異二聚體蛋白的生成的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于生成異二聚體蛋白的體外方法。
【專利說明】異二聚體蛋白的生成 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于生成異二聚體蛋白的體外方法，其包括在還原性條件下溫育第一 和第二同二聚體蛋白的第一步和使從第一步獲得的組合物經(jīng)受氧化條件的第二步。本發(fā)明 的方法特別適合于包含抗體的異二聚體蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 近年來單克隆抗體已成為成功的治療分子，特別是用于治療癌癥。雙特異性抗體 可進(jìn)一步能夠提高單克隆抗體療法的效力和功效，例如它們可以用于將藥物或毒性化合物 引導(dǎo)至靶細(xì)胞，用于將效應(yīng)器機(jī)制再引導(dǎo)至疾病相關(guān)部位或提高對腫瘤細(xì)胞的特異性，例 如通過與只見于腫瘤細(xì)胞的靶分子的組合結(jié)合。此外，通過在一種雙特異性抗體中組合兩 種單克隆抗體的特異性可以潛在連結(jié)較大的一批作用機(jī)制，即其組合的作用機(jī)制。
[0004] 最近Chames and Baty (2009)Curr Opin Drug Disc Dev 12:276 已經(jīng)綜述了關(guān)于 雙特異性抗體的不同形式和用途。開發(fā)雙特異性抗體的主要障礙之一是通過傳統(tǒng)技術(shù)難以 制備足夠質(zhì)量和數(shù)量的材料，所述傳統(tǒng)技術(shù)諸如雜交雜交瘤和化學(xué)綴合方法（Marvin and Zhu(2005)Acta Pharmacol Sin 26:649)。由不同重鏈和輕鏈組成的兩種抗體在宿主細(xì)胞 中的共表達(dá)，除了產(chǎn)生期望的雙特異性抗體以外，還產(chǎn)生可能的抗體產(chǎn)物的混合物。
[0005] 已描述數(shù)種策略以利于在不同抗體構(gòu)建體共表達(dá)后形成異二聚的（即雙特異性） 產(chǎn)物。
[0006] Lindhofer 等（1995J Immunol 155:219)公開 了大鼠 / 小鼠四源雜交瘤 (quadroma)中優(yōu)先的物種限制性重/輕鏈配對。
[0007] 用于形成雙特異性抗性的技術(shù)是所謂的"隆突-入-空穴（knob-into-hole) "策 略（美國專利5,731，168)。EP1870459(Chugai)和TO2009089004(Amgen)描述了有利于 在不同抗體域在宿主細(xì)胞中共表達(dá)后形成異二聚體的其它策略。在這些方法中，構(gòu)成重鏈 恒定域3 (CH3)，即兩個(gè)CH3域中的CH3-CH3界面的一個(gè)或更多個(gè)殘基被荷電氨基酸置換，使 得在靜電上不利于形成同二聚體且在靜電上利于異二聚體化。W02007110205 (Merck)描述 了又一種策略，其中利用IgA與IgG CH3域之間的差異促使異二聚體化。
[0008] Dali'Acqua 等（1998Biochemistry 37:9266)已鑒定五個(gè)參與 CH3 同二聚體界面 處的CH3-CH3接觸的在能量上關(guān)鍵的氨基酸殘基（366、368、405、407和409)。
[0009] W0 2008119353 (Genmab)描述了用于抗體生成的離體方法。
[0010] W0 11/131746 (Genmab)公開了含有抗體Fc的異二聚體蛋白及其生成方法。
[0011] 本發(fā)明涉及用于生成異二聚體蛋白，諸如穩(wěn)定的IgGl雙特異性抗體的方法，其中 所述方法特別適合于穩(wěn)定的異二聚體蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，其中將二硫鍵再氧化。通過在同 二聚體的CH3域中引入不對稱的突變，可以迫使Fab臂交換反應(yīng)由于CH3域的互補(bǔ)性而變 為方向性的，且由此產(chǎn)生高度穩(wěn)定的異二聚體蛋白。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于生成異二聚體蛋白的體外方法，其包括下列步驟：
[0014] a)在還原性條件下將第一同二聚體蛋白與第二同二聚體蛋白一起溫育，所述還原 性條件足以容許鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵還原，且
[0015] 其中所述第一同二聚體蛋白包含免疫球蛋白的Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)， 且所述第二同二聚體蛋白包含免疫球蛋白的Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含第二CH3區(qū)，且其中所述 第一和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3區(qū)之間的異二聚體相互 作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用，
[0016] b)使從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，所述氧化條件足以容許所述異二聚 體蛋白中的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵。
[0017] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明步驟a)用下列步驟替換：
[0018] X)提供編碼包含第一免疫球蛋白的Fc區(qū)的第一多肽的第一核酸構(gòu)建體，所述第 一 Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)，
[0019] y)提供編碼包含第二免疫球蛋白的Fc區(qū)的第二多肽的第二核酸構(gòu)建體，所述第 二Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)，
[0020] 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3區(qū)之 間的異二聚體相互作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用，且
[0021] 其中所述第一同二聚體蛋白在位置409處具有除了 Lys、Leu或Met外的氨基酸， 且所述第二同二聚體蛋白具有選自下組的位置處的氨基酸取代：366、368、370、399、405和 407,
[0022] 和 / 或
[0023] 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列使得在如實(shí)施例21中描述的那樣測定時(shí)，每個(gè) 所述CH3區(qū)的同二聚體相互作用的解離常數(shù)介于0.01和10微摩爾，諸如介于0.05和10 微摩爾之間，更優(yōu)選介于0. 01和5之間，諸如介于0. 05和5微摩爾之間，甚至更優(yōu)選介于 0. 01和1微摩爾之間，諸如介于0. 05和1微摩爾之間，介于0. 01和0. 5之間或介于0. 01 和0. 1之間，
[0024] z)在宿主細(xì)胞中共表達(dá)所述第一和第二核酸構(gòu)建體。
[0025] 附圖簡述
[0026] 圖1 :通過種間Fab-臂交換生成雙特異性抗體。通過ELISA測定GSH誘導(dǎo)的指定 的抗EGFR(2F8)和CD20 (7D8) IgG4抗體之間的體外Fab-臂交換后雙特異性抗體的生成。 在ELISA中分析0-1 μ g/mL的濃度系列（總抗體）。雙特異性結(jié)合在Fab-臂交換后在獼猴 (Rh)和人（Hu) IgG4抗體之間比在同一物種的兩種抗體之間高。
[0027] 圖2 :人和獼猴抗體同種型的核心鉸鏈（即人IgGl中的CPPC序列，其包含潛在形 成重鏈間二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基和其它人和獼猴同種型中的相應(yīng)殘基）和CH3-CH3界 面的氨基酸序列的比對。
[0028] 圖3 :使用參與進(jìn)行Fab-臂交換的突變體人IgGl生成雙特異性抗體。通過 ELISA測定通過GSH誘導(dǎo)的人CD20(7D8) IgG4抗體和指定的人EGFR(2F8) IgGl抗體之間 的體外Fab-臂交換進(jìn)行的雙特異性抗體生成。呈現(xiàn)的圖顯示了三次獨(dú)立Fab-臂交換實(shí) 驗(yàn)的平均數(shù)，其中使用總抗體濃度1 μ g/mL進(jìn)行ELISA。雙特異性結(jié)合在Fab-臂交換后 在IgGl-2F8-CPSC-ITL和IgG4-7D8之間比在兩種IgG4抗體之間高。組合IgG4-7D8與 IgGl-2F8、IgGl-2F8-CPSC或IgGl-2F8-ITL在使用的條件下不生成雙特異性抗體。
[0029] 圖4 :通過人IgG4和突變體IgGl抗體的體內(nèi)Fab-臂交換生成雙特異性抗體。通 過ELISA測定通過在免疫缺陷小鼠中人CD20(7D8) IgG4和指定的人EGFR(2F8) IgGl和IgG4 突變體抗體之間的體內(nèi)Fab-臂交換進(jìn)行的雙特異性抗體生成。呈現(xiàn)的圖顯示了平均數(shù)（η = 4)。雙特異性反應(yīng)性以相對于總IgG濃度的雙特異性抗體濃度（百分比）呈現(xiàn)。具有 穩(wěn)定化鉸鏈（CPPC)或CH3域中的R409K突變的人IgG4不能參與Fab-臂交換。具有鉸鏈 中的CPSC序列和CH3域中的K409R突變兩者的的IgGl參與進(jìn)行Fab-臂交換。（*)含有 IgGl-2F8、IgG4-2F8-CPPC或IgG4-2F8-R409K的混合物的雙特異性結(jié)合低于檢測線，因此 任意設(shè)置為0。
[0030] 圖5 :使用2-巰基-乙胺· HC1- (2-MEA-)誘導(dǎo)的人IgGl和IgG4抗體之間 的Fab-臂交換生成雙特異性抗體。通過ELISA測定2-MEA誘導(dǎo)的指定人EGFR(2F8)和 ⑶20 (7D8)抗體之間的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成。測試0-40mM2-MEA的濃度 系列。呈現(xiàn)的圖顯示了 ELISA的結(jié)果，其中使用20 μ g/mL的總抗體濃度。2-MEA也在含有 穩(wěn)定化鉸鏈（CPPC)的抗體之間有效誘導(dǎo)Fab-臂交換。關(guān)于CH3域，與兩種野生型IgG4抗 體相比，人IgG4 X具有三重突變T350I-K370T-F405L的人IgGl的組合產(chǎn)生更高水平的雙 特異性反應(yīng)性。
[0031] 圖6 :使用2-MEA誘導(dǎo)的人IgGl和IgG4抗體之間的Fab-臂交換生成雙特異性抗 體。
[0032] 對0_40mM 2-MEA的濃度系列的所有樣品通過質(zhì)譜術(shù)測定2-MEA誘導(dǎo)的指定人 EGFR(2F8)和⑶20(7D8)抗體之間的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成。（A)顯示了 用 0mM、7mM 和 40mM2-MEA 進(jìn)行 IgGl-2F8-ITL xIgG4-7D8-CPPC 之間的 Fab-臂交換反應(yīng)的 樣品的質(zhì)譜圖的代表性例子。（B)在量化質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，計(jì)算百分比雙特異性抗體，并相對于 Fab-臂交換反應(yīng)中的2-MEA濃度繪圖。IgG4-2F8x IgG4-7D8生成最大約50%的雙特異性 抗體。IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC生成最大約95%的雙特異性抗體。
[0033] 圖7 :通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab-臂交換獲得的異二聚體雙特異性抗體的穩(wěn)定性分 析。通過在存在指定濃度的無關(guān)IgG4的情況中在GSH誘導(dǎo)的Fab-臂交換反應(yīng)后在ELISA 中測量EGFR/CD20雙特異性結(jié)合測試通過組合IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC(A)或 IgG4-2F8 X IgG4-7D8(B)通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab-臂交換生成的雙特異性樣品的穩(wěn)定性。相 對于起始材料（對照）的雙特異性結(jié)合（其設(shè)置為100% )呈現(xiàn)雙特異性結(jié)合。（A)2-MEA 誘導(dǎo)的源自IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC的雙特異性產(chǎn)物的雙特異性結(jié)合是保留的， 指示不參與在GSH條件下的Fab-臂交換的穩(wěn)定產(chǎn)物。（B) 2-MEA誘導(dǎo)的源自I gG4-2F8x IgG4-7D8的雙特異性產(chǎn)物的雙特異性EGFR/CD20結(jié)合是減少的，指示參與在GSH條件下與 無關(guān)IgG4的Fab-臂交換的產(chǎn)物。
[0034] 圖8 :通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab-臂交換生成的異二聚體雙特異性抗體的血漿清除 率。給三組小鼠（每組3只小鼠）注射指定的抗體：（1)100 μ g雙特異性抗體，其通過體外 2-MEA 誘導(dǎo)的 IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC 之間的 Fab-臂交換生成；（2)100yg 雙特異 性抗體 +1，〇〇〇 μ g 無關(guān) IgG4 ; (3) 50 μ gIgGl-2F8-ITL+50 μ g IgG4-7D8-CPPC。（A)隨時(shí)間 的總抗體濃度，其通過ELISA測定?？偪贵w血漿濃度的曲線對于所有抗體是相同的。（B)雙 特異性抗體濃度，如通過ELISA測定的。注射抗體的雙特異性在添加和不添加過量的無關(guān) IgG4的情況中是相同的。（*) IgGl-2F8-ITL+IgG4-7D8-CPPC混合物的雙特異性結(jié)合低于檢 測限，因此相應(yīng)的符號不能在此圖中繪制。顯示了兩次ELISA實(shí)驗(yàn)的平均值。
[0035] 圖9 :通過人IgGl-2F8and IgG4-7D8-CPPC之間的Fab-臂交換生成的雙特異性抗 體的純度。（A)還原性SDS-PAGE(a)顯示了雙特異性樣品和IgGl對照樣品兩者的重鏈和 輕鏈的條帶。非還原性SDS-PAGE(b)顯示了完整的IgG。（B)來自ΗΡ-SEC的峰結(jié)果顯示了 >98%的雙特異性樣品是均質(zhì)的，且實(shí)際上沒有檢測到抗體聚集物。（C)質(zhì)譜顯示了 Fab-臂 交換生成約100 %雙特異性產(chǎn)物。
[0036] 圖10 :在通過與人IgG4_7D8的Fab-臂交換生成雙特異性抗體中三重突變體 (ITL)、雙重突變體（IT、IL、TL)和單突變體（L)人IgGl-2F8之間的比較。通過ELISA測定 在2-MEA誘導(dǎo)的人IgGl-2F8三重和雙重突變體和具有CPSC鉸鏈的野生型IgG4-7D8 (A)或 具有穩(wěn)定化鉸鏈的突變體IgG4-7D8-CPPC(B)，或單突變體IgGl-2F8-F405L和具有野生型 CPSC或穩(wěn)定化CPPC鉸鏈的IgG4-7D8 (C)之間的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成。 對于包括雙重和單突變體的實(shí)驗(yàn)，在ELISA中分別分析0-20 μ g/mL或0-10 μ g/mL的濃度 系列（總抗體）。IgG4與雙重突變體IgGl-2F8-IL和-TL的組合與三重突變體IgGl-ITL 產(chǎn)生相似的雙特異性EGFR/⑶20結(jié)合。與IgGl-2F8-IT的組合不生成雙特異性產(chǎn)物。IgG4 野生型和具有穩(wěn)定化鉸鏈的IgG4兩者與單突變體IgGl-2F8-F405L的組合產(chǎn)生雙特異性 EGFR/CD20 結(jié)合。
[0037] 圖11 :在不同溫度使用2-MEA誘導(dǎo)的Fab-臂交換生成雙特異性抗體。通過于0°C、 20°C和37°C在2-MEA誘導(dǎo)的體外Fab-臂交換反應(yīng)中組合指定的人EGFR(2F8)和CD20 (7D8) 抗體進(jìn)行的雙特異性抗體生成在時(shí)間上繼之以ELISA。雙特異性結(jié)合的誘導(dǎo)于37°C最有 效，并且于20°C較慢。于0°C，沒有測量到雙特異性結(jié)合的產(chǎn)生。
[0038] 圖12 :通過由不同還原劑誘導(dǎo)的體外Fab-臂交換生成雙特異性抗體。使用ELISA 測量通過用濃度系列的指定還原劑的還原反應(yīng)中組合人IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC 進(jìn)行的雙特異性抗體生成。在用DTT (在2. 5mM DTT獲得最大值）和2-MEA (在25mM2-MEA 獲得最大值），但不用GSH的反應(yīng)后測量雙特異性結(jié)合。（*)由于形成抗體聚集體而排除 GSH濃度>10mM的數(shù)據(jù)。
[0039] 圖 13 :2-MEA 誘導(dǎo)的 IgGl-2F8-ITL 和 IgGl-7D8-K409X 突變體之間的 Fab-臂交 換。通過ELISA測定2-MEA誘導(dǎo)的IgGl-2F8-ITL和指定的IgGl-7D8-K409X突變體之間的 體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成。⑷分析0-20 μ g/mL的濃度系列（總抗體）。陽 性對照是純化的一批源自IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC的雙特異性抗體。（B)交換以 20 μ g/mL時(shí)相對于陽性對照（黑色柱形）的雙特異性結(jié)合呈現(xiàn)。暗灰色柱形表示IgG4對 照（IgG4-7D8x IgG4-2F8)、陰性對照（IgGl-2F8x IgGl-7D8-K409R)之間和 IgGl-2F8-ITL 與IgG4-7D8-CPPC之間的雙特異性結(jié)合。亮灰色柱形表示來自指定IgGl-7D8-K409X突變 體和IgGl-2F8-ITL之間同時(shí)實(shí)施的Fab-臂-交換反應(yīng)的結(jié)果。
[0040] 圖14 :抗體去糖基化不影響通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab-臂交換進(jìn)行的雙特異性抗體 生成。通過ELISA測定2-MEA誘導(dǎo)的指定EGFR(2F8)和CD20(7D8)抗體之間的體外Fab-臂 交換后的雙特異性抗體生成。與其酶促去糖基化的變體比較與7D8抗體的交換。在ELISA 中分析0-20 μ g/mL的濃度系列（總抗體）。牽涉去糖基化（deglyc)抗體的Fab-臂交換反 應(yīng)與源自其的糖基化變體顯示了相同的雙特異性結(jié)合曲線。
[0041] 圖15 :參與Fab-臂交換的能力與CH3-CH3相互作用強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)。（A)、⑶和（C) 通過具有指定突變的IgGl-2F8和IgGl-7D8 (A)或IgG4-2F8和IgG4-7D8 (B和C)構(gòu)建體之 間的GSH誘導(dǎo)的Fab-臂交換生成雙特異性抗體，其在ELISA中隨時(shí)間以雙特異性結(jié)合呈 現(xiàn)。相對于24小時(shí)后IgG4-2F8 xIgG4-7D8對照呈現(xiàn)雙特異性。（D)和（E)基于IgGl的 (D)或基于IgG4的（E)分子的表觀KD(表2)和24小時(shí)后的雙特異性抗體生成（圖15A/ B/C)之間的關(guān)系。
[0042] 圖16 :IgGl、IgG4和（部分）IgG3主鏈中抗EGFr抗體2F8的序列比對。描繪了依 照Kabat和依照EU索引的氨基酸編號方式（兩者記載于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))。SEQ ID N0:10 中給出 2F8-G1，SEQ ID N0:11 中給出 2F8-G3 (部分），而 SEQ ID NO: 12 中給出 2F8-G4。
[0043] 圖17 :通過由不同還原劑誘導(dǎo)的體外Fab-臂交換生成雙特異性抗體。使 用ELISA測量通過在用濃度系列的指定還原劑的還原反應(yīng)中組合人IgGl-2F8-F405L 和IgGl-7D8-K409R的雙特異性抗體生成。相對于源自2-MEA誘導(dǎo)的IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC之間的Fab-臂交換的雙特異性對照樣品的信號（其設(shè)置為100% )標(biāo)準(zhǔn) 化測量的0D值。在用濃度范圍0. 5-50mM的DTT、濃度范圍25-50mM的2-MEA和濃度范圍 0. 5-5. OmM的三（2-羧乙基）膦（TCEP)，但不用GSH的反應(yīng)后測量最大雙特異性結(jié)合。（*) 由于形成抗體聚集體而排除GSH濃度彡25mM的數(shù)據(jù)。
[0044] 圖 18 :使用 2-MEA 誘導(dǎo)的人 IgGl-2F8-F405L 和 IgGl-7D8-K409R 之間的 Fab-臂 交換生成雙特異性抗體。
[0045] ㈧通過ELISA測定2-MEA誘導(dǎo)的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成。 呈現(xiàn)的圖顯示了 ELISA的結(jié)果，其中使用20μ8/ιΛ的總抗體濃度。2-MEA有效誘導(dǎo)人 IgGl-2F8-F405L 和 IgGl-7D8-K409R 之間的 Fab-臂交換。（Β)對于濃度系列 0-40mM2-MEA 的所有樣品，通過質(zhì)譜術(shù)測定2-MEA誘導(dǎo)的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成。在量 化質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，計(jì)算雙特異性抗體的百分比，并且相對于Fab-臂交換反應(yīng)中的2-MEA濃度 繪圖。IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換在測試的最高2-MEA濃度產(chǎn) 生約100 %雙特異性抗體，這確認(rèn)ELISA數(shù)據(jù)。
[0046] 圖19 :通過人IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換生成的雙 特異性抗體的純度。質(zhì)譜法顯示了 Fab-臂交換生成約100%雙特異性產(chǎn)物。
[0047] 圖20 :通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab-臂交換生成的雙特異性抗體的血漿清除。給兩組 小鼠（每組3只小鼠）注射指定的抗體：（1) 100 μ g雙特異性抗體，其通過體外2-MEA誘導(dǎo) 的1861-2?844051^11861-708-1(4091?之間的？ &13-臂交換生成；（2)10(^8雙特異性抗體 +l，000μg無關(guān)IgG4(10xIgG4)。（A)隨時(shí)間的總抗體濃度，其通過ELISA測定。對于所有 抗體，總抗體血漿濃度的曲線是相同的。（B)雙特異性抗體濃度，如通過ELISA測定的。注 射抗體的雙特異性在添加和不添加過量的無關(guān)IgG4的情況中是相同的。
[0048] 圖21 :雙特異性抗體對CD20表達(dá)細(xì)胞的CDC介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷，所述雙特異性抗體 通過2-MEA誘導(dǎo)的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換生成。使用濃 度系列的指定抗體測試其介導(dǎo)對Daudi (A)和Raji (B)細(xì)胞的CDC的能力。這兩種細(xì)胞系 都表達(dá)⑶20,而非EGFR。在IgGl-7D8中引入K409R不影響其誘導(dǎo)⑶C的能力。源自2-MEA 誘導(dǎo)的IgGl-2F8-F405Lx IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換的雙特異性抗體仍然能夠誘 導(dǎo) CDC。
[0049] 圖22 :雙特異性抗體對EGFR表達(dá)細(xì)胞的ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷，所述雙特異性抗 體通過2-MEA誘導(dǎo)的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換生成。使用 濃度系列的指定抗體測試其介導(dǎo)對A431細(xì)胞的ADCC的能力。IgGl-7D8不能結(jié)合⑶20陰 性A431細(xì)胞，因此不誘導(dǎo)ADCC。EGFR抗體IgGl-2F8在CH3域中引入F405L突變后也誘導(dǎo) ADCC。IgGl-2F8-F405L 的 ADCC 效應(yīng)器功能在通過 IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R 之 間的Fab-臂交換獲得的雙特異性形式中得到保留。
[0050] 圖 23 :2-MEA 誘導(dǎo)的 IgGl-2F8-F405X 突變體和 IgGl-7D8-K409R 之間的 Fab-臂交 換。通過ELISA測定在2-MEA誘導(dǎo)的指定IgGl-2F8-F405X突變體和IgGl-7D8-K409R之間 的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成。（A)在ELISA中分析0-20 μ g/mL的濃度系列 (總抗體）。陽性對照是純化的一批源自IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R的雙特異性 抗體。（B)交換以20 μ g/mL時(shí)相對于陽性對照（黑色柱形）的雙特異性結(jié)合呈現(xiàn)。暗灰色 柱形表示 IgG4 對照（IgG4-7D8x IgG4-2F8)和陰性對照（IgGl-2F8x IgGl-7D8-K409R)之 間的雙特異性結(jié)合。亮灰色柱形表示來自指定IgGl-2F8-F405X突變體和IgGl-7D8-K409R 或?qū)φ罩g同時(shí)實(shí)施的Fab-臂-交換反應(yīng)的結(jié)果。
[0051] 圖 24 :2-MEA 誘導(dǎo)的 IgGl-2F8-Y407X mutants and IgGl-7D8-K409R 之間 的Fab-臂交換。通過ELISA測定在2-MEA誘導(dǎo)的指定IgGl-2F8-Y407X突變體和 IgGl-7D8-K409R之間的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成。（A)在ELISA中分 析0-20 μ g/mL的濃度系列（總抗體）。陽性對照是純化的一批源自IgGl-2F8-F405L X I gG 1-7D8-K409R的雙特異性抗體。（B)交換以20 μ g/mL時(shí)相對于陽性對照（黑色柱 形）的雙特異性結(jié)合呈現(xiàn)。暗灰色柱形表示IgG4對照（IgG4-7D8x IgG4-2F8)和陰性 對照（IgGl_2F8x IgGl-7D8-K409R)之間的雙特異性結(jié)合。亮灰色柱形表示來自指定 IgGl-2F8-Y407X突變體和IgGl-7D8-K409R或?qū)φ罩g同時(shí)實(shí)施的Fab-臂-交換反應(yīng)的結(jié) 果。
[0052] 圖25 :通過非還原性（圖25 (A))和還原性（圖25 (B))條件下的SDS-PAGE分析 通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab-臂交換生成的雙特異性抗體
[0053] 圖26 :同二聚體起始材料IgGl-2F8-F405L (圖26⑶）、同二聚體起始材料 IgGl-7D8-K409R (圖26(A))、這兩種同二聚體的混合物（1:1)(圖26(C))、和通過2-MEA誘 導(dǎo)的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換生成的雙特異性產(chǎn)物（圖 26(D))的 ΗΡ-SEC 譜。
[0054] 圖27 :同二聚體起始材料IgGl-2F8-F405L (圖27⑶）、同二聚體起始材料 IgGl-7D8-K409R (圖27(A))、這兩種同二聚體的混合物（1:1)(圖27(C))、和通過2-MEA誘 導(dǎo)的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換生成的雙特異性產(chǎn)物（圖 27(D))的質(zhì)譜法（ESI-MS)。
[0055] 圖28 :同二聚體起始材料IgGl-2F8-F405L (圖28 (A))、同二聚體起始材料 IgGl-7D8-K409R (圖28(B))、這兩種同二聚體的混合物（1:1)(圖28(C))、和通過2-MEA誘 導(dǎo)的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換生成的雙特異性產(chǎn)物（圖 28(D))的毛細(xì)管等電聚焦（cIEF)圖。
[0056] 圖29 :同二聚體起始材料IgGl-2F8-F405L (圖29 (A))、同二聚體起始材料 IgGl-7D8-K409R (圖29(B))、這兩種同二聚體的混合物（1:1)(圖29(C))、和通過2-MEA誘 導(dǎo)的IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8-K409R之間的Fab-臂交換生成的雙特異性產(chǎn)物（圖 29 (D))的 HPLC-CIEX 圖。
[0057] 圖30 :同二聚體IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R的交換反應(yīng)，如在不同時(shí)間 點(diǎn)注射后通過高壓液相層析陽離子交換（HPLC-CIEX)監(jiān)測的。
[0058] 圖31 :交換反應(yīng)后殘留的同二聚體，如用CIEX方法檢測的（以箭頭標(biāo)示）。
[0059] 圖32 :IgG濃度、2-MEA濃度、溫育溫度和溫育時(shí)間對雙特異性抗體生成的影響，如 ELISA測定的。
[0060] 圖33 :多個(gè)IgG濃度、2-MEA濃度、溫育溫度和時(shí)間的雙特異性抗體生成，如通過 ELISA測定且與任意設(shè)置為100%的對照相比。
[0061] 圖34 :多個(gè)IgG濃度、2-MEA濃度、溫育溫度和時(shí)間的雙特異性抗體生成，如通過 HPLC-CIEX 分析的。
[0062] 圖35 :使用0-20 μ g/mL的濃度系列（總抗體）通過ELISA測定2-MEA誘導(dǎo)的指定 IgGl-2F8-L368X突變體和IgGl-7D8-K409R之間的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成 (圖35 (A))。陽性對照是純化的一批源自IgGl-2F8-F405L xIgGl-7D8-K409R的雙特異性抗 體。圖35(B)顯示了在20 μ g/mL時(shí)相對于陽性對照（黑色柱形）的雙特異性結(jié)合。暗灰 色柱形表示 IgG4 對照（IgG4-7D8xIgG4-2F8)和陰性對照（IgGl-2F8x IgGl-7D8-K409R)之 間的雙特異性結(jié)合。亮灰色柱形表示來自指定IgGl-2F8-L368X突變體和IgGl-7D8-K409R 之間同時(shí)實(shí)施的Fab-臂-交換反應(yīng)的結(jié)果。
[0063] 圖36 :使用0-20 μ g/mL的濃度系列（總抗體）通過ELISA測定2-MEA誘導(dǎo)的指定 IgGl-2F8-K370X突變體和IgGl-7D8-K409R之間的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成 (圖36(A))。陽性對照是純化的一批源自IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R的雙特異性 抗體。圖36 (B)顯示了在20 μ g/mL時(shí)相對于陽性對照（黑色柱形）的雙特異性結(jié)合。暗灰色 柱形表示 IgG4 對照（IgG4-7D8 X IgG4-2F8)和陰性對照（IgGl-2F8x IgGl-7D8-K409R)之 間的雙特異性結(jié)合。亮灰色柱形表示來自指定IgGl-2F8-D370X突變體和IgGl-7D8-K409R 之間同時(shí)實(shí)施的Fab-臂-交換反應(yīng)的結(jié)果。
[0064] 圖37 :使用0-20 μ g/mL的濃度系列（總抗體）通過ELISA測定2-MEA誘導(dǎo)的指定 IgGl-2F8-D399X突變體和IgGl-7D8-K409R之間的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成 (圖37(A))。圖37(B)顯示了在20 μ g/mL抗體濃度時(shí)相對于陽性對照（黑色柱形）的雙 特異性結(jié)合。暗灰色柱形表示IgG4對照（IgG4-7D8 X IgG4-2F8)和陰性對照（IgGl-2F8 X IgGl-7D8-K409R)之間的雙特異性結(jié)合。亮灰色柱形表示來自指定IgGl-2F8-D399X突變體 和IgGl-7D8-K409R之間同時(shí)實(shí)施的Fab-臂-交換反應(yīng)的結(jié)果。
[0065] 圖38 :使用0-20 μ g/mL的濃度系列（總抗體）通過ELISA測定2-MEA誘導(dǎo)的指定 IgGl-2F8-T366X突變體和IgGl-7D8-K409R之間的體外Fab-臂交換后的雙特異性抗體生成 (圖38(A))。圖38(B)顯示了在20 μ g/mL抗體濃度時(shí)相對于陽性對照（黑色柱形）的雙 特異性結(jié)合。暗灰色柱形表示IgG4對照（IgG4-7D8 X IgG4-2F8)和陰性對照（IgGl-2F8 X IgGl-7D8-K409R)之間的雙特異性結(jié)合。亮灰色柱形表示來自指定IgGl-2F8-T366X突變體 和IgGl-7D8-K409R之間同時(shí)實(shí)施的Fab-臂-交換反應(yīng)的結(jié)果。
[0066] 圖39 :于15°C在0、30、60、105和200分鐘溫育后四種不同IgGl突變體組合（如 指定）之間的2-MEA誘導(dǎo)的Fab-臂交換，如通過三明治式ELISA測定的。
[0067] 圖40:于15°C抗體溫育90分鐘后不同IgGl突變體組合之間的2-MEA誘導(dǎo)的 Fab-臂交換，如通過三明治式ELISA測定的。
[0068] 圖41:通過分析CIEX分析雙特異性抗體，并且如下計(jì)算不同緩沖液（如圖 注中指定）中隨時(shí)間形成的異二聚體的百分比：異二聚體（％)= 100% -[峰面積％ IgGl-2F8-F405L+ 峰面積％ IgGl-7D8-K409R]。
[0069] 圖42 :在于0°C、0/N(A，B)或于4°C貯存6天（C，D)后通過非還原性（A，C)和還原 性（B，D)條件下的SDS-PAGE分析用含有10mg/mL每種抗體的混合物生成的40mL雙特異性 抗體批次。每塊凝膠的第1道含有麗標(biāo)志物，第2道含有IgGl內(nèi)部測定對照。A，B :第3 道：用含有l(wèi)〇mg/mL每種抗體的混合物生成的40mL雙特異性抗體批次；C，D :第4道：用含 有10mg/mL每種抗體的混合物生成的40mL批次。
[0070] 對于非還原性條件，指定重鏈（H)和輕鏈（L)的不同組合：148kDa(LHHL)，125kDa (HHL)，99kDa (HH)，67kDa(HL)，51kDa(Η)和 25kDa (L)。
[0071] 圖43 :在IgGl抗⑶38抗體的還原和氧化期間的氧化還原電勢和氧飽和。使用氧 化還原探頭和溶解氧（DO)探頭追蹤還原和氧化階段期間的氧化還原電勢和氧飽和。左側(cè) y軸和實(shí)線顯示了氧化還原電勢；右側(cè)y軸和虛線顯示了如通過不同過程階段期間溶液中 測量的氧飽和，如以箭頭標(biāo)示的。
[0072] 圖44 :抗CD38抗體的還原和氧化期間的ΗΡ-SEC分析。通過ΗΡ-SEC分析抗CD38 抗體的還原和氧化期間采集的樣品。樣品2(S0002):在從配制緩沖液進(jìn)行緩沖液更換為 PBS后的抗CD38抗體；樣品3至8 :還原階段（溫育時(shí)間：1、2、3、4、472、5小時(shí)）期間的抗 CD38抗體；樣品9至12 :滲濾過程期間的抗CD38抗體（1、2、3、4小時(shí)時(shí)的樣品）；樣品13 ; 0/N溫育后的抗⑶38抗體；樣品14 :將CuS04添加至溶液后的抗⑶38抗體。為了比較，單 獨(dú)的2-MEA和與2-碘乙酰胺（IAA) -起的2-MEA的ΗΡ-SEC譜以粗線顯示。7. 715和9. 193 的峰代表二聚體和單體IgGl。11. 073的峰的性質(zhì)是未知的。
[0073] 圖45 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的SDS-PAGE分析。通過非還原性SDS-PAGE 分析來分析抗CD38抗體的還原和氧化期間采集的樣品。第1道：配制緩沖液中的抗CD38 抗體；第2道：緩沖液更換為PBS后的抗⑶38抗體；第3道到第8道：還原階段期間（圖上 方指定的溫育時(shí)間）的抗CD38抗體；第9道到第12道：滲濾過程期間的抗CD38抗體；第 13道：0/N溫育后的抗CD38抗體；第14道：將CuS0 4添加到溶液后的抗CD38抗體。
[0074] 圖46 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的ESI-MS分析。將抗⑶38抗體的還原和 再氧化期間采集的樣品淬滅，并通過ESI-MS分析來分析。樣品l(SOOOl):配制緩沖液中的 抗⑶38抗體；樣品2 :緩沖液更換為PBS后的抗⑶38抗體；第3道到第8道：還原階段期間 (溫育時(shí)間：l、2、3、4、472、5h)的抗CD38抗體；第9道到第12道：滲濾過程期間（l、2、3、4h 時(shí)的樣品）的抗⑶38抗體；第13道：0/N溫育后的抗⑶38抗體；第14道：將CuS04添加到 溶液后的抗CD38抗體。應(yīng)當(dāng)注意到，LC-MS通過LC系統(tǒng)中的還原劑除去或者在電噴射過 程期間將樣品暴露于空氣（即氧氣）而促進(jìn)再氧化過程。樣品可能損失在淬滅步驟過程中 尚未被IAA加帽的共價(jià)附接的還原劑分子。因此，與SDS-PAGE相比，ESI-MS過高評估共價(jià) 再氧化的完整1@6。標(biāo)示重鏈〇1)和輕鏈仏）的不同組合丄冊1^冊1^冊，1，!1和1^在圖 中僅對輕鏈（L)給出質(zhì)量詳情；+2-MEA = +7?a ;+2_碘乙酰胺=+57Da。
[0075] 圖47 :IgGl抗⑶38抗體的還原和氧化期間的氧化還原電勢和氧飽和-更快速的 滲濾和第二滲濾步驟。使用氧化還原探頭和溶解氧（DO)探頭追蹤還原和氧化階段期間的 氧化還原電勢和氧飽和。左側(cè)y軸和實(shí)線顯示了氧化還原電勢；右側(cè)y軸和虛線顯示了如 通過不同過程階段期間溶液中測量的氧飽和，如以箭頭標(biāo)示的。
[0076] 圖48 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的ΗΡ-SEC分析-更快速的滲濾和第二滲 濾步驟。通過ΗΡ-SEC分析抗⑶38抗體的還原和氧化期間采集的樣品。樣品1(S0001):配 制緩沖液中的抗CD38抗體；樣品2 :緩沖液從配制緩沖液更換為PBS后的抗CD38抗體；第 3道到第9道：還原階段期間（溫育時(shí)間5、10、15、30和60分鐘和2和3小時(shí)）的抗⑶38 抗體；第10道到第15道：滲濾過程期間（10、20、30、40、50和60分鐘后的樣品）的抗CD38 抗體；第16道到第18道：滲濾后1、2和25小時(shí)的抗⑶38抗體；第19道：第二次滲濾后1 小時(shí)的抗⑶38抗體。
[0077] 圖49 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的SDS-PAGE分析-更快速的滲濾和第二滲 濾步驟。通過非還原性SDS-PAGE分析來分析抗⑶38抗體的還原和氧化期間采集的樣品。 第1道：配制緩沖液中的抗⑶38抗體；第2道：緩沖液更換為PBS后的抗⑶38抗體；第3 道到第9道：還原階段期間（溫育時(shí)間5、10、15、30和60分鐘和2和3小時(shí)）的抗⑶38抗 體；第10道到第15道：滲濾過程期間（10、20、30、40、50和60分鐘后的樣品）的抗CD38抗 體；第16道到第18道：滲濾后1、2和25小時(shí)的抗⑶38抗體；第19道：第二次滲濾后1小 時(shí)的抗⑶38抗體。
[0078] 圖50 :IgGl抗⑶38抗體的還原和氧化期間的氧化還原電勢和氧飽和-更快速的 滲濾和較低的2-MEA濃度。使用氧化還原探頭和溶解氧（D0)探頭追蹤還原和氧化階段期 間的氧化還原電勢和氧飽和。左側(cè)y軸和實(shí)線顯示了氧化還原電勢；右側(cè)y軸和虛線顯示 了如通過不同過程階段期間溶液中測量的氧飽和，如以箭頭標(biāo)示的。
[0079] 圖51 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的ΗΡ-SEC分析-更快速的滲濾和較低的 2-MEA濃度。通過ΗΡ-SEC分析抗⑶38抗體的還原和氧化期間采集的樣品。樣品1(S0001): 配制緩沖液中的抗CD38抗體；樣品2 :緩沖液從配制緩沖液更換為PBS后的抗CD38抗體； 第3道到第6道：還原階段期間（溫育時(shí)間：20和60分鐘和3和4小時(shí)）的抗⑶38抗體； 第7道到第10道：滲濾過程期間（10、20、40和60分鐘后的樣品）的抗⑶38抗體；第11道 到第14道：滲濾停止后1、2、3和24小時(shí)的抗⑶38抗體。
[0080] 圖52 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的SDS-PAGE分析-更快速的滲濾和較低的 2-MEA濃度。通過非還原性SDS-PAGE分析來分析抗⑶38抗體的還原和氧化期間采集的樣 品。第1道：配制緩沖液中的抗⑶38抗體；第2道：緩沖液從配制緩沖液更換為PBS后的 抗⑶38抗體；第3道到第6道：還原階段期間（溫育時(shí)間：20和60分鐘和3和4小時(shí)）的 抗⑶38抗體；第7道到第10道：滲濾過程期間（10、20、40和60分鐘后的樣品）的抗⑶38 抗體；第11道到第14道：滲濾停止后1、2、3和24小時(shí)的抗⑶38抗體。
[0081] 圖53 :IgGl抗⑶38抗體的還原和氧化期間的氧化還原電勢和氧飽和-更快速的 滲濾和還原階段期間的EDTA存在。（A)使用氧化還原探頭和溶解氧（D0)探頭追蹤還原和 氧化階段期間的氧化還原電勢和氧飽和。左側(cè)y軸和實(shí)線顯示了氧化還原電勢；右側(cè)y軸 和虛線顯示了如通過不同過程階段期間溶液中測量的氧飽和，如以箭頭標(biāo)示的。
[0082] (B)在存在和缺乏EDTA (從實(shí)施例46 [沒有EDTA]和47 [具有EDTA]采集）的情 況中D0下降的比較。
[0083] 圖54 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的SDS-PAGE分析-更快速的滲濾和還原 階段期間的EDTA存在。通過非還原性SDS-PAGE分析來分析抗⑶38抗體的還原和氧化期 間采集的樣品。第1道：配制緩沖液中的抗⑶38抗體；第2道：緩沖液從配制緩沖液更換 為PBS后的抗⑶38抗體；第3道到第7道：還原階段期間（溫育時(shí)間：10分鐘和1、2、3和 4小時(shí)）的抗⑶38抗體；第8道到第11道：滲濾過程期間（開始滲濾后10、30、40和60分 鐘的樣品）的抗⑶38抗體；第12道到第14道：滲濾停止后1和24小時(shí)和6天的抗⑶38 抗體。
[0084] 圖55 :IgGl抗⑶38抗體的還原和氧化期間的氧化還原電勢和氧飽和-更快速的 滲濾和還原階段后的N2存在。使用氧化還原探頭和溶解氧（D0)探頭追蹤還原和氧化階段 期間的氧化還原電勢和氧飽和。左側(cè)y軸和實(shí)線顯示了氧化還原電勢；右側(cè)y軸和虛線顯 示了如通過不同過程階段期間溶液中測量的氧飽和，如以箭頭標(biāo)示的。
[0085] 圖56 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的SDS-PAGE分析-更快速的滲濾和還原 階段后的N2存在。通過非還原性SDS-PAGE分析來分析抗⑶38抗體的還原和氧化期間采 集的樣品。第1道：配制緩沖液中的抗⑶38抗體；第2道：緩沖液從配制緩沖液更換為PBS 后的抗⑶38抗體；第3道到第7道：還原階段期間（溫育時(shí)間：10分鐘和1、2、3和4小時(shí)） 的抗⑶38抗體；第8道到10道：滲濾過程期間（開始滲濾后10、30、和60分鐘的樣品）的 抗⑶38抗體；第11道：停止?jié)B濾后24小時(shí)的抗⑶38抗體；第12道和第13道：在停止用 氮?dú)馔L(fēng)并開始用氧氣通風(fēng)后1和24小時(shí)的抗⑶38抗體。
[0086] 圖57 :IgGl抗⑶38抗體的還原和氧化期間的氧化還原電勢和氧飽和-更快速的 滲濾和還原階段后的EDTA存在。使用氧化還原探頭和溶解氧（D0)探頭追蹤還原和氧化階 段期間的氧化還原電勢和氧飽和。左側(cè)y軸和實(shí)線顯示了氧化還原電勢；右側(cè)y軸和虛線 顯示了如通過不同過程階段期間溶液中測量的氧飽和，如以箭頭標(biāo)示的。
