細胞穿膜肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細胞穿膜肽，其任選地與促細胞凋亡肽連接，可用作促細胞凋亡劑以抑制體外細胞的增殖以及治療腫瘤。
【專利說明】細胞穿膜肽
[0001] 本發(fā)明涉及穿過細胞膜的穿梭肽。
[0002] 發(fā)明背景:
[0003] 細胞凋亡是基因方面的程序性細胞死亡，其失調(diào)與癌癥及其他病理相關(guān)。盡管已 知細胞凋亡依賴Bcl-2家族成員和半胱天冬酶（caspase)，近期的數(shù)據(jù)表明，兩個主要的 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶家族，PPl和PP2A，是參與細胞生命或細胞死亡決定的關(guān)鍵作用者。 Ser/Thr磷酸酶PP2A參與細胞凋亡的誘導(dǎo)和防止兩者，意味著磷酸酶行為存在復(fù)雜的相互 作用。幾種磷酸酶最近已經(jīng)成為多種疾?。òò┌Y）治療的具有吸引力的靶標。然而， 唯一靶向磷酸酶的臨床藥物是免疫抑制性環(huán)孢霉素A和FK506。
[0004] 細胞穿膜肽（CPP)是能夠在不引起細胞膜損傷的情況下易位至細胞內(nèi)的分子，這 使得提出其作為遞送治療性藥物的載體的用途。已經(jīng)鑒定出幾種CPP，例如Tat、黑腹果 蠅觸足肽（antennapedia)或SHV1VP22。這些肽能夠穿過細胞膜，到達細胞質(zhì)和/或細胞 核。已經(jīng)設(shè)計出與PP1/PP2A蛋白相互作用的穿膜肽。這種名為"藥物磷酸酶技術(shù)"（DPT) 的方法描述于Guergnon等，2006以及國際專利申請W02003/011898和W02004/011595中。 可特異性地解除半胱天冬酶-9和PP2A之間相互作用的被稱為DPT-C9h的促細胞凋亡肽 (pro-apoptoticpeptide),使用了這種穿膜序列（國際專利申請W02010/112471)。
[0005] 然而，此肽半衰期很短，這對于臨床應(yīng)用來說是一個真正的缺陷。
[0006] 發(fā)明概沭
[0007] 本發(fā)明的突變肽克服了這個問題，因為其不會被人血清蛋白酶所消化。這種新的 特性使得可能減少注射肽的劑量以及給藥療程。
[0008] 本發(fā)明提供了包含如下氨基酸序列（I)的肽：
[0009]X1-KKKIK-F-EI-X2-X3(I)(SEQIDNO:1)
[0010] 其中X1為空缺、賴氨酸殘基或纈氨酸-賴氨酸；
[0011] X2為空缺、賴氨酸殘基或賴氨酸-異亮氨酸；
[0012] X3為空缺或1至4個氨基酸的氨基酸序列；
[0013] 以及Ψ為不同于精氨酸的氨基酸殘基，
[0014] 或者經(jīng)一種或多種化學(xué)修飾衍生自序列（I)的抗蛋白水解肽，或經(jīng)一個或多個保 守性替換衍生自序列（I)的基本上同源的肽。
[0015] 本發(fā)明進一步提供了包含所述肽的載體，所述肽作為細胞穿膜肽與目標分子相偶 聯(lián)。
[0016] 本發(fā)明進一步提供了包含所述肽的嵌合肽構(gòu)建體，所述肽作為細胞穿膜肽與促細 胞凋亡肽融合，其中所述穿膜肽優(yōu)選與促細胞凋亡肽的N末端融合。
[0017] 本發(fā)明的另一個方面是包含編碼細胞穿膜肽或嵌合肽構(gòu)建體的序列的核酸。
[0018] 本發(fā)明的另一個方面是包含核酸的載體，所述載體用于基因治療或者體內(nèi)或離體 基因轉(zhuǎn)移，所述核酸包含（i)編碼細胞穿膜肽的核苷酸序列，以及與（i)偶聯(lián)的（ii)目標 核苷酸序列。
[0019] 還進一步包括了將嵌合肽構(gòu)建體或編碼所述嵌合肽構(gòu)建體的核酸用于抑制細胞 體外增殖。
[0020] 本發(fā)明進一步的主題是包含如本文所描述的所述載體或嵌合肽以及藥學(xué)上可接 受的載體的藥物組合物。
[0021] 本發(fā)明進一步涉及根據(jù)本發(fā)明的嵌合肽或藥物組合物用于治療過度增生性疾病 或寄生蟲病的用途。
[0022] 發(fā)明詳沭
[0023] 發(fā)明人致力于提高W02010/112471中所公開肽的穩(wěn)定性，特別是受到蛋白酶降解 的肽DPT-C9h。此肽對應(yīng)于與半胱天冬酶-9與PP2A的結(jié)合位點的序列相關(guān)聯(lián)的穿膜肽。 此肽在人細胞系中誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，它僅在分離自慢性淋巴細胞白血病患者的腫瘤B 細胞中具有特異性細胞凋亡效應(yīng)而對健康細胞則沒有影響。此外，當(dāng)注射到攜帶有人乳腺 癌異種移植物的小鼠中時，該肽引起腫瘤體積的顯著減小。
[0024]DPT-C9 由序列VKKKKIKREIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(SEQIDNO:6)組成，其中 VKKKKIKREIKI(SEQIDN0:7)為穿膜肽。
