 Gly 或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失；或 式 B-3:Ala-Hyp/Pro-Gly,式中，Hyp/Pro 表示 Hyp 或 Pro。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的DPP-4抑制劑，其中，所述肽為選自 Gly-Pro-Ala-Gly、 Gly-Pro-AIa-GIy-Pro> Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg>Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-1le> Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-VaKGly-Pro-1 Ie-Gly-Pro-VaI > Gly-Pro-Val > Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Glu、Gly-Ala、Gly-Ala-1Ie-Gly-Pro-Ala> Gly-Ala-1Ie-Gly-Pro-Ser> Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala>Gly-Ala-Val-Gly-Pro、Leu-Pro> Leu-Pro-Gly、Leu-Pro-Gly-Pro-Ala、Ala-Pro-Gly、Ile-Hyp-Gly 和 Leu-Hyp-Gly-Pro-Ala 的任意一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DPP-4抑制劑，其中，所述肽為式A所示的任意一種以上和式B所示的任意一種以上的混合物:
式 A:Gly-Pro/Ala-Xa-Xb-Xc-Xd,式中，Pro/Ala 表不 Pro 或 Ala, Xa 表不 Hyp> Pro 和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸殘基或缺失；
式 B: Leu/11 e/Al a-Hyp/Pro-Xa-Xb-Xc,式中，Leu/Ile/Ala 表不 Leu、Ile 或 Ala, Hyp/Pro表示Hyp或Pro, Xa表示Hyp、Pro、He和Arg以外的氨基酸殘基或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。
【文檔編號(hào)】C07K5/103GK103987724SQ201280054376
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月4日
【發(fā)明者】林田治, 楠畑雅, 厚沢雄二, 多賀祐喜, 小山洋一, 服部俊治 申請人:株式會(huì)社日皮