[0087] 圖58 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的SDS-PAGE分析-更快速的滲濾和還原階 段后的EDTA存在。通過非還原性SDS-PAGE分析來分析抗⑶38抗體的還原和氧化期間采 集的樣品。第1道：配制緩沖液中的抗⑶38抗體；第2道：緩沖液從配制緩沖液更換為PBS 后的抗⑶38抗體；第3道到第6道：還原階段期間（溫育時(shí)間：10分鐘和2、3和4小時(shí)） 的抗⑶38抗體；第7道到9道：滲濾過程期間（開始滲濾后10、30、和60分鐘的樣品）的 抗⑶38抗體；第10道：停止?jié)B濾后24小時(shí)的抗⑶38抗體；第11道：添加硫酸銅后30分 鐘的抗⑶38抗體。
[0088] 圖59 :IgGl抗⑶38抗體的還原和氧化期間的氧化還原電勢和氧飽和-更快速的 滲濾和還原階段后的硫酸銅存在。使用氧化還原探頭和溶解氧（D0)探頭追蹤還原和氧化 階段期間的氧化還原電勢和氧飽和。左側(cè)y軸和實(shí)線顯示了氧化還原電勢；右側(cè)y軸和虛 線顯示了如通過不同過程階段期間溶液中測量的氧飽和，如以箭頭標(biāo)示的。
[0089] 圖60 :抗⑶38抗體的還原和氧化期間的SDS-PAGE分析-更快速的滲濾和還原 階段后的硫酸銅存在。通過非還原性SDS-PAGE分析來分析抗CD38抗體的還原和氧化期間 采集的樣品。第1道：配制緩沖液中的抗CD38抗體；第2道：緩沖液從配制緩沖液更換為 PBS后的抗⑶38抗體；第3道到第7道：還原階段期間（溫育時(shí)間：10分鐘和1、2、3和4小 時(shí)）的抗CD38抗體；第8道到9道：滲濾過程期間（開始滲濾后10和60分鐘的樣品）的 抗⑶38抗體；第10道：停止?jié)B濾后24小時(shí)的抗⑶38抗體；第Μ道：麗標(biāo)志物。
[0090] 圖61 :再氧化過程期間的SDS-PAGE分析。在含有EDTA或Cu2+的PBS中在不同溫 育時(shí)間后采集樣品，并通過非還原性（A，C)和還原性（B，D)條件下的SDS-PAGE分析。第1 道：IgGl，內(nèi)部測定對照，第2道：Oh樣品；第3道：lh樣品，第4道：2h樣品，第5道：3h樣 品，第6道：4h樣品，第7道：24h樣品，第8道：MW標(biāo)志物。
[0091] 圖62 :在存在Cu2+的情況中在不同溫育時(shí)間后的重鏈-輕鏈組合的相對量。通 過自SDS-PAGE凝膠的密度測定法量化個(gè)別的分子種類。所有掃描條帶的總強(qiáng)度設(shè)置為 100%。
[0092] 圖63 :反應(yīng)器流徑、材料清單和方法。使用0. 2N NaOH對流徑消毒，并用WFI漂洗。 更換反應(yīng)的早晨，從緩沖劑袋將合適量的PBS添加至系統(tǒng)。通過重力補(bǔ)料添加同二聚體，并 且以7LPM循環(huán)系統(tǒng)以混合內(nèi)容物。通過重力添加2-MEA儲備溶液啟動反應(yīng)。將滲透閥關(guān) 閉，并且補(bǔ)料泵設(shè)置為30RPM(7LPM)，以進(jìn)行還原過程。在5小時(shí)后，將滲透閥打開，并將泵 速提高以滿足滲濾的目標(biāo)補(bǔ)料壓力70kPa。對于lg/L條件，泵設(shè)置為165RPM(31LPM)。對 于20g/L條件，泵設(shè)置為140RPM(26LPM)。將PBS添加路徑打開，并且控制滲濾泵速以保持 反應(yīng)器袋中的恒定重量。此程序產(chǎn)生250L/h (對于lg/L條件）和125L/h (對于20g/L條 件）的滲濾速率。在500L廢物袋中收集目標(biāo)滲濾體積后，將滲透閥關(guān)閉，并停止?jié)B濾泵。在 氧化時(shí)間期間將補(bǔ)料泵返回到30RPM(7LPM)循環(huán)。在0/N溫育后，實(shí)施第二次滲濾（對于 lg/L條件為3個(gè)滲濾體積（diavolume)，且對于20g/L條件為4個(gè)滲濾體積）。在周圍溫度 (22-25°C )實(shí)施所有過程。直接從袋中或從閥1中取出樣品（圖1)。
[0093] 材料清單
[0094] 1) 1/2，'零靜態(tài)三通隔膜閥（zero-static tee diaphragm valve)，SED, 316L SS
[0095] 2)50L 袋，Sartoruis Stedim，F(xiàn)FB207004 型，在 50L Wave 混合器上，EHT rev A 型
[0096] 3) Twin 杠桿f平，Intercomp，TB83〇 型
[0097] 4) 1/2" ID 管道，鉬固化娃酮（platinum cured silicone)，Masterflex96410_82
[0098] 5) 3/8" ID 管道，鉬固化硅酮，Tygon 3350
[0099] 6)管道彈簧夾（Tubing pinch clamp)
[0100] 7) 1〃ID 高壓軟管，強(qiáng)化鉬固化硅酮，316L SS TC 末端，Page International，SWPV 型
[0101] 8)0-30psig 壓強(qiáng)表，Anderson，EM066010041025A 型
[0102] 9) 1"三通器（gauge tee)，316L SS
[0103] 10) 1/2' 三通器，316L SS
[0104] 11) 1/2" xl"TC 減速器（reducer)，316L SS
[0105] 12)補(bǔ)料懦動泵（Feed peristaltic pump)，Watson Marlow，720DUN/RE 型， Stapure 管道元件，960. 0254. PFT 型，0-33LPM
[0106] 13)溶解氧傳感器和發(fā)送器，Metter-Toledo,4100e 和 Inpro 6800/12/120(傳感 器）型
[0107] 14)氧化還原傳感器和發(fā)送器，Mettler Toledo,2100e和3250SG (傳感器）型
[0108] 15) l"Wedgewood 流動池，316L SS
[0109] 16) 1/2，，三通管，Kynar，Cole-Parmer EW-30703-78 型
[0110] 17)l/2"隔膜閥，SED，316LSS
[0111] 18)具有Pall -次性聚丙烯插入物的Millipore UF膜固定器（holder)，和Pall 0mega30kD PES 膜，0S030F26 型
[0112] 19)Male Kleenpak HT 連接器，Pall，KPCHT02M6 型
[0113] 20)Female Kleenpak HT 連接器，Pall，KPCHT02F6 型
[0114] 21)滲濾濾器（Diafilter)懦動泵，Watson Marlow, 620 型 Di/R，Stapure 管道兀 件，960. 0170. PFT 型，0-9LPM
[0115] 22)0. 2micron 濾器，Pall，KA3NFP1 型
[0116] 23)500L 袋，Sartoruis Stedim，F(xiàn)XB211905 型
[0117] 24) 200L 袋，Sartoruis Stedim，PDL200LWS 型
[0118] 25) 20L 袋，Sartoruis Stedim，F(xiàn)FB208721 型
[0119] 26) 5L 袋，Sartoruis Stedim，F(xiàn)FB208723 型
[0120] *所有TC墊圈均為鉬固化硅酮。
[0121] *所有5/20/50L Sartorius Stedim袋使用具有EVA (乙烯乙酸乙烯酯）產(chǎn)物接觸 和EV0H(乙烯乙烯醇）氣體屏障層的多層膜。
[0122] *所有200/500L Sartorius Stedim袋使用具有ULDPE (超低密度聚乙烯）產(chǎn)物接 觸接觸和EV0H氣體屏障層的多層膜。
[0123] 圖64 :來自三種不同條件的初始和最終產(chǎn)物的CIEX譜。
[0124] 圖65 :初始和最終產(chǎn)物的還原性（左側(cè)）和非還原性（右側(cè)）SDS-PAGE分析。第 1 道：IgGl-bl2 測定對照。第 2 道：初始 IgGl-F405L-2F8。第 3 道：初始 IgGl-K409R-7D8。 第4道：以lg/L運(yùn)行的最終25-L。第5道：以20g/L運(yùn)行的最終25-L。
[0125] 圖66 :還原和再氧化期間的溶解氧和氧化還原電勢。使用氧化還原探頭和D0探 頭追蹤IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間的氧飽和和 氧化還原電勢。水平虛線顯示了 D0和氧化還原兩者的初始數(shù)值。2-MEA的添加（以箭頭標(biāo) 示）在運(yùn)行開始時(shí)與D0和氧化還原的大幅下降一致。垂直虛線顯示滲濾的開始和停止。
[0126] 圖67 :還原和再氧化期間的pH譜。通過pH探頭測量IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間的pH。水平虛線顯示初始的pH值。 2-MEA的添加（以箭頭標(biāo)示）與運(yùn)行開始時(shí)pH的大幅下降一致。垂直虛線顯示滲濾的開始 和停止。
[0127] 圖68 :還原階段期間的氧消耗率（OCR[mM/h])、消耗的總02 (mM)和D0 (% )。計(jì)算 氧消耗率和消耗的總〇2，測量D0。垂直點(diǎn)線代表還原的開始和結(jié)束。
[0128] 圖69 :還原和再氧化期間的SDS-PAGE (非還原性）分析。通過非還原性SDS-PAGE 分析來分析IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間采集的 樣品。Μ :麗標(biāo)志物；C :IgGl對照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5 道：還原后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、 2、3、5、和7L滲濾緩沖液后的滲濾結(jié)果，第11道和第12道：滲濾后1小時(shí)和0/N溫育。在 左側(cè)標(biāo)示分子量標(biāo)志物的質(zhì)量。還原/再氧化的IgG種類以Η(重鏈）和/或L(輕鏈）及 其組合標(biāo)示。
[0129] 圖70 :還原和再氧化期間的CIEX譜。在指定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)在IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間將樣品采集并快速冷凍，并通過分析 CIEX分析。
[0130] 圖71 :0/N溫育后終樣品的HP-SEC分析。通過HP-SEC分析滲濾后在0/N溫育后 采集的樣品。7. 599和10. 792的峰分別標(biāo)示二聚體和單體IgG。
[0131] 圖72 :還原和再氧化期間的溶解氧和氧化還原電勢。使用氧化還原探頭和DO探 頭追蹤在存在2mM EDTA的情況中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還 原和再氧化期間的氧飽和和氧化還原電勢。水平虛線顯示了 D0和氧化還原兩者的初始數(shù) 值。2-MEA的添加在運(yùn)行開始時(shí)與D0和氧化還原的大幅下降一致（以箭頭標(biāo)示）。垂直虛 線顯示滲濾的開始和停止。運(yùn)行晚期（t = 24h)的氧化還原增加和D0下降與CuS04的添 加一致。
[0132] 圖73 :還原和再氧化期間的pH譜。通過pH探頭追蹤在存在2mM EDTA的情況中 IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間的pH。水平虛線顯 示初始的pH值。2-MEA的添加（以箭頭標(biāo)示）與運(yùn)行開始時(shí)pH的大幅下降一致。垂直虛 線顯示滲濾的開始和停止。
[0133] 圖74 :還原和再氧化期間的SDS-PAGE分析。通過非還原性SDS-PAGE分析來分析 在存在2mM EDTA的情況中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再 氧化期間采集的樣品。Μ :麗標(biāo)志物；C :IgGl對照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3 道、第4道和第5道：還原后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)，第6道、第7道、第8道、第9 道和第10道：1、2、3、5、和7L滲濾緩沖液后的滲濾結(jié)果，第11道和第12道：滲濾后1小時(shí) 和0/N溫育；第13道：添加 CuS04后10分鐘。在左側(cè)標(biāo)不分子量標(biāo)志物的質(zhì)量。還原/再 氧化的IgG種類以Η(重鏈）和/或L(輕鏈）及其組合標(biāo)示。
[0134] 圖75 :還原和再氧化期間的CIEX譜。通過分析CIEX分析在存在2mMEDTA的情況 中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間采集的樣品。在 指定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)采集樣品，并將其快速冷凍，直到CIEX分析。
[0135] 圖76 :還原和再氧化期間的溶解氧和氧化還原電勢。使用氧化還原探頭和D0探 頭追蹤IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間的氧飽和和 氧化還原電勢。2-MEA的添加（以箭頭標(biāo)示）在運(yùn)行開始時(shí)與D0和氧化還原的大幅下降一 致。水平虛線顯示氧化還原和D0兩者的初始數(shù)值。垂直虛線顯示滲濾的開始和停止。
[0136] 圖77 :還原和再氧化期間的攪動速率。2-MEA的添加（以箭頭標(biāo)示）與接近運(yùn)行 開始的攪動速率的大幅升高一致。垂直虛線顯示滲濾的開始和停止。
[0137] 圖78 :還原和再氧化期間的pH譜。通過pH探頭追蹤IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間的pH。2-MEA的添加（以箭頭標(biāo)示）與 運(yùn)行開始時(shí)pH的大幅下降一致。垂直虛線顯示滲濾的開始和停止。
[0138] 圖79 :還原和再氧化期間的SDS-PAGE (非還原性）分析。通過非還原性SDS-PAGE 分析來分析IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間采集的 樣品。Μ :麗標(biāo)志物；C :IgGl對照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5 道：還原后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、 2、3、5、和7L滲濾緩沖液后的滲濾結(jié)果，第11道和第12道：滲濾后1小時(shí)和0/N溫育。在 左側(cè)標(biāo)示分子量標(biāo)志物的質(zhì)量。還原/再氧化的IgG種類以Η(重鏈）和/或L(輕鏈）及 其組合標(biāo)示。
[0139] 圖80 :還原和再氧化期間的CIEX譜。通過分析CIEX分析IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間采集的樣品。在指定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)采集樣 品，并將其快速冷凍，直到CIEX分析。
[0140] 圖81 :還原和再氧化期間的溶解氧和氧化還原電勢。使用氧化還原探頭和D0探頭 追蹤IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間的氧飽和和氧 化還原電勢。水平虛線顯示了 redox和D0兩者的初始數(shù)值。2-MEA的添加（以箭頭標(biāo)示） 在運(yùn)行開始時(shí)與D0和氧化還原的大幅下降一致。水平虛線顯示氧化還原和D0兩者的初始 數(shù)值。垂直虛線顯示滲濾的開始和停止。
[0141] 圖82 :還原和再氧化期間的攪動速率。2-MEA的添加（以箭頭標(biāo)示）與接近運(yùn)行 開始的攪動速率的大幅升高一致。垂直虛線顯示滲濾的開始和停止。
[0142] 圖83:還原和再氧化期間的pH譜。通過pH探頭追蹤IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間的pH。水平虛線顯示初始數(shù)值。2-MEA 的添加（以箭頭標(biāo)示）與運(yùn)行開始時(shí)pH的大幅下降一致。水平虛線顯示初始pH值。垂直 虛線顯示滲濾的開始和停止。
[0143] 圖84 :還原和再氧化期間的SDS-PAGE (非還原性）分析。通過非還原性SDS-PAGE 分析來分析IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間采集的 樣品。Μ :麗標(biāo)志物；C :IgGl對照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5 道：還原后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、 2、3、5、和7L滲濾緩沖液后的滲濾結(jié)果，第11道和第12道：滲濾后1小時(shí)和0/N溫育。在 左側(cè)標(biāo)示分子量標(biāo)志物的質(zhì)量。還原/再氧化的IgG種類以Η(重鏈）和/或L(輕鏈）及 其組合標(biāo)示。
[0144] 圖85 :還原和再氧化期間的CIEX譜。通過分析CIEX分析IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間采集的樣品。在指定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)采集樣 品，并將其快速冷凍，直到CIEX分析。
[0145] 圖86 :還原和再氧化期間的溶解氧和氧化還原電勢。使用氧化還原探頭和D0探 頭追蹤在存在氮?dú)獾那闆r中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再 氧化期間的氧飽和和氧化還原電勢。時(shí)間〇時(shí)的2-MEA添加與運(yùn)行開始時(shí)氧化還原的大幅 下降一致。垂直虛線顯示滲濾的開始、滲濾的結(jié)束、滲濾后1小時(shí)樣品點(diǎn)、和滲濾后3小時(shí) 樣品點(diǎn)。在滲濾結(jié)束時(shí)用空氣沖刷頂部空間。
[0146] 圖87 :還原和再氧化期間的pH譜。通過pH探頭追蹤在存在氮?dú)獾那闆r中 IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和氧化期間的pH。水平虛線顯示 初始pH值。時(shí)間0時(shí)的2-MEA的添加與運(yùn)行開始時(shí)pH的大幅下降一致。垂直虛線顯示滲 濾的開始和停止。
[0147] 圖88 :還原和再氧化期間的SDS-PAGE (非還原性）分析。通過非還原性SDS-PAGE 分析來分析在存在氮?dú)獾那闆r中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原 和再氧化期間采集的樣品。M :MW標(biāo)志物；C :IgGl對照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、 第3道、第4道和第5道：還原后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)，第6道、第7道、第8道、 第9道和第10道：1、2、3、5、和7L滲濾緩沖液后的滲濾結(jié)果，第11道和第12道：滲濾后1 和3小時(shí)；第13道：滲濾后0/N溫育。在左側(cè)標(biāo)示分子量標(biāo)志物的質(zhì)量。還原/再氧化的 IgG種類以Η(重鏈）和/或L(輕鏈）及其組合標(biāo)示。
[0148] 圖89 :還原和再氧化期間的CIEX譜。通過分析CIEX分析在存在氮?dú)獾那闆r中 IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間采集的樣品。在指 定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)采集樣品，并將其快速冷凍，直到CIEX分析。
[0149] 圖90:引入空氣后的氧消耗。圖顯示了在添加空氣后更好在滲濾后的數(shù)值。實(shí)際 D0是系統(tǒng)測量的DO。D0 (無消耗）是假設(shè)沒有氧消耗的計(jì)算值。消耗的02是使用先前測 定的kla并假設(shè)系統(tǒng)中的氧飽和是0. 2mM計(jì)算的消耗氧量。
[0150] 圖91 :還原和再氧化期間的溶解氧和氧化還原電勢。使用氧化還原探頭和D0探 頭追蹤IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間的氧飽和和 氧化還原電勢。水平虛線顯示了氧化還原和D0的初始數(shù)值。垂直虛線顯示滲濾的開始和 停止。2-MEA的添加與運(yùn)行開始時(shí)D0和氧化還原的大幅下降一致。剛好在滲前，將pH調(diào)節(jié) 至5.0。在0/N溫育后，將pH調(diào)回到7. 4。
[0151] 圖92 :還原和再氧化期間的pH譜。通過pH探頭測量IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的還原和再氧化期間的pH。水平虛線顯示初始數(shù)值。垂直虛 線顯示滲濾的開始和停止。2-MEA的添加與運(yùn)行開始時(shí)pH下降一致。剛好在針對pH 5.0 緩沖液滲濾前，將pH調(diào)節(jié)至5. 0。在0/N溫育后將pH再調(diào)節(jié)至7. 4。
[0152] 圖93 :還原和再氧化期間的SDS-PAGE (非還原性）分析。通過非還原性SDS-PAGE 分析來分析IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間采集的 樣品。Μ :麗標(biāo)志物；C :IgGl對照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5 道：還原后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、 2、3、5、和7L滲濾緩沖液后的滲濾結(jié)果，第11道和第12道：滲濾后1小時(shí)和0/N溫育；第 13道、第14道和第15道：Tris添加后立即和1和2小時(shí)。在左側(cè)標(biāo)不分子量標(biāo)志物的質(zhì) 量。還原/再氧化的IgG種類以Η(重鏈）和/或L(輕鏈）及其組合標(biāo)示。
[0153] 圖94 :還原和再氧化期間的CIEX譜。通過分析CIEX分析IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的還原和再氧化期間采集的樣品。在指定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)采集樣 品，并將其快速冷凍，直到CIEX分析。
[0154] 圖95 :胱胺（cystamine)添加后的溶解氧和氧化還原電勢。使用氧化還原探頭和 D0探頭追蹤對IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409Rl:l混合物添加胱胺后的氧飽和和氧化 還原電勢。
[0155] 圖96 :胱胺添加后的CIEX譜。通過分析CIEX分析對IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R添加胱胺后采集的樣品。在指定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)采集樣品。
[0156] 圖97 :使用10mM半胱氨酸的還原的CIEX譜。將樣品每55分鐘在柱上加載，并通 過分析CIEX分析。顯示了選擇的譜，標(biāo)示溫育時(shí)間。
[0157] 圖98 :在25mM半胱氨酸時(shí)的還原的CIEX譜。將樣品每55分鐘在柱上加載，并通 過分析CIEX分析。顯示了選擇的譜，標(biāo)示溫育時(shí)間。
[0158] 圖99 :在50mM半胱氨酸時(shí)的還原的CIEX譜。將樣品每55分鐘在柱上加載，并通 過分析CIEX分析。顯示了選擇的譜，標(biāo)示溫育時(shí)間。
[0159] 圖100 :在75mM半胱氨酸時(shí)的還原的CIEX譜。將樣品每55分鐘在柱上加載，并 通過分析CIEX分析。顯示了選擇的譜，標(biāo)示溫育時(shí)間。
[0160] 圖101 :在lOOmM半胱氨酸時(shí)的還原的CIEX譜。將樣品每55分鐘在柱上加載，并 通過分析CIEX分析。顯示了選擇的譜，標(biāo)示溫育時(shí)間。
[0161] 圖102 :使用半胱氨酸還原，除去半胱氨酸，并溫育后的CIEX譜。顯示了在50mM半 胱氨酸中于30°C還原385分鐘，接著使用脫鹽柱除去半胱氨酸，隨后溫育2小時(shí)和18小時(shí) 后的CIEX譜。
[0162] 圖103 :從固定化的還原劑柱洗脫后剩余的同二聚體和新形成的雙特異性抗體的 CIEX譜。將同二聚體IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R的混合物添加至固定化的還原劑 柱，溫育并洗脫。通過分析CIEX分析雙特異性抗體的形成。
[0163] 圖104 :用于檢測雙特異性抗體的同種異型ELISA。將IgGlm(f)-K409R-CD20 和IgGlm(za)-F405L-EGFR的混合物與25mM2-MEA于37°C -起溫育90分鐘。在三明治 式ELISA中測量雙特異性抗體的形成。將405nm的光密度在Y軸上繪制，作為雙特異性 IgGlm(f，za)-CD20xEGFR抗體形成的測量。包括IgGlm(fa)抗體作為陽性對照。
[0164] 圖105 :SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后實(shí)施CIEX分析，其中過量添加 IgGl-7D8-AAA-K409R。量化顯示了交換反應(yīng)后存在 11.4% IgGl-7D8-AAA-K409R(*)、 88.5%雙特異性抗體和僅0.1%1861-2?844051^(+)同二聚體。
[0165] 圖106 :SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后實(shí)施CIEX分析，其中過量添加 IgGl-2F8-F405R。量化顯示了交換反應(yīng)后存在0. 4%
[0166] IgGl-7D8-K409R(*)、88· 4%雙特異性抗體、和 11. 2% IgGl-2F8-F405L(+)。
[0167] 圖107 :SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后實(shí)施CIEX分析，其中使用過量的 IgGl-7D8-AAA-K409R。量化指示交換反應(yīng)后存在 25. 5% IgGl-7D8-AAA-K409R(*)、73· 3% 雙特異性抗體和1. 2% of IgGl-2F8-F405L(+)。注意到IgGl-2F8-F405L同二聚體的百分 比在最佳的交換條件下是進(jìn)一步降低的（圖105)。
[0168] 圖108 :蛋白A快速蛋白液相層析（FPLC)譜。使用50 %過量的 IgGl-7D8-AAA-K409R同二聚體在交換后產(chǎn)生雙特異性抗體的蛋白A FPLC譜。在左軸上，顯 示了以mAU計(jì)的A28(l信號（黑色跡線跡線），在右軸上顯示了 pH(灰色跡線）。兩個(gè)明顯峰 之間的尖峰代表分級開始時(shí)的氣泡。
[0169] 圖109 :流過級分（在圖108中用*標(biāo)示的峰）的CIEX分析。既沒有檢測到雙特 異性抗體（保留時(shí)間約16. 4分鐘）也沒有檢測到IgGl-2F8-F405L(保留時(shí)間約19. 2分 鐘）；13· 6分鐘的峰對應(yīng)于（非結(jié)合）IgGl-7D8-AAA-K409R同二聚體。
[0170] 圖110 :洗脫產(chǎn)物（在圖108中用+標(biāo)示的峰）的CIEX分析。16. 4分鐘的峰對應(yīng) 于雙特異性抗體，在13. 6分鐘（IgGl-7D8-AAA-K409R)沒有檢出峰，并且檢出（1. 4% ) 19. 2 分鐘（IgGl-2F8-F405L)的小峰。這證明了與蛋白A拋光（polishing)組合的SNEEP可以 用于除去殘留的同二聚體。
[0171] 圖 111 :蛋白 A 共同純化的 IgGl-bl2-F405L 和 IgGl-058-K409R 的 FPLC 層析譜。 跡線顯示了 A280信號。以約5mL后A280信號升高觀察到加載。清洗和洗脫步驟的開始用 箭頭標(biāo)記。在第一低pH再生步驟期間觀察到100mL的洗脫后峰。此峰沒有進(jìn)行分析，但是 指示次要蛋白雜質(zhì)。
[0172] 圖 112 :蛋白 A共同純化的 IgGl-058-K409R⑷和 IgGl-bl2-F405L(+)的 CIEX譜。
[0173] 圖113 :從蛋白A共同純化的IgGl-bl2-F405L和IgGl-058-K409R生成的雙特異 性抗體的HP-SEC譜。7. 5分鐘的峰（*)對應(yīng)于二聚體種類，9. 0分鐘的峰對應(yīng)于單體種類 (+)。
[0174] 圖114 :從蛋白Α共同純化的IgGl-bl2-F405L和IgGl-058-K409R生成的雙特異性 抗體的CIEX譜。26分鐘的峰（*)對應(yīng)于雙特異性抗體；36分鐘的峰對應(yīng)于IgG-bl2-F405L 同二聚體（+)。沒有檢出IgGl-058-K409R。
[0175] 圖115 :雙特異性抗體和同二聚體的1:1:1混合物的FPLC譜。在近等度條件下在 WCIEX 柱上分開的 IgGl-7D8-K409R(*)、雙特異性抗體（+)、和 IgGl-2F8-F405L(#)的 1:1:1 混合物的FPLC譜（較淺的梯度僅略微加速IgGl-2F8-F405L的洗脫）。
[0176] 圖116 :計(jì)算的解析。對檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖液顯示了計(jì)算的解析（R，使用等式 5計(jì)算）。對20mM檸檬酸鹽pH 6. 4發(fā)現(xiàn)最佳的解析。認(rèn)為1. 75-2. 00的解析對于滿意的分 離是可接受的（John W. Dolan, Peak Tailing and Resolution, LC Resources Inc.，Walnut Creek, California, USA)〇
[0177] 圖 117 :FPLC 譜。在 pH 6.4,20mM 檸檬酸時(shí)摻有 10% IgGl-2F8-F405L 同二聚體 (+)的 IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8-K409R(*)雙特異性抗體的 FPLC 譜。加載是 4.4mg/mL 樹脂。
[0178] 圖 118 :IgGl-2F8-F405L X IgG17D8-K409R雙特異性抗體的 CIEX譜。顯示了在圖 117 中以星號（*)標(biāo)示的 IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R 的 CIEX 譜。IgGl-7D8-K409R 同二聚體（*)、雙特異性抗體、和IgGl-2F8-F405L同二聚體（+)的百分比是4. 3、94. 8、和 0. 9。IgGl-7D8-K409R同二聚體是來自摻有IgGl-2F8-F405L的初始批次的殘留同二聚體。
[0179] 圖119 :FPLC層析圖。A)在具有75mM2-MEA的PBS中20mg雙特異性抗體的蛋白 A洗脫譜（總體積3mL)。實(shí)線是A254信號（左軸），虛線是A28Q (左軸）信號，長虛點(diǎn)線是 pH(數(shù)值未顯示，pH在約65mL時(shí)從7. 4下降至3.0,并且指示僅用于參照）。B)蛋白A上 加載的具有75mM2-MEA的PBS (總體積3mL)。實(shí)線是A254信號（左軸），虛線是A28Q (左軸） 信號，長虛點(diǎn)線是pH(數(shù)值未顯示，pH在約65mL時(shí)從7. 4下降至3. 0,并且指示僅用于參 照）。
[0180] 圖120 :穿透（breakthrough)測定的點(diǎn)。A)在蛋白A柱暴露于2-MEA之前（左側(cè) 小圖）和之后（右側(cè)小圖）測定穿透點(diǎn)（在圖中用箭頭標(biāo)示）。使用停留時(shí)間1分鐘加載 IgGl-7D8-K409R(5mg/mL)。在對75mM2-MEA暴露之前和之后，穿透點(diǎn)是約15mL，指示柱性能 不受2-MEA的存在強(qiáng)烈影響。顯示的數(shù)據(jù)是A280數(shù)值（mAU)。B)A)的圖象放大，兩條跡線 重疊。
[0181] 圖121 :2-MEA除去后洗脫蛋白質(zhì)的還原性SDS-PAGE分析。泳道含有標(biāo)志物、對照 抗體（IgGl-bl2)、在存在2-MEA的情況中在柱加載前的雙特異性反應(yīng)混合物、和2-MEA除去 后的終產(chǎn)物。沒有檢出蛋白A，指示柱保持完整。重鏈和輕鏈以箭頭標(biāo)示，蛋白A的預(yù)期分 子量（45kDa)以星號（*)標(biāo)示。
[0182] 圖122 :雙特異性lambda-kappa抗體的CIEX譜。預(yù)期含有λ輕鏈的BMA031-K409R 抗體的地方以加號（+)標(biāo)示，并且沒有檢出峰，具有κ輕鏈的IgG12F8-F405L抗體用星號 (*)標(biāo)示。雙特異性抗體在中間。BMA031-K409R、雙特異性抗體、和IgG12F8-F405L的百分 比分別為11. 2、88. 8和0。
[0183] 圖123 :于不同溫育貯存不同時(shí)間段的雙特異性抗體（黑色）、IgGl-7D8_K409R(灰 色）和IgGl-2F8-F405L (白色）的A280數(shù)據(jù)。在Nanodrop上實(shí)施A280測量，并且結(jié)果在 1mm徑長以A280(AU)給出。
[0184] 圖124 :于2-8 °C和于25 °C在t = 0和t = 12個(gè)月時(shí)雙特異性抗體（D)、 IgGl-7D8-K409R(l)和 IgGl-2F8-F405L(2)的非還原性 SDS-PAGE。C =內(nèi)部 IgGl 測定對 照。
[0185] 圖125 :于2-8 °C和于25 °C在t = 0和t = 12個(gè)月時(shí)雙特異性抗體（D)、 IgGl-7D8-K409R(l)和 IgGl-2F8-F405L(2)的還原性 SDS-PAGE。C =內(nèi)部 IgGl 測定對照。
[0186] 圖 126 :于 40°C在 t = 0 和 t = 3 個(gè)月時(shí)雙特異性（D)、IgGl-7D8-K409R(l)和 IgGl-2F8-F405L(2)的非還原性SDS-PAGE。C=內(nèi)部IgGl測定對照。
[0187] 圖 127 :于 40°C在 t = 0 和 t = 3 個(gè)月時(shí)雙特異性（D)、IgGl-7D8-K409R(l)和 IgGl-2F8-F405L(2)的還原性 SDS-PAGE。C=內(nèi)部 IgGl 測定對照·
[0188] 圖 128 :雙特異性抗體（實(shí)心）、IgGl-7D8-K409R (有條紋）和 IgGl-2F8-F405L (有 點(diǎn)）的ΗΡ-SEC層析圖。貯存條件是A:t = 0;B:于2-8°Ct = 12個(gè)月；C:于25°C，t= 12 個(gè)月，和于40°C，D:t = 3個(gè)月。
[0189] 圖 129 :雙特異性抗體（實(shí)心）、IgGl-7D8-K409R (有條紋）和 IgGl-2F8-F405L (有 點(diǎn)）的CIEX層析圖。貯存條件是A:t = 0 ;B :于2-8°C t = 12個(gè)月；C :于25°C，t = 12個(gè) 月，和于40°C，D:t = 3個(gè)月。（注意：與t = 12個(gè)月相比t = 0時(shí)材料的保留時(shí)間的差異 可以是由于緩沖液組成的小變化和/或使用不同柱批次所致。在每次運(yùn)行中內(nèi)部IgGl對 照的分析也顯示了與t = 0相比t = 12個(gè)月時(shí)+1. 64分鐘的轉(zhuǎn)變，數(shù)據(jù)未顯示）。
[0190] 發(fā)明詳述
[0191] 定義
[0192] 術(shù)語"免疫球蛋白"指一類結(jié)構(gòu)上相關(guān)的糖蛋白，由兩對多肽鏈，即一對輕（L)的 低分子量鏈和一對重（H)鏈構(gòu)成，所有四條鏈都通過二硫鍵互聯(lián)。已充分表征免疫球蛋 白的結(jié)構(gòu)。見例如 Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.編，2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))。簡言之，每條重鏈通常由重鏈可變區(qū)（本文縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。 重鏈恒定區(qū)通常由三個(gè)域CHI、CH2和CH3構(gòu)成。重鏈在所謂"鉸鏈區(qū)"中經(jīng)由二硫鍵互 聯(lián)。每條輕鏈通常由輕鏈可變區(qū)（本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)通常 由一個(gè)域CL構(gòu)成。通常，根據(jù)EU索引對恒定區(qū)的氨基酸殘基編號，所述EU索引如描述于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)。圖 16 給出 了抗體 2F8 的不同同種型形式的EU和Kabat編號（W002/100348)?？蓪H和VL區(qū)進(jìn)一步細(xì)分為高可 變性的區(qū)（或者在結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)的序列和/或形式上高變的高變區(qū)），也稱為互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)，其散布在稱為框架區(qū)（FR)的更保守的區(qū)中。每個(gè)VH和VL通常由以下列順序從氨 基端排列至羧基端的三個(gè)CDR和四個(gè)FR構(gòu)成：FR1，CDR1，F(xiàn)R2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (還可見 Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901917(1987))〇
[0193] 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語"Fab臂"指抗體的一個(gè)重鏈-輕鏈對。
[0194] 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語"Fc區(qū)"或"Fc域"指至少包含鉸鏈區(qū)、CH2域和CH3域的 抗體區(qū)（參見例如 Kabat EA,于 US Department of Health and Human Services, NIH publication n。91-3242,Edn.第 5版 662,680,689 (1991)?？梢匀缦律?Fc 區(qū)，即用木 瓜蛋白酶消化抗體，其中Fc區(qū)是由此獲得的片段，其包括免疫球蛋白的兩個(gè)CH2-CH3區(qū)和 鉸鏈區(qū)?？贵w重鏈的恒定域限定抗體同種型，例如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgAl，IgA2, IgE。 Fc域與稱作Fc受體的細(xì)胞表面受體和補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)一起介導(dǎo)抗體的效應(yīng)器功能。
[0195] 如本文中使用的，術(shù)語"CH2區(qū)"或"CH2域"意圖指免疫球蛋白的CH2區(qū)。如此， 例如人IgGl抗體的CH2區(qū)對應(yīng)于依照EU編號系統(tǒng)的氨基酸228-340。然而，CH2區(qū)也可以 是如本文中描述的任何其它抗體同種型。
[0196] 如本文中使用的，術(shù)語"CH3區(qū)"或"CH3域"意圖指免疫球蛋白的CH3區(qū)。如此， 例如人IgGl抗體的CH3區(qū)對應(yīng)于依照EU編號系統(tǒng)的氨基酸341-447。然而，CH3區(qū)也可以 是如本文中描述的任何其它抗體同種型。
[0197] 術(shù)語"抗體"（Ab)在本發(fā)明上下文中指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子片段或 其任一種的衍生物，它們具有在典型生理?xiàng)l件下與抗原特異性結(jié)合的能力，具有顯著時(shí)間 段的半衰期，諸如至少約30分鐘，至少約45分鐘，至少約1小時(shí)，至少約2小時(shí)，至少約4 小時(shí)，至少約8小時(shí)，至少約12小時(shí)，約24小時(shí)或更久，約48小時(shí)或更久，約3、4、5、6、7 或更多天等，或者任何其它相關(guān)功能限定的時(shí)間段（諸如足以誘導(dǎo)、促進(jìn)、增強(qiáng)和/或調(diào)節(jié) 與抗體結(jié)合抗原關(guān)聯(lián)的生理反應(yīng)的時(shí)間和/或抗體足以募集效應(yīng)器活性的時(shí)間）。免疫球 蛋白分子的重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域。抗體（Ab)的恒定區(qū)可介 導(dǎo)免疫球蛋白結(jié)合至宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞（比如效應(yīng)細(xì)胞）和補(bǔ)體 系統(tǒng)的組分比如Clq，補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑的第一組分?？贵w也可以是雙特異性抗體、雙抗體 (diabody)或類似分子。術(shù)語"雙特異性抗體"指對至少兩種不同表位、通常是非重疊表位 具有特異性的抗體或含有兩種獨(dú)特抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。如上所示，除非另外聲明或者與 上下文明確矛盾，否則本文的術(shù)語抗體包括保留與抗原特異性結(jié)合的能力的抗體片段。此 類片段可通過任何已知的技術(shù)提供，比如酶促切割、肽合成和重組表達(dá)技術(shù)。已顯示抗體的 抗原結(jié)合功能可通過全長抗體的片段例如Fab或F (ab'）2片段實(shí)施。還應(yīng)理解除非另外指 定，否則術(shù)語抗體還包括多克隆抗體、單克隆抗體（mAb)、抗體樣多肽，比如嵌合抗體和人源 化抗體。如此產(chǎn)生的抗體可具備任何同種型。
[0198] 術(shù)語"全長抗體"當(dāng)用于本文時(shí)，指含有正常見于該同種型抗體的所有重鏈和輕鏈 恒定域和可變域的抗體。
[0199] 如本文中使用的，"同種型"指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的免疫球蛋白類別（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或 IgM)。
[0200] 如本文使用的，術(shù)語"人抗體"旨在包括具有從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變 區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基 (例如通過體外隨機(jī)誘變或位點(diǎn)特異性誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變）。但是， 如本文使用的，術(shù)語"人抗體"并不旨在包括其中從另一哺乳動物物種比如小鼠種系衍生的 CDR序列已移植在人框架序列上的抗體。
[0201] 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語"重鏈抗體"指只由重鏈組成且缺乏通常見于抗體的輕鏈的抗 體。重鏈抗體，自然存在于例如駱駝（camelid)，可結(jié)合抗原，盡管只具有VH域。
[0202] 術(shù)語"表位"意指能夠與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由表面集合 的分子（例如氨基酸或糖側(cè)鏈）組成，通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特 性。構(gòu)象性和非構(gòu)象性表位的區(qū)別在于在變性溶劑存在時(shí)，與前者的結(jié)合而非與后者的結(jié) 合喪失。表位可包含直接參與結(jié)合的氨基酸殘基和不直接參與結(jié)合的其它氨基酸殘基，諸 如被抗原結(jié)合肽有效封閉的氨基酸殘基（換句話說，氨基酸殘基位于抗原結(jié)合肽的覆蓋區(qū) (footprint)內(nèi)）。