[0025] 發(fā)明人已經(jīng)顯示，穿膜肽中的一個突變極大地提高了整個肽的穩(wěn)定性，同時能保 持其特性，特別是其誘導(dǎo)細胞凋亡的能力。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，跨膜肽中精氨酸殘基的突變能防止被蛋白酶切割。
[0027]發(fā)明人因此設(shè)計了包含如下氨基酸序列（I)的肽：
[0028]X1-KKKIK-F-EI-X2-X3(I)(SEQIDNO:1)
[0029] 其中X1為空缺、賴氨酸殘基或纈氨酸-賴氨酸；
[0030]X2為空缺、賴氨酸殘基或賴氨酸-異亮氨酸；
[0031]X3為空缺或1至4個氨基酸的氨基酸序列；
[0032] 以及Ψ為不同于精氨酸的氨基酸殘基。
[0033] 在優(yōu)選的實施方式中，Ψ為A、K或N。仍然優(yōu)選對于精氨酸而言Ψ是非保守的。 因此，在優(yōu)選的實施方式中，Ψ是不同于賴氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的氨基酸殘基。優(yōu)選 Ψ為丙氨酸。
[0034] 在優(yōu)選的實施方式中，
[0035]X1為纈氨酸-賴氨酸；
[0036]X2為賴氨酸-異亮氨酸；
[0037] 以及X3為空缺。
[0038]優(yōu)選的肽為 VKKKKIKAEIKI(SEQIDNO :2)。
[0039]另一條肽為 VKKKKIKKEIKI(SEQIDNO :10)。
[0040]另一條肽為 VKKKKIKNEIKI(SEQIDNO :11)。
[0041] 定義：
[0042] 術(shù)語"患者"是指需要進行其中期望達到促細胞凋亡效應(yīng)的治療的人或非人的動 物，優(yōu)選哺乳動物，包括男性、女性、成人和兒童。
[0043] 如本文中所使用的術(shù)語"治療"（treatment)或"療法"（therapy)包括治愈性和/ 或預(yù)防性的治療。更具體地，治愈性治療是指癥狀緩解、改善和/或消除、減少和/或穩(wěn)定 (例如無法發(fā)展至更晚期的階段）中的任意一種，以及某種特定疾病癥狀延遲進展。
[0044] 預(yù)防性治療是指如下任意一種：中斷發(fā)作、減少發(fā)展風(fēng)險、減少發(fā)病、延緩發(fā)生、減 少發(fā)展，以及增加某種特定疾病的癥狀發(fā)作的時間。
[0045] 術(shù)語"穿膜肽"或"細胞穿膜肽"（或"CPP"）或"穿梭肽"可相互替換使用，其意為 該肽能夠易位至細胞內(nèi)而不會引起細胞膜的實質(zhì)性損傷，并且當(dāng)與其他分子相連接時能夠 用作其他分子的載體。該術(shù)語是指陽離子細胞穿膜肽，也稱之為轉(zhuǎn)運肽、載體肽或肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)域。CPP，正如本文中所示，具有誘導(dǎo)與CPP融合的肽穿透給定細胞培養(yǎng)物群體中30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%以內(nèi)的細胞的能力，并允許在全身性體內(nèi)施用時 使大分子易位至多個組織中，其中所述百分比包括其間的所有整數(shù)。細胞穿膜肽也可以指 這樣的肽，當(dāng)使其在合適的條件下與細胞相接觸時，能夠以明顯高于被動擴散的狀態(tài)從外 部環(huán)境穿入細胞內(nèi)環(huán)境中，包括細胞質(zhì)、細胞器例如線粒體或細胞核。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人 員所已知的各種方法來評估這種特性。
[0046] 當(dāng)一個或多個氨基酸殘基被生物學(xué)相似的殘基所替代，或者當(dāng)大于80%的氨基 酸是相同的，或大于大約90%、優(yōu)選大于大約95%的氨基酸是相似的（功能上相同）時， 兩條氨基酸序列是"同源的"、"基本上同源的"或"基本上相似的"。優(yōu)選地，利用例如 GCG(GeneticsComputerGroup，GCG軟件包程序手冊，版本 7，Madison，Wisconsin)堆積 (pileup)程序或本領(lǐng)域已知的任意程序（BLAST、FASTA等）通過比對來鑒定相似或同源的 序列。優(yōu)選地，這些同源肽不包含兩個半胱氨酸殘基，以防止環(huán)化。
[0047] 本文所使用的術(shù)語"保守性替換"是指一個氨基酸殘基被另一個所替代而不會改 變肽的整體構(gòu)象和功能，其包括但不限于一個氨基酸被一個具有相似特性（例如極性、氫 鍵勢能、酸性、堿性、形狀、疏水性、芳香性等）的所替代。具有相似特性的氨基酸是本領(lǐng)域 熟知