[0203] 在抗體與預(yù)定抗原結(jié)合的情況下，本文所用術(shù)語"結(jié)合"通常是這樣的結(jié)合， 即在使用抗原作為配體，抗體作為分析物，通過例如表面等離振子共振（SPR)技術(shù)在 BIAcore3000儀器中測定時(shí)，其親和力相當(dāng)于約10_6M或更小，例如10_7M或更小，諸如約 1(Γ 8Μ或更小，諸如約1(Γ9Μ或更小，約或更小，或約1(ΓηΜ或甚至更小的K D，且其中抗 體以對應(yīng)于如下KD的親和力結(jié)合所述預(yù)定抗原，所述KD比其對與預(yù)定抗原或緊密相關(guān)抗原 不同的非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白）結(jié)合的親和力低至少10倍，諸如低至少100倍， 例如低至少1，〇〇〇倍，諸如低至少10, 〇〇〇倍，例如低至少100, 〇〇〇倍。親和力較低的量取 決于抗體的KD，使得在抗體的KD非常低（即抗體是高特異性的）時(shí)，則對抗原的親和力低 于對非特異性抗原的親和力的量可以是至少10,〇〇〇倍。如本文中使用的，術(shù)語"k d"(m)是 指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。
[0204] 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語"第一和第二CH3區(qū)之間的異二聚體相互作用"指第一 CH3/第 二CH3異二聚體蛋白中第一 CH3區(qū)與第二CH3區(qū)之間的相互作用。
[0205] 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語"第一和第二CH3區(qū)的同二聚體相互作用"指第一 CH3/第一 CH3同二聚體蛋白中第一 CH3區(qū)與另一個(gè)第一 CH3區(qū)之間的相互作用和第二CH3/第二CH3 同二聚體蛋白中第二CH3區(qū)與另一個(gè)第二CH3區(qū)之間的相互作用。
[0206] 如本文中使用的，"分離的抗體"表示材料已脫離其原來環(huán)境（例如如果它是自然 存在的則是自然環(huán)境或者如果它是重組表達(dá)的則是宿主細(xì)胞）。還有利的是，抗體呈純化形 式。術(shù)語"純化的"并不需要絕對純度；相反，它旨在作為相對定義，表示與起始材料相比相 對于組合物中污染物的濃度的抗體濃度增加。
[0207] 如本文中使用的，術(shù)語"宿主細(xì)胞"旨在指其中已引入表達(dá)載體如編碼本發(fā)明抗體 的表達(dá)載體的細(xì)胞。重組宿主細(xì)胞包括例如轉(zhuǎn)染瘤，比如CH0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、NS/0細(xì)胞 和淋巴細(xì)胞。
[0208] 當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語兩種或更多種核酸構(gòu)建體的"共表達(dá)"，指兩種構(gòu)建體在單個(gè) 宿主細(xì)胞中表達(dá)。
[0209] 如本文中使用的，術(shù)語"腫瘤細(xì)胞蛋白"指位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上的蛋白。
[0210] 如本文中使用的，術(shù)語"效應(yīng)細(xì)胞"指參與與免疫應(yīng)答的識別期和活化期相對的 免疫應(yīng)答效應(yīng)期的免疫細(xì)胞。示例性免疫細(xì)胞包括骨髓或淋巴來源的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞 (比如B細(xì)胞和T細(xì)胞，包括溶細(xì)胞性T細(xì)胞（CTL))、殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單 核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞比如嗜中性粒細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。 一些效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)特異性Fc受體和執(zhí)行特異性免疫功能。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能 夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性（ADCC)，比如自然殺傷細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì) 胞可吞噬靶抗原或靶細(xì)胞。
[0211] 術(shù)語"還原性條件"或"還原性環(huán)境"指足以容許抗體鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵還原 的條件。
[0212] 除非上下文矛盾，本發(fā)明中提及氨基酸位置依照EU索引，如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991)中描述的。
[0213] 術(shù)語"rpm"或"RPM"指每分鐘的旋轉(zhuǎn)，并且在本發(fā)明的上下文中可以以rpm或RPM 指示。
[0214] 本發(fā)明的方法
[0215] 本發(fā)明涉及用于生成異二聚體蛋白的體外方法，其包括下列步驟：
[0216] a)在還原性條件下將第一同二聚體蛋白與第二同二聚體蛋白一起溫育，所述還原 性條件足以容許鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵還原，且
[0217] 其中所述第一同二聚體蛋白包含免疫球蛋白的Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)， 且所述第二同二聚體蛋白包含免疫球蛋白的Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含第二CH3區(qū)，且其中所述 第一和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3區(qū)之間的異二聚體相互 作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用，
[0218] b)使從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，所述氧化條件足以容許所述異二聚 體蛋白中的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵。
[0219] 或者，本發(fā)明的步驟a)可以包括下列步驟：
[0220] z)提供編碼包含第一免疫球蛋白的Fc區(qū)的第一多肽的第一核酸構(gòu)建體，所述第 一 Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)，
[0221] y)提供編碼包含第二免疫球蛋白的Fc區(qū)的第二多肽的第二核酸構(gòu)建體，所述第 二Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)，
[0222] 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3區(qū)之 間的異二聚體相互作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用，且
[0223] 其中所述第一同二聚體蛋白具有位置409處除了 Lys、Leu或Met外的氨基酸， 且所述第二同二聚體蛋白具有選自下組的位置處的氨基酸取代：366、368、370、399、405和 407,
[0224] 和 / 或
[0225] 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列使得在如實(shí)施例21中描述的那樣測定時(shí)，每個(gè) 所述CH3區(qū)的同二聚體相互作用的解離常數(shù)介于0.01和10微摩爾，諸如介于0.05和10 微摩爾之間，更優(yōu)選介于0. 01和5之間，諸如介于0. 05和5微摩爾之間，甚至更優(yōu)選介于 0. 01和1微摩爾之間，諸如介于0. 05和1微摩爾之間，介于0. 01和0. 5之間或介于0. 01 和0. 1之間，
[0226] z)在宿主細(xì)胞中共表達(dá)所述第一和第二核酸構(gòu)建體。
[0227] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟z)進(jìn)一步包括在所述宿主細(xì)胞中共表達(dá)一種或多種 編碼輕鏈的核酸構(gòu)建體。
[0228] 本發(fā)明的方法在生產(chǎn)較大體積的異二聚體蛋白時(shí)是特別合適的。
[0229] 因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，步驟b)可以包括：
[0230] b)使至少10mL從步驟a)中獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，所述氧化條件足以容許 所述異二聚體蛋白中半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵。
[0231] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括獲得異二聚體蛋白的步驟，例如本 發(fā)明的方法可以包括步驟c):
[0232] c)獲得異二聚體蛋白。
[0233] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟a)可以包括下列步驟：
[0234] i)提供包含免疫球蛋白的Fc區(qū)的第一同二聚體蛋白，所述Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)，
[0235] ii)提供包含免疫球蛋白的Fc區(qū)的第二同二聚體蛋白，所述Fc區(qū)包含第二CH3 區(qū)，
[0236] 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3區(qū)之 間的異二聚體相互作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用，
[0237] iii)在還原性條件下將所述第一蛋白與所述第二蛋白一起溫育，所述還原性條件 足以容許所述鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵的還原。
[0238] 可以一起或分開生成和/或純化第一和第二同二聚體蛋白。例如，若通過在宿主 細(xì)胞中表達(dá)生成第一和第二同二聚體蛋白，則第一和第二同二聚體蛋白可以在同一反應(yīng)容 器，例如同一生物反應(yīng)器中生產(chǎn)。若在同一反應(yīng)容器中生產(chǎn)第一和第二同二聚體蛋白，則 所述第一和第二同二聚體蛋白可以在相同宿主細(xì)胞中或者由不同宿主細(xì)胞生成。或者，第 一和第二同二聚體蛋白可以在兩個(gè)分開的反應(yīng)容器中，例如在兩個(gè)分開的生物反應(yīng)器中生 產(chǎn)。若第一和第二同二聚體蛋白由不同宿主細(xì)胞生成，則此類宿主細(xì)胞可以源自相同或不 同細(xì)胞類型。同一反應(yīng)容器中的生產(chǎn)對于成本或時(shí)機(jī)考慮或者利用氧化還原酶諸如胞質(zhì)溶 膠硫氧還蛋白1和2(TXN1和TXN2)可以是有利的，所述氧化還原酶由表達(dá)第一和/或第二 同二聚體蛋白的宿主細(xì)胞釋放，其可以在某些條件下例如通過裂解大量活細(xì)胞，使得釋放 還原需要的酶和輔因子，這與非常低的氧濃度組合，從而催化第一和第二同二聚體蛋白的 鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵還原，由此促進(jìn)在生物反應(yīng)器中或在隨后的收獲步驟中發(fā)生重鏈交 換（Kao等，2010，Biotechnol.Bioeng 107;622-632)。如此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明 的步驟a)可以與第一和/或第二同二聚體蛋白的生產(chǎn)在同一反應(yīng)容器中實(shí)施。在又一個(gè) 實(shí)施方案中，步驟b)也可以與步驟a)在同一反應(yīng)容器中實(shí)施，或者與步驟a)和第一和/ 或第二同二聚體蛋白的生產(chǎn)兩者在同一反應(yīng)容器中實(shí)施。在此情況中，已經(jīng)存在于反應(yīng)中 的氧和二價(jià)金屬離子也可以刺激步驟b)的再氧化過程。
[0239] 用于生產(chǎn)第一和/或第二同二聚體蛋白的其它條件包括關(guān)于步驟a)描述的那些 條件中的任一種。以不同批次生產(chǎn)第一和第二同二聚體蛋白從控制的觀點(diǎn)（更容易再現(xiàn)和 /或測定每種同二聚體的品質(zhì)）看或者在使用同二聚體中的一種通過將其與多種不同其它 同二聚體組合創(chuàng)建多種不同雙特異性抗體時(shí)可能是有利的。
[0240] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以在步驟a)中的溫育前純化第一和/或第二同二聚體蛋 白。用于純化同二聚體的方法包括但不限于蛋白A和蛋白G層析（或親和層析的其它方 式）、基于例如抗原結(jié)合或抗獨(dú)特型抗體的親和層析、離子交換、疏水性相互作用、kappa或 lambda選擇、硫親和力（thioaffinity)、和輕磷灰石層析和其它混合模式樹脂。其它純化方 法包括但不限于用例如鹽或聚乙二醇沉淀以獲得純化的蛋白質(zhì)。還涵蓋不同純化方法的組 合。
[0241] 若分開生產(chǎn)第一和第二同二聚體蛋白，則也可以分開純化第一和第二同二聚體蛋 白。
[0242] 在備選實(shí)施方案中，若分開生產(chǎn)第一和第二同二聚體蛋白，它們可以通過例如蛋 白A純化一起純化。將第一和第二同二聚體蛋白一起純化可以提供一些操作和/或經(jīng)濟(jì)效 M〇
[0243] 若將第一和第二同二聚體蛋白一起生產(chǎn)，則也可以通過例如蛋白A純化將第一和 第二同二聚體蛋白一起純化。
[0244] 通過在步驟a)前純化第一和/或第二同二聚體蛋白，有可能除去如下的組分，所 述組分可以影響方法的一個(gè)或多個(gè)步驟的速率或程度；諸如步驟a)的還原和/或交換過程 和/或步驟b)的氧化過程，或者其可以進(jìn)一步或備選影響異二聚體蛋白的品質(zhì)。如上文描 述的，可以將第一和第二同二聚體蛋白分開或一起生產(chǎn)。如此，若將第一和第二同二聚體蛋 白一起生產(chǎn)，則特別地，可以將所述第一和第二同二聚體蛋白一起純化。若將第一和第二同 二聚體蛋白分開生產(chǎn)，則可以將第一和/或第二同二聚體蛋白分開或一起純化，例如通過 組合第一和第二同二聚體蛋白，隨后將它們純化。
[0245] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二同二聚體蛋白可以存在于溶液或緩沖液 中。若例如此緩沖液對于步驟a)中發(fā)生的還原和交換過程的實(shí)施不是最佳的，則可以用另 一種溶液或緩沖劑替換緩沖液。如此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括 在步驟a)前將其中有第一和/或第二同二聚體蛋白的溶液或緩沖液替換為另一種溶液或 緩沖液的步驟。
[0246] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以純化異二聚體蛋白。用于純化異二聚體蛋白的方法可 以包括但不限于本文中描述的那些方法中的任一種。用于純化異二聚體蛋白的相關(guān)方法包 括但不限于蛋白A和蛋白G層析（或親和層析的其它方式）、基于例如抗原結(jié)合或抗獨(dú)特型 抗體的親和層析、離子交換、疏水性相互作用、kappa或lambda選擇、硫親和力、和輕磷灰石 層析和其它混合模式樹脂。其它純化方法使用用例如鹽或聚乙二醇沉淀而不是層析來獲得 純化的蛋白質(zhì)。
[0247] 因此，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括純化異二聚體蛋白的步驟。通過純化異二聚 體蛋白，有可能除去過量的試劑，諸如還原劑，和雜質(zhì)。純化異二聚體蛋白還可以包括除去 殘留的第一和/或第二同二聚體蛋白。如下文描述的，可以在步驟a)中使用過量的第一或 第二同二聚體蛋白以促進(jìn)殘留第一和/或第二同二聚體蛋白的除去。
[0248] 純化異二聚體蛋白的步驟可以介于步驟a)和b)之間，但是就大多數(shù)目的而言，它 通?？梢栽诓襟Eb)后。
[0249] 若第一或第二同二聚體蛋白已經(jīng)經(jīng)過修飾，例如第一或第二CH3區(qū)已經(jīng)經(jīng)過修 飾，以降低或消除蛋白A或蛋白G結(jié)合，則特別地，可以通過蛋白A或蛋白G層析純化本發(fā)明 的異二聚體蛋白。也可以例如與蛋白A和/或蛋白G層析組合使用其它純化方法，此類其 它方法包括但不限于，或者親和層析的其它方式、基于例如抗原結(jié)合或抗獨(dú)特型抗體的親 和層析、kappa或lambda選擇、硫親和力、離子交換、疏水性相互作用、輕磷灰石層析和其它 混合模式樹脂。其它方法使用用例如鹽或聚乙二醇沉淀而不是層析來獲得純化的蛋白質(zhì)。
[0250] 在純化時(shí)或在純化后，可以將異二聚體蛋白配制為適合于貯存異二聚體蛋白，例 如確保異二聚體蛋白穩(wěn)定性的條件。對異二聚體抗體，此類配制劑通?？梢允侨芤夯蚓彌_ 液。或者，可以將異二聚體蛋白冷凍干燥。
[0251] 適合于本發(fā)明方法的過程的設(shè)備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。宿主細(xì)胞表達(dá)同二聚 體抗體可以例如通常在反應(yīng)容器，諸如生物反應(yīng)器中實(shí)施。如上文描述的，還原和氧化步驟 a)和b)可以與第一和/或第二同二聚體蛋白的表達(dá)在同一生物反應(yīng)器中發(fā)生或者它可以 在分開的生物反應(yīng)器容器中發(fā)生。類似地，還原和氧化步驟a)和b)也可以在同一反應(yīng)容器 中發(fā)生，或者它們可以在分開的反應(yīng)器容器中實(shí)施。若還原和氧化步驟a)和b)在同一反 應(yīng)容器中發(fā)生，則可以將條件從步驟a)改變?yōu)椴襟Eb)，如本文中描述的。反應(yīng)容器和支持 過程管道可以是一次性的或者可再用的，并且由標(biāo)準(zhǔn)材料（塑料、玻璃、不銹鋼，等等制成。 可以給反應(yīng)容器裝備混合、噴射、頂部空間除氣、溫度控制和/或用用于測量溫度、重量/體 積、pH、溶解氧（DO)、和氧化還原電勢的探頭監(jiān)測。所有此類技術(shù)在制造廠的標(biāo)準(zhǔn)單元操作 內(nèi)是常見的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0252] 可以如本文中描述的那樣實(shí)施本發(fā)明的方法的單個(gè)步驟。
[0253] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是胞外方法。如上文描述的，可以通過在宿主細(xì) 胞中表達(dá)適當(dāng)?shù)貙?shí)施第一和第二同二聚體蛋白的生產(chǎn)。因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可 以在胞外實(shí)施步驟a)、b)和c)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)、步驟b)、步驟c)、和步驟 a)、b)和c)中任一之間的任何步驟及任何隨后步驟可以在胞外實(shí)施。
[0254] 第一和第二同二聚體蛋白
[0255] 可以以多種方式使用本發(fā)明的方法以生成異二聚體蛋白的期望組合，并且其特別 適合于大規(guī)模生產(chǎn)雙特異性抗體。除了能夠組合靶向不同抗原的抗體以獲得選擇性結(jié)合 夕卜，它可用于通過組合兩種靶向相同抗原的不同抗體來改變期望的性質(zhì)，例如增加 CDC。另 夕卜，它可用于通過用無關(guān)（無活性）抗體制備其雙非對稱抗體來除去拮抗性抗體的部分激 動活性或者將激動性抗體轉(zhuǎn)化為拮抗性抗體。
[0256] 在一個(gè)實(shí)施方案中，同二聚體蛋白選自（i)Fc區(qū)，（ii)抗體，（iii)包含F(xiàn)c區(qū)的融 合蛋白，諸如與受體、細(xì)胞因子或激素融合的Fc區(qū)區(qū)，和（iv)與前藥、肽、藥物或毒素綴合 的Fc區(qū)。
[0257] 在一些實(shí)施方案中，除了 Fc區(qū)外，所述第一和/或第二同二聚體蛋白還包含抗體 的一個(gè)或多個(gè)或所有其它區(qū)，即CH1區(qū)、VH區(qū)、CL區(qū)和/或VL區(qū)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述第一同二聚體蛋白是全長抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二同二聚體蛋白是全 長抗體。
[0258] 在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，所述第一和第二同二聚體蛋白都是抗體，優(yōu)選全長抗 體，并結(jié)合不同的表位。在此類實(shí)施方案中，產(chǎn)生的異二聚體蛋白是雙特異性抗體。所述表 位可位于不同抗原或相同抗原上。
[0259] 然而，在其它實(shí)施方案中，只有一種同二聚體蛋白是全長抗體，另一種同二聚體蛋 白不是全長抗體，而是例如Fc區(qū)，其連同另一種蛋白質(zhì)或肽序列如受體、細(xì)胞因子或激素 一起表達(dá)，或者與前藥、肽、藥物或毒素綴合。若第一和/或第二同二聚體蛋白是抗體，例如 全長抗體，則在一個(gè)實(shí)施方案中，它可以與前藥、肽、藥物或毒素綴合或者含有其接受基團(tuán)。 在又一個(gè)實(shí)施方案中，同二聚體蛋白都不是全長抗體。例如，兩種同二聚體蛋白可以是與 另一種蛋白質(zhì)或肽序列如受體、細(xì)胞因子或激素融合或者與前藥、肽、藥物或毒素綴合的Fc 區(qū)。例如，這可以用于生成與兩種不同化合物，例如前藥、肽、藥物或毒素綴合的異二聚體蛋 白，其通過在本發(fā)明的方法中使用與兩種不同化合物，例如前藥、肽、藥物或毒素綴合的第 一和第二同二聚體蛋白進(jìn)行。這在添加藥物的過程或化學(xué)與添加另一種藥物不相容的情況 中也可以是相關(guān)的，那樣對第一和第二同二聚體蛋白分別添加兩種藥物中每種的過程可以 分開且在本發(fā)明的方法前實(shí)施。
[0260] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白的Fc區(qū)與源自選自下組的同種型或選自 下組的同種型的Fc區(qū)相似或相同：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(至少具有本文中指示的突變 例外），且第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)與源自選自下組的同種型或選自下組的同種型的Fc區(qū) 相似或相同：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(至少具有本文中指示的突變例外）。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述第一和所述第二同二聚體蛋白兩者的Fc區(qū)與源自IgGl同種型（至少具 有本文中指示的突變例外）或該IgGl同種型的Fc區(qū)相似或相同。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述同二聚體蛋白的Fc區(qū)之一與源自IgGl同種型或該IgGl同種型的Fc區(qū)相似或 相同，而另一個(gè)與源自IgG4同種型（至少具有本文中指示的突變例外）或該IgG4同種型 的Fc區(qū)相似或相同。在后一種實(shí)施方案中，所得的異二聚體蛋白包含IgGl的Fc區(qū)和IgG4 的Fc區(qū)，并且如此就效應(yīng)器功能的活化而言可以具有令人感興趣的中間特性。若所述第一 和/或所述第二同二聚體蛋白包含消除Asn連接的糖基化的接受位點(diǎn)的突變或者以其它方 式操作為改變糖基化特性，則可以獲得相似的產(chǎn)物。
[0261] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，通過例如按US2009317869所述或按van Berkel等（2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350所述，在同二聚體蛋白，例如抗體產(chǎn)生期間向培養(yǎng)基中加入化 合物，或者例如按 Yamane-Ohnuki 等（2004)Biotechnol. Bioeng87:614 所述，使用 FUT8 敲 除細(xì)胞，對同二聚體蛋白中的一種或兩種進(jìn)行糖改造以減少巖藻糖，因此提高ADCC?？刹捎?Umafta等（1999) Nature Biotechnol 17:176所述方法，備選地使ADCC最優(yōu)化?；蛘?，可以 在不添加巖藻糖的宿主細(xì)胞例如Biowa/KHK中表達(dá)第一和/或第二同二聚體蛋白。
[0262] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，例如按照Natsume等（2009)Cancer Sci. 100:2411所述工 程化改造或修飾同二聚體蛋白中的一種或兩種以增強(qiáng)補(bǔ)體活化。
[0263] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，已工程化改造同二聚體蛋白中的一種或兩種以減少或增加 對新生兒Fc受體（FcRn)的結(jié)合以便操縱異二聚體蛋白的血清半衰期。
[0264] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，已將同二聚體起始蛋白中的一種工程化改造或修飾為不 結(jié)合蛋白A或蛋白G，或蛋白A和蛋白G的組合，從而允許通過使產(chǎn)物穿過蛋白A或蛋白 G柱讓異二聚體蛋白與所述同二聚體起始蛋白分離。對于其中相對于作為原料的另一同 二聚體蛋白使用過量的一種同二聚體蛋白的實(shí)施方案這可能特別有用。在此類實(shí)施方案 中，可能有用的是，工程化改造或修飾會過量使用的同二聚體蛋白的蛋白A或蛋白G結(jié)合 位點(diǎn)，從而破壞其結(jié)合此類樹脂的能力。此類修飾包括但不限于CH3域中的修飾，其在W0 2010/151792(通過提及將其收入本文）中披露。如此，本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白 可以包含W0 2010/151792中描述的CH3域中的一處或多處修飾，其降低或消除IgG對蛋白 A的結(jié)合。如此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白可以包含但 不限于選自下組的修飾：a)435R和b)435R和436F。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同 二聚體蛋白可以包含下列突變：I253A、H310A、和H435A(AAA)，其還消除對蛋白A的結(jié)合。 在異二聚體化反應(yīng)后，異二聚體蛋白然后可通過在蛋白A柱上通過與過剩的未互換同二聚 體蛋白分離。若使用蛋白G純化異二聚體蛋白，則本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白可以 包含但不限于選自下組的修飾：1253、S254、H433和N434(Sloan，D.，等，Prot. Sci. 1999 ; 8:1643-1648 ;Sauer_Eriksson，Ε·，等，Structurel995 ;3:265-278)。在異二聚體化反應(yīng) 后，異二聚體蛋白然后可通過在蛋白G柱上通過與過剩的未互換同二聚體蛋白分離。其它 純化方法包括本文中描述的那些方法中的任一種。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二同 二聚體蛋白可以包含不同輕鏈，諸如kappa和lambda輕鏈，或者第一和第二同二聚體蛋白 可以是不同同種異型的，諸如本文中描述的。
[0265] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，同二聚體蛋白之一是（l)Fc區(qū)或（2)識別無關(guān)表位的全長 抗體。
[0266] 待用作本發(fā)明同二聚體起始材料的可變區(qū)可以例如通過由Kohler 等，Nature256,495(1975)首次描述的雜交瘤方法制備，或者可通過重組DNA方法制備?？?變區(qū)也可從噬菌體抗體文庫用描述于例如Clackson等，Nature352, 624628 (1991)和Marks 等，J. Mol. Biol. 222, 581597 (1991)的技術(shù)分離。可變區(qū)可從任何合適來源獲得。因此，例 如，可變區(qū)可以自雜交瘤的單克隆抗體獲得，所述雜交瘤從自用目標(biāo)抗原（其例如呈在表 面上表達(dá)該抗原的細(xì)胞或者編碼目標(biāo)抗原的核酸形式）免疫的小鼠獲得的鼠脾臟B細(xì)胞制 備。可變區(qū)還可以自雜交瘤的單克隆抗體獲得，所述雜交瘤從自經(jīng)免疫的人或非人哺乳動 物諸如大鼠、犬、靈長類等的抗體表達(dá)細(xì)胞衍生。
[0267] 第一和/或第二同二聚體蛋白可以是例如嵌合或人源化抗體。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，同二聚體起始蛋白中的一種或兩種除了任何指定突變以外是人抗體。人單克隆 抗體可用轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠如HuMAb小鼠或TC小鼠（其攜帶編碼人重鏈和輕鏈 全集的全部或部分的微型染色體）產(chǎn)生。HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因小基因座 (minilocus)，其編碼非重排人重鏈（μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列以及滅活內(nèi)源 性μ和κ鏈基因座的靶定突變（Lonberg，N.等，Nature368,856859(1994))。因此，小 鼠展現(xiàn)出降低的小鼠 IgM或κ輕鏈表達(dá)，且在響應(yīng)免疫時(shí)，所引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基 因進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變以產(chǎn)生高親和力人IgG，κ單克隆抗體（(Lonberg，N.等 (1994)，見上文；綜述見 Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994)，Lonberg，N. and Huszar，D·，Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93(1995)及 Harding, F. and Lonberg, N. Ann. Ν· Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995))。HuMAb 小鼠的制 備詳細(xì)記載于 Taylor，L.等，Nucleic Acids Research20, 6287 6295 (1992)，Chen, J. 等,International Immunology 5, 647656 (1993), Tuaillon 等,J. Immunol.152,29122 920 (1994), Taylor, L.等，International Immunology 6,579 591 (1994), Fishwild，D. 等，Nature Biotechnology 14,845 851(1996)。還可見 US 5, 545, 806, US 5, 569, 825, US 5,625，126，US 5, 633, 425, US 5, 789, 650, US 5, 877, 397, US 5, 661，016, US 5, 814, 318, US 5, 874, 299, US 5, 770, 429, US 5, 545, 807, W0 98/24884, W0 94/25585, W0 93/1227, W0 92/22645, W0 92/03918和W0 01/09187。這些轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞可用于按照熟知的技術(shù) 產(chǎn)生分泌人單克隆抗體的雜交瘤。
[0268] 此外，可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過直接克隆或展示型技術(shù)，包括但不限于噬菌 體克隆或展示、逆轉(zhuǎn)錄病毒展示、核糖體展示、哺乳動物展示及其它技術(shù)鑒定本發(fā)明的人抗 體或者來自其它物種的本發(fā)明抗體，并且所得分子可進(jìn)行另外的成熟，諸如親和力成熟，因 為此類技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知。
[0269] 在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其部分如一個(gè)更多個(gè)CDR源自駱駝科 (Camelidae)物種（見W02010001251)，或者源自軟骨魚物種諸如鉸口鯊，或者是重鏈抗體 或域抗體。
[0270] 在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的或步驟a)中提供的所述第一和第 二同二聚體蛋白是純化的。用于純化同二聚體的方法可以是本文中描述的那些方法中的任 一種，例如下文描述的那些方法中的任一種。
[0271] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二同二聚體蛋白與藥物、前藥或毒素綴合或者 含有藥物、前藥或毒素的接受基團(tuán)。此類接受基團(tuán)可以是例如非天然氨基酸。在一個(gè)具體 的實(shí)施方案中，第一和第二同二聚體蛋白可以與不同化合物綴合，或者含有不同修飾，由此 導(dǎo)致生成包含兩種化合物或修飾的異二聚體蛋白。
[0272] 如上所述，同二聚體起始蛋白的第一 CH3區(qū)與第二CH3區(qū)的序列不同，并使得所述 第一和第二CH3區(qū)之間的異二聚體相互作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相 互作用。
[0273] 在一個(gè)實(shí)施方案中，與各種同二聚體相互作用相比異二聚體相互作用的強(qiáng)度增 力口，是因?yàn)镃H3修飾，而非因?yàn)橐牍矁r(jià)鍵、半胱氨酸殘基或荷電殘基。
[0274] 在大多數(shù)實(shí)施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)物異二聚體蛋白是高度穩(wěn)定的，在體外的溫和 還原條件下或者重要地對人或動物施用后在體內(nèi)，不經(jīng)歷Fab臂互換。因此，在一個(gè)實(shí)施方 案中，所得異二聚體蛋白中所述第一與第二蛋白之間的異二聚體相互作用使得在描述于實(shí) 施例13的條件下在0. 5mM GSH下不能發(fā)生Fab臂互換。
[0275] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所得異二聚體蛋白中所述第一與第二蛋白之間的異二聚體 相互作用使得在描述于實(shí)施例14的條件下在小鼠體內(nèi)不發(fā)生Fab臂互換。
[0276] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如在按實(shí)施例30所述確定時(shí)，所得異二聚體蛋白中所述 第一與第二蛋白之間的異二聚體相互作用強(qiáng)度為兩種同二聚體相互作用中的最強(qiáng)相互作 用強(qiáng)度的大于2倍，諸如大于3倍，如大于5倍。
[0277] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述所述第一和第二CH3區(qū)的序列使得所得異二聚體蛋白 中所述第一與第二蛋白之間的異二聚體相互作用的解離常數(shù)低于〇. 05微摩爾（μ M)，如按 實(shí)施例30描述測定時(shí)。
[0278] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二CH3區(qū)的序列使得如按實(shí)施例21描述測定 時(shí)，兩種同二聚體相互作用的解離常數(shù)高于0. 01 μ Μ，諸如高于0. 05 μ Μ，優(yōu)選0. 01-10 μ Μ， 諸如0. 05-10 μ Μ，更優(yōu)選0. 01-5 μ Μ，諸如0. 05-5 μ Μ，甚至更優(yōu)選0. 01-1 μ Μ，諸如 0. 05-1 μ Μ，0. 01-0. 5 μ Μ或者0. 01-0. 1 μ Μ。其中同二聚體起始蛋白相對穩(wěn)定的實(shí)施方案 可具有更容易制備大量起始蛋白和例如避免聚集或錯(cuò)折疊的優(yōu)點(diǎn)。
[0279] 在一些實(shí)施方案中，可基于兩種在CH3區(qū)只含有少數(shù)相當(dāng)保守的不對稱突變的同 二聚體起始蛋白，利用本發(fā)明的方法以高收率獲得穩(wěn)定的異二聚體蛋白。
[0280] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二CH3區(qū)的序列在不相同的位置含有氨 基酸取代。
[0281] 氨基酸取代基可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。非天然氨基酸的例子例如公開 于Xie J and Schultz P. G., Current Opinion in Chemical Biology(2005), 9:548 - 554, 及 Wang Q.等，Chemistry & Biology (2009) ,16:323-336。
[0282] 在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸是天然氨基酸。
[0283] 在一個(gè)實(shí)施方案中，相對于野生型（例如人IgG，諸如人IgGl)CH3區(qū)，所述第一同 二聚體蛋白在CH3區(qū)具有不超過1個(gè)氨基酸取代，而第二同二聚體蛋白在CH3區(qū)具有不超 過1個(gè)氨基酸取代。
[0284] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代： 366, 368, 370, 399,405,407和409,而所述第二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨 基酸取代：366, 368, 370, 399,405,407和409,且其中不在相同位置取代所述第一同二聚體 蛋白和所述第二同二聚體蛋白。
[0285] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置366處具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代：368,370,399,405,407和409。在一 個(gè)實(shí)施方案中，位置366處的氨基酸選自Arg，Lys，Asn，Gin, Tyr，Glu和Gly。
[0286] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置368處具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代：366, 370, 399,405,407和409。
[0287] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置370處具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代：366, 368, 399,405,407和409。
[0288] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置399處具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代：366, 368, 370,405,407和409。
[0289] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置405處具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代：366, 368, 370, 399,407和409。
[0290] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置407處具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代：366, 368, 370, 399,405和409。
[0291] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置409處具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代：366, 368, 370, 399,405和407。
[0292] 因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二CH3區(qū)的序列含有不對稱突變，即在兩 個(gè)CH3區(qū)的不同位置的突變，如在一個(gè)CH3區(qū)的405位的突變而另一個(gè)CH3區(qū)的409位的 突變。
[0293] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一或第二同二聚體蛋在位置409處具有與Lys、Leu或 Met不同的氨基酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置409處具有選 自下組的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Phe，Gly，His，lie，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp 和 Tyr。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置409處具有選自下組的氨 基酸：4找，617，把 8，￥&1和116。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位 置409處具有選自下組的氨基酸：Arg，His，lie和Val。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或 第二同二聚體蛋白在位置409處具有Arg。
[0294] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一或第二同二聚體蛋在位置405處具有與Phe不同的 氨基酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置405處具有與Phe，Arg或 Gly不同的氨基酸。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置405處具有 選自下組的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，lie，Lys，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr， Val，Trp和Tyr。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置405處具有 Leu〇
[0295] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一或第二同二聚體蛋在位置366處具有與Lys，Arg， Ser，Thr或Trp不同的氨基酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置366 處具有與 Phe, Gly, lie, Lys，Leu, Met, Arg, Ser，Thr，Trp 或 Tyr 不同的氨基酸。在甚至 又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置366處具有選自下組的氨基酸：Ile和 Val。
[0296] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一或第二同二聚體蛋在位置368處具有與Phe，Leu或 Met不同的氨基酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置368處具有與 Phe，Leu，Lys或Met不同的氨基酸。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在 位置 368 處具有選自下組的氨基酸：Ala, Asp, Glu，Gly，His, lie, Asn，Gin, Arg，Ser，Thr， Val和Trp。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二同二聚體蛋白在位置368處具有選自下 組的氨基酸：Asp和Glu。
[0297] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置409處具有與Lys，Leu或Met不同 的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白在選自下組的位置處具有氨基酸取代：366, 368, 370， 399,405 和 407。
[0298] 在一個(gè)此類實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白在位置409處具有與Lys，Leu或 Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白在位置405處具有與Phe不同的氨基酸。在 本文的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白在位置409處具有與Lys，Leu或Met不 同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白在位置405處具有與Phe，Arg或Gly不同的氨基酸。 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白在位置409處具有選自下組的氨基酸:Ala， Asp，Glu，Phe，Gly，His，lie，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp 和 Tyr，而所述第二同二聚 體蛋白在位置405處具有選自下組的氨基酸：Ala, Asp, Glu，Gly, His, lie, Lys，Leu, Met, Asn，Gin, Arg，Ser，Thr，Val, Trp和Tyr。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在 位置409處具有選自下組的氨基酸4找，617，把8，￥&1和116，而所述第二同二聚體蛋白在 位置405處具有Leu。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置409處具有選自 下組的氨基酸：Arg，His，lie和Val，而所述第二同二聚體蛋白在位置405處具有Leu。在 甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白在位置409處具有Arg，而所述第二同二聚 體蛋白在位置405處具有Leu。
[0299] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置366處具有與Lys，Arg，Ser，Thr 或Trp不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白在位置405處具有與Phe不同的氨基酸。在 又一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在位置366處具有與Phe，Gly，lie，Lys，Leu，Met， Arg，Ser，Thr，Trp或Tyr不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白在位置405處具有與 Phe，Arg或Gly不同的氨基酸。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白在位置 366處具有選自下組的氨基酸：Ile和Val，而第二同二聚體蛋白在位置405處具有選自下 組的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，lie，Lys，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp 和Tyr。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白在位置366處具有選自下組的氨 基酸：Ile和Val，而第二同二聚體蛋白在位置405處具有Leu。
[0300] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置405處的Phe和位置409 處與Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白包含位置405處與Phe不同 的氨基酸和位置409處的Lys。在本文的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位 置405處的Phe和位置409處與Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白 包含位置405處與Phe，Arg或Gly不同的氨基酸和位置409處的Lys。
[0301] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置405處的Phe和位置409 處與Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白包含位置405處的Leu和位 置409處的Lys。在本文的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置405處的 Phe和位置409處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白包含位置405處與Phe，Arg或Gly不同 的氨基酸和位置409處的Lys。
[0302] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置405處的Phe和位置409 處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白包含位置405處的Leu和位置409處的Lys。
[0303] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置409處與Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白包含位置409處的Lys、位置370處的Thr和位置 405 處的 Leu。
[0304] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置409處的Arg，而所述第二 同二聚體蛋白包含位置409處的Lys、位置370處的Thr和位置405處的Leu。
[0305] 在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置370處的Lys、位置 405處的Phe和位置409處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白包含位置409處的Lys、位置 370處的Thr和位置405處的Leu。
[0306] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置409處與Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白包含位置409處的Lys和：a)位置350處的lie和 位置405處的Leu，或b)位置370處的Thr和位置405處的Leu。
[0307] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置409處的Arg，而所述第二 同二聚體蛋白包含位置409處的Lys和：a)位置350處的lie和位置405處的Leu，或b) 位置370處的Thr和位置405處的Leu。
[0308] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置350處的Thr、位置370處 的Lys、位置405處的Phe、和位置409處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白包含位置409處 的Lys和：a)位置350處的lie和位置405處的Leu，或b)位置370處的Thr和位置405 處的Leu。
[0309] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白包含位置350處的Thr、位置370處 的Lys、位置405處的Phe、和位置409處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白包含位置350處 的lie、位置370處的Thr、位置405處的Leu和位置409處的Lys。
[0310] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處與Tyr，Asp, Glu，Phe, Lys, Gin, Arg, Ser或Thr不同的氨基酸。
[0311] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處的Ala，Gly，His，lie，Leu，Met， Asn, Val 或 Trp〇
[0312] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處的Gly，Leu，Met，Asn或Trp。
[0313] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置407處的Tyr和位置409 處與Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處與Tyr，Asp， Glu，Phe, Lys, Gin, Arg, Ser或Thr不同的氨基酸和位置409處的Lys。
[0314] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置407處的Tyr和位置409 處與Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處的Ala，Gly， His，lie，Leu，Met，Asn，Val 或 Trp 和位置 409 處的 Lys。
[0315] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置407處的Tyr和位置409 處與Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處的Gly，Leu， Met, Asn或Trp和位置409處的Lys。
[0316] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置407處的Tyr和位置409 處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處與Tyr, Asp, Glu，Phe，Lys，Gin, Arg， Ser或Thr不同的氨基酸和位置409處的Lys。
[0317] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置407處的Tyr和位置409 處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處的Ala, Gly，His, lie, Leu, Met, Asn, Val或Trp和位置409處的Lys。
[0318] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置407處的Tyr和位置409 處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白具有位置407處的Gly，Leu，Met，Asn或Trp和位置409 處的Lys。
[0319] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚體蛋白具有位置366處與Lys，Arg，Ser, Thr或Trp不同 的氨基酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而第二同二聚體蛋白具有位置366處與Phe，Gly，lie, Lys，Leu, Met, Arg， Ser，Thr，Trp或Tyr不同的氨基酸。
[0320] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys，Leu或Met不同的 氨基酸，而第二同二聚體蛋白具有位置368處與Phe，Leu或Met不同的氨基酸。在又一個(gè)實(shí) 施方案中，第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而第二同二 聚體蛋白具有位置368處與Phe，Leu，Lys或Met不同的氨基酸。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中， 第一同二聚體蛋白具有位置409處選自下組的氨基酸：Ala，Asp, Glu，Phe，Gly，His, lie, Asn, Gin, Arg，Ser, Thr, Val, Trp和Tyr,而所述第二同二聚體蛋白具有位置368處選自下 組的氨基酸：Ala, Asp, Glu，Gly，His, lie, Asn, Gin, Arg，Ser, Thr, Val 和 Trp。在甚至又 一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白具有位置409處選自下組的氨基酸：Arg，Gly，His, Val 和lie,而所述第二同二聚體蛋白具有位置368處選自下組的氨基酸：Ala，Asp, Glu，Gly， His, lie, Asn, Gin, Arg，Ser, Thr, Val和Trp。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋 白具有位置409處選自下組的氨基酸：Arg，His，Val和lie，而所述第二同二聚體蛋白具有 位置368處選自下組的氨基酸：Asp和Glu。在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一同二聚體 蛋白具有位置409處的Arg，而所述第二同二聚體蛋白具有位置368處選自下組的氨基酸： Asp 和 Glu。
[0321] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys，Leu或Met不同的 氨基酸，而第二同二聚體蛋白具有
[0322] ⑴位置368處與Phe，Leu和Met不同的氨基酸，或
[0323] (ii)位置 370 處的 Trp，或
[0324] (iii)位置399處與Asp，Cys，Pro, Glu或Gin不同的氨基酸。
[0325] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白具有位置409處的Arg，Ala，His或Gly，而 第二同二聚體蛋白具有
[0326] (i)位置 368 處的 Lys，Gln，Ala，Asp，Glu，Gly，His，lie，Asn，Arg，Ser，Thr，Val 或Trp,或
[0327] (ii)位置 370 處的 Trp，或
[0328] (iii)位置 399 處的 Ala，Gly，lie，Leu，Met，Asn，Ser，Thr，Trp，Phe，His，Lys， Arg 或 Tyr〇
[0329] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白具有位置409處的Arg，而第二同二聚體蛋 白具有
[0330] (i)位置 368 處的 Asp, Glu，Gly，Asn，Arg，Ser，Thr，Val，或 Trp，或
[0331] (ii)位置 370 處的 Trp，或
[0332] (iii)位置 399 處的 Phe，His, Lys，Arg 或 Tyr。
[0333] 除了上文規(guī)定的氨基酸取代以外，所述第一和第二同二聚體蛋白可含有相對于野 生型（例如人IgG)Fc序列的其它氨基酸取代、缺失或插入。
[0334] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二CH3區(qū)除了包含規(guī)定的突變以外，還包含 在 SEQ ID N0:l(IgGlm(a))列出的序列：
[0335] SEQ ID N0:1:
[0336] GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0337] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二CH3區(qū)除了包含規(guī)定的突變以外，還包含 在 SEQ ID N0:2(IgGlm(f))列出的序列：
[0338] SEQ ID NO:2:
[0339] GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0340] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二CH3區(qū)除了包含規(guī)定的突變以外，還包含 在 SEQ ID N0:3(IgGlm(ax))列出的序列：
[0341] SEQ ID NO:3:
[0342] GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
[0343] 通過本發(fā)明生產(chǎn)異二聚體蛋白包括使得第一和第二同二聚體蛋白的CH3區(qū)之間 的異二聚體相互作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)之間各自的同二聚體相互作用。如上文描 述的，此效應(yīng)特別可以用第一和/或第二同二聚體蛋白的CH3修飾的上文提及的例子獲得。 然而，預(yù)見到包含與本文中描述的突變不同的突變的第一和/或第二同二聚體蛋白也可以 在本發(fā)明的方法中使用。例如，第一和第二同二聚體蛋白可以是大鼠抗體和小鼠抗體（如 Lindhofer等（1995)J Immunoll55:219(見上文）描述的），或者所謂進(jìn)入隆突-進(jìn)入-空 穴（knob-in-hole)變體抗體（如描述于美國專利5, 731，168 (見上文））。如此，在本發(fā)明 的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一和第二同二聚體蛋白可以包含US 5, 731，168中描述的 隆突-進(jìn)入-空穴單一或雙重修飾。
[0344] 本發(fā)明的方法也可以用于生成如W02011/143545中描述的雙特異性抗體。
[0345] 可用于本發(fā)明的第一和第二同二聚體蛋白的另一個(gè)合適的例子包括那些基于第 一和第二同二聚體蛋白的CH3區(qū)之間的靜電相互作用的，如那些披露于W0 2009/089004 的。此技術(shù)又可以稱為靜電操縱。
[0346] 然而，在一些情況中，后一種同二聚體起始蛋白可能更難生成，因?yàn)橥垠w CH3-CH3相互作用太弱。因此，可以優(yōu)選本文中描述的在位置366, 368, 370, 399,405,407和 409中的一個(gè)或多個(gè)具有突變的變體。可以優(yōu)選本文中描述的在位置350, 370,405和409 中的一個(gè)或多個(gè)具有突變的變體。
[0347] 同二聚體起始蛋白鉸鏈區(qū)的序列可變化。但是，如果鉸鏈區(qū)不是IgG4樣的，優(yōu)選 為IgGl樣的，所得異二聚體蛋白在一些情況下可能更穩(wěn)定。
[0348] 如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一或所述第二同二聚體蛋白在（核心）鉸鏈區(qū)都 不包含 Cys-Pro-Ser-Cys 序列。
[0349] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和所述第二同二聚體蛋白兩者在（核心）鉸鏈區(qū) 都包含 Cys-Pro-Pro-Cys 序列。
[0350] 在其中第一和所述第二同二聚體蛋白是抗體的許多實(shí)施方案中，所述抗體還包含 輕鏈。如上文所解釋的，所述輕鏈可能不同，即序列不同且各自只與一條重鏈形成功能性抗 原結(jié)合域。但是，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二同二聚體蛋白是重鏈抗體，其不需 要輕鏈用于抗原結(jié)合，見例如 Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446。
[0351] 步驟 a)
[0352] 如上文描述的，本發(fā)明的方法的步驟a)包括在還原性條件下將所述第一同二聚 體蛋白與所述第二同二聚體蛋白一起溫育，所述還原性條件足以容許鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵 的還原。術(shù)語"足以"在"足以容許鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵的還原的還原性條件"的上下文中 可以特別是根據(jù)容許發(fā)生Fab-臂交換反應(yīng)。如此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，"足以容許 鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵的還原的還原性條件"是導(dǎo)致生成超過50%異二聚體蛋白，諸如超過 60%異二聚體蛋白，或超過70%異二聚體蛋白，或超過80%異二聚體蛋白，或超過90%異 二聚體蛋白，或超過95%異二聚體蛋白，或超過99%異二聚體蛋白，或超過99. 5%異二聚 體蛋白，諸如100%異二聚體蛋白的條件。異二聚體蛋白的百分比在此上下文中相對于第一 同二聚體蛋白、第二同二聚體蛋白和異二聚體蛋白的總量而言。例如，可以通過CIEX測量 異二聚體蛋白的量或百分比，如本文中例子中描述的。
[0353] 在本發(fā)明的上下文中，提及"步驟a)的還原性條件"意圖指"足以容許鉸鏈區(qū)中鏈 間二硫鍵的還原的還原性條件"。本文中給出了合適條件的例子。鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵還 原的最低需要可以隨同二聚體起始蛋白，特別隨鉸鏈區(qū)的精確序列而不同。不限于任何理 論，鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基可以在還原二硫鍵后例如與還原劑，諸如2-MEA結(jié)合，或者形 成鏈內(nèi)二硫鍵或者與未結(jié)合的半胱氨酸殘基起反應(yīng)。
[0354] 步驟a)中的異二聚體蛋白形成基于第一和第二同二聚體蛋白鉸鏈區(qū)中二硫鍵的 還原和所述第一和第二同二聚體蛋白Fc區(qū)中的交換。
[0355] 因此，此外，步驟a)的還原性條件可以實(shí)現(xiàn)第一和第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)的交 換，由此生成異二聚體蛋白。也可以在步驟a)中發(fā)生兩個(gè)第一或兩個(gè)第二同二聚體蛋白的 Fc區(qū)的交換，這會導(dǎo)致第一或第二同二聚體蛋白的形成。第一和第二同二聚體蛋白的CH3 區(qū)之間的異二聚體相互作用強(qiáng)于所述CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用。不限于任何理論， 與第一和第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)的交換相比，異二聚體蛋白的Fc區(qū)的交換由此可以是 不利的。如此，步驟a) -般可以導(dǎo)致比第一和第二同二聚體蛋白之任一更多的異二聚體蛋 白的生成。因此，一般地，本發(fā)明的方法導(dǎo)致獲得產(chǎn)物，即第一和第二同二聚體蛋白和異二 聚體蛋白的總量的超過50%,諸如超過60%,或超過70%,或超過80%,或超過90%,或超 過95 %，或超過99 %是異二聚體蛋白。
[0356] 可以將第一和第二同二聚體蛋白一起或分開生成，如也在上文描述的。若將第一 和第二同二聚體蛋白一起生成，步驟a)與第一和第二同二聚體蛋白的生成可以在同一容 器，例如生物反應(yīng)器中發(fā)生。用于生成第一和第二同二聚體蛋白，諸如抗體的方法是本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的。
[0357] 步驟a)中的第一同二聚體和第二同二聚體蛋白的濃度不必須是相同的。原則上， 就第一和第二同二聚體蛋白的濃度而言沒有限制，但是出于大多數(shù)實(shí)際目的，步驟a)中第 一和第二同二聚體蛋白各自的濃度通?？梢栽讴? lmg/mL至100mg/mL的范圍中，諸如在 0. 5-100mg/mL的范圍中，或在l-75mg/mL的范圍中，或在l-50mg/mL的范圍中。步驟a)中的 第一和第二同二聚體蛋白的終濃度可以是至少〇.25mg/mL。所述上限主要是因?yàn)?，濃度高?200mg/mL的蛋白質(zhì)會是如此粘滯，以致于它們難以處理，可以達(dá)到溶解度的限度，或者蛋白 質(zhì)聚集率太高。因此，步驟a)中的第一和第二同二聚體蛋白的總濃度通?？梢栽?.2mg/mL 至200mg/mL的范圍中，諸如在0· 5-100mg/mL的范圍中，或在l-50mg/mL的范圍中。
[0358] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以在方法的步驟a)中使用過量的第一或第二同 二聚體蛋白。若例如第一同二聚體蛋白對產(chǎn)物安全性或功效具有較強(qiáng)的影響或者比第二同 二聚體蛋白更難以與異二聚體蛋白分開，或者反之亦然或者為了簡化或易于純化通過方法 生成的異二聚體蛋白，則這可以特別相關(guān)。使用過量的一種同二聚體蛋白；即第一或第二同 二聚體蛋白可以易于如本文中描述的異二聚體蛋白的后續(xù)純化，因?yàn)榫筒粔蜇S富的蛋白質(zhì) 而言，它會驅(qū)動步驟a)中的交換過程更接近完成。如此，隨著第一或第二同二聚體蛋白成 為限制，其大部分會在步驟a)中使用，并且隨后的純化然后主要會在于將異二聚體蛋白與 過量使用的同二聚體蛋白，而不是第一和第二同二聚體蛋白兩者分開。因此，在步驟a)中 使用過量的第一或第二同二聚體蛋白特別地可以與使用包含促進(jìn)純化的差異的第一和第 二同二聚體蛋白組合。此類差異包括本文中描述的差異，例如不結(jié)合蛋白A或蛋白G、不同 的輕鏈和/或不同的同種異型。使用非等摩爾量的第一和第二同二聚體蛋白可以稱為操縱 的非等摩爾交換方法（steered non-equimolar exchange process，SNEEP)，并且可以例如 如本文中實(shí)施例64中描述的那樣實(shí)施。
[0359] 如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的第一與第二同二聚體蛋白的比率可以不同 于1:1，例如第一與第二同二聚體蛋白的比率可以具有范圍為1:1. 03至1:2 ;諸如范圍為 1:1. 05至1:1. 5,或范圍為1:1. 1至1:1. 5,或范圍為1:1. 1至1:1. 4 ;或范圍為1:1. 15至 1:1. 35,或范圍為1:1. 2至1:1. 3的比率。
[0360] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二同二聚體蛋白在步驟a)中可以以過量 5% -60%的第一或第二同二聚體蛋白，諸如過量15% -55%的第一或第二同二聚體蛋白， 例如過量20% -55%的第一或第二同二聚體蛋白，或過量30-50%的第一或第二同二聚體 蛋白，或特別是過量15 % -35 %的第一或第二同二聚體蛋白，諸如過量20 % -30 %的第一或 第二同二聚體蛋白使用。
[0361] 特別地，步驟a)中的第一和第二同二聚體蛋白可以存在于溶液中，諸如在緩沖液 中。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在溶液中，諸如在緩沖液中實(shí)施步驟a)。特別地，溶液可以是 水溶液。合適的緩沖液可以是支持還原和交換過程，并且未不利影響第一和第二同二聚體 蛋白或異二聚體的緩沖液，例如第一和第二同二聚體蛋白和異二聚體蛋白在其中穩(wěn)定的緩 沖液。步驟a)中使用的緩沖液可以與由于先前的加工步驟而存在第一和/或第二同二聚 體蛋白的緩沖液相同，以使方法操作最少化?；蛘?，它可以是不同緩沖液以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化條件 或最佳的還原。例如，可以已經(jīng)在步驟a)前純化第一和/或第二同二聚體蛋白，并且可以 已經(jīng)在純化過程中改變緩沖液或溶液。
[0362] 用于步驟a)的合適緩沖液的例子包括但不限于PBS (磷酸鹽緩沖鹽水）、 DPBS (Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水）、PBS Braun (實(shí)施例44)、檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖 液、組氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液。此類緩沖液的具體例子包括那些在本發(fā) 明的例子中描述的。如實(shí)施例43中也顯示的，緩沖液的選擇可以影響異二聚體蛋白形成的 動力學(xué)。如此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明的步驟a)中使用Tris或磷酸鹽緩 沖液。步驟a)中使用的緩沖液可以例如是本文中實(shí)施例43中描述的磷酸鹽或Tris緩沖 液，或者它可以是本文中實(shí)施例53中描述的PBS緩沖液。
[0363] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的緩沖液可以包含范圍為Ι-lOOmM的緩沖液，諸如 l-50mM緩沖液或范圍為1-25禮，或范圍為5-20mM。
[0364] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的緩沖液可以包含范圍為1-lOOmM的磷酸鹽，諸如 l-50mM磷酸鹽或范圍為1-25禮，或范圍為5-20mM。
[0365] 步驟a)的還原性條件的pH可以在pH 3-10,諸如pH 4-9的范圍中，或者在pH 4. 5-8. 5的范圍中。如從實(shí)施例43看出的，pH值可以影響異二聚體蛋白形成的動力學(xué)。如 此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，步驟a)中的還原性條件的pH可以在pH 5-8的范圍中，諸如 pH 6-8,或pH 6. 5-7. 5,例如pH特別可以為大約5. 5,或6,或6. 5,或7,或L 5,或L 8或8。
[0366] 合適緩沖液的例子包括實(shí)施例43的那些緩沖液，特別是選自下組的緩沖液：1) lx Dulbecco 氏磷酸鹽緩沖鹽水（DPBS) :8. ImM 磷酸鈉（Na2HP04-7H20)、1. 5mM 磷酸鉀（ΚΗ2Ρ04)、 138mM氯化鈉（NaCl)、2· 7mM氯化鉀（KCl)pH 5· 0 ;2) lx DPBS pH 7· 0 ;3)20mM Tris-HCl, pH 7. 8。
[0367] 在一個(gè)備選實(shí)施方案中，步驟a)中的緩沖液可以選自下組，但不限于：a) lOmM磷 酸鈉、2mM 磷酸鉀、137mM NaCl，pH 5.0;b)10mM 磷酸鈉、2mM 磷酸鉀、137mM NaCl，pH 7.0; c)20mM 檸檬酸鈉 ，pH 4.9;d)20mM 檸檬酸鈉 ，pH 6.0;和 e)20mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH 7· 8。
[0368] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的還原性條件包括還原劑，例如硫氫基還原劑。術(shù) 語"還原劑"和"還原試劑"在本發(fā)明的上下文中可互換使用。通常，步驟a)中的還原性條 件包括添加還原劑，例如硫氫基還原劑。還原劑可以例如選自下組，但不限于：2_巰基乙 胺（2-MEA)、二硫蘇糖醇（DTT)、二硫赤蘚糖醇（DTE)、谷胱甘肽、三（2-羧乙基）膦（TCEP)、 L-半胱氨酸、D-半胱氨酸和β -巰基-乙醇及其化學(xué)衍生物，優(yōu)選選自下組的還原劑：2-巰 基乙胺、二硫蘇糖醇、L-半胱氨酸，D-半胱氨酸和二（2-羧乙基）膦。如此，在一個(gè)實(shí)施 方案中，還原劑可以選自下組：2_巰基乙胺（2-ΜΕΑ)、2-巰基乙胺的化學(xué)衍生物（2-ΜΕΑ)、 L-半胱氨酸、和D-半胱氨酸。更特別地，還原劑是2-巰基乙胺（2-ΜΕΑ)、或L-半胱氨酸、 或D-半胱氨酸。還原劑2-巰基乙胺具有其它化學(xué)名稱，諸如2-ΜΕΑ，和半胱胺，并且此類術(shù) 語在本發(fā)明的上下文中可互換使用。術(shù)語2-ΜΕΑ也用于描述2-巰基乙胺-HC1，其例如在本 發(fā)明的實(shí)施例中使用。
[0369] 步驟a)的還原劑、其濃度和溫育時(shí)間的選擇應(yīng)當(dāng)使得鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵被 還原，并且第一和第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)的交換是可能的。然而，同時(shí)避免使用太嚴(yán)格 的條件，諸如太高的還原劑濃度或太長的溫育時(shí)間可能是有利的，例如因?yàn)樗赡苁遣槐?要的且太嚴(yán)格的條件，可能損害第一和/或第二同二聚體蛋白或異二聚體蛋白。最佳條件 可以受到不同參數(shù)，諸如溫度、pH、溶解氧濃度、同二聚體濃度、緩沖液的選擇、痕量金屬和 螯合劑、和還原劑的選擇和濃度影響。
[0370] 還原劑的合適濃度可以在0. ImM至1M的范圍中。若還原劑是2-MEA，則濃度可 以通常在10-500mM的范圍中，諸如在25-500mM的范圍中，或在40-350mM的范圍中，或在 10-100mM的范圍中，例如在25-100mM的范圍中，或在10-75mM的范圍中，例如在25-75mM 的范圍中，或在10_60mM的范圍中，例如在25-60mM的范圍中，或在10-50mM的范圍中，例如 在25-50mM的范圍中，諸如10mM左右，或25mM左右，或30mM左右，或40mM左右，或50mM左 右。若還原劑是L-半胱氨酸或D-半胱氨酸，則濃度通?？梢栽?0-500mM的范圍中，諸如 在10-400mM的范圍中，或在10-300mM的范圍中，或在10-200mM的范圍中，或在20-150mM的 范圍中，或在20-125mM的范圍中，或在25-100mM的范圍中，諸如25mM左右，或50mM左右， 或75mM左右或100mM左右。
[0371] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)包括溫育至少15分鐘，諸如至少20分鐘或至少30 分鐘，或至少60分鐘或至少90分鐘，諸如15分鐘至10小時(shí)，或15分鐘至6小時(shí)，或15分 鐘至5小時(shí)，或15分鐘至4. 5小時(shí)，或15分鐘至4小時(shí)，或30分鐘至10小時(shí)，或30分鐘 至6小時(shí)，或30分鐘至5小時(shí)，或30分鐘至4. 5小時(shí)，或320分鐘至4小時(shí)，或90分鐘至 10小時(shí)，或90分鐘至6小時(shí)，或90分鐘至5小時(shí)，或90分鐘至4. 5小時(shí)，或90分鐘至4小 時(shí)，諸如2-5小時(shí)，或2-4. 5小時(shí)，或2-4小時(shí)，或3-5小時(shí)，或3-4. 5小時(shí)，或3-4小時(shí)，或 3. 5-5小時(shí)，或3. 5-4. 5小時(shí)，例如約2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)或5小時(shí)。如實(shí)施例45和實(shí)施 例53中顯示的，鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵的還原，和第一和第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)交換以生 成異二聚體蛋白在給定條件下在4小時(shí)內(nèi)完成。
[0372] 步驟a)的最佳溫度可以取決于還原劑的選擇。通常，溫度可以在2_45°C的范圍 中，諸如在2-KTC的范圍中，或在15-45°C的范圍中，或在20-40°C的范圍中，或在20-30°C 的范圍中，或在30-40°C的范圍中，或在22-39°C的范圍中，諸如在21-26°C的范圍中，或在 22-25°C的范圍中，諸如25°C左右或37°C左右。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)包括在存在至少 25mM選自下組的還原劑的情況中于至少20°C的溫度溫育至少30分鐘：2_巰基乙胺、L-半 胱氨酸和D-半胱氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)受控的Fab-臂交換的還原性條件，即第一 和第二同二聚體蛋白的鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵還原及隨后第一和第二同二聚體蛋白的Fc 區(qū)交換就需要的氧化還原電勢而言進(jìn)行描述。三肽谷胱甘肽（GSH)是在細(xì)胞中的主要低 分子量硫醇，并控制硫醇-二硫化物氧化還原狀態(tài)，其為體內(nèi)正常氧化還原信號傳導(dǎo)必需。 通過維持還原型GSH及其氧化形式GSSG的硫醇-至-二硫化物狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞氧化還原 平衡的動力學(xué)?？蓽y量還原電位的數(shù)值，如Rost and Rapoport，Nature201:185(1964)及 Aslund 等，J. Biol. Chem. 272:30780-30786 (1997)中的。將每個(gè) GSSG 氧化兩個(gè) GSH 的化 學(xué)計(jì)量加以考慮的氧化還原電勢Eh為對氧化還原狀態(tài)的定量衡量。通過能斯特方程式計(jì) 算 Eh :(方程 1) : Eh = EQ+ (RT/nF) In ([GSSG (氧化型）]/ [GSH (還原型）]2)。E。是在限定 pH 下氧化還原對的標(biāo)準(zhǔn)電位，R是氣體常數(shù)，T是絕對溫度，F(xiàn)是法拉第常數(shù)，η是轉(zhuǎn)移的電子 數(shù)。GSH/GSSG對的Eh的體內(nèi)估測值在-260至-200mV的范圍中（Aw, T.，News Physiol. Sci. 18:201-204 (2003))。因此終末分化的細(xì)胞維持-200mV等級的Eh，而活躍增殖的細(xì)胞 維持約_260mV的更為還原的Eh。
[0373] DTT 的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢是 _330mV(Cleland 等 Biochemistry 3:480-482(1964))。TCEP已顯示在溶液中還原DTT，因此具有比DTT更負(fù)的氧化還原電位。 然而，精確數(shù)值尚未報(bào)道。因此可以根據(jù)需要的氧化還原電勢E h描述適合于本發(fā)明的步驟 a)的還原條件，所述需要的氧化還原電勢Eh最好低于在體內(nèi)在正常血漿條件下獲得的數(shù) 值，并且高于還原位于鉸鏈區(qū)中且參與鏈間二硫鍵形成或參與輕鏈和重鏈之間的二硫鍵的 抗體二硫鍵外部的抗體二硫鍵的氧化還原電勢。
[0374] 因此，在一個(gè)或又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)在具有范圍低于-50mV，諸如低 于-150mV，優(yōu)選-150和-600mV之間，諸如-200和-500mV之間，更優(yōu)選-250和-450mV之 間，諸如-250和-400mV之間，甚至更優(yōu)選-350至-450mV之間的氧化還原電勢的還原條件 下進(jìn)行。
[0375] 在一個(gè)或又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)包括在至少25mM2-巰基乙胺存在下或者至 少0. 5mM二硫蘇糖醇存在下或至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20°C溫度溫育至 少30分鐘，例如90分鐘。
[0376] 在一個(gè)或又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)包括在至少25mM2-巰基乙胺存在下或者至 少0. 5mM二硫蘇糖醇存在下或至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20°C溫度于5至 8的pH，諸如pH 7. 0或pH 7. 4溫育至少30分鐘，例如90分鐘。
[0377] 在另一個(gè)或又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)包括在至少25mM2-巰基乙胺存在下，或在 至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20°C溫度溫育至少30分鐘，例如90分鐘?？梢?于6至8的pH，諸如pH 7-8實(shí)施溫育。
[0378] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)包括在25-75mM2-巰基乙胺存在下，或在25-100mM L-或D-半胱氨酸存在下在20-30°C溫度溫育4-6小時(shí)。可以于6至8的pH，諸如pH 7-8 實(shí)施溫育。
[0379] 在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)包括在50mM2-巰基乙胺存在下，或在25-100mM L-或D-半胱氨酸存在下在25°C溫度溫育5小時(shí)?？梢杂?至8的pH，諸如pH 7-8實(shí)施溫 育。
[0380] 在一個(gè)或又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)包括添加金屬螯合劑，諸如EDTA、EGTA或檸 檬酸。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)顯示了在本發(fā)明的步驟a)中使用2-MEA作為還原劑時(shí)，步驟a) 中添加或包含EDTA降低此步驟中的2-MEA自身氧化速率，如通過較低的氧化率觀察到的 (參見例如實(shí)施例47和54)。不限于任何理論，這可以是由于步驟a)中存在的金屬離子被 EDTA螯合，然后，這可以降低通過金屬離子進(jìn)行的2-MEA自身氧化。一般地，還原劑的自身 氧化消耗還原劑，導(dǎo)致有效降低的還原劑濃度。如此，通過添加金屬螯合劑，可以提高鉸鏈 區(qū)中鏈間二硫鍵的還原速率和/或?yàn)榱诉€原鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵可以需要更少的還原 齊U。金屬離子可以例如存在于反應(yīng)中使用的溶液或緩沖液中和/或它們可以從用于反應(yīng)的 設(shè)備中浸出。
[0381] 可以在步驟a)中添加或包括的合適金屬螯合劑的例子包括但不限于EDTA、EGTA 和朽1檬酸。
[0382] 金屬螯合劑的濃度取決于步驟a)中組合物中的金屬離子濃度，其可以例如受到 步驟a)中使用的組分影響。然而，EDTA或EGTA的相關(guān)濃度可以在0. OlmM至10mM的范圍 中，諸如在0. ImM至10mM的范圍中，諸如在0. 5mM至5mM的范圍中，或在ImM至5mM的范圍 中，諸如ImM左右，或2mM左右，或3mM左右，或4mM左右或5mM左右。
[0383] 步驟a)中的氧（例如溶解氧）濃度也可以影響鏈間二硫鍵的還原和/或第一和 第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)的交換。如此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的還原性條件包 括降低步驟a)中存在的氧（例如溶解氧）的量，例如溶解于步驟a)的組合物中的氧量。
[0384] 步驟a)中的組合物中的氧存在或氧（例如溶解氧或氧化劑）量可以受到多種 因素影響，諸如不同化合物的存在或可以降低或提高氧氣從空氣轉(zhuǎn)移到溶液中的機(jī)械效 應(yīng)。如此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟a)包括限制混合速率，限制氧噴射，使氧 氣至頂部空間的轉(zhuǎn)移最小化或那些的任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，混合率可以例如是 50-200rpm，諸如75-150rpm，或75-125rpm，例如lOOrpm左右。頂部空間充氣的速率可以例 如在5-25mL/min的范圍中，例如在10-20mL/min的范圍中，例如15mL/min左右。
[0385] 可以用以下等式2測定傳氧速率：
[0386] 0TR = kla X In (D0*_D0) X s，
[0387] 其中：
[0388] 0TR =傳氧速率（mM/hr)
[0389] kla =傳氧系數(shù)（1/小時(shí)）
[0390] D0* =平衡D0濃度（氮?dú)?0%，空氣=100%，氮?dú)?500% )
[0391] D0 =實(shí)際溶解氧濃度
[0392] s =氧溶解度（約 0· 2mM/100% )
[0393] 氧傳遞范圍的最佳范圍取決于還原劑的類型和濃度。
[0394] 在實(shí)施例57中，使用氮?dú)庾鳛闅怏w，并且在交換反應(yīng)前使系統(tǒng)D0恢復(fù)至0%。用 D0* = 0和D0 = 0依照等式2, 0TR = 0mM/hr。此條件導(dǎo)致合適的交換。
[0395] 在實(shí)施例53中，在氣相中使用空氣，因此D0* = 100%。實(shí)施例53(以100RPM攪 動）的kla是0.76/hr。系統(tǒng)的D0從100%的飽和數(shù)值下降到0.2%的穩(wěn)態(tài)數(shù)值。那么，依 照等式2的此條件的傳氧速率是0. 15mM/hr。此條件導(dǎo)致合適的交換。
[0396] 在實(shí)施例55中，在氣相中使用空氣，因此D0* = 100%。實(shí)施例55(以400RPM攪 動）的kla是4. Ο/hr。系統(tǒng)的D0從100%的飽和數(shù)值下降到3%的穩(wěn)態(tài)數(shù)值。那么，依照 等式2的此條件的傳氧速率是0. 78mM/hr。此條件導(dǎo)致不完全還原和異二聚體產(chǎn)物的低轉(zhuǎn) 化。
[0397] 這些結(jié)果證明了在使用50mM2-MEA作為還原劑時(shí)，0-0. 15mM/hr的0TR提供合適的 結(jié)果，而0. 78mM/hr或更高的0TR提供亞最佳的結(jié)果。
[0398] 若使用空氣傳遞氧，則步驟a)中的傳氧系數(shù)（kla)可以小于例如3/小時(shí)，諸如小 于2/小時(shí),或小于1/小時(shí),或小于0. 90/小時(shí),或小于0. 80/小時(shí)，例如小于0. 76/小時(shí)， 諸如0.76/小時(shí)左右。
[0399] 限制或清除步驟a)中的組合物中溶解的氧量的另一種方式包括添加惰性氣體， 諸如氮?dú)庵敛襟Ea)以從組合物中置換氧。
[0400] 如此,在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的還原性條件包括用惰性氣體，例如氮?dú)?置換、消除或替換步驟a)中的組合物中溶解的氧。這可以例如經(jīng)由用氮?dú)膺M(jìn)行頂部空間充 氣和/或用足夠的攪拌噴射實(shí)現(xiàn)。
[0401] 可以通過監(jiān)測氧化還原電勢和/或通過監(jiān)測溶解氧的濃度追蹤第一和第二同二 聚體蛋白的鉸鏈區(qū)中的二硫鍵的還原進(jìn)展。用于此類監(jiān)測的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的，并且包括例如不同類型的探頭，諸如本文中描述或使用的任何探頭。
[0402] 在一個(gè)備選實(shí)施方案中，可以通過使第一和第二異二聚體蛋白在包含還原劑的材 料上通過實(shí)施步驟a)。此類方法的例子可以是包含還原劑的柱，例如包含例如本文中描述 的還原劑的固定化反應(yīng)劑柱，諸如實(shí)施例61中描述的柱。
[0403] 然后可以從所述材料獲得異二聚體蛋白，例如將其從柱中洗脫。通過此方法獲得 的異二聚體蛋白可以不包含或僅包含痕量的還原劑，因?yàn)檫@與材料（例如在柱中）結(jié)合。溫 度、溶解氧的濃度、第一和第二同二聚體蛋白的濃度、氧化還原電勢和pH可以與上文描述 的那些相似。
[0404] 步驟 b)
[0405] 本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括下列步驟：
[0406] b)使從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，該氧化條件足以容許異二聚體蛋白 中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵。
[0407] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟b)包括：
[0408] b)使至少10mL從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，所述氧化條件足以容許異 二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵。
[0409] 步驟a)的還原性條件引起第一和第二同二聚體蛋白的鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵的還 原。除了鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵外，第一和/或第二同二聚體蛋白中也可以有其它二硫鍵， 諸如抗體的重鏈和輕鏈之間的二硫鍵或鏈內(nèi)二硫鍵。步驟a)的還原性條件還可以引起第 一和/或第二同二聚體蛋白中此類其它鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵的還原。
[0410] 在步驟a)中的第一和第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)交換后，若再形成異二聚體蛋白 的第一和第二Fc區(qū)之間的鉸鏈區(qū)中的二硫鍵及任選地其它二硫鍵，則這可以是有利的。由 此導(dǎo)致生成異二聚體蛋白，其至少包含鉸鏈區(qū)中的二硫鍵，以及任選地還有在與第一和/ 或第二同二聚體蛋白中的位置相似的位置處的其它二硫鍵。此類二硫鍵的存在提高異二聚 體蛋白的穩(wěn)定性。
[0411] 實(shí)施例41顯示了在依照本發(fā)明的步驟a)生成的雙特異性抗體的緩沖液更換后， 僅將雙特異性抗體部分再氧化。因此，實(shí)施例41指示所述實(shí)施例中的步驟a)的條件對于 雙特異性抗體的鉸鏈區(qū)中的二硫鍵再氧化不是充分的。此外，實(shí)施例48和實(shí)施例57也顯 示了在通過添加氮?dú)鈱⑵渲脫Q來降低溶解氧濃度時(shí)，抗體中半胱氨酸至二硫鍵的再氧化受 到抑制。為了將半胱氨酸氧化成二硫鍵，兩個(gè)半胱氨酸應(yīng)當(dāng)彼此足夠緊密接近。本發(fā)明的 方法一般導(dǎo)致異二聚體蛋白的天然再裝配。如此，例如通過本方法生成的雙特異性抗體中 的半胱氨酸一般可以定位為在第一和第二抗體（第一和第二同二聚體蛋白）中，使得抗體 中存在的二硫鍵也在雙特異性抗體中形成。在本發(fā)明的上下文中，提及"步驟b)的氧化條 件"意圖指"足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵的氧化條件"。在又一 個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)中的氧化條件足以形成異二聚體蛋白中的所有相關(guān)二硫鍵；例如鏈 間和鏈內(nèi)-硫鍵兩者。
[0412] 在本發(fā)明的上下文中，足以容許將異二聚體蛋白中半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵的 條件意指形成至少80%、諸如至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少99%、或100% 鏈間-硫鍵。如本文中別處描述的，異-聚體蛋白可以包含能夠形成鏈間和鏈內(nèi)-硫鍵兩 者的半胱氨酸殘基。將半胱氨酸氧化成二硫鍵的相關(guān)時(shí)間范圍取決于例如制造條件，并且 通?？梢栽?8小時(shí)內(nèi)，諸如24小時(shí)內(nèi)，或15小時(shí)內(nèi)，或10小時(shí)內(nèi)，或5小時(shí)內(nèi)，或4小時(shí) 內(nèi)，或3小時(shí)內(nèi)，或2小時(shí)內(nèi)。
[0413] 出于產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的目的，在沒有不利影響產(chǎn)物的情況中提高生產(chǎn)速度一般認(rèn)為是一 個(gè)優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例55和56指示提高氧量提高二硫鍵再氧化的速率。這對于較大體積的異二 聚體蛋白的生產(chǎn)可以是特別相關(guān)的。如此，本發(fā)明的方法包括步驟b)使至少10mL從步驟 a)獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，該氧化條件足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈 間-硫鍵。
[0414] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)中使用的從步驟a)獲得的組合物的體積可以是至 少15mL、諸如至少20mL、或至少25mL、或至少30mL、或至少40mL、或至少50mL、或至少75mL、 或至少100mL、或至少125mL、或至少150mL、或至少200mL、或至少250mL、或至少300mL、或 至少350mL、或至少400mL、或至少450mL、或至少500mL、或至少550mL、或至少600mL、或至 少650mL、或至少700mL、或至少750mL、或至少800mL、或至少850mL、或至少900mL、或至少 950mL、或至少1L、或至少2L、或至少3L、或至少4L、或至少5L、或至少10L。原則上，沒有上 限，若過程以連續(xù)過程運(yùn)行，則尤其沒有。然而，對于許多過程條件，適合于此類生產(chǎn)的反應(yīng) 器容器可以為1L至10, 000L的大小。
[0415] 在一個(gè)或又一個(gè)實(shí)施方案中，從步驟a)獲得的組合物中的異二聚體蛋白的濃度 (例如其用于步驟b))可以是至少0· lmg/mL、諸如至少0· 2mg/mL、或至少0· 3mg/mL、或至 少0· 4mg/mL、或至少0· 5mg/mL、或至少0· 75mg/mL、或至少lmg/mL、或至少1. 5mg/mL、或至 少2mg/mL、或至少3mg/mL、或至少4mg/mL、或至少5mg/mL、或至少10mg/mL、或至少15mg/ mL、或至少16mg/mL、或至少20mg/mL。異二聚體蛋白濃度的上限可以是100-200mg/mL，諸如 100mg/mL左右，或150mg/mL左右，或200mg/mL左右。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，從步驟a) 獲得的組合物中的異二聚體蛋白濃度可以在〇. l_200g/L的范圍中，諸如在l-100g/L的范 圍中。本發(fā)明不限于異二聚體蛋白的特定濃度，然而，在蛋白質(zhì)的濃度（無論它是第一或第 二同二聚體蛋白還是異二聚體蛋白）太高時(shí)，組合物可能變得不穩(wěn)定或者太粘，使得難以 一起運(yùn)行和/或可形成蛋白質(zhì)聚集體。比較而言，太低的異二聚體蛋白濃度可能不是經(jīng)濟(jì) 上可行的。
[0416] 獲得足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵的氧化條件必需的 氧量（例如通過將其在步驟b)中供應(yīng)）取決于不同因素。此類因素包括例如從步驟a) 獲得的組合物的體積、異二聚體蛋白的濃度、需要氧化的二硫鍵數(shù)目和從步驟a)獲得的組 合物中的氧濃度，其可以取決于例如緩沖液中的氧溶解度，該氧溶解度可以取決于特定的 溶液或緩沖液、pH、離子強(qiáng)度、溫度、壓力和周圍氧濃度。使從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受本 發(fā)明的步驟b)的氧化條件可以提高將異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵的速 率。一般地，步驟b)中對于將異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵足夠或必需的 氧量可以是或者大約是每摩爾二硫鍵〇. 5摩爾氧氣（02)，例如在每摩爾二硫鍵0. 25-0. 75 摩爾氧氣（〇2)，諸如每摩爾二硫鍵〇. 3-0. 7摩爾氧氣（02)的范圍中。這對應(yīng)于每2摩爾半 胱氨酸1摩爾氧氣（〇2)，諸如在每2摩爾半胱氨酸0.6-1. 4摩爾氧氣（02)的范圍中。如此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)中的"氧化條件"包括每摩爾二硫鍵0. 3-0. 7摩爾氧氣，諸如每 摩爾二硫鍵存在0. 5摩爾氧氣，或在每2摩爾半胱氨酸0. 6-1. 4摩爾氧氣的范圍中，例如每 2摩爾半胱氨酸1摩爾氧氣。
[0417] 因此，獲得氧氣與二硫鍵或半胱氨酸的此類比率的相關(guān)氧濃度取決于從步驟a) 獲得的組合物中的異二聚體蛋白的濃度。
[0418] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)中的氧化條件可以包括至少0. 05mM氧氣、諸如至 少0. 075mM氧氣、或至少0. ImM氧氣、或至少0. 125mM氧氣、或至少0. 15mM氧氣、或至少 0. 175mM氧氣、或至少0. 2mM氧氣的濃度。
[0419] 氧氣的分子溶解度在海水中于latm，25°C是0· 206mM。然而，在本方法的條件（例 如緩沖液，溫度等），從步驟a)獲得的組合物中的氧濃度可以小于0. 2mM。
[0420] 由于氧溶解度依賴于氣相中氧氣的部分壓力，增加的氧傳遞可以通過提高系統(tǒng)中 的空氣壓力獲得。例如，壓力升高2倍導(dǎo)致平衡溶解氧濃度的2倍增加和增加的傳氧速率。 或者，氣相中的氧氣的部分壓力可以通過使用氧氣代替空氣提高。由于空氣含有約21%氧 氣，純氧氣的使用提供高約5倍的平衡溶解氧濃度和增加的傳氧速率?？梢越M合壓力和純 氧氣以進(jìn)一步提高氧溶解度和傳遞率。
[0421] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)中的氧化條件包括用氧氣飽和從步驟a)獲得的組合 物。
[0422] 從步驟a)獲得的組合物一般包含少量的氧，以確保鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵的正 確還原。如此，可能有必要在本發(fā)明的方法的步驟b)中供應(yīng)氧氣。
[0423] 在一個(gè)實(shí)施方案中，如上文描述的，第一和第二同二聚體蛋白可以存在于溶液，諸 如緩沖液中。如此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，從步驟a)獲得的組合物可以是溶液，例如緩 沖液。在此實(shí)施方案中，它是溶解于溶液中的氧量，即溶解氧濃度，其對于異二聚體蛋白中 半胱氨酸的氧化是重要的。
[0424] 如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，"步驟b)的氧化條件"指控制溶解氧的水平，其可以例如 包括增加從步驟a)獲得的組合物中的溶解氧的量或濃度。
[0425] 用于獲得或產(chǎn)生步驟b)的氧化條件的不同手段可以在本發(fā)明的方法中使用，并 且包括但不限于本文中描述的那些手段。
[0426] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟b)的氧化條件包括添加氧氣。術(shù)語"添加氧氣" 在本發(fā)明的上下文中應(yīng)當(dāng)理解為在從步驟a)獲得的組合物中提高氧量，例如溶解氧，使得 它足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵。添加氧氣的手段或方法包括但 不限于機(jī)械手段、將從步驟a)獲得的組合的溶液或緩沖液改變?yōu)榘^高氧量的溶液或 緩沖液，諸如用于本文中描述的滲濾的緩沖液之一，用包含足夠氧的溶液或緩沖液稀釋從 步驟a)獲得的組合物的溶液或緩沖液，添加能夠生成氧氣的化合物，提高壓力或者通過直 接添加或包括氧，例如氧氣。也可以使用此類方法的組合。
[0427] 可以例如連續(xù)測量步驟b)中氧的量或濃度，從而確保步驟b)期間的所有時(shí)間有 足夠的氧。用于測量氧的方法或設(shè)備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可以例如包括本文中 描述的那些方法或設(shè)備中的任一種，諸如實(shí)施例44中描述的探頭。
[0428] 例如通過用氧氣或空氣噴射或提高壓力對步驟b)添加氧氣。另一種方法可以是 提高提高氧氣從環(huán)境（例如空氣）的傳遞。這可以例如通過機(jī)械手段，例如通過攪拌、攪 動、提高壓力或產(chǎn)生流進(jìn)行。例如，若步驟b)中的組合物存在于容器（諸如器皿）中，例 如，可以將氧氣從例如頂部空間傳遞到步驟b)的組合物中，或者可以應(yīng)用用于攪動或攪拌 步驟b)的組合物的手段。通過控制攪動或攪拌步驟b)中的組合物的速率，可以控制自環(huán) 境中的傳氧率，即攪動或攪拌速率或流動越高，可以對從步驟a)獲得的組合物中傳遞越多 的氧。也可以應(yīng)用用于提高壓力的手段。對步驟b)添加氧氣也可以通過不同手段的組合 實(shí)施，例如，攪動和/或攪拌可以與噴射和/或用氧氣或空氣提高步驟b)中的組合物的壓 力組合。
[0429] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟b)中的氧化條件包括氧化劑。優(yōu)選地，氧化 劑是能夠確保異二聚體蛋白中鏈間二硫鍵的氧化，但是同時(shí)避免氧化異二聚體蛋白中已知 對氧化敏感的其它部分，諸如如甲硫氨酸和色氨酸等氨基酸的氧化劑。合適的氧化劑的例 子是脫氫抗壞血酸（dhAA)。若使用dhAA氧化步驟a)中存在的還原劑，則dhAA的典型濃度 可以在還原劑濃度的1-2倍的范圍中，例如在50-100mM的范圍中。若在添加 dhAA前除去 步驟a)中存在的還原劑，則足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵的氧 化劑量可以較低，諸如在〇. 01-lmM，例如0. 1-lmM的范圍中。若在本發(fā)明的步驟b)中添加 氧化劑，諸如dhAA，則隨后可以使用標(biāo)準(zhǔn)過濾和/或?qū)游黾夹g(shù)將其除去。
[0430] 可以組合使用用于在步驟b)中添加或增加氧的不同手段或方法。
[0431] 例如，不依賴于例如如何通過用氧氣噴射、攪拌、攪動或產(chǎn)生流添加氧氣，在一個(gè) 實(shí)施方案中，它可以與添加氧化劑組合。
[0432] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)的還原性條件包含還原劑，其也可以存在于 從步驟a)獲得的組合物中，因此經(jīng)受步驟b)的氧化條件。步驟b)中的還原劑存在對于步 驟b)的氧化條件可以是有害的。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將異二聚體蛋白與還原劑 分開。如下文描述的，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了用于將還原劑與異二聚體蛋白分開的某 些方法導(dǎo)致或產(chǎn)生足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵的氧化條件。
[0433] 根據(jù)方法，除去還原劑或?qū)惗垠w蛋白與還原劑分開可能不一定足以容許將異 二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵，在步驟a)中生成大量異二聚體蛋白，即高濃 度和/或高體積的異二聚體蛋白時(shí)，尤其不行（參見例如實(shí)施例41、52和53)。然而，出于 其它原因可能有利的是，將異二聚體蛋白與還原劑分開，并且因此，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一 步包括將異二聚體蛋白與還原劑分開的步驟。下文進(jìn)一步描述將還原劑與異二聚體蛋白分 開的實(shí)施方案。
[0434] 用于減少從步驟a)獲得的組合物中的還原劑量的另一種方法是增加所述組合物 的體積，由此降低從步驟a)獲得的組合物中還原劑的濃度。因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，可 以例如通過添加與從步驟a)獲得的組合物的緩沖液相同的緩沖液（只是它不含步驟a)的 還原劑）或者通過添加與從步驟a)獲得的組合物的緩沖液不同的緩沖劑（它不含步驟a) 的還原劑）增加從步驟a)獲得的組合物的體積。增加從步驟a)獲得的組合物的體積可以 與本文中描述的其它實(shí)施方案（包括用于分開還原劑和異二聚體蛋白的方法）組合使用。
[0435] 如上文描述的那樣對步驟b)中的組合物添加氧氣和/或氧化劑可以足以容許將 異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵。此外，若步驟a)包括還原劑，則這些條件 也足以氧化還原劑，從而其不能進(jìn)一步還原異二聚體蛋白的鏈間二硫鍵。如此，在又一個(gè)實(shí) 施方案中，步驟b)的氧化條件足以容許氧化步驟a)的還原劑。例如，若在步驟a)中使用 2-MEA作為還原劑，則步驟b)的氧化條件可以使得2-MEA自身氧化，從而它不能還原任何二 硫鍵（參見例如實(shí)施例59)。不依賴于還原劑被氧化與否，隨后將異二聚體蛋白與還原劑分 開可以是相關(guān)的。因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還可以包括分開異二聚體蛋白 和還原劑。用于將異二聚體蛋白與還原劑分開的方法包括本文（例如下文）中描述的那些 方法中的任一種。異二聚體蛋白和還原劑的分開可以是步驟b)的一部分或者可以是一個(gè) 分開的步驟。
[0436] 如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)包括添加氧氣或氧化劑，任選地隨后分開異二 聚體蛋白與還原劑。也可以在步驟b)后以分開的步驟實(shí)施分開異二聚體蛋白與還原劑。
[0437] 在步驟b)中添加氧氣和/或氧化劑也可以導(dǎo)致還原劑的氧化，而沒有將異二聚體 蛋白中的半胱氨酸完全氧化成二硫鍵。在此情況中，可以將異二聚體蛋白與還原劑分開，然 后隨后可以將異二聚體蛋白的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵，這通過例如如上文描述的，添 加氧氣和/或氧化劑進(jìn)行。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)可以包括使從步驟a)獲得的 組合物經(jīng)受足以氧化還原劑的氧化條件，分開異二聚體蛋白與還原劑，并使異二聚體蛋白 經(jīng)受足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵的條件。例如，可以與上文所 述類似地通過添加氧氣和/或氧化劑進(jìn)行或?qū)嵤┻€原劑和異二聚體蛋白中的半胱氨酸至 鏈間二硫鍵的氧化。然而，就用于還原劑氧化和異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化成鏈間二 硫鍵的需要的氧量、溫育時(shí)間等而言，可以有一些差異。用于分開異二聚體蛋白與還原劑的 方法包括但不限于下文描述的任何方法，例如透析、沉淀、層析或過濾。因此，在一個(gè)實(shí)施方 案中，步驟b)可以包括使從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受層析，例如柱層析，或過濾，例如滲 濾，諸如切向流過濾或正常流過濾。用于實(shí)施層析或過濾的方法包括但不限于下文描述的 任何方法。
[0438] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)的氧化條件可以使得與分開異二聚體蛋白和還原 劑同時(shí)將異二聚體蛋白的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵。在此情況中，本發(fā)明的步驟b)可以 包括與分開異二聚體蛋白和還原劑同時(shí)添加氧氣和/或氧化劑，如上文描述的。因此，在一 個(gè)實(shí)施方案中，用于分開異二聚體蛋白與還原劑的方法或條件可以導(dǎo)致或容許將異二聚體 蛋白中的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)可以包括分開異 二聚體蛋白和還原劑。用于分開異二聚體蛋白與還原劑的方法包括但不限于下文描述的任 何方法，例如透析、沉淀、層析或過濾。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)可以包括使從步驟 a)獲得的組合物經(jīng)受層析，例如柱層析，或過濾，例如滲濾，諸如切向流過濾或正常流過濾。 用于實(shí)施層析或過濾的方法包括但不限于下文描述的任何方法。
[0439] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包括分開異二聚體蛋白與還原劑，隨后 使異二聚體蛋白經(jīng)受足以容許在異二聚體蛋白中將半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵的氧化條 件。在此實(shí)施方案中，分開異二聚體蛋白與還原劑的步驟可以視為步驟b)前的分開的步驟 或者其可以視為步驟b)的一部分。用于分開異二聚體蛋白與還原劑的方法包括但不限于 下文描述的任何方法，例如透析、沉淀、層析或過濾?？梢匀缟衔拿枋龅哪菢荧@得足以容許 在異二聚體蛋白中將半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵的氧化條件，通過例如對包含異二聚體蛋 白的組合物添加氧氣和/或氧化劑進(jìn)行。
[0440] 用于分開異二聚體蛋白與還原劑的方法在原則上可以是任何導(dǎo)致或能夠分開兩 者而不損害異二聚體蛋白的方法。此類方法包括但不限于透析、沉淀、層析或過濾。分開異 二聚體蛋白和還原劑可以作為連續(xù)過程實(shí)施或者其可以作為分批過程實(shí)施。
[0441] 包含異二聚體蛋白的從步驟a)獲得的組合物可以特別是溶液，諸如緩沖液。可以 通過用沒有還原劑的另一種緩沖液或溶液更換從步驟a)獲得的組合物的緩沖液或溶液完 成異二聚體蛋白與還原劑的分開。除非存在還原劑，可以將緩沖液或溶液更換為與從步驟 a)獲得的組合物相同的緩沖液或溶液，或者可以將其更換為另一種緩沖液或溶液，諸如適 合于隨后的步驟或異二聚體蛋白的最終配制劑的緩沖液或溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，將從 步驟a)獲得的組合物的溶液或緩沖液更換的溶液或緩沖液也可以包含氧，例如溶解氧，或 氧化劑。因此，在步驟b)中更換或稀釋從步驟a)獲得的組合物的溶液或緩沖液可以產(chǎn)生 "足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化為鏈間二硫鍵的氧化條件"。如上文描述的，步 驟b)的氧化條件可以通過不同手段獲得；例如添加氧氣或氧化劑，通過除去還原劑（分開 異二聚體蛋白和還原劑）、機(jī)械手段，例如層析或過濾方法，和/或通過將從步驟a)獲得的 組合物的緩沖液或溶液更換成包含較高的氧量或氧化劑的緩沖液或溶液。"較高的氧量"在 此上下文中應(yīng)當(dāng)理解為與從步驟a)獲得的組合物的緩沖液或溶液中存在的氧量相比。從 步驟a)獲得的組合物的緩沖液或溶液的更換可以例如通過層析或過濾實(shí)施。如此，在一個(gè) 實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通過層析或過濾更換從步驟a)獲得的組合物的溶液（例如 緩沖液）的步驟。
[0442] 從步驟a)獲得的組合物的溶液或緩沖液的更換可以例如用至少3 (三）個(gè)體積的 沒有還原劑的緩沖液或溶液完成。原則上，可以更換的體積數(shù)沒有上限，但是對于大多數(shù) 實(shí)際目的，可以更換3-12個(gè)體積的緩沖液或溶液，諸如范圍為4-11個(gè)體積，或范圍為4-10 個(gè)體積，或范圍為5-10個(gè)體積，例如5,6, 7,8,9或10個(gè)體積可以足以充分降低還原劑的濃 度，或者從從步驟a)獲得的組合物除去還原劑。
[0443] 通過層析或過濾分開異二聚體蛋白和還原劑可以牽涉溶液或緩沖液的更換，SP如 上文描述的緩沖液或溶液更換。
[0444] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于分開異二聚體蛋白和還原劑的層析方法的合適例 子可以是基于結(jié)合和洗脫的層析方法。術(shù)語"結(jié)合和洗脫"基于還原劑或異二聚體蛋白對 層析材料的結(jié)合，而其它組分不結(jié)合?？梢栽诹鬟^和清洗步驟中收集不結(jié)合層析材料的組 分，而可以在改變緩沖液條件后分開收集結(jié)合的材料，從而從柱中洗脫組分。存在不同層析 方法，并且最合適的方法取決于還原劑的選擇和異二聚體蛋白。合適的例子包括但不限于 蛋白A和蛋白G層析（或親和層析的其它方式）、基于例如抗原結(jié)合或抗獨(dú)特型抗體的親和 層析、kappa或lambda選擇、陽離子交換層析、混合模式層析（例如羥磷灰石）、離子交換、 疏水性相互作用、固定化金屬親和層析和親硫性吸附層析。
[0445] 在一個(gè)實(shí)施方案中，層析可以是柱層析。如上文描述的，層析可以牽涉用沒有還原 劑的另一種緩沖液或溶液更換從步驟a)獲得的組合物的緩沖液或溶液。這可以例如牽涉 范圍3-12個(gè)體積的緩沖液或溶液更換。層析方法經(jīng)常以分批過程實(shí)施，如此若通過層析分 開異二聚體蛋白和還原劑，則它在一個(gè)實(shí)施方案中可以以分批過程實(shí)施。
[0446] 如上文描述的，也可以通過過濾分開異二聚體蛋白和還原劑。過濾方法的合適例 子是滲濾。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了滲濾的條件可以足以容許異二聚體蛋白中的半胱氨 酸氧化為鏈間二硫鍵，即使在使用大體積的從步驟a)獲得的組合物時(shí)（參見例如實(shí)施例 41)。如此，可以與將異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵同時(shí)進(jìn)行通過滲濾分開 異二聚體蛋白和還原劑。如此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟b)可以包括從步 驟a)獲得的組合物的滲濾。滲濾可以牽涉至少三個(gè)體積的緩沖液或溶液更換，如上文描述 的。滲濾的方法包括切向流過濾（TFF)和正常流過濾（NFF)，兩者都可以用于本發(fā)明的方 法。TFF和NFF兩者可以作為連續(xù)過程或作為分批過程實(shí)施。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明的步驟b)包括使從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受下列方法之一：連續(xù)TFF、分批TFF、連續(xù) NFF或分批NFF。
[0447] 不同的滲濾方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。出于本發(fā)明的目的，例如可以用具有 范圍為10-50kDa，例如20-40kDa，諸如30kDa左右的截留值的膜實(shí)施滲濾。膜可以例如由 材料諸如聚醚砜（PES)、改良型聚醚砜（mPES)、再生纖維素（RC)、三乙酸纖維素（CTA)、親水 化聚偏氟乙烯（PVDF)、硝酸纖維素或尼龍制成。膜的構(gòu)造可以例如是中空纖維、平片材或螺 旋纏繞的（spirally wound)。
[0448] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用中空筒，諸如纖維筒進(jìn)行滲濾。中空筒的表面積影 響滲濾率，即表面積越大，滲濾率越高。滲濾率可以例如以L/小時(shí)測量。表面積可以在 0. 05-lm2的范圍中，例如在0. 05-0. 5m2的范圍中，諸如0. lm2左右，或0. 16m2左右或0. 4m2 左右。
[0449] 筒入口壓力可以在10-40psig(70_280kPa)的范圍中，優(yōu)選在 20-30psig(140-210kPa)的范圍中。
[0450] 術(shù)語"psig"指高于大氣壓的每平方英寸的磅數(shù)，并且與單位Pa (帕斯卡）的關(guān)聯(lián) 是 101，325Pa = 14. 7psig。
[0451] 術(shù)語"PSI"指每平方英寸的磅數(shù)。
[0452] 可以將滲濾實(shí)施一段時(shí)間，該時(shí)間段對于實(shí)施相關(guān)數(shù)目的體積的緩沖液/溶液更 換是必需的。合適的時(shí)間段取決于例如膜的表面積、膜的類型、異二聚體蛋白的濃度、系統(tǒng) 壓力、循環(huán)速率、濾器筒的幾何學(xué)、溫度、溶液的粘性、要過濾的體積、滲濾過程中由溶液引 起的濾器污垢量。通常，可以將滲濾實(shí)施30分鐘至20小時(shí)。
[0453] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過使所述組合物循環(huán)通過中空纖維筒實(shí)施所述滲濾， 直到發(fā)生了 1至7個(gè)，諸如3至7個(gè)，或5至7個(gè)或7個(gè)體積的緩沖液更換，所述中空纖維筒 包含范圍為10_50kDa的截留值，且具有范圍為0. 05-lm2的表面積，具有范圍為70-280kPa 的筒入口壓力。
[0454] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過使所述組合物循環(huán)通過30kDa改良型聚醚砜中空纖 維筒實(shí)施所述滲濾，直至發(fā)生了 5至7,諸如七（7)個(gè)體積的緩沖液更換，所述30kDa改良型 聚醚砜中空纖維筒具有0. lm2的表面積及25PSI (170kPa)的筒入口壓力，導(dǎo)致25mL/min的 滲透率。
[0455] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過使所述組合物循環(huán)通過30kDa改良型聚醚砜中空纖 維筒實(shí)施所述滲濾，直至發(fā)生了 5至7,諸如七（7)個(gè)體積的緩沖液更換，所述30kDa改良 型聚醚砜中空纖維筒具有0. 4m2的表面積及25PSI (170kPa)的筒入口壓力，導(dǎo)致100mL/min 的滲透率。
[0456] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過使所述組合物循環(huán)通過30kDa改良型聚醚砜中空纖 維筒實(shí)施所述滲濾，直至發(fā)生了 5至7,諸如七（7)個(gè)體積的緩沖液更換，所述30kDa改良型 聚醚砜中空纖維筒具有0. 16m2的表面積及25PSI (170kPa)的筒入口壓力，導(dǎo)致lOOmL/min 的滲透率。
[0457] 以連續(xù)過程實(shí)施過濾一般包括以與除去滲透物相同的速率對系統(tǒng)添加緩沖液或 溶液，由此使系統(tǒng)中溶液/緩沖液的量保持恒定。如此，在本發(fā)明的上下文中，這會意味著 在步驟b)中，以與除去滲透物相同的速率對從步驟a)獲得的組合物添加緩沖液/溶液?？?以從保留物中收集異二聚體蛋白。另一方面，在本發(fā)明的方法中以分批過程實(shí)施層析或過 濾通?？梢誀可鏉饪s從步驟a)獲得的組合物中存在的異二聚體蛋白，而除去從步驟a)獲 得的組合物的溶液?；蛘?，可以將包含異二聚體蛋白的從步驟a)獲得的組合物稀釋，隨后 通過層析或過濾濃縮。若將該過程實(shí)施超過一次，則隨后可以將濃縮的異二聚體蛋白在緩 沖液或溶液中再次稀釋，之后重復(fù)層析或過濾步驟。
[0458] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在分開還原劑和異二聚體蛋白前稀釋從步驟a)獲得的 組合物。
[0459] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將通過層析或過濾，例如滲濾分開異二聚體蛋白和還原 劑實(shí)施一次。
[0460] 在一些實(shí)施方案中，可以將通過層析或過濾分開異二聚體蛋白和還原劑重復(fù)兩次 或更多次，例如以之間的不同步驟。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包括步驟 1)-111)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟b)可以包括步驟D-III):
[0461] I)分開從步驟a)獲得的組合物的異二聚體蛋白和還原劑，
[0462] II)溫育包含異二聚體蛋白的自步驟I)獲得的組合物，
[0463] III)分開自步驟II)獲得的組合物的異二聚體蛋白和還原劑。
[0464] 異二聚體蛋白和還原劑的分開在步驟I)中可能不是完全的，從而自步驟I)獲得 的包含異二聚體蛋白的組合物仍然可以包含還原劑。
[0465] 可以通過本文中描述（諸如上文描述）的方法實(shí)施分開步驟I)中的異二聚體蛋 白和還原劑。特別地，它可以通過滲濾實(shí)施。上文描述的層析和過濾的條件也適用于步驟 I)和III)?？梢詫⒉襟EII)中溫育自步驟I)獲得的異二聚體蛋白于范圍為10-45°c，例如 范圍為15-40°C，或范圍為15-35°C，或范圍為20-40°C，或范圍為20-35°C的溫度進(jìn)行例如1 小時(shí)至10天的時(shí)段，或1小時(shí)至5天，或1小時(shí)至3天，或1小時(shí)至48小時(shí)，諸如5-24小 時(shí)，或8-18小時(shí)的時(shí)段。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以將步驟II)中溫育自步驟I)獲得的異 二聚體蛋白于范圍為15_40°C的溫度實(shí)施1至24小時(shí)的時(shí)段。
[0466] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟I)可以包括從步驟a)獲得的組合物的滲濾。如此，在 又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟I)、II)和III)可以包括：
[0467] I)滲濾從步驟a)獲得的組合物
[0468] II)溫育自步驟I)獲得的滲余物
[0469] III)滲濾自步驟II)獲得的組合物。
[0470] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟I)和/或III)中的滲濾可以包括緩沖液更換，諸如范 圍為3-12個(gè)體積的緩沖液更換。
[0471] 在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟II)包括在范圍為15_35°C的溫度溫育12-48小時(shí) 的時(shí)段。
[0472] 如實(shí)施例45中顯示的，對于一些條件（例如取決于步驟a)的還原性條件）可以 重復(fù)異二聚體蛋白和還原劑的分開，這有助于確保異二聚體蛋白中的半胱氨酸完全再氧化 成鏈間二硫鍵和/或使包含異二聚體蛋白的組合物中的還原劑量進(jìn)一步最小化。
[0473] 此外，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 EDTA(-種金屬螯合劑）的存在（參見實(shí)施例 49)導(dǎo)致同二聚體蛋白中半胱氨酸至鏈間二硫鍵的氧化率降低，其中同二聚體蛋白用作異 二聚體蛋白的例子。對異二聚體蛋白看到類似的觀察結(jié)果（實(shí)施例54)。這指示步驟b)中 的存在金屬離子，至少與不存在金屬離子的情況相比，提高異二聚體蛋白中半胱氨酸至鏈 間二硫鍵的氧化率。如此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)，例如步驟b)中的氧化條件可以包 含金屬離子。可以在步驟b)中將金屬離子添加至從步驟a)獲得的組合物，或者它可以存在 于從步驟a)獲得的組合物中，例如通過選擇步驟a)中的緩沖液或溶液。因此，在一個(gè)實(shí)施 方案中，步驟b)中的氧化條件包括添加金屬離子。即使金屬離子已經(jīng)存在于從步驟a)獲 得的組合物中，進(jìn)一步的金屬離子可以添加或在步驟b)期間添加，尤其若金屬離子的濃度 如此之低，以致于它可能限制異二聚體蛋白中的半胱氨酸至鏈間二硫鍵的氧化速率，或若 存在金屬螯合劑。特別地，合適的金屬離子的例子是二價(jià)過渡金屬離子，諸如銅，例如以硫 酸銅形式，猛、鐵、鎳、鎂和鈷。適當(dāng)?shù)?，金屬離子可以以范圍為0. 〇l-l〇〇ppm,或0. 1-100 μ Μ 的濃度存在或者添加?？梢詫~以例如硫酸銅添加至步驟b)。
[0474] 若金屬螯合劑存在于方法的步驟a)中，則特別可以添加二價(jià)過渡金屬，例如銅 (例如為硫酸銅形式）的添加。硫酸銅可以發(fā)揮用氧進(jìn)行氧化的催化劑的功能。
[0475] 本發(fā)明的發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了步驟b)中的氧化還原電勢特別影響異二聚體蛋白 中半胱氨酸至鏈間二硫鍵的再氧化的速率，而且還在一定程度上影響產(chǎn)率。本發(fā)明的發(fā)明 人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了重鏈間的鏈間二硫鍵的再氧化在約-350mV開始，而重鏈和輕鏈之間的鏈間 鍵的再氧化在約_280mV開始。異二聚體蛋白中所有二硫鍵的完全形成一般在氧化還原電 勢高于_50mV時(shí)發(fā)生，而對于最佳的過程魯棒性（robustness)，氧化還原電勢應(yīng)當(dāng)優(yōu)選是 至少50mV。因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)中的氧化還原電勢可以高于-300mV，諸如 高于-280mV，或高于-75mV，或高于-50mV、或高于OmV、或高于25mV、或高于50mV。為了將 異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化成二硫鍵，其是相關(guān)的氧化還原電勢的下限。步驟b)中氧 化還原電勢的上限可以是100-300mV左右，例如100-200mV，諸如100mV左右、或200mV左 右或250mV左右、或300mV左右。因此，步驟b)的氧化還原電勢可以在-300mV至300mV、 或-300mV至200mV的范圍中、或在-280mV至300mV、或-280mV至200mV的范圍中、或 在-75mV 至 300mV、或-75mV 至 200mV 的范圍中、或在-50mV 至 300mV、或-50mV 至 200mV 的 范圍中、或在OmV至300mV、或OmV至200mV的范圍中、或在25mV至300mV、或25mV至200mV 的范圍中，或在50mV至300mV、或50mV至200mV的范圍中。
[0476] 此外，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在從步驟a)獲得的組合物為溶液的實(shí)施方案 中，步驟b)中的pH也影響異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化成二硫鍵。因此，在又一個(gè)實(shí) 施方案中，步驟b)中的pH在一個(gè)具體的實(shí)施方案中可以在pH 6-8. 5的范圍中，諸如pH 6. 5-8的范圍，或在pH 6. 5-8. 5的范圍中，或在pH 6-8的范圍中，或pH 6. 5-7. 5的范圍，或 pH 7-7. 5的范圍，例如pH 7. 4左右。
[0477] 確保步驟b)中的組合物的pH在某些范圍內(nèi)，例如pH 6-8. 5可以例如通過選擇具 有合適pH的步驟a)中的溶液或緩沖液，或者通過對步驟b)中的組合物添加能夠調(diào)節(jié)pH 的組分，例如濃縮的pH調(diào)節(jié)溶液來進(jìn)行。確保步驟b)中的組合物的pH在特定范圍內(nèi)也可 以通過使用包含緩沖液更換的上文描述的方法之一進(jìn)行，從而更換的緩沖液或溶液包含相 關(guān)范圍內(nèi)的pH。
[0478] 步驟b)中的緩沖液或溶液（例如用其改變從步驟a)獲得的組合物，例如通過滲 濾）可以包括但不限于本文中描述的任何緩沖液或溶液，諸如實(shí)施例中描述的任何緩沖液 或溶液。此類緩沖液的例子包括例如PBS (磷酸鹽緩沖鹽水），PBS，pH 7. 4。
[0479] 可以通過監(jiān)測氧化還原電勢和/或通過監(jiān)測溶解氧濃度追蹤第一和第二同二聚 體蛋白的鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵的還原的進(jìn)展。用于此類監(jiān)測的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的，并且包括例如使用不同類型的探頭，例如實(shí)施例44中描述的探頭之一。
[0480] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生抗體產(chǎn)物，其中超過80%，諸如超過90%、 例如超過95%、諸如超過99%抗體分子是期望的雙特異性抗體。
[0481] 與基于共表達(dá)的方法相比，本文中描述的后生產(chǎn)（post-production)方法更靈活 且更容易控制。
[0482] 鈍化
[0483] 雖然本發(fā)明的方法經(jīng)常產(chǎn)生較高的異二聚體蛋白產(chǎn)率，但是殘留量的第一和/或 第二同二聚體蛋白也存在于通過本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)物或組合物中。
[0484] 此外，通過本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)物還可以包含方法過程中存在的還原劑和/或 其它組分諸如緩沖液或鹽。在某些情況中，可以優(yōu)選除去此類組分，從而它們不存在于終產(chǎn) 物中。
[0485] 如上文描述的，在一些實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明的步驟b)中除去還原劑、緩沖 液組分、或鹽。這些組分的除去可以作為本方法的分開的方法實(shí)施或者與還原劑的除去同 時(shí)實(shí)施，例如通過上文描述的任何方法，諸如牽涉從步驟a)獲得的組合物的緩沖液更換的 任何方法進(jìn)行。
[0486] 因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括異二聚體蛋白的純化 步驟。異二聚體蛋白的純化可以視為步驟c)獲得異二聚體蛋白。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中， 步驟c)包括使自步驟b)獲得的組合物經(jīng)受純化方法。
[0487] 合適的純化方法的例子包括但不限于選自下組的方法：蛋白A和蛋白G層析（或 親和層析的其它方式）、基于例如抗原結(jié)合或抗獨(dú)特型抗體的親和層析、離子交換、疏水性 相互作用層析、kappa或lambda選擇、硫親和力、混合模式層析（例如輕磷灰石）、固定化金 屬親和層析和親硫性吸附層析。其它純化方法包括但不限于用例如鹽或聚乙二醇沉淀以獲 得純化的蛋白質(zhì)。還涵蓋不同純化方法的組合。
[0488] 使異二聚體蛋白經(jīng)受純化步驟，或純化方法指異二聚體蛋白的任何種類的純化； 諸如分開異二聚體蛋白與殘留量的第一和/或第二同二聚體蛋白，或分開異二聚體蛋白與 其它組分，例如還原劑、鹽或緩沖液或其它產(chǎn)物或方法相關(guān)雜質(zhì)。
[0489] 自殘留量的第一和/或第二同二聚體蛋白純化或分開異二聚體蛋白可以由于異 二聚體蛋白非常類似于第一和第二同二聚體蛋白而變得復(fù)雜。如此，異二聚體蛋白與殘留 量的第一和/或第二同二聚體蛋白的分開可以比異二聚體蛋白與存在的其它組分，例如還 原劑、緩沖劑或鹽的分開更困難。
[0490] 如本文中別處描述的，可以實(shí)施本發(fā)明的方法，從而相對于異二聚體蛋白的形成， 第一或第二同二聚體蛋白的量是有限的。此類方法的一個(gè)例子稱為操縱非等摩爾交換方 法（SNEEP)。如此，第一或第二同二聚體蛋白在步驟a)中可以超過另一種同二聚體蛋白存 在。特別地，可以通過相對于另一種包含過量或有限量的一種同二聚體蛋白調(diào)節(jié)步驟a)中 第一和第二同二聚體蛋白的比率，從而導(dǎo)致有限的同二聚體蛋白在步驟a)中完全使用。這 導(dǎo)致生成組合物，即從步驟a)獲得的組合物，其包含異二聚體蛋白及殘留量的僅第一和第 二同二聚體蛋白之一，而不是第一和第二同二聚體蛋白兩者。隨后從殘留同二聚體蛋白純 化異二聚體蛋白由此變得更簡單，因?yàn)楫惗垠w蛋白僅必須與第一或第二同二聚體蛋白而 不是它們兩者分開。
[0491] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一同二聚體蛋白在步驟a)中超過第二同二聚體蛋白 存在，或反之亦然。特別地，第一與第二同二聚體蛋白的比率可以是如本文中描述的。
[0492] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，用過量的第一或第二同二聚體蛋白實(shí)施方法與等度洗脫的 純化步驟組合。
[0493] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用過量的第一或第二同二聚體蛋白實(shí)施方法與純化步驟組 合，所述純化步驟基于過量使用的同二聚體的抗原結(jié)合或抗獨(dú)特型抗體結(jié)合。
[0494] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過基于第一和第二同二聚體蛋白的差異的方法實(shí)施自 第一和/或第二同二聚體蛋白純化或分開異二聚體蛋白。此類方法可以促進(jìn)第一和第二同 二聚體蛋白彼此分開，且根據(jù)方法，還促進(jìn)同二聚體蛋白與異二聚體蛋白的分開。基于第一 和第二同二聚體蛋白的差異的此類純化或分離方法的例子包括但不限于如下的方法，其中 第一或第二同二聚體蛋白不結(jié)合蛋白A或蛋白G，或其中第一和第二同二聚體蛋白包含不 同輕鏈，例如kappa和lambda輕鏈，或其中第一和第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)包含不同同種 異型。此類方法可以促進(jìn)第一或第二同二聚體蛋白與異二聚體蛋白的分開。在又一個(gè)實(shí)施 方案中，這可以與等度洗脫的純化步驟組合。
[0495] 在一個(gè)實(shí)施方案中，基于第一和第二同二聚體蛋白的差異的此類純化或分離方法 可以與如上文所述使用過量的第一或第二同二聚體蛋白組合。然后，隨后自殘留的同二聚 體純化或分開異二聚體蛋白可以利用第一和第二同二聚體蛋白的差異，因?yàn)楫惗垠w蛋白 與殘留的同二聚體差別為包含以限制量使用的同二聚體的Fc區(qū)。
[0496] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以已經(jīng)將第一或第二同二聚體蛋白工程化改造或修飾為使 得它不結(jié)合蛋白A或蛋白G，或蛋白A和G的組合。然后，自第一和第二同二聚體蛋白中至 少一種純化或分開異二聚體蛋白可以通過將其在蛋白A或蛋白G柱（僅異二聚體蛋白和尚 未在蛋白A或蛋白G結(jié)合方面修飾的同二聚體蛋白會與其結(jié)合）上通過實(shí)施。這促進(jìn)不結(jié) 合蛋白A或蛋白G的同二聚體蛋白與異二聚體蛋白的分開。若第一同二聚體蛋白不結(jié)合蛋 白A而第二同二聚體蛋白不結(jié)合蛋白G，或反之亦然，則可以將異二聚體蛋白與第一和第二 同二聚體蛋白分開，這通過將包含異二聚體蛋白的組合物在蛋白A和蛋白G材料上通過進(jìn) 行。第一和第二同二聚體蛋白可以已經(jīng)修飾為不結(jié)合蛋白A和/或蛋白G，如本文中描述 的。這也可以用于分開還原劑與異二聚體蛋白。這可以與如本文中描述的其它純化方法組 合。
[0497] 使用步驟a)中已經(jīng)修飾為使得不結(jié)合蛋白A、或蛋白G，或蛋白A和蛋白G的第 一或第二同二聚體蛋白可以特別用于如下的實(shí)施方案，其中過量的第一或第二同二聚體蛋 白在步驟a)中相對于另一種同二聚體蛋白使用。在此類實(shí)施方案中，可能有用的是工程 化改造或修飾會過量使用的同二聚體蛋白的蛋白A或蛋白G結(jié)合位點(diǎn)，使得其結(jié)合此類樹 脂的能力被破壞。此類修飾包括但不限于CH3域中的修飾，其披露于W02010/151792,通 過提及將其收入本文。如此，本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白可以包含W02010/151792 中描述的CH3域中的一處或多處修飾，其降低或消除IgG對蛋白A的結(jié)合。如此，在一個(gè) 具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白可以包含選自下組但不限于此的修 飾：a)435R及b)435R和436F。或者，第一或第二同二聚體蛋白可以包括下列突變：I253A、 H310A、和H435A，其消除對蛋白A的結(jié)合。然后，可以通過在蛋白A柱上通過將異二聚體蛋 白與過剩的未交換的同二聚體蛋白分開。這可以與如本文中描述的其它純化方法組合。
[0498] 在第一和第二同二聚體蛋白包含輕鏈的另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的第一和 第二同二聚體蛋白的輕鏈可以是不同的。例如，第一同二聚體蛋白可以包含kappa輕鏈，而 第二同二聚體蛋白可以包含lambda輕鏈，或反之亦然。適合于僅與kappa或lambda輕鏈結(jié) 合的柱層析的材料或樹脂能夠結(jié)合，然后可以用于自第一和/或第二同二聚體蛋白純化或 分開異二聚體蛋白。此類材料或樹脂的例子包括例如來自GE Healthcare Life Sciences 的稱為KappaSelect和LambdaFabSelect的親和介質(zhì)。使用包含不同輕鏈，例如kappa和 lambda輕鏈的第一和第二同二聚體蛋白可以與步驟a)中過量使用同二聚體蛋白之一組 合。例如，可以用包含kappa輕鏈的第一同二聚體蛋白和包含lambda輕鏈的第二同二聚體 蛋白且在第一同二聚體蛋白超過第二同二聚體蛋白存在的情況中，或者就其是否是過量使 用的包含kappa或lambda輕鏈的同二聚體蛋白而言反之亦然實(shí)施步驟a)。然后，步驟c) 可以包括使異二聚體蛋白在僅能夠與lambda輕鏈結(jié)合的柱上通過。然后，步驟c)導(dǎo)致異 二聚體蛋白與包含kappa輕鏈的殘留第一同二聚體蛋白分開。類似地，步驟c)可以包括使 異二聚體蛋白在僅與kappa輕鏈結(jié)合的柱上通過，若它是步驟a)中過量使用的包含lambda 輕鏈的同二聚體。這可以與如本文中描述的其它純化方法組合。
[0499] 或者，也可以在不過量使用同二聚體蛋白之一的情況中實(shí)施異二聚體蛋白的純化 或分開，其基于kappa或lambda輕鏈對不同材料的結(jié)合差異。在此實(shí)施方案中，在此實(shí)施 方案中，步驟c)可以包括使異二聚體蛋白在與kappa輕鏈結(jié)合的材料上，隨后在與lambda 輕鏈上通過，或者反之亦然。由于異二聚體蛋白包含kappa和lambda輕鏈兩者，而第一和 第二同二聚體蛋白包含kappa或lambda輕鏈，由此可以將異二聚體蛋白與第一和第二同二 聚體蛋白分開。這可以與如本文中描述的其它純化方法組合。
[0500] 通過其中第一和第二同二聚體蛋白包含不同輕鏈（例如kappa和lambda輕鏈）， 且其中同二聚體蛋白之一過量使用的方法生成的異二聚體蛋白的通過將其在與非過量使 用的同二聚體蛋白的輕鏈結(jié)合的材料上通過的純化也可以適用于與本發(fā)明不同的生成異 二聚體蛋白的方法。例如基于在宿主細(xì)胞中共表達(dá)重鏈和輕鏈的方法或其它方法。
[0501] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二同二聚體蛋白的恒定區(qū)可以是不同同種異型 的。同種異型是通常在群體內(nèi)找到的氨基酸序列的變異。例如，人IgGl重鏈的不同同種異 型是已知的，Glm(f)[又稱作 Glm(3) ]、Glm(z)[又稱作 Glm(17) ]，Glm(a)[又稱作 Glm(l)] and Glm(x)[又稱作 Glm(2)] (Jefferis, R.，mAbs2009 ;1:4, 1-7)。如此，在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二同二聚體蛋白的恒定區(qū)可以是不同同種異型；例如它們可以 是IgGl同種型，而第一同二聚體蛋白的恒定區(qū)可以是例如IgGlm(za) [ = IgGlm(l, 17)] 或IgGlm(zax) [ = IgGlm(l，2, 17)]同種異型，而第二同二聚體蛋白的恒定區(qū)可以是例如 IgGlm(f) [ = IgGlm(3)]或 IgGlm(fa) [ = IgGlm(l，3)]同種異型。類似地，與使用 kappa 和lambda輕鏈的上文描述的實(shí)施方案一樣，使用包含不同同種異型的恒定區(qū)的第一和第 二同二聚體蛋白可以與步驟a)中過量使用第一或第二同二聚體蛋白組合。在此實(shí)施方案 中，步驟c)然后可以包括使異二聚體蛋白在材料，例如用同種異型特異性抗體（與不過量 使用的同二聚體蛋白中存在的同種異型結(jié)合）包被的珠上通過。由此，可以自步驟a)中過 量使用的同二聚體蛋白純化異二聚體蛋白。這可以與如本文中描述的其它純化方法組合。
[0502] 在一個(gè)備選實(shí)施方案中，不在步驟a)中調(diào)節(jié)第一或第二同二聚體蛋白的比率，如 此步驟a)中第一或第二同二聚體蛋白均未完全使用，導(dǎo)致包含異二聚體蛋白、第一和第二 同二聚體蛋白的組合物的生成。在此實(shí)施方案中，步驟c)可以包括使異二聚體蛋白在與同 種異型之一結(jié)合的材料上，隨后在與另一種同種異型結(jié)合的另一種材料上通過。這可以與 如本文中描述的其它純化方法組合。
[0503] 與異二聚體蛋白與同二聚體蛋白的分開組合的包含不同同種異型Fc區(qū)的第一和 第二同二聚體蛋白的使用也可以適用于與本發(fā)明的方法不同的生成異二聚體蛋白的方法。 此類方法可以進(jìn)一步包括使用過量的第一或第二同二聚體蛋白。此類方法的例子包括那些 基于在同一宿主細(xì)胞中共表達(dá)第一和第二同二聚體蛋白的方法。
[0504] C端賴氨酸
[0505] 通過羧肽酶從重鏈除去C端賴氨酸是抗體在哺乳動物細(xì)胞中重組表達(dá)后，及人血 清中在體內(nèi)通常觀察到的抗體修飾（Cai等（2010)Biotechnol. Bioeng. Sep9)。除去經(jīng)常是 部分的，導(dǎo)致具有0(K0)、1(K1)或2(K2)個(gè)C端賴氨酸的抗體的混合群體。特別地，B細(xì)胞 雜交瘤生成 Κ0、Κ1 和 Κ2 分子的混合物（Dick 等（2008)Biotech. Bioeng. 100:1132)。
[0506] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將異二聚體蛋白，例如通過本發(fā)明的方法生成的雙特異 性抗體的C端賴氨酸除去。術(shù)語"C端賴氨酸殘基"指CH3區(qū)的C端，例如抗體重鏈的C端 (其是IgGl中的位置447)的賴氨酸殘基。
[0507] 除了 C端賴氨酸可以具有的各種效應(yīng)外，C端賴氨酸的除去生成異二聚體蛋白，例 如包含超過一種異二聚體蛋白分子的組合物或群體，其就C端賴氨酸的存在而言是更同質(zhì) 的。
[0508] 如此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二同二聚體蛋白不含C端賴氨酸。
[0509] 可以通過將第一和/或第二同二聚體蛋白工程化改造為不含C端賴氨酸，或者通 過從第一和/或第二同二聚體蛋白除去（例如通過酶催化）C端賴氨酸或者通過從異二聚 體蛋白除去（諸如通過酶催化）C端賴氨酸除去C端賴氨酸。
[0510] 因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，將第一和/或第二同二聚體蛋白遺傳修飾為不含C端 賴氨酸（例如在重鏈中）。
[0511] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括例如通過與羧肽酶一起溫育例如 從重鏈除去c端賴氨酸的步驟。
[0512] 若第一和/或第二同二聚體蛋白工程化改造為不含C端賴氨酸，則可以如下生成 第一和/或第二同二聚體蛋白：
[0513] i)提供編碼免疫球蛋白的Fc區(qū)的核苷酸構(gòu)建體，所述Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)和/ 或包含免疫球蛋白的Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含第二CH3區(qū)，其中所述構(gòu)建體不編碼所述第一和 /或第二CH3區(qū)C端的賴氨酸殘基，
[0514] ii)在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核苷酸構(gòu)建體，和
[0515] iii)從所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物回收所述第一和/或第二同二聚體蛋白。
[0516] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二同二聚體蛋白可以是抗體，其在大多數(shù)實(shí)施 方案中還可以包含輕鏈，如此，所述宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步表達(dá)在相同或不同載體上的輕鏈 編碼構(gòu)建體。
[0517] 用于制備核苷酸構(gòu)建體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0518] 類似地，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核苷酸構(gòu)建體的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的。
[0519] 在本發(fā)明的上述方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，從/基于具有C端賴氨酸殘基密碼子 的初始重鏈序列衍生或設(shè)計(jì)步驟i)中提供的核苷酸構(gòu)建體。如此，與所述初始重鏈序列相 t匕，所述核苷酸構(gòu)建體可以包含C端賴氨酸殘基密碼子的缺失。
[0520] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從第一和/或第二同二聚體蛋白除去C端賴氨酸殘基， 例如通過酶促切割進(jìn)行。如此，可以在生成第一和/或第二同二聚體蛋白后自其除去C端賴 氨酸。用于酶促除去C端賴氨酸的方法包括但不限于使第一和/或第二同二聚體蛋白經(jīng)受 與羧肽酶的溫育。因此，可以在步驟a)前實(shí)施例如從重鏈除去C端賴氨酸的步驟。如此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包括在步驟a)前使第一和/或第二同二聚體蛋白經(jīng) 受羧肽酶的進(jìn)一步步驟。
[0521] 類似地，可以從異二聚體蛋白除去C端賴氨酸。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明的方法可以在步驟a)后包括使異二聚體蛋白經(jīng)受羧肽酶的進(jìn)一步步驟。此步驟可以 在步驟a)和步驟b)之間或者它可以在步驟b)后。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在步 驟a)后實(shí)施（例如從重鏈）除去C端賴氨酸的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在步驟 b)后實(shí)施（例如從重鏈）除去C端賴氨酸的步驟。原則上，本發(fā)明的方法可以包括使第一 和/或第二同二聚體蛋白和異二聚體蛋白兩者經(jīng)受羧肽酶。然而，對于大多數(shù)目的，包括 上文提及的步驟之一應(yīng)當(dāng)足以除去C端賴氨酸。合適的羧肽酶的例子包括但不限于羧肽 酶B或羧肽酶N(Cai等Biotechnol.Bioeng.Sep9(2010)見上文）。適合于用羧肽酶處理 的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。除去C端賴氨酸的另一種方法應(yīng)當(dāng)是在表達(dá)羧肽酶的 宿主細(xì)胞中表達(dá)第一和/或第二同二聚體蛋白。將第一和/或第二同二聚體蛋白在羧肽 酶有活性的溫度留在宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中達(dá)足夠的時(shí)間量也會導(dǎo)致C端賴氨酸的除去（Luo JL, Ahang J, Ren D, Tsai ff-L, Li F (2102)Probing of C-Terminal Lysine Variation in a Recombinant Monoclonal Antibody Production Using Chinese Hamster Ovary Cells with Chemically Defined Media. Biotechnol.Bioeng. 109:2306-2315)。
[0522] 核酸序列
[0523] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白的核酸序 列，其中所述第一或第二同二聚體蛋白不包含C端賴氨酸。第一和第二同二聚體蛋白可以 是與本發(fā)明相關(guān)的上文描述的任一種第一和第二同二聚體蛋白。
[0524] 在又一方面，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白的表達(dá)載體， 其中所述第一或第二同二聚體蛋白不包含C端賴氨酸。
[0525] 在甚至又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的第一或第二同二聚體 蛋白的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中所述第一或第二同二聚體蛋白不包含C端賴氨酸。
[0526] 在本發(fā)明的上下文中，表達(dá)載體可以是任何合適的載體，包括染色體、非染色 體、和合成核酸載體（包含合適的一組表達(dá)控制元件的核酸序列）。此類載體的例子包 括SV40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質(zhì)粒、源自質(zhì)粒和噬菌體DNA的 組合的載體、和病毒核酸（RNA或DNA)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列可以包含在 裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表達(dá)元件（如記載于例如Sykes和Johnston, Nat Biotechl7, 355-59(1997))、緊密核酸載體（compacted nucleic acid vector)(如 記載于例如 US 6, 077, 835 和 / 或 WO 00/70087)、質(zhì)粒載體諸如 pBR322、pUC19/18、 或pUC 118/119、"艨（midge) "最小尺寸核酸載體（如記載于例如Schakowski等，Mol Ther3, 793-800 (2001))、或者作為沉淀的核酸載體構(gòu)建體，諸如CaP04沉淀的構(gòu)建體（如 記載于例如 W0 00/46147, Benvenisty and Reshef，PNAS USA 83, 9551-55 (1986)，Wigler 等，Cell 14,725(1978)，及 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7,603(1981)), 所述核酸序列編碼本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白的Fc區(qū)，其中所述第一或第二同二 聚體蛋白不包含C端賴氨酸。此類核酸載體及其用法是本領(lǐng)域中公知的（參見例如US 5, 589, 466 和 US 5, 973, 972)。
[0527] 在一個(gè)實(shí)施方案中，載體適合于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。此類載體的例子包括表達(dá) 載體，諸如 BlueScript(Stratagene)、pIN 載體（Van Heeke 和 Schuster, J Biol Chem 264. 5503-5509 (1989)、pET 載體（Novagen, Madison WI)等）。
[0528] 表達(dá)載體也可以或備選是適合于在酵母系統(tǒng)中表達(dá)的載體?？梢圆捎眠m合于在酵 母系統(tǒng)中表達(dá)的任何載體。合適的載體包括例如包含組成性或誘導(dǎo)型啟動子，諸如alpha 因子、醇氧化酶和PGH的載體（綜述見：F.Ausubel等編Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987),及 Grant 等，Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)) 〇
[0529] 表達(dá)載體也可以或備選是適合于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的載體，例如包含谷氨酰 胺合成酶作為選擇標(biāo)志物的載體，諸如Bebbington(1992)Biotechnology(NY) 10:169-175 中描述的載體。
[0530] 核酸和/或載體也可以包含編碼分泌/定位序列（其可以將多肽，諸如新生多肽 鏈靶向至周質(zhì)空間或靶向入細(xì)胞培養(yǎng)基中）的核酸序列。此類序列是本領(lǐng)域中已知的，并 且包括分泌前導(dǎo)或信號肽。
[0531] 在本發(fā)明的表達(dá)載體中，核酸序列可以包含任何合適的啟動子、增強(qiáng)子、和其它表 達(dá)促進(jìn)元件或者與任何合適的啟動子、增強(qiáng)子、和其它表達(dá)促進(jìn)元件聯(lián)合，所述核酸序列編 碼本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白，其中所述第一或第二同二聚體蛋白不包含C端賴 氨酸。此類元件的例子包括強(qiáng)表達(dá)啟動子（例如人CMV IE啟動子/增強(qiáng)子及RSV、SV40、 SL3-3、MMTV、和HIV LTR啟動子）、有效的多聚（A)終止序列、大腸桿菌（E.coli)中的質(zhì)粒 產(chǎn)物的復(fù)制起點(diǎn)、抗生素抗性基因如選擇標(biāo)志物、和/或方便的克隆位點(diǎn)（例如多接頭）。 核酸還可以包含誘導(dǎo)型啟動子，其與組成性啟動子諸如CMV IE形成對比。
[0532] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以經(jīng)由病毒載體將表達(dá)載體定位于和/或投遞至宿主細(xì)胞 或宿主動物。
[0533] 在甚至又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組真核或原核宿主細(xì)胞，諸如轉(zhuǎn)染瘤 (transfectoma)，其生成本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白，其中所述第一或第二同二聚 體蛋白不包含C端賴氨酸，如本文中定義的。宿主細(xì)胞的例子包括酵母、細(xì)菌和哺乳動物細(xì) 胞，諸如CHO或HEK細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定整合到細(xì)胞基 因組中的核酸的細(xì)胞，所述核酸包含編碼本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白Fc區(qū)的表達(dá) 的序列，其中所述第一或第二同二聚體蛋白不包含C端賴氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供包含非整合型核酸的細(xì)胞，所述非整合型核酸諸如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、或線性表達(dá) 元件，其包含編碼本發(fā)明第一或第二同二聚體蛋白表達(dá)的序列，其中所述第一或第二同二 聚體蛋白不包含C端賴氨酸。
[0534] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及雜交瘤，其生成本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白，其 中所述第一或第二同二聚體蛋白不包含C端賴氨酸。在甚至又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基 因非人動物或植物，其包含編碼本發(fā)明的第一或第二同二聚體蛋白的核酸，其中所述第一 或第二同二聚體蛋白不包含C端賴氨酸，其中所述動物或植物生成本發(fā)明的第一或第二同 二聚體蛋白，其中所述第一或第二同二聚體蛋白不包含C端賴氨酸。
[0535] 異二聚體蛋白
[0536] 本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的異二聚體蛋白。
[0537] 本發(fā)明的方法能夠形成不對稱分子，在每條Fab臂或者每個(gè)CH3域上具有不同特 征的分子或者在整個(gè)分子內(nèi)具有不同修飾的分子，例如具有用于綴合的非天然氨基酸取代 的分子。此類不對稱分子可以任何合適的組合產(chǎn)生。這在下文通過一些非限制性例子進(jìn)一 步說明。
[0538] 雙特異性抗體可用于將成像或免疫治療劑投遞至感興趣的靶細(xì)胞，包括但不限于 腫瘤細(xì)胞。
[0539] 在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性分子的第一 Fab臂結(jié)合腫瘤細(xì)胞，諸 如腫瘤細(xì)胞表面蛋白或者腫瘤細(xì)胞表面的糖，諸如本文列出的腫瘤細(xì)胞表面蛋白中的一 種，而第二Fab臂識別放射活性效應(yīng)分子，包括但不限于與肽或半抗原偶聯(lián)或連接（經(jīng)由 螯合劑）的放射性標(biāo)記物。此類放射性標(biāo)記肽的例子是銦標(biāo)記的二乙烯三胺五乙酸（抗 DTPA(In)van Schaijk 等 Clin. Cancer Res. 2005 ;ll:7230s-7126s)。另一種例子是使用 攜帶放射性核素諸如例如锝-99的半抗原標(biāo)記的膠粒諸如脂質(zhì)體、聚合物膠束的納米顆粒 (Jestin 等Q J Nucl Med Mol Imaging2007 ;51:51-60)。
[0540] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用半抗原偶聯(lián)的備選細(xì)胞抑制分子諸如毒素作為由第二 Fab臂識別的效應(yīng)分子。
[0541] 在本發(fā)明方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，將雙特異性分子的第一 Fab臂在N297位置 (EU編號）糖基化，并將雙特異性分子的第二Fab臂無糖基化（aglycosylated)(非糖基化， 例如通過將 N297 突變?yōu)?Q 或 A 或 E 突變（Bolt S 等，Eur J Immunol 1993, 23:403-411))。 在Fc區(qū)的不對稱糖基化影響與Fc γ -受體的相互作用，并且影響抗體的抗體依賴性細(xì)胞的 細(xì)胞毒性效應(yīng)（Ha等，Glyc〇bi〇l 〇gy2011，21 (8) : 1087-1096)以及與其它效應(yīng)器功能分子 諸如Clq的相互作用。
[0542] 在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性分子的第一 Fab臂與FcRn(新生兒 Fe 受體）相互作用（Roopenian DC,等 Nat. Rev.Immunol. 2007,7:715-725)，并且通過使 分子上FcRn相互作用位點(diǎn)突變例如通過產(chǎn)生H435A突變來妨礙第二Fab臂與FcRn結(jié)合 (Shields，R.L.等，J Biol Chem，2001，F(xiàn)iran，M.等，Int Immunol，2001)。
[0543] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在雙特異性分子的兩條Fab臂中的一條上改善或減少與 Clq的結(jié)合。
[0544] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，已將蛋白質(zhì)工程化改造為在分子的兩條Fab臂中的一條或 兩條上增強(qiáng)補(bǔ)體活化。
[0545] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在于雙特異性分子中的每條Fab臂從不同的IgG亞類衍 生。
[0546] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在于雙特異性分子中的每條Fab臂攜帶不同的同種異型 突變（Jefferis 和 Lefranc, 2009, MABsl: 332-8)。
[0547] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，另一類不對稱免疫治療分子通過用免疫活性、免疫刺激性 或免疫抑制性細(xì)胞因子置換雙特異性分子的一條Fab臂的Fab產(chǎn)生。此類細(xì)胞因子的非 限制性例子是 IL-2、IFN- a、IFN- β、IFN- γ、TNF- a、G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-4、IL-6、 IL-13?；蛘?，在分子中包括（生長）因子或激素刺激劑或抑制劑。
[0548] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，一條Fab臂的Fab被裂解肽置換，裂解肽即能夠裂解腫 瘤細(xì)胞、細(xì)菌、真菌等的肽，包括但不限于抗微生物肽如爪蟾抗菌肽（magainin)、蜂毒肽 (mellitin)、殺菌膚（cecropin)、KLAKKLAK 及其變體（Schweizer 等 Eur. J. Pharmacology 2009 ;625:190-194, Javadpour，J. Med. Chem.，1996, 39:3107 - 3113, Marks 等，Cancer Res2005 ;65:2373-2377, Rege等，Cancer Res. 2007 ;67:6368-6375)或陽離子裂解肽（CLYP 技術(shù)，US2009/0269341)。
[0549] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ab臂上的Fab中之一或兩者被細(xì)胞因子和/或生長因子 的受體置換，產(chǎn)生所謂的誘餌受體，其中靶向TNF-α的Enbrel? (依那西普）和靶向VEGF 的VEGF-trap是眾所周知的例子。將這兩種誘餌受體組合成一個(gè)分子顯示優(yōu)于單一誘餌受 體的活性（Jung, J. Biol. Chem. 2011 ;286:14410-14418)。
[0550] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，另一類不對稱免疫治療分子通過將免疫活性細(xì)胞因 子、免疫刺激性細(xì)胞因子或免疫抑制性細(xì)胞因子與存在于雙特異性分子中的Fab臂中 的一條或兩條的N-端或C-端融合而產(chǎn)生。這可對雙特異性分子的抗腫瘤活性產(chǎn)生 積極影響。此類分子的例子是（但不限于下文列表）IL-2 (Fournier等，2011，Int. J. Oncology, doi: 10. 3892/i jo. 2011. 976)、IFN-a、IFN-P 或 IFN-Y(Huan 等，2007; J. Immunol. 179:6881-6888, Rossie 等，2009 ;Bloodll4:3864-3871)、TNF-a?；蛘?，細(xì)胞因 子比如例如G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-4、IL-6或IL-13的N-端或C-端融合可積極地影響 雙特異性抗體分子效應(yīng)器功能?；蛘邔⑸L因子或激素刺激劑或抑制劑在N-端或C-端包 括在分子中。
[0551] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，裂解肽比如例如抗微生物肽如爪蟾抗菌肽、蜂 毒膚、殺菌膚、KLAKKLAK 及其變體（Schweizer 等 Eur. J. Pharmacology 2009 ; 625:190-194, Javadpour，J. Med. Chem.，1996, 39:3107 - 3113, Marks 等，Cancer Res 2005 ; 65:2373-2377, Rege 等，Cancer Res. 2007 ;67:6368-6375)或陽離子裂解肽（CLYP 技術(shù)， US2009/0269341)在一條或兩條Fab臂上的N-端或C-端融合可增強(qiáng)分子的活性。
[0552] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，另一類別的不對稱免疫治療分子是單價(jià)抗體，該分子以一 條Fab臂與選擇的靶標(biāo)相互作用。在此類分子中，存在于雙特異性分子中的一條Fab臂針 對選擇的祀分子，分子的第二條Fab臂不攜帶Fab或者具有非結(jié)合/非功能性Fab比如對 MetMab所述的（Genentech ;W0 96/38557)?；蛘撸僧a(chǎn)生單體的Fc融合蛋白諸如對因子 VIII 和 IX 所述的那些（Peters 等，Blood2010 ;115:2057-2064)。
[0553] 或者，可通過本發(fā)明方法產(chǎn)生任何上述不對稱分子的組合。
[0554] 通過本發(fā)明的方法生成的異二聚體蛋白可以含有包含第一免疫球蛋白的Fc區(qū)的 第一多肽和包含第二免疫球蛋白的Fc區(qū)的第二多肽，所述第一 Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)，所述 第二Fc區(qū)包含第二CH3區(qū)，其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第 一和第二CH3區(qū)之間的異二聚體相互作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互 作用，且
[0555] 其中所述第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸， 且所述第二同二聚體蛋白具有選自下組的位置處的氨基酸取代：366, 368, 370, 399,405和 407,
[0556] 和 / 或
[0557] 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列使得在如實(shí)施例21中描述的那樣測定時(shí)，每 個(gè)CH3區(qū)的同二聚體相互作用的解離常數(shù)為0. 01-10微摩爾，諸如0. 05-10微摩爾，更優(yōu)選 0. 01-5,諸如0. 05-5微摩爾，甚至更優(yōu)選0. 01-1微摩爾，諸如0. 05-1微摩爾，0. 01-0. 5或 0· 01-0. 1。
[0558] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一 CH3區(qū)具有位置409處與Lys、Leu或Met不同的氨 基酸，且所述第二CH3區(qū)具有位置405處與Phe不同的氨基酸，
[0559] 和 / 或
[0560] 所述第一和第二CH3區(qū)的序列使得在如實(shí)施例21中描述的那樣測定時(shí)，每個(gè) CH3區(qū)的同二聚體相互作用的解離常數(shù)為0. 01-10微摩爾，諸如0. 05-10微摩爾，更優(yōu)選 0. 01-5,諸如0. 05-5微摩爾，甚至更優(yōu)選0. 01-1微摩爾，諸如0. 05-1微摩爾，0. 01-0. 5或 0· 01-0. 1。
[0561] 在異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，
[0562] 所述第一 CH3區(qū)具有位置409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3 區(qū)具有位置405處與Phe不同的氨基酸，諸如位置405處與Phe、Arg或Gly不同的氨基酸，
[0563] 或
[0564] 所述第一 CH3區(qū)具有位置409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3 區(qū)具有位置407處與Tyr，Asp, Glu，Phe, Lys，Gin, Arg，Ser或Thr不同的氨基酸。
[0565] 在其它實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的異二聚體蛋白包含上文關(guān)于生產(chǎn)方法描述的任 何其它特征。
[0566] 如此，在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一多肽是抗體（優(yōu)選 人抗體）的全長重鏈。
[0567] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二多肽是抗體（優(yōu)選人抗 體）的全長重鏈。
[0568] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二多肽都是兩種抗體 (優(yōu)選結(jié)合不同表位的兩種人抗體）的全長重鏈，因此所得異二聚體蛋白是雙特異性抗體。 這種雙特異性抗體可以是重鏈抗體，或者是除了重鏈以外還包含兩條全長輕鏈（其可相同 或不同）的抗體。
[0569] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，第一多肽的Fc區(qū)與源自選自下組 的同種型的Fc區(qū)相似或相同：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(除了規(guī)定突變以外），且第二多肽 的Fc區(qū)是選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同種型的（除了規(guī)定突變以外）。
[0570] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一 CH3區(qū)包含位置405處的 Phe和位置409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3區(qū)包含位置405處與 Phe不同的氨基酸和位置409處的Lys。
[0571] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一 CH3區(qū)包含位置405處的 Phe和位置409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3區(qū)包含位置405處的 Leu和位置409處的Lys。
[0572] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一 CH3區(qū)包含位置405處的 Phe和位置409處的Arg，且所述第二CH3區(qū)包含位置405處的Leu和位置409處的Lys。
[0573] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一 CH3區(qū)包含位置409處與 Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3區(qū)包含位置409處的Lys和：a)位置350處 的lie和位置405處的Leu，或b)位置370處的Thr和位置405處的Leu。
[0574] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一 CH3區(qū)包含位置409處的 Arg，且所述第二CH3區(qū)包含位置409處的Lys和：a)位置350處的lie和位置405處的 Leu，或b)位置370處的Thr和位置405處的Leu。
[0575] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一 CH3區(qū)包含位置350處的 Thr、位置370處的Lys、位置405處的Phe和位置409處的Arg，且所述第二CH3區(qū)包含位 置409處的Lys和：a)位置350處的lie和位置405處的Leu，或b)位置370處的Thr和 位置405處的Leu。
[0576] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一 CH3區(qū)包含位置350處的 Thr、位置370處的Lys、位置405處的Phe和位置409處的Arg，且所述第二CH3區(qū)包含位 置350處的lie、位置370處的Thr、位置405處的Leu和位置409處的Lys。
[0577] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和所述第二多肽在鉸鏈區(qū) 中都不包含Cys-Pr〇-Ser_Cys序列。
[0578] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和所述第二多肽在鉸鏈區(qū) 中都包含Cys_Pr〇-Pr〇-Cys序列。
[0579] 在本發(fā)明異二聚體蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一多肽和/或所述第二多肽 包含除去用于Asn-連接的糖基化的受體位點(diǎn)的突變。
[0580] 靶抗原
[0581] 如上文所解釋的，在本發(fā)明的一個(gè)重要實(shí)施方案中，異二聚體蛋白是包含兩個(gè)在 結(jié)合特異性（即結(jié)合不同表位）上不同的可變區(qū)的雙特異性抗體。
[0582] 原則上，任何特異性組合都是可能的。如上文提到，雙特異性抗體可以潛在用于進(jìn) 一步提高單克隆抗體療法的效力和功效。單特異性抗體一種可能的局限性是缺乏對期望的 靶細(xì)胞的特異性，這是因?yàn)榘锌乖磉_(dá)在對其不期望抗體結(jié)合的其它細(xì)胞類型上。例如，在 腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)的靶抗原也可在健康組織中表達(dá)，這可導(dǎo)致在用針對該抗原的抗體治療 后產(chǎn)生不期望的副作用。對只在靶細(xì)胞類型上表達(dá)的蛋白具有進(jìn)一步特異性的雙特異性抗 體可以潛在改善與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合。
[0583] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，同二聚體蛋白都是抗體，其中第一抗體和第二抗體結(jié)合 同一腫瘤細(xì)胞上的不同表位。
[0584] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，同二聚體蛋白都是抗體，其中第一抗體結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的 表位，而另一種抗體是對于意圖的應(yīng)用沒有任何相關(guān)體內(nèi)結(jié)合活性的無關(guān)或無活性抗體。
[0585] 如此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二表位位于同一細(xì)胞，例如腫 瘤細(xì)胞上。腫瘤細(xì)胞上的合適靶物包括但不限于下列各項(xiàng)：erbBl(EGFR)、erbB2(HER2)、 erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、CD38、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-包膜蛋白、骨膜蛋 白（periostin)、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFRvIII、Ll-CAM、AXL、組織因子（TF)、 CD74、EpCAM和MRP3。腫瘤細(xì)胞靶物的可能組合包括但不限于：erbB 1+erbB2、erbB2+erbB3、 erbBl+erbB3、CD19+CD20、CD38+CD34、CD4+CXCR5、CD38+RANKL、CD38+CXCR4、CD20+CXCR4、 CD20+CCR7、CD20+CXCR5、CD20+RANKL、erbB2+AXL、erbBl+cMet、erbB2+c-Met、erbB2+EpCAM、 c-Met+AXL、c-Met+TF、CD38+CD20、CD38+CD138。
[0586] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二表位可位于同一祀抗原上，其中兩個(gè)表位 在靶抗原上的位置使得抗體與一個(gè)表位的結(jié)合不干擾抗體與另一表位的結(jié)合。在本文 又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二同二聚體蛋白是結(jié)合位于同一靶抗原上兩個(gè)不同表 位，但對于靶細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞具有不同的殺傷作用模式的抗體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案 中，祀抗原是erbB2 (HER2)，且雙特異性抗體組合培妥珠單抗（pertuzumab)和曲妥珠單抗 (trastuzumab)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，祀抗原是erbBl(EGFr)，且雙特異性 抗體組合扎魯木單抗（zalutumumab)和尼妥珠單抗（nimotuzumab)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0587] 雙特異性抗體還可作為介質(zhì)用于將效應(yīng)機(jī)制再靶向疾病相關(guān)組織，例如腫瘤。因 此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一表位或所述第二表位位于腫瘤細(xì)胞諸如腫瘤細(xì)胞蛋白 或腫瘤細(xì)胞糖上，而另一表位位于效應(yīng)細(xì)胞上。
[0588] 在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞是T細(xì)胞。
[0589] 效應(yīng)細(xì)胞上的可能靶標(biāo)包括下列各項(xiàng)：Fc γ RI (⑶64):在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和 活化的嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)；FcyRIII (⑶16):在自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)；⑶3 : 在循環(huán)T細(xì)胞上表達(dá)；CD89 :在PMN(多形核嗜中性粒細(xì)胞）、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨 噬細(xì)胞上表達(dá)；⑶32a :在巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)；在嗜堿性粒細(xì)胞 和肥大細(xì)胞上表達(dá)的Fc ε RI。在一個(gè)實(shí)施方案中表位位于在T細(xì)胞上表達(dá)的⑶3。
[0590] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體對病原性微生物具有結(jié)合特異性，而第二抗體對 效應(yīng)細(xì)胞蛋白（諸如 CD3, CD4, CD8, CD40, CD25, CD28, CD16, CD89, CD32, CD64, Fc ε RI 或 CD 1)具有結(jié)合特異性。
[0591] 此外，雙特異性抗體可用于使化療劑更特異性地靶向該化療劑應(yīng)對其發(fā)揮作用的 細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，同二聚體蛋白中的一種是識別小分子或肽的抗體，或者能 夠例如根據(jù)描述于Rader等，（2003) PNAS 100:5396的原理與此類分子形成共價(jià)鍵。在本 發(fā)明方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體對腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面蛋白（諸如erbBl， erbB2, erbB3, erbB4, EGFR3vIII，CEA，MUC-1，CD19, CD20, CD4, CD38, EpCAM，c-Met，AXL， Ll-CAM，組織因子，CD74或CXCR5)具有結(jié)合特異性（即結(jié)合所述腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面 蛋白上的表位），而第二抗體對可以任選與肽或半抗原偶聯(lián)或連接的化療劑諸如毒素（包 括放射性標(biāo)記肽）、放射性同位素、藥物或前藥具有結(jié)合特異性。
[0592] 雙特異性抗體還可用于靶向囊泡，如電子致密囊泡，或者含有針對腫瘤的毒素、藥 物或前藥的小細(xì)胞。參見例如MacDiarmid等（2009)Nature Biotech27:643。小細(xì)胞是非 染色體細(xì)胞，其是不含有染色體DNA的異常細(xì)胞分裂產(chǎn)物。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述第一或所述第二表位位于腫瘤細(xì)胞，諸如腫瘤細(xì)胞蛋白或腫瘤細(xì)胞糖上，而另一表位位 于電子致密囊泡或小細(xì)胞上。
[0593] 另外，通過將對血清蛋白的結(jié)合特異性包括在雙特異性抗體中可改變抗體的血清 半衰期。例如，通過將對血清白蛋白的結(jié)合特異性包括在雙特異性抗體中可延長血清半 衰期。因此，在本發(fā)明方法又一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體對腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞蛋白諸如 erbBl(EGFR)， erbB2(HER2)， erbB3, erbB4, MUC-1， CD19, CD20, CD4, CD38, CD138, CXCR5， c-Met，HERV-包膜蛋白、骨膜蛋白、Bigh3, SPARC，BCR，CD79, CD37, EGFRvIII，Ll-CAM，AXL， 組織因子（TF)，⑶74, EpCAM或MRP3, CEA具有結(jié)合特異性，而第二抗體對血液蛋白諸如血 清白蛋白具有結(jié)合特異性。第二結(jié)合特異性還可用于使抗體靶向特定組織，諸如中樞神經(jīng) 系統(tǒng)或腦（跨越血腦屏障）。因此，在本發(fā)明方法又一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體對腦特異 性靶標(biāo)具有結(jié)合特異性，腦特異性靶標(biāo)諸如淀粉樣蛋白-β (例如用于治療阿爾茨海默病 (Alzheimer' s disease))、Her_2(例如用于治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移）、EGFR(例如用于治療原 發(fā)性腦癌）、Nogo A (例如用于治療腦損傷）、TRAIL (例如用于治療HIV)、alpha-突觸核蛋 白（synuclein)(例如用于治療帕金森?。tt (例如用于治療亨廷頓?。℉untington))、 朊病毒（例如用于治療瘋牛?。?、西尼羅病毒蛋白；第二抗體對血腦屏障蛋白具有結(jié)合特異 性，血腦屏障蛋白諸如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR)、胰島素受體、黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（MTfR)、乳鐵 蛋白受體（LfR)、載脂蛋白E受體2 (Ap〇ER2)、LDL受體相關(guān)蛋白1和2 (LRP1和LRP2)、高級 糖基化終產(chǎn)物的受體（RAGE)、白喉毒素受體=肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子（DTR = HB-EGF)、gpl90 (Abbott 等，Neurobiology of Disease37 (2010) 13-25)。
[0594] 對血腦屏障蛋白的結(jié)合特異性還可用于使另一種非抗體分子靶向特定組織，諸 如中樞神經(jīng)系統(tǒng)或腦（跨越血腦屏障）。因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，同二聚體蛋白之一 是對血腦屏障蛋白（諸如TfR，胰島素受體，MTfR，LfR，ApoER2, LRP1，LRP2, RAGE，DTR(= HB-EGF)或gpl90)具有結(jié)合特異性的全長抗體，而另一種同二聚體蛋白是在N-或C-端 連接另一種蛋白的Fc區(qū)，所述另一種蛋白諸如細(xì)胞因子、可溶性受體或者其它蛋白，如 VIP(血管活性腸肽）、BDNF(腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子）、FGF(成纖維細(xì)胞生長因子）、多種 FGF、EGF(表皮生長因子）、PNA(肽核酸）、NGF(神經(jīng)生長因子）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白（NT)-3、 NT-4/5、膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、神養(yǎng)蛋白（neurturin)、神經(jīng) 調(diào)節(jié)蛋白、白介素、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF)-a、TGF-β、促紅細(xì)胞生成素、肝細(xì)胞生長因子、血 小板衍生的生長因子、artemin、persephin、導(dǎo)蛋白、心肌營養(yǎng)蛋白-1、干細(xì)胞因子、中期 因子、多效營養(yǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、腦信號蛋白、腦信號蛋白（semaphorin)、白細(xì)胞抑 制因子、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙?；?半乳糖胺-6-硫酸 酯酶、芳香基硫酸酯酶Β、酸性α-葡萄糖苷酶或者鞘憐脂酶（Pardridge，靶向腦的生物 藥物（Pardridge, Bioparmaceutical drug targeting to the brain, Journal of Drug Targeting 2010, 1-11 ;Pardridge, Re-engineering Biopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojan horses. Bioconjugate Chemistry2008, 19:1327-1338)
[0595] 在本發(fā)明方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗體對腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞蛋白諸如 erbBl，erbB2, erbB3, erbB4，MUC-l，CD19, CD20, CD4 或 CXCR5 具有結(jié)合特異性，而第二抗體 對參與凝血的蛋白諸如組織因子具有結(jié)合特異性。
[0596] 其它特別引入關(guān)注的結(jié)合特異性組合包括：⑶3+HER2,⑶3+⑶20, IL-12+IL18， IL-la+IL-lb， VEGF+EGFR， EpCAM+CD3, GD2+CD3, GD3+CD3, HER2+CD64, EGFR+CD64， CD30+CD16, NG2+CD28, HER2+HER3, CD20+CD28, HER2+CD16, Bcl2+CD3, CD19+CD3, CEA+CD3, EGFR+CD3, IgE+CD3, EphA2+CD3, CD33+CD3, MCSP+CD3, PSMA+CD3, TF+CD3, CD19+CD16， CD19+CD16a, CD30+CD16a, CEA+HSG, CD20+HSG, MUC1+HSG, CD20+CD22, HLA-DR+CD79， PDGFR+VEGF，IL17a+IL23, CD32b+CD25，CD20+CD38，HER2+AXL，CD89+HLA II 類，CD38+CD138， TF+c-Met，Her2+EpCAM，HER2+HER2, EGFR+EGFR，EGFR+c-Met，c-Met+ 非結(jié)合臂以及 G-蛋白 偶聯(lián)受體的組合。
[0597] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗體可基本按照Taylor等 J. Immunol. 158:842-850(1997)及 Taylor 和 Ferguson, J. Hematother. 4:357-362, 1995 所 述，通過靶向紅細(xì)胞而用于清除病原體、病原性自身抗體或者有害化合物諸如來自循環(huán)的 毒液和毒素。所述第一表位位于紅細(xì)胞（紅血球）蛋白（包括但不限于紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1) 上，所述第二表位位于待靶定清除的化合物或生物體上。
[0598] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，第二Fab臂包含代表自身抗原或者連接自身抗原的綴合位 點(diǎn)諸如dsDNA的融合蛋白。因此通過本發(fā)明的雙特異性抗體靶向病原體、自身抗體或有害 化合物以及接著的紅細(xì)胞介導(dǎo)的清除，可在各種疾病和綜合征的治療中具有治療效用。
[0599] 綴合
[0600] 在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，第一和/或第二同二聚體蛋白連接至選自下列的化 合物：毒素（包括放射性同位素）、前藥或藥物。此類化合物可例如在癌癥療法中更有效地 殺傷靶細(xì)胞。因此所得異二聚體蛋白是免疫綴合物?；蛘呋衔锟膳c所得異二聚體蛋白偶 聯(lián)，即在已發(fā)生Fab臂交換之后。
[0601] 因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將第一和/或第二同二聚 體蛋白與另一種化合物；例如毒素、前藥或藥物連接或綴合的步驟。
[0602] 或者，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將異二聚體蛋白與另一種化合物；例如毒素、前藥 或藥物連接或綴合的步驟。
[0603] 如本文中別處描述的，可以將第一和第二同二聚體蛋白與不同化合物綴合，由此 導(dǎo)致生成與兩種不同化合物（例如毒素、前藥和/或藥物）綴合的異二聚體蛋白。若用于綴 合第一化合物的方法與用于綴合第二化合物的方法不相容，則這可以是特別有用的。例如， 不同化合物可以是兩種不同毒素，或兩種不同前藥，或兩種不同藥物，或者一種化合物可以 是毒素，而另一種是前藥或藥物，或一種化合物可以是前藥，而另一種是藥物?？梢允褂萌?何合適的組合。
[0604] 或者，本發(fā)明的方法包括使用還原-氧化組合異二聚體蛋白的形成與毒素的綴 合。
[0605] 用于形成本發(fā)明免疫綴合物的合適化合物包括泰素（taxol)、細(xì)胞松弛素 B(cytochalasin B)、短桿菌膚 D(gramicidin D)、溴化乙淀（ethidium bromide)、依米 ?。╡metine)、絲裂霉素（mitomycin)、依托泊苷（etoposide)、tenoposide、長春新堿 (vincristine)、長春喊（vinblastine)、秋水仙素（colchicin)、多柔比星（doxorubicin)、 柔紅霉素（daunorubicin)、二輕基炭疽菌素二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽 醌（mitoxantrone)、光神霉素（mithramycin)、放線菌素 D(actinomycin D)、l_ 去氫睪酮 (l-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids)、普魯卡因（procaine)、丁卡因 (tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普蔡洛爾（propranolol)和噪羅霉素（puromycin)、 抗代謝藥（例如甲氨蝶呤、6-巰基噪呤、6-硫鳥噪呤、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱（fludarabin)、 5-氟尿啼陡、氨烯咪胺（decarbazine)、輕基脲、天冬酰胺酶、吉西他濱（gemcitabine)、 克拉屈濱（cladribine))、燒化劑（例如氮芥（mechlorethamine)、噻替派（thioepa)、 苯丁酸氣芥（chlorambucil)、美法侖（melphalan)、卡莫司?。╟armustine，BSNU)、洛莫 司汀（lomustine，CCNU)、環(huán)憐醜胺（cyclophosphamide)、白消安（busulfan)、二溴甘露 醇（dibromomannitol)、鏈唑菌素（streptozotocin)、達(dá)卡巴嗪（dacarbazine, DTIC)、 丙卡巴肼（procarbazine)、絲裂霉素 C(mitomycin C)、順鉬（cisplatin)和其它鉬 衍生物，諸如卡鉬（carboplatin))、抗生素（例如放線菌素 D (dactinomycin)(舊稱 放線菌素（actinomycin))、博來霉素（bleomycin)、柔紅霉素（daunorubicin)(舊稱 道諾霉素（daunomycin))、多柔比星（doxorubicin)、伊達(dá)比星（idarubicin)、光神 霉素（mithramycin)、絲裂霉素（mitomycin)、米托蒽醌（mitoxantrone)、普卡霉素 (plicamycin)、安曲霉素（anthramycin，AMC))、白喉毒素和相關(guān)分子（例如白喉A鏈和其 活性片段和雜合分子）、蓖麻毒蛋白毒素（例如蓖麻毒蛋白A或去糖基化蓖麻毒蛋白A鏈 毒素）、霍亂毒素、志賀樣毒素（SLT-I, SLT-II, SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百 日咳毒素、破傷風(fēng)毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制劑、假單胞菌屬（Pseudomonas)外毒 素、alorin、肥阜草蛋白（saporin)、蒴蓮根毒素（modeccin)、gelanin、相思豆毒蛋白A鏈、 蒴蓮根毒素 A鏈、α-帚曲霉素（alpha-sarcin)、油桐（Aleurites fordii)蛋白、石竹素 (dianthin)蛋白、美洲商陸（Phytolacca americana)蛋白（PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜 (momordica charantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白（curcin)、巴豆毒蛋白、肥阜草（sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素（gelonin)、mitogellin、局限曲菌素（restrictocin)、酚 霉素（phenomycin)和依諾霉素（enomycin)毒素。其它合適的綴合分子包括核糖核酸酶 (RNA酶）、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、 美登木素生物喊、Auristatins(MMAE,MMAF)、刺抱霉素（Calicheamicins)和 Duocarmycin 類似物（Ducry and Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21:5-13)、Dolostatin_10、 Dolostatin-15、伊立替康（Irinotecan)或其活性代謝物SN38、吡咯并苯并二氮雜（PBD)。 [0606] 在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二同二聚體蛋白連接至α發(fā)射體，包 括但不限于釷-227、鐳-223、鉍-212和錒-225。
[0607] 在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二同二聚體蛋白連接至β發(fā)射放射性 核素，包括但不限于碘-313、釔-90、氟-18、錸-186、鎵-68、锝-99、銦-111和镥-177。
[0608] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，待綴合化合物包括核酸或核酸相關(guān)分子。在本發(fā)明一個(gè)這 樣的方面，綴合的核酸是細(xì)胞毒性核糖核酸酶、反義核酸、抑制性RNA分子（如siRNA分子） 或免疫刺激性核酸（如免疫刺激性含CpG基序的DNA分子）。
[0609] 可采用本領(lǐng)域已知用于綴合的任何方法，包括Hunter等，Nature 144, 945 (1962), David 等，Biochemistry 13., 1014 (1974), Pain 等，J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981)及 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)描述的方法?？?通過使其它部分與蛋白的N-端側(cè)C-端側(cè)在化學(xué)上綴合制備綴合物（參見例如Antibody Engineering Handbook, Osamu Kanemitsu 編，Chijin Shokan(1994)出版）。在適當(dāng)?shù)那?況下，還可通過在內(nèi)部殘基或糖處綴合產(chǎn)生此類綴合的抗體衍生物。藥劑可直接或間接與 本發(fā)明的蛋白偶聯(lián)。第二藥劑的間接偶聯(lián)的一個(gè)例子是通過間隔物部分偶聯(lián)。用于藥物綴 合物的連接技術(shù)最近已概括于 Ducry and Stump (2010) Bioconjugate Chem. 21: 5。
[0610] 鉬合物和用涂
[0611] 通過本發(fā)明的方法生成的異二聚體蛋白可以在具有藥學(xué)可接受載體的藥物組合 物中使用。
[0612] 可按照常規(guī)技術(shù)配制藥物組合物，所述常規(guī)技術(shù)例如公開于下述文獻(xiàn)中的常規(guī) 技術(shù)：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro 編，Mack Publishing Co.，Easton, PA, 1995。本發(fā)明的藥物組合物可包含例如稀釋劑、填充劑、鹽、緩 沖劑、去污劑（例如非離子型去污劑，例如Tween-20或Tween-80)、穩(wěn)定劑（例如不含糖或 蛋白質(zhì)的氨基酸）、防腐劑、組織固定劑、增溶劑和/或適于納入藥物組合物中的其它物質(zhì)。
[0613] 藥學(xué)上可接受的載體包括與本發(fā)明的化合物在生理上相容的任何和所有合適的 溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑、抗氧化劑和吸收延緩劑等。可用 于本發(fā)明藥物組合物的合適的水性和非水性載體的例子包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽溶液、乙 醇、右旋糖、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇）。藥學(xué)可接受載體包括無菌水性溶液劑 或分散劑和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液劑或分散劑的無菌粉劑?？赏ㄟ^例如使用包衣材 料（例如卵磷脂）、在分散劑的情況下通過維持所需粒徑和通過使用表面活性劑，來保持適 當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> [0614] 本發(fā)明的藥物組合物還可包含藥學(xué)可接受抗氧化劑，例如（1)水溶性抗氧化劑， 例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑， 諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚、丁基化羥基甲苯、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α -生育酚等； 和（3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
[0615] 本發(fā)明的藥物組合物還可在組合物中包含等張劑，諸如糖、多元醇，諸如甘露醇、 山梨糖醇、甘油或氯化鈉。
[0616] 本發(fā)明的藥物組合物還可含有適于所選給藥途徑的可提高藥物組合物的保存期 限或有效性的一種或多種輔助劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、防腐劑或緩沖劑。 可將本發(fā)明的化合物與可防止化合物快速釋放的載體一起制備，諸如受控釋放配制劑，包 括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)。這類載體可包括明膠、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸 甘油酯、生物可降解的生物相容性聚合物諸如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸 酯和單獨(dú)的或與蠟一起的聚乳酸，或者本領(lǐng)域眾所周知的其它物質(zhì)。用于制備這類配制劑 的方法一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
[0617] 可根據(jù)需要通過將所需量的活性化合物與例如上文列舉的一種成分或成分的組 合一起摻入適當(dāng)溶劑中，接著滅菌微量過濾，來制備無菌注射用溶液劑。
[0618] 藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以變化，以便獲得對于特定患者、組合 物和給藥方式有效實(shí)現(xiàn)所需治療反應(yīng)而又對患者無毒的活性成分的量。所選的劑量水平將 取決于多個(gè)藥動學(xué)因素，包括所用的本發(fā)明具體組合物的活性、給藥途徑、給藥時(shí)間、所用 具體化合物的排泄率、治療持續(xù)時(shí)間、與所用具體組合物聯(lián)用的其它藥物、化合物和/或物 質(zhì)、待治療患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和既往病史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的 因素。
[0619] 可通過任何合適的途徑和方式施用藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，胃腸外施用 本發(fā)明的藥物組合物。本文所用"胃腸外施用"意指非腸內(nèi)和局部給藥的施用方式，通常通 過注射施用，包括表皮、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、腱 內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、顱內(nèi)、胸內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注 射和輸注。
[0620] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過靜脈內(nèi)或皮下注射或輸注施用藥物組合物。
[0621] 在一個(gè)主要方面，本發(fā)明涉及用作藥物的依照本發(fā)明的異二聚體蛋白諸如本發(fā)明 的雙特異性抗體。本發(fā)明的異二聚體蛋白可用于多種目的。具體來講，如上文解釋的，本發(fā) 明的異二聚體蛋白可用于治療各種形式的癌癥，包括轉(zhuǎn)移癌和難治性癌。
[0622] 因此，一方面，本發(fā)明涉及抑制腫瘤細(xì)胞的生長和/或增殖和/或殺傷腫瘤細(xì)胞的 方法，其包括對有需要的個(gè)體施用如本文描述的本發(fā)明異二聚體蛋白。
[0623] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的異二聚體蛋白用于治療免疫疾病和自身免疫疾 病、炎性疾病、感染性疾病、心血管疾病、CNS和肌肉骨骼疾病。
[0624] 調(diào)整上述治療方法和用途中的劑量方案以提供最佳的所需反應(yīng)（例如治療反 應(yīng)）。例如，可施用單次推注，可隨時(shí)間施用若干分劑量，或可按治療情況危急程度所示，按 比例減少或增加劑量。
[0625] 異二聚體蛋白的有效劑量和劑量方案取決于待治療的疾病或病況，并且可由本 領(lǐng)域技術(shù)人員決定。本發(fā)明雙特異性抗體的治療有效量的示例性、非限制性范圍為約 0· l-100mg/kg，諸如約 0· l-50mg/kg，例如約 0· l-20mg/kg，諸如約 0· l-10mg/kg，例如約 0. 5,約諸如0. 3,約1、約3、約5或者約8mg/kg 〇
[0626] 具有本領(lǐng)域普通技能的醫(yī)生或獸醫(yī)可容易決定和規(guī)定有效量的所需藥物組合物。 例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以以低于達(dá)到所需治療效果需要的水平開始給予用于藥物組合物中的 異二聚體蛋白的劑量，逐漸增加劑量直到達(dá)到所需效果。一般而言，本發(fā)明組合物的合適劑 量會是有效產(chǎn)生治療效果的最低劑量的化合物的量。施用可以是例如胃腸外，例如靜脈內(nèi)、 肌內(nèi)或皮下。
[0627] 本發(fā)明的異二聚體蛋白還可預(yù)防性給藥以減小發(fā)生疾病諸如癌癥的危險(xiǎn)，在疾病 進(jìn)展中延遲事件出現(xiàn)的發(fā)作，和/或當(dāng)疾病諸如癌癥緩解時(shí)減小復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。
[0628] 本發(fā)明的異二聚體蛋白諸如雙特異性抗體還可在組合療法中給藥，即與其它與待 治療疾病或狀況有關(guān)的治療劑組合。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，含異二聚體蛋白的藥物與一 種或多種其它治療劑諸如細(xì)胞毒劑、化療劑或抗血管生成劑組合。此類組合給藥可以同時(shí)、 單獨(dú)或序貫給予。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療疾病諸如癌癥的方法，該方法包括 對有需要的受試者施用治療有效量的與放射療法和/或手術(shù)組合的異二聚體蛋白，諸如本 發(fā)明的雙特異性抗體。
[0629] 本發(fā)明的異二聚體蛋白諸如雙特異性抗體還可用于診斷目的。 實(shí)施例
[0630] 實(shí)施例1 :用于表達(dá)人IgGl_2F8和IgGl_7D8的表達(dá)載體
[0631] 將 HuMab 2F8 (TO 02/100348)和 HuMab 7D8 (TO 04/035607)的 VH 和 VL 編碼 區(qū)克隆在表達(dá)載體pConGlf(含有人IgGlm(f)同種異型恒定區(qū)的基因組序列（Lonza Biologies))中用于制備人IgGl重鏈及克隆在pConKappa(含有人κ輕鏈恒定區(qū)，Lonza Biologies)中用于制備κ輕鏈。對于IgG4抗體，將VH區(qū)插入pTomG4載體（含有在 PEE12. 4載體（Lonza Biologies)中的人IgG4恒定區(qū)的基因組序列）中?；蛘?，在隨后 的構(gòu)建體中，使用含有在PEE12. 4載體中的重鏈（IgGl或IgG4)的完全密碼子優(yōu)化編碼區(qū) 或者在ρΕΕ6·4載體（Lonza Biologies)中的HuMab 2F8或HuMab 7D8的人κ輕鏈的載 體。此外，將HuMab-2F8的密碼子優(yōu)化的VH編碼區(qū)以及含有F405L突變的人IgGlm(za)同 種異型恒定區(qū)的密碼子優(yōu)化的序列在pcDNA3. 3載體（Invitrogen)中克隆，產(chǎn)生表達(dá)載體 p33Glza-2F8-F405L。
[0632] 實(shí)施例2 :用于表達(dá)鉸鏈缺失的IgGl_2F8和含有特定突變的人IgGl和IgG4 CH2-CH3片段的表達(dá)載體
[0633] 為了在抗體重鏈的鉸鏈和CH3區(qū)中引入突變，根據(jù)制造商的推薦使用 Quickchange定向誘變試劑盒（Stratagene，La Jolla，CA)?；蛘?，完全合成構(gòu)建體或?qū)H 區(qū)在已含有編碼取代的特定氨基酸的載體中克隆。
[0634] 通過PCR或者合成構(gòu)建完全密碼子優(yōu)化的編碼CH2和CH3片段的構(gòu)建體。這些構(gòu) 建體具有N-端信號肽和6個(gè)氨基酸的His標(biāo)簽，含有人IgGl/4恒定區(qū)的341-447位氨基 酸。將構(gòu)建體在PEE12. 4中克隆。
[0635] 為了構(gòu)建鉸鏈缺失的IgGl (Uni-Gl)分子，制備編碼具有EGFR特異性的人IgGl同 種型的Uni-Gl形式的合成DNA構(gòu)建體。在該構(gòu)建體中，將天然鉸鏈區(qū)（如由鉸鏈外顯子所 限定的）缺失。在IgGl構(gòu)建體中在158位產(chǎn)生額外的Ser至Cys突變以補(bǔ)救此同種型中 HC和LC鏈之間的Cys鍵。下文顯示了蛋白序列（SEQ ID N0:4)。將構(gòu)建體插入到pEE6.4 載體中，稱為PHG1-2F8。
[0636] QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYY ⑶ SVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0637] 實(shí)施例3:用于表達(dá)獼猴IgG4_2F8和IgG4_7D8的表達(dá)載體
[0638] 合成含有中國獼猴IgG4重鏈和κ輕鏈的編碼區(qū)和Humab2F8和7D8的VH和VL區(qū) 的載體，將其完全密碼子優(yōu)化并插在PEE 12. 4 (重鏈）和pEE6. 4 (輕鏈）中。所用重鏈恒定 區(qū)序列（基于由Scinicariello等，Immunology 111 :66_74, 2004描述的序列）如下（與 人序列比對）：
[0639] 人 IgG4
[0640] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH 獼猴（Ch) IgG4
[0641] -STKGPSVFPLASCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
[0642] 人 IgG4
[0643] TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG
[0644] 獼猴（Ch) IgG4
[0645] TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYVCNVVHEPSNTKVDKRVEFT-
[0646] 人 IgG4
[0647] PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
[0648] 獼猴（Ch) IgG4
[0649] PPCPACPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
[0650] 人 IgG4
[0651] QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
[0652] 獼猴（Ch) IgG4
[0653] QFNWYVDGAEVHHAQTKPRERQFNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCKV
[0654] 人 IgG4
[0655] SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY
[0656] 稱猴（Ch) IgG4
[0657] SNKGLPAPIEKTISKAKGQPREPQVYILPPPQEELTKNQVSLTCLVTGFY
[0658] 人 IgG4
[0659] PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF 獼猴（Ch) IgG4
[0660] PSDIAVEWESNGQPENTYKTTPPVLDSDGSYLLYSKLTVNKSRWQPGNIF
[0661] 人 IgG4 SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID N0:5)
[0662] 獼猴（Ch)IgG4 TCSVMHEALHNHYTQKSLSVSPGK(SEQ ID N0:6)
[0663] 使用的獼猴輕鏈恒定區(qū)（CL)序列是：
[0664] AVAAPSVFIFPPSEDQVKSGTVSVVCLLNNFYPREASVKWKVDGVLKTGNSQESVTEQDSKDNTYSLSS TLTLSSTDYQSHNVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :7)
[0665] 實(shí)施例4 :通過在HEK-293F細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)生成抗體
[0666] 按照制造商說明書，使用293fectin (Invitrogen)，通過在HEK-293F細(xì)胞 (Invitrogen)中共轉(zhuǎn)染相關(guān)的重鏈和輕鏈表達(dá)載體,在無血清條件下生成抗體。
[0667] 實(shí)施例5 :IgGl和IgG4抗體的純化
[0668] 通過蛋白A親和層析純化IgGl和IgG4抗體。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液用0. 20 μ Μ死端 式濾器過濾，接著在 5mL 蛋白 Α 柱（rProtein A FF，GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上上 樣，用0. 1M檸檬酸-NaOH，pH 3洗脫IgG。將洗脫液立即用2MTris-HCl，pH 9中和，并針對 12. 6mM憐酸鈉，140mM NaCl, pH 7. 4(B. Braun, Oss, The Netherlands)透析過夜。在透析后， 將樣品用〇. 20 μ Μ死端式濾器無菌過濾。通過比濁法和280nm處的吸光度確定純化的IgG 的濃度。將純化的蛋白用SDS-PAGE、IEF、質(zhì)譜法和糖分析法（glycoanalysis)分析。
[0669] 實(shí)施例6 :CH2_CH3片段的純化
[0670] 將有His標(biāo)簽的CH2-CH3蛋白通過固定化金屬離子（Ni2+)親和層析 (Macherey-Nagel GmbH, Diiren, Germany)純化，用 PBS 平衡的 Η)_10 柱（GE Healthcare)脫 鹽，用〇.2μΜ死端式濾器無菌過濾。通過280nm處的吸光度測定純化的蛋白質(zhì)的濃度。通 過SDS-PAGE分析了純化蛋白的質(zhì)量。
[0671] 實(shí)施例7 :通過人與獼猴IgG4抗體之間GSH誘導(dǎo)的Fab臂互換產(chǎn)生雙特異性抗體
[0672] 為了測試人與獼猴IgG4抗體之間的Fab臂交換，用人IgG4_2F8 (抗EGFR)、 IgG4-7D8 (抗CD20)、獼猴IgG4-2F8和獼猴IgG4-7D8制備兩種抗體所有可能的組合。對 于體外Fab臂交換，將抗體混合物（在0. 5mL PBS中以4 μ g/mL終濃度含有各種抗體）與 0. 5mM還原型谷胱甘肽（GSH)在37°C溫育24小時(shí)。為終止還原反應(yīng)，將.5mL PBS/0. 05% Tween20(PBST)加至反應(yīng)混合物。
[0673] 用夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)通過測定雙特異性結(jié)合測試雙特異性抗體 的存在情況。將ELISA板（Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)用 2 μ g/mL(100 μ L/ 孔）重組EGFR胞外域在PBS中在4°C包被過夜。將板用PBST清洗一次。將系列稀釋 的抗體樣品（0-1 μ g/mL，在3倍稀釋液中）在PBST/0. 2% BSA(PBSTB)中轉(zhuǎn)移至包被的 ELISA板（100 μ L/孔），在室溫（RT)在平板振蕩器（300rpm)上溫育60分鐘。棄去樣品， 將板用PBS/0. 05% Tween 20(PBST)清洗一次。接著，將板在平板振蕩器（300rpm)上與 含2yg/mL小鼠抗獨(dú)特型單克隆抗體2F2 SABI. 1 (針對7D8;Genmab)的PBTB(100yL/ 孔）溫育60分鐘。將板用PBS/0. 05% Tween 20 (PBST)清洗一次。接著，將板在平板振 蕩器（300rpm)上與PBSTB(100yL/孔）中綴合有HRP的山羊抗小鼠 IgG(15G;Jackson ImmunoResearch Laboratories, Westgrove, PA, USA ; 1: 5· 000)在RT -起溫育60 分鐘。將板 用 PBS/0. 05% Tween 20 (PBST)清洗一次。加入 ABTS(PBS 中 50mg/mL ;Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) (100 μ L/ 孔），并在 RT 避光溫育 30 分鐘。用 2 % 草酸（100 μ L/ 孔；Riedel de Haen Seelze, Germany)終止反應(yīng)。在RT10分鐘后，在ELISA讀板器中測量 405nm處的吸光度。
[0674] 圖1顯示人和獼猴IgG4的組合與相同物種的IgG4分子的各個(gè)組合相比產(chǎn)生更大 的雙特異性結(jié)合（更高的〇D 405nm)。這些數(shù)據(jù)顯示Fab臂互換發(fā)生在人IgG4與獼猴IgG4 之間。而且，更高的雙特異性結(jié)合提示人IgG4半分子顯示優(yōu)先與獼猴IgG4半分子二聚體 化（異二聚體化），導(dǎo)致Fab臂交換反應(yīng)的平衡轉(zhuǎn)向雙特異性異二聚體而不是轉(zhuǎn)向50%異 二聚體和50%同二聚體的隨機(jī)互換。
[0675] 實(shí)施例8 :人和獼猴IgG4的序列分析
[0676] 為了嘗試闡明與相同物種的IgG4分子之間的Fab臂交換相比的人與獼猴IgG4 之間的Fab臂交換增加，分析了人和獼猴抗體的核心鉸鏈和CH3-CH3界面氨基酸（關(guān)于人 CH3-CH3 界面殘基的綜述參見例如 Dall'Acqua,等（1998)Biochemistry 37:9266)。圖 2 顯示中國獼猴IgG4的核心鉸鏈序列是226-CPAC-229,并且CH3域含有在409位的賴氨酸 (K)。此外，序列比對顯示獼猴IgG4的特征在于與人IgG4相比在CH3-CH3界面的額外的三 個(gè)氨基酸取代：在350位獼猴為異亮氨酸（I)對比人的蘇氨酸（T);在370位獼猴為蘇氨酸 (T)對比人的賴氨酸（K);和在405位獼猴為亮氨酸（L)對比人的苯丙氨酸（F)。
[0677] 實(shí)施例9 :用人IgG4與含有獼猴IgG4CH3序列的人IgGl之間GSH誘導(dǎo)的Fab臂 交換產(chǎn)生雙特異性抗體
[0678] 基于實(shí)施例7所述人與獼猴IgG4之間的Fab臂交換，分析了中國獼猴IgG4CH3序 列是否可參與人IgGl的Fab臂交換。因此，除了產(chǎn)生鉸鏈序列CPSC的P228S突變外，將三 重突變T350I-K370T-F405L (下文稱為ITL)引入人IgGl_2F8中。將人IgGl-2F8突變體與 人IgG4-7D8組合用于體外GSH誘導(dǎo)的Fab臂交換。將含有在0. 5mL具有0. 5mM GSH的PBS 中4 μ g/mL終濃度的每種抗體的抗體混合物在37°C溫育0-3-6-24小時(shí)。為了終止還原反 應(yīng)，將0. 5mLPBS/0. 05% Tween20 (PBST)加至反應(yīng)混合物。按照實(shí)施例7所述在ELISA中進(jìn) 行雙特異性結(jié)合的測量。
[0679] 圖3證實(shí)與人IgG4-7D8組合時(shí)，單獨(dú)引入CPSC鉸鏈不使人IgGl-2F8參與GSH 誘導(dǎo)的Fab臂交換。而且，將獼猴IgG4特異性CH3界面氨基酸（ITL)引入人IgGl-2F8中 并同時(shí)保留野生型IgGl鉸鏈，在這些條件下與人IgG4-7D8組合時(shí)也不導(dǎo)致參加 Fab臂交 換。相反，具有在鉸鏈中的CPSC序列和獼猴IgG4特異性CH3界面氨基酸（ITL)的變體人 IgGl-2F8主鏈序列，在與人IgG4-7D8發(fā)生GSH誘導(dǎo)的Fab臂交換后，顯示比兩種人IgG4抗 體增加的雙特異性結(jié)合。這些數(shù)據(jù)顯示含CPSC的鉸鏈與在350、370和405位分別含有I、 T和L的CH3域組合，足以使人IgGl參加 GSH誘導(dǎo)的Fab臂交換，并且與人IgG4組合時(shí)，交 換反應(yīng)的平衡向經(jīng)交換的雙特異性產(chǎn)物移動。
[0680] 實(shí)施例10 :通過人IgG4與IgGl或IgG4突變體之間的體內(nèi)Fab臂交換產(chǎn)生雙特 異性抗體
[0681] 為了進(jìn)一步鑒定參與Fab臂交換需要的特征，體內(nèi)分析了人IgG4和IgGl變體。對 每組 4 只雌性 SCID 小鼠 （Charles River, Maastricht, The Netherlands) i.v.注射抗體混 合物，其在300 μ L總體積中含有600 μ g抗體（500 μ g 7D8+100 μ g2F8)。在注射后3、24、 48和72小時(shí)從隱靜脈抽取血液樣品。將血液收集在含肝素的瓶中，以10, 000g離心5分鐘 使細(xì)胞與血漿分離。產(chǎn)生雙特異性抗體，接著按實(shí)施例7所述用在PBSTB中系列稀釋的血 漿樣品在ELISA中評估⑶20和EGFR雙特異性反應(yīng)性。用體外經(jīng)交換的抗體混合物作為參 考物，通過非線性回歸曲線擬合（GraphPad Software, San Diego, CA)將血楽樣品中的雙特 異性抗體量化。
[0682] 圖4顯示其中鉸鏈或CH3序列轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的人IgGl序列（分別是CPPC或R409K) 的人IgG4-2F8不再參加體內(nèi)Fab臂交換。反之亦然，其中鉸鏈區(qū)和CH3界面序列兩者轉(zhuǎn)化 為相應(yīng)的人IgG4序列（CPSC和K409R)人IgGl能夠參與體內(nèi)Fab臂交換。這些數(shù)據(jù)顯示含 CPSC的鉸鏈（在228位的S)與在409位含精氨酸（R)的CH3域組合，足以使通過人IgGl 和人IgG4在體內(nèi)的Fab臂交換能夠進(jìn)行。
[0683] 實(shí)施例11 :通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab臂交換產(chǎn)生雙特異性抗體：穩(wěn)定化鉸鏈的繞開 /破壞
[0684] 2-巰基乙胺·Η(：1 (2-MEA)是溫和的還原劑，已被描述為選擇性裂解抗體鉸鏈區(qū)的 二硫鍵，同時(shí)保留重鏈與輕鏈之間的二硫鍵。測試一系列濃度的2-ΜΕΑ通過兩種含有CPSC 或CPPC鉸鏈區(qū)的抗體之間的Fab臂交換誘導(dǎo)雙特異性抗體產(chǎn)生的能力。將抗體混合物（含 有各種0· 5mg/mL終濃度的抗體）與一系列濃度的2-MEA (0,0· 5, L 0, 2. 0, 5. 0, 7. 0,10. 0， 15. 0,25. 0和40. OmM)以100 μ L Tris-EDTA(TE)總體積中于37°C溫育90分鐘。為了終止 還原反應(yīng)，按照制造商推薦用離心柱（Microcon離心過濾器，30k，Millipore)通過使樣品 脫鹽除去還原劑2-MEA。按照實(shí)施例7所述在ELISA中測量雙特異性結(jié)合。
[0685] 對組合IgG4-2F8 X IgG4-7D8 (其含有CPSC鉸鏈區(qū)且已知參與GSH誘導(dǎo)的Fab臂 交換）和組合IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC(其因?yàn)榉€(wěn)定的鉸鏈區(qū)而不參與GSH誘導(dǎo) 的Fab臂交換（描述于實(shí)施例9,圖3))測試2-MEA誘導(dǎo)的Fab臂交換。令人驚奇地，如通 過非還原性SDS-PAGE所確定的，發(fā)現(xiàn)2-MEA誘導(dǎo)輕鏈與重鏈分離（數(shù)據(jù)未顯示）。但是， 如圖5所示產(chǎn)生功能性雙特異性抗體。在2. 0mM2-MEA濃度下達(dá)到在野生型人IgG4-2F8與 IgG4-7D8之間的Fab臂交換后雙特異性結(jié)合的最大水平，其與實(shí)施例9所述的用0. 5mM GSH 所達(dá)到的水平（圖3)相當(dāng)。但是，2-MEA能夠以劑量依賴性方式誘導(dǎo)人抗體IgGl-2F8-lTL 與IgG4-7D8-CPPC(具有穩(wěn)定的鉸鏈區(qū)）之間的Fab臂交換。雖然在低2-MEA濃度形成很 少或不形成雙特異性抗體（這可能是因?yàn)閮煞N抗體的鉸鏈區(qū)都存在CPPC序列所致），但在 更高濃度的2-MEA下非常有效地產(chǎn)生雙特異性抗體。在25mM2-MEA達(dá)到最大的雙特異性結(jié) 合，其超過在兩種野生型IgG4抗體之間的Fab臂交換后的最大結(jié)合。這些最大結(jié)合水平與 實(shí)施例9(圖3)關(guān)于對含有CPSC鉸鏈的相應(yīng)抗體（IgGl-2F8-CPSC-ITL)的GSH處理所述 的最大結(jié)合水平相當(dāng)。因?yàn)镮gGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC兩者都含有CPPC鉸鏈，所以 這些數(shù)據(jù)提示2-MEA可繞過體外Fab臂交換對CPSC鉸鏈的需要。
[0686] 實(shí)施例12 :在通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab臂交換產(chǎn)生雙特異性抗體后的質(zhì)譜法
[0687] 通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab臂交換產(chǎn)生雙特異性抗體描述于實(shí)施例11，其中雙特異 性結(jié)合通過ELISA顯示（圖5)。為了證實(shí)形成雙特異性抗體，通過電噴霧電離質(zhì)譜法 (ESI-MS)分析樣品以確定分子量。首先，通過將200μ 8抗體與0.005U N-聚糖酶（產(chǎn) 品目錄號GKE-5006D ;Pr〇Zyme)在180μ L PBS中在37°C溫育過夜使樣品去糖基化。將 樣品在具有 BEH300C18, 1·7μπι，2· 1x50mm 柱的 Aquity UPLC?(Waters，Milford，USA)上 60°(1|脫鹽，用含0.05(%甲酸（卩1111^1^6(161-(16 1131&1,1311(3118,661'1]1&115〇的]^-]\^級乙臆 (洗脫劑13)(13；[0801￥6，\^11^118￥331(1，1116他1：1161'1311(18)和]\1( >)水（洗脫劑4)的混合物 梯度洗脫。在以正離子模式操作的mi crOTOF?質(zhì)譜儀（Bruker, Bremen, Germany)上在 線記錄飛行時(shí)間電噴霧電離質(zhì)譜。在分析前，用ES調(diào)諧混合物（tuning mix) (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)校準(zhǔn) 500-4000m/z 標(biāo)度。通過用由DataAnalysis? 軟件 3· 4版本（Bruker, Bremen, Germany)提供的Maximal Entropy對質(zhì)譜解卷積?；谠诒緦?shí) 驗(yàn)用于Fab臂交換的抗體分子量，可將雙特異性抗體與原來的抗體區(qū)別開來（還描述于實(shí) 施例15,對于IgGl-2F8-ITLxIgG4-7D8-CPPC，見圖9C)。對于雙特異性抗體的峰，確定曲線 下面積，并除以曲線下總面積以計(jì)算每個(gè)樣品中的雙特異性抗體百分?jǐn)?shù)。
[0688] 圖6A顯示用0mM2-MEA(對應(yīng)于親本抗體的兩個(gè)峰）、7mM2-MEA(對應(yīng)于親本 和雙特異性抗體的三個(gè)峰）和40mM2-MEA(對應(yīng)于雙特異性抗體的一個(gè)峰）進(jìn)行的 IgGl-2F8-ITL與IgG4-7D8-CPPC之間的Fab臂交換反應(yīng)的三個(gè)代表性質(zhì)譜曲線。雙特異性 產(chǎn)物的均勻峰提示不發(fā)生輕鏈錯(cuò)配（這會導(dǎo)致再分的峰）。定量數(shù)據(jù)在圖6B中呈現(xiàn)，顯示 1 861-2?8-111與1864-708-0--(：之間的？&13臂交換產(chǎn)生接近100%雙特異性抗體。相反， 野生型IgG4抗體之間的Fab臂交換產(chǎn)生少于50%雙特異性產(chǎn)物。這些數(shù)據(jù)證實(shí)描述于實(shí) 施例11的雙特異性結(jié)合ELISA的結(jié)果（圖5)。
[0689] 實(shí)施例13 :通過2-MEA誘導(dǎo)Fab臂交換產(chǎn)生的雙特異性抗體的穩(wěn)定性
[0690] 測試通過2-MEA誘導(dǎo)的體外Fab臂交換產(chǎn)生的雙特異性抗體的穩(wěn)定性。因此，將 2 μ g用7. 0mM2_MEA從IgGl_2F8_ITL和IgG4_7D8_CPPC產(chǎn)生的雙特異性樣品（如實(shí)施例11 所述，圖5)在一系列濃度（0、2、20、100μ g)的無關(guān)IgG4(針對乙酰膽堿受體的IgG4-MG) 的存在下用于GSH誘導(dǎo)的Fab臂交換反應(yīng)，所述一系列濃度代表與2 μ g雙特異性測試樣品 相比0,1，10, 50倍過量的IgG4-MG。在該反應(yīng)中的Fab臂交換會導(dǎo)致雙特異性EGFR/⑶20 結(jié)合的喪失。GSH還原反應(yīng)的條件與實(shí)施例7所述相同（在37°C在0. 5mLPBS/0. 5mM GSH 中24小時(shí)）。為了終止還原反應(yīng)，將0. 5mL PBSTB加至反應(yīng)混合物。按照實(shí)施例7所述在 ELISA中測量雙特異性結(jié)合。將GSH還原反應(yīng)后的雙特異性結(jié)合相對于在起始材料（對照） 中測量的雙特異性結(jié)合（其設(shè)置為100% )表示。
[0691] 圖7A顯示對于IgGl-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC衍生的雙特異性樣品，在無關(guān) IgG4的存在下GSH誘導(dǎo)的Fab臂交換后的EGFR/⑶20雙特異性結(jié)合無明顯改變。這指 示雙特異性產(chǎn)物穩(wěn)定，即不參與GSH誘導(dǎo)的Fab臂交換。作為對照，圖7B顯示IgG4-2F8 X IgG4-7D8衍生的樣品顯示在無關(guān)IgG4的存在下GSH誘導(dǎo)的Fab臂交換后減少的 EGFR/⑶20雙特異性結(jié)合，指示該產(chǎn)物不穩(wěn)定。這些數(shù)據(jù)顯示由在CH3域含有三重突變 T350I-K370T-F405L的人IgGl重鏈和含有產(chǎn)生穩(wěn)定化鉸鏈（CPPC)的S228P取代的人IgG4 重鏈組成的異二聚體是穩(wěn)定的。
[0692] 實(shí)施例14 :通過2-MEA誘導(dǎo)的Fab臂交換產(chǎn)生的雙特異性抗體的藥動學(xué)和穩(wěn)定性 的體內(nèi)分析
[0693] 將通過IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC之間體外2-MEA誘導(dǎo)的Fab臂交換產(chǎn) 生的雙特異性抗體（實(shí)施例11，圖5,7mM2-MEA)注射在SCID小鼠中以分析其與親本抗體 IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC比較的穩(wěn)定性（體內(nèi)Fab臂交換）和藥動學(xué)性質(zhì)（血漿清 除率）。對三組小鼠（每組3只小鼠）尾靜脈內(nèi)靜脈內(nèi)注射200 μ L純化抗體：（1) 100 μ g雙 特異性抗體；（2) 100 μ g雙特異性抗體+1，000 μ g無關(guān)IgG4 (那他珠單抗，抗-α 4-整聯(lián)蛋 白）；（3)50yg IgGl-2F8-ITL+50yg IgG4-7D8-CPPC。在抗體施用后以預(yù)定時(shí)間間隔（10 分鐘、3小時(shí)、1、2、7、14、21天）通過頰穿刺收集血液樣品（50-100 μ L)。將血液收集在含肝 素的小瓶內(nèi)，以14, 000g離心10分鐘。在進(jìn)一步分析以前將血漿貯存于_20°C。
[0694] 通過ELISA測定血漿樣品中的總IgG濃度。后續(xù)步驟的測定條件與實(shí)施例7所述 ELISA的相同。用于總IgG測量的具體化合物如下：用2 μ g/mL小鼠抗人IgG (克隆MH16-1 ; CLB ;產(chǎn)品目錄號M1268)包被；血清樣品稀釋液（對于第1和3組為1:500和1:2, 500)和 (對于第2組為1:2, 500和1:10,000);綴合物：綴合有HRP的山羊抗人IgG(克隆11H; Jackson ;產(chǎn)品目錄號109-035-098 ;1:10, 000)。測定血漿樣品中雙特異性抗體的存在，并 通過如實(shí)施例10所述在ELISA中的⑶20和EGFR雙特異性反應(yīng)性來量化。
[0695] 圖8A顯示總抗體血漿濃度。血漿清除曲線的形狀在所有組中是相同的，指示在 分析時(shí)間間隔里雙特異性抗體的血漿清除與親本抗體IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC相 同。圖8B顯示隨著時(shí)間推移雙特異性抗體的血漿濃度。將10倍過量的無關(guān)IgG4加至 雙特異性抗體不影響雙特異性抗體濃度，指示不發(fā)生體內(nèi)Fab臂交換。在注射親本抗體 (IgGl-2F8-ITL+IgG4-7D8-CPPC)后，血漿中檢測不到雙特異性抗體，證實(shí)這些抗體不參與 體內(nèi)Fab臂交換。這些數(shù)據(jù)提示通過IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC之間的體外2-MEA 誘導(dǎo)Fab臂交換產(chǎn)生的雙特異性抗體產(chǎn)物，在體內(nèi)穩(wěn)定（無 Fab臂交換）并顯示與親本單 價(jià)抗體相當(dāng)?shù)乃幋鷦恿W(xué)性質(zhì)（血漿清除率）。
[0696] 實(shí)施例15 :通過兩種抗體之間2-MEA誘導(dǎo)Fab臂交換產(chǎn)生的雙特異性抗體的純度
[0697] 將通過人IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC之間2-MEA誘導(dǎo)Fab臂交換產(chǎn)生的雙 特異性抗體批次，在ro-ΙΟ脫鹽柱（產(chǎn)品目錄號17-0851-01 ;GEHealthcare)上純化。接 著，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)、高效大小排阻層析（ΗΡ-SEC)和 質(zhì)譜法分析雙特異性產(chǎn)物的純度。通過在ELISA中的雙特異性結(jié)合（數(shù)據(jù)未顯示）證實(shí)了 產(chǎn)生的雙特異性抗體的功能性。
[0698] 用改良的 Laemmli 法（Laemmlil970Nature227 (5259) :680-5)在 4-12 % NuPAGE Bis-Tris凝膠（Invitrogen, Breda, The Netherlands)上在還原和非還原條件下進(jìn)行 SDS-PAGE，其中在中性pH運(yùn)行樣品。將SDS-PAGE凝膠用考馬斯染色，并用GeneGenius (Syn optics, Cambridge, UK)數(shù)字成像。圖9A顯示在Fab臂交換后的抗體樣品由完整IgG和在 非還原凝膠上可檢測到的痕量半分子（H1L1)構(gòu)成（圖9A-b)。
[0699] 用連接 TSK ΗΡ-SEC 柱（G3000SWxl ;Toso Biosciences, via Omnilabo，Breda，The Netherlands)和 Waters2487 雙重 λ 吸光度檢測器（Waters)的 Waters Alliance2695 分 離單兀（Waters, Etten-Leur, The Netherlands)進(jìn)行 HP-SEC 分級。使樣品以 lmL/min 運(yùn) 行。將結(jié)果用2002版Empower軟件處理，并將每個(gè)峰表示為總峰高的百分?jǐn)?shù)。圖9B顯示 >98%的樣品由完整IgG構(gòu)成，實(shí)際上不形成聚集物。
[0700] 按照實(shí)施例12所述進(jìn)行質(zhì)譜法。圖9C顯示起始材料IgGl-2F8-ITL和 IgG4-7D8-CPPC 以及通過 IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC 之間的 Fab 臂交換產(chǎn)生 的雙特異性產(chǎn)物的質(zhì)譜概貌。在Fab臂交換的樣品中的產(chǎn)物是145, 90lkDa，其與從 IgGl-2F8-ITL(146, 259. 5/2 = 73, 130)+IgG4-7D8-CPPC(145, 542. 0/2 = 72, 771)衍生的雙 特異性產(chǎn)物完全相配。此外，雙特異性抗體產(chǎn)物顯示均勻的峰，提示不發(fā)生會導(dǎo)致產(chǎn)生再分 的峰的輕鏈錯(cuò)配。這些數(shù)據(jù)顯示Fab臂交換產(chǎn)生100%雙特異性抗體。除了 IgG4-7D8-CPPC 和雙特異性樣品的主峰（K0)以外所檢測到的小峰可歸因于抗體重鏈中存在一個(gè)（K1)或兩 個(gè)（K2)C-端賴氨酸。
[0701] 這些數(shù)據(jù)顯示約100 %功能性雙特異性抗體樣品是通過IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC之間的2-MEA誘導(dǎo)Fab臂交換產(chǎn)生的。
[0702] 實(shí)施例16 :闡明人IgGl進(jìn)行Fab臂交換對T350I、K370T和F405L取代的需要 [0703] 為了進(jìn)一步鑒定IgGl參與Fab臂交換所需要的在IgGl CH3域中的決定 簇（determinant)，將含有三重突變T350I-K370T-F405L (ITL)的IgGl與雙重突變體 T350I-K370T(IT)，T350I-F405L(IL)和 K370T-F405L(TL)比較。還測試單突變體 405L(L)。 用2-MEA作為還原劑以誘導(dǎo)體外Fab臂交換（50 μ g每種抗體在100 μ L PBS/25mM2-MEA 中在37°C達(dá)90分鐘）。對于單突變體F405L抗體，在使用Amicon Ultra離心裝置 (30k，Millipore，產(chǎn)品目錄號UFC803096)將緩沖液更換為PBS后使用來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上清液 的未純化抗體。為了終止還原反應(yīng)，按照實(shí)施例11所述使用離心柱通過使樣品脫鹽除去還 原劑2-MEA。通過在按照實(shí)施例7所述的ELISA中測量的雙特異性結(jié)合來確定雙特異性抗 體的產(chǎn)生。
[0704] 將三重突變（ITL)、雙重突變（IT、IL和TL)和單突變（L)引入IgGl-2F8中。將 這些突變體與含有CPSC鉸鏈（野生型）或穩(wěn)定化鉸鏈（IgG4-7D8-CPPC)的IgG4-7D8組 合，在37°C用25mM2-MEA進(jìn)行Fab臂交換90分鐘。圖10A-B顯示IgGl-2F8-IL和-TL突 變體顯示與三重突變體ITL相同水平的Fab臂交換，這與組合的IgG4-7D8 (CPSC或CPPC鉸 鏈）無關(guān)。相比之下，對于與IgGl-2F8-IT突變體的組合未發(fā)現(xiàn)雙特異性結(jié)合。圖10C顯 示IgGl-2F8-F405L突變體也顯示Fab臂交換，這與組合的IgG4-7D8 (CPSC或CPPC鉸鏈） 無關(guān)。這些數(shù)據(jù)指示在上述條件下F405L突變足以使人IgGl參與Fab臂交換。
[0705] 實(shí)施例17 :在不同溫度下通過2-MEA誘導(dǎo)Fab臂交換產(chǎn)生雙特異性抗體
[0706] 在不同溫度下測試2-MEA誘導(dǎo)通過兩種不同抗體之間的Fab臂交換產(chǎn)生雙特異 性抗體的能力。通過在0°C、20°C(RT)或37°C在320μ1 PBS/25mM2-MEA中將160yg人 IgGl-2F8-ITL與160μ g IgG4-7D8-CPPC(每種抗體終濃度為0· 5mg/mL) -起溫育開始 Fab臂交換反應(yīng)。從這些反應(yīng)中，在不同時(shí)間點(diǎn)（0、2. 5、5、10、15、30、45、60、75、90、120、 150、180和240分鐘）取出20yL樣品。將20yL PBS加至每個(gè)樣品，之后按照制造商 的推薦，用Zeba96孔離心脫鹽板（7k,產(chǎn)品目錄號89808Thermo Fisher Scientific)通 過使樣品脫鹽，除去還原劑2-MEA。使用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands)通過測量280nm波長的吸光度確定總抗體濃度。按 照實(shí)施例7所述在ELISA中使用系列稀釋的抗體樣品（總體濃度0-20 μ g/mL，在25倍稀釋 液中）測量雙特異性結(jié)合。
[0707] 圖11顯示發(fā)現(xiàn)通過人IgGl-2F8-ITL與IgG4-7D8-CPPC之間的2-MEA誘導(dǎo)的Fab 臂交換產(chǎn)生雙特異性抗體在37°C最有效，45分鐘后達(dá)到最大雙特異性結(jié)合。在室溫，雙特 異性抗體的產(chǎn)生更慢，240分鐘后達(dá)到最大雙特異性結(jié)合。在0°C，在分析時(shí)間過程期間觀 察不到雙特異性結(jié)合的產(chǎn)生。
[0708] 實(shí)施例18 :對不同還原劑分析其誘導(dǎo)通過體外Fab臂交換產(chǎn)生雙特異性抗體的能 力
[0709] 上文已顯示0. 5mM GSH可在體外誘導(dǎo)人IgG4與IgGl-CPSC-ITL之間而不是人 IgG4與含有穩(wěn)定鉸鏈的IgGl-ITL之間的Fab臂交換（圖3)。此外，發(fā)現(xiàn)2-MEA能夠誘導(dǎo) 具有穩(wěn)定化鉸鏈區(qū)的抗體諸如IgGl-ITL X IgG4-CPPC之間的Fab臂交換（圖5)。為了測 試是否其它濃度的GSH或2-MEA或者其它還原劑能夠體外誘導(dǎo)兩種不同抗體之間的Fab臂 交換，測試一系列濃度的2-MEA、GSH和DTT (二硫蘇糖醇）。因此，將20 μ 1 PBS中10 μ g人 IgGl-2F8-ITL和10μ gIgG4-7D8-CPPC (每種抗體終濃度為0. 5mg/mL)的組合與一系列濃度 的不同還原劑（〇· 〇,〇· 04,0· 1，0· 2,0· 5,1. 0,2· 5,5· 0,12. 5,25· 0 和 50. OmM)在 37°C溫育。 90分鐘后，將20 μ L PBS加至每種樣品，并按照實(shí)施例17所述用離心脫鹽板通過使樣品脫 鹽除去還原劑。按照實(shí)施例17所述確定總抗體濃度。按照實(shí)施例7所述在ELISA中使用 抗體樣品的系列稀釋液（總抗體濃度0-20 μ g/mL，3倍稀釋）測量雙特異性結(jié)合。
[0710] 圖12證實(shí)2-MEA在25mM2-MEA濃度下誘導(dǎo)最大雙特異性結(jié)合。發(fā)現(xiàn)DTT非常有 效地產(chǎn)生雙特異性抗體，在2. 5mM DTT下達(dá)到最大雙特異性結(jié)合。在0-5mM范圍的GSH濃 度不能誘導(dǎo)通過IgGl-ITL與IgG4-CPPC抗體（兩者都含有穩(wěn)定化鉸鏈區(qū)）之間的Fab臂 交換產(chǎn)生雙特異性抗體。更高的GSH濃度（12. 5-50mM)導(dǎo)致形成抗體聚集物，如通過非還 原性SDS-PAGE(數(shù)據(jù)未顯示）所確定的。因此，從分析中排除這些樣品。這些數(shù)據(jù)顯示不 同還原劑可誘導(dǎo)通過兩種不同抗體之間的Fab臂交換產(chǎn)生雙特異性抗體。
[0711] 實(shí)施例19 :用于與IgGl-ITL組合參加2-MEA誘導(dǎo)的Fab臂交換的在IgG1409位 的決定簇
[0712] 2-MEA可誘導(dǎo)人IgGl-ITL和IgG4-CPPC之間的Fab臂交換，如實(shí)施例11所述（圖 5)。人IgGl與IgG4的CH3界面殘基區(qū)別只在于409位：IgGl為賴氨酸⑷和IgG4為精 氨酸（R)(描述于實(shí)施例8,圖2)。因此，測試在409位用精氨酸或任何其它氨基酸取代賴 氨酸（K409X)，是否可使IgGl能夠參加2-MEA誘導(dǎo)的與IgGl-ITL的Fab臂交換。將20 μ 1 PBS/25mM2-MEA 中 10 μ g 人 IgGl-2F8-ITL 和 10 μ g IgGl-7D8-K409X 的組合（每種抗體終 濃度為〇.5mg/mL)在37°C溫育90分鐘。在用Amicon Ultra離心單元（30k，Millipore,產(chǎn) 品目錄號UFC803096)將緩沖液更換為PBS后，使用來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上清液的未純化抗體。在 Fab臂交換反應(yīng)后，將20μ L PBS加至每種樣品，按照實(shí)施例17所述使用離心脫鹽板通過使 樣品脫鹽除去還原劑。按照實(shí)施例7所述在ELISA中使用抗體樣品的系列稀釋液（總抗體 濃度0-20 μ g/mL，在3倍稀釋液中）測量雙特異性結(jié)合。
[0713] 圖 13A 顯示在 IgGl-2F8-ITL X IgGl-7D8-K409X 之間 2-MEA 誘導(dǎo)的 Fab 臂交換后 雙特異性結(jié)合的結(jié)果。在圖13B中，將交換表示為相對于純化批次的雙特異性抗體（將其設(shè) 為100% )的雙特異性結(jié)合，所述雙特異性抗體從IgGl-2F8-ITL與IgG4-7D8-CPPC之間的 2-MEA誘導(dǎo)的Fab臂交換衍生。如表I表示，還將這些數(shù)據(jù)評分為（-)無 Fab臂交換、（+/-) 低度、（+)中度或（++)高度Fab臂交換。當(dāng)IgGl-7D8的409位是K(=野生型IgGl)、L或 Μ時(shí)發(fā)現(xiàn)無 Fab臂交換（-)。發(fā)現(xiàn)Fab臂交換當(dāng)IgGl-7D8的409位是F、I、N或Y時(shí)是中度 (+)，當(dāng) IgGl-7D8 的 409 位是 A、D、E、G、H、Q、R、S、T、V 或 W 時(shí)為高度（++)。
[0714] 表 1 :2-MEA 誘導(dǎo)的 IgGl-2F8-ITL 和 IgGl-7D8-K409X 突變體之間的 Fab 臂交換。 通過夾心ELISA確定2-MEA誘導(dǎo)的IgGl-2F8-ITL和IgGl-7D8-K409X突變體之間的體外 Fab臂交換后雙特異性抗體的產(chǎn)生。（_)無，（+/_)低度，（+)中度，（++)高度Fab臂交換。
[0715]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于生成異二聚體蛋白的體外方法，其包括下列步驟： a) 在還原性條件下將第一同二聚體蛋白與第二同二聚體蛋白一起溫育，所述還原性條 件足以容許鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵還原，且 其中所述第一同二聚體蛋白包含免疫球蛋白的Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)，且所 述第二同二聚體蛋白包含免疫球蛋白的Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含第二CH3區(qū)，且其中所述第一 和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3區(qū)之間的異二聚體相互作用 強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用， b) 使從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，所述氧化條件足以容許所述異二聚體蛋 白中的半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵。
2. 依照權(quán)利要求1的體外方法，其中步驟b)包括使至少10mL從步驟a)獲得的組合物 經(jīng)受足以容許氧化的氧化條件。
3. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述方法進(jìn)一步包括如下步驟： c) 獲得所述異二聚體蛋白。
4. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟a)中的所述還原性條件包括添 加還原劑。
5. 依照權(quán)利要求4的體外方法，其中所述還原劑選自下組：2_巰基乙胺、2-巰基乙胺 的化學(xué)衍生物、L-半胱氨酸、和D-半胱氨酸。
6. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟a)包括添加金屬螯合劑。
7. 依照權(quán)利要求6的體外方法，其中所述金屬螯合劑是EDTA、EGTA或檸檬酸。
8. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟a)中的所述還原性條件包括減 少步驟a)中的組合物中的氧量。
9. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中在還原性條件下實(shí)施步驟a)，所述還 原性條件具有介于-150和-600mV之間，諸如介于-350和-450mV之間的氧化還原電勢。
10. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟a)包括在存在至少25mM選自 下組的還原劑的情況中于至少20°C的溫度溫育至少30分鐘：2_巰基乙胺、L-半胱氨酸和 D-半胱氨酸。
11. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一和第二同二聚體蛋白在緩 沖液中。
12. 依照權(quán)利要求11的體外方法，其中所述緩沖液包含范圍為Ι-lOOmM的磷酸鹽，諸如 l-50mM磷酸鹽或范圍為1-25禮，或范圍為5-20mM。
13. 依照權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述緩沖液具有范圍為4. 5-8. 5， 諸如范圍為6. 5至7. 5的pH。
14. 依照權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述緩沖液選自下組：a)8. ImM磷 酸鈉（Na2HP04-7H20)、1· 5mM 磷酸鉀（KH2P04)、138mM 氯化鈉（NaCl)、2· 7mM 氯化鉀（KCl)pH 5· 0 ;b)8. ImM磷酸鈉（Na2HP04-7H20)、L 5mM 磷酸鉀（KH2P04)、138mM 氯化鈉（NaCl)、2· 7mM 氯 化鉀（KCl)pH 7.0 ;3)20mM Tris-HCl，pH 7.8。
15. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)包括范圍為6-8. 5的pH。
16. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)包括至少-300mV的氧化還原 電勢。
17. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)中的所述氧化條件包括至少 0. 05mM氧氣的存在。
18. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)中的所述氧化條件包括添加 氧氣。
19. 依照權(quán)利要求18的體外方法，其中以機(jī)械方式，例如通過攪動、攪拌、提高壓力或 產(chǎn)生流動實(shí)施添加氧氣。
20. 依照權(quán)利要求18-19中任一項(xiàng)的體外方法，其中通過用氧氣或空氣噴射或者提高 壓力實(shí)施添加氧氣。
21. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)中的所述氧化條件包括氧化 劑。
22. 依照權(quán)利要求21的體外方法，其中所述氧化劑是脫氫抗壞血酸（dhAA)。
23. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)包括分開所述異二聚體蛋白 和所述還原劑。
24. 依照權(quán)利要求23的體外方法，其中步驟b)包括使從步驟a)獲得的組合物經(jīng)受層 析或過濾。
25. 依照權(quán)利要求24的體外方法，其中所述層析是柱層析。
26. 依照權(quán)利要求24的體外方法，其中所述過濾是滲濾。
27. 依照權(quán)利要求26的方法，其中所述滲濾是切向流過濾（TFF)或正常流過濾（NFF)。
28. 依照權(quán)利要求27的體外方法，其中所述滲濾是TFF。
29. 依照權(quán)利要求27的體外方法，其中通過使所述組合物循環(huán)通過中空纖維筒實(shí)施所 述滲濾，直到發(fā)生了 1至7個(gè)體積的緩沖液更換，所述中空纖維筒包含范圍為10-50kDa的 截留值，且具有范圍為〇. 〇5-lm2的表面積，且具有范圍為70-280kPa的筒入口壓力。
30. 依照權(quán)利要求23-29中任一項(xiàng)的體外方法，其中分開所述異二聚體蛋白和所述還 原劑包括用不含所述還原劑的緩沖液或溶液更換從步驟a)獲得的組合物的緩沖液或溶 液。
31. 依照權(quán)利要求30的體外方法，其包括范圍為3-12個(gè)體積的緩沖液或溶液更換，諸 如范圍為4-10個(gè)體積。
32. 依照權(quán)利要求24-30中任一項(xiàng)的體外方法，其中分開所述異二聚體蛋白和所述還 原劑是連續(xù)過程。
33. 依照權(quán)利要求24-30中任一項(xiàng)的體外方法，其中分開所述異二聚體蛋白和所述還 原劑是分批過程。
34. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)中的所述氧化條件包括下列 步驟： I) 從步驟a)獲得的組合物的滲濾 II) 從步驟I)獲得的滲余物的溫育 III) 從步驟II)獲得的組合物的滲濾。
35. 依照權(quán)利要求34的體外方法，其中步驟I)和/或III)中所述的滲濾包括范圍為 3-12個(gè)體積的緩沖液更換。
36. 依照權(quán)利要求34-35中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟II)包括于范圍為15-35°C的 溫度溫育12-48小時(shí)的時(shí)段。
37. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中從步驟a)獲得的所述組合物中的異 二聚體蛋白濃度范圍為l-l〇〇g/L。
38. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)中的所述氧化條件包含金屬 離子。
39. 依照權(quán)利要求38的體外方法，其中步驟b)中的所述氧化條件包括添加金屬離子。
40. 依照權(quán)利要求38-39中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述金屬離子的濃度范圍為0. 1至 100 μ M。
41. 依照權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述金屬離子選自下組：銅、錳、 鎂、鐵、鎳和鈷。
42. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟a)中第一與第二同二聚體蛋白 的比率范圍為1:1.01至1:2。
43. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一或第二同二聚體蛋白不能 結(jié)合蛋白A和/或蛋白G。
44. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一和第二同二聚體蛋白包含 不同輕鏈。
45. 依照權(quán)利要求44的體外方法，其中步驟c)包括通過將所述異二聚體蛋白在僅與輕 鏈之一結(jié)合的材料上通過而將其與殘留的第一和/或第二同二聚體蛋白分開。
46. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一和第二同二聚體蛋白的Fc 區(qū)是不同同種異型的。
47. 依照權(quán)利要求44的體外方法，其中步驟c)包括通過將所述異二聚體蛋白在僅與所 述同種異型之一結(jié)合的材料上通過而將其與殘留的第一和/或第二同二聚體蛋白分開。
48. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟c)包括使從步驟b)獲得的組合 物經(jīng)受純化方法。
49. 依照權(quán)利要求48的體外方法，其中所述純化方法選自下組：蛋白A或蛋白G層析、 基于抗原結(jié)合的親和層析、基于抗獨(dú)特型抗體的親和層析、離子交換、疏水性相互作用層 析、混合式層析（諸如羥磷灰石）、固定化金屬親和層析和親硫性吸附層析。
50. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟a)包括下列步驟： i) 提供包含免疫球蛋白的Fc區(qū)的第一同二聚體蛋白，所述Fc區(qū)包含第一 CH3區(qū)， ii) 提供包含免疫球蛋白的Fc區(qū)的第二同二聚體蛋白，所述Fc區(qū)包含第二CH3區(qū)， 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3區(qū)之間的 異二聚體相互作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用， iii) 在還原性條件下將所述第一蛋白與所述第二蛋白一起溫育，所述還原性條件足以 容許所述鉸鏈區(qū)中鏈間二硫鍵的還原。
51. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟b)包括使至少30mL從步驟a) 獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，所述氧化條件足以容許所述異二聚體蛋白中的半胱氨酸氧化 成鏈間-硫鍵。
52. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟a)中的第一同二聚體和第二同 二聚體蛋白的終濃度是至少〇. 25mg/mL。
53. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列含有 不同位置處的氨基酸取代。
54. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中相對于野生型CH3區(qū)，所述第一同二 聚體蛋白具有述CH3區(qū)中的不超過1處氨基酸取代，且所述第二同二聚體蛋白具有CH3區(qū) 中的不超過1處氨基酸取代。
55. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一同二聚體蛋白具有選自下 組的位置處的氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，且所述第二同二聚體蛋白具 有選自下組的位置處的氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，且其中所述第一同 二聚體蛋白和所述第二同二聚體蛋白不在相同位置處被取代。
56. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一同二聚體蛋白具有位置 409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二同二聚體蛋白具有選自下組的位置處 的氨基酸取代：366、368、370、399、405 和 407。
57. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一同二聚體蛋白具有位置 409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二同二聚體蛋白具有位置405處與Phe不 同的氨基酸。
58. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一同二聚體蛋白具有位置 409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二同二聚體蛋白具有位置405處與Phe、 Arg或Gly不同的氨基酸。
59. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一同二聚體蛋白具有位置 409 處選自下組的氨基酸：Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、 Trp and Tyr，且所述第二同二聚體蛋白具有位置405處選自下組的氨基酸：Ala、Asp、Glu、 Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 和 Tyr〇
60. 依照權(quán)利要求59的體外方法，其中所述第一同二聚體蛋白具有位置409處選自下 組的氨基酸：Arg、Gly、His、Val和lie，且所述第二同二聚體蛋白具有位置405處的Leu。
61. 依照權(quán)利要求56-60中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一同二聚體蛋白具有位置 409 處的 Arg。
62. 依照權(quán)利要求56-61中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第二同二聚體蛋白具有位置 405 處的 Leu。
63. 依照權(quán)利要求62的體外方法，其中所述第一同二聚體蛋白具有位置409處的Arg， 且所述第二同二聚體蛋白具有位置405處的Leu。
64. 依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述第一和/或第二同二聚體蛋白 不含c端賴氨酸。
65. 依照權(quán)利要求64的體外方法，其中所述第一和/或第二同二聚體蛋白在遺傳上修 飾為在重鏈中缺乏c端賴氨酸。
66. 依照權(quán)利要求64的體外方法，其中所述方法包括從所述重鏈除去c端賴氨酸的步 驟。
67. -種用于生成異二聚體蛋白的體外方法，其包括下列步驟： X)提供編碼包含免疫球蛋白的第一 Fc區(qū)的第一多肽的第一核酸構(gòu)建體，所述第一 Fc 區(qū)包含第一 CH3區(qū)， y) 提供編碼包含免疫球蛋白的第二Fc區(qū)的第二多肽的第二核酸構(gòu)建體，所述第二Fc 區(qū)包含第一 CH3區(qū)， 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3區(qū)之間的 異二聚體相互作用強(qiáng)于所述第一和第二CH3區(qū)各自的同二聚體相互作用，且 其中所述第一同二聚體蛋白具有位置409處與Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述 第二同二聚體蛋白具有選自下組的位置處的氨基酸取代：366、368、370、399、405和407， 和/或 其中所述第一和第二CH3區(qū)的序列使得在如實(shí)施例21中描述的那樣測定時(shí)，每個(gè)所述 CH3區(qū)的同二聚體相互作用的解離常數(shù)介于0. 01和10微摩爾，諸如介于0. 05和10微摩爾 之間，更優(yōu)選介于〇. 01和5之間，諸如介于0. 05和5微摩爾之間，甚至更優(yōu)選介于0. 01和 1微摩爾之間，諸如介于0. 05和1微摩爾之間，介于0. 01和0. 5之間或介于0. 01和0. 1之 間， z) 在宿主細(xì)胞中共表達(dá)所述第一和第二核酸構(gòu)建體， b)使步驟z)中獲得的組合物經(jīng)受氧化條件，所述氧化條件足以容許所述異二聚體蛋 白中半胱氨酸氧化成鏈間二硫鍵。
68. 依照權(quán)利要求67的體外方法，其包含權(quán)利要求1-66的任一項(xiàng)特征。
69. 編碼第一或第二同二聚體蛋白的核苷酸序列，其中所述第一或第二同二聚體蛋白 的重鏈不包含c端賴氨酸。
【文檔編號】C07K16/46GK104114579SQ201280064946
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月27日
【發(fā)明者】M.格雷默, A.昆杜, E.T.J.范登布雷默, M.范坎彭, P.普賴姆, A.F.拉布里杰恩, J.I.美斯特斯, J.J.內(nèi)杰森, J.舒爾曼, P.帕倫, P.范博凱爾, W.L.沃斯, A.格里特森 申請人:根馬布股份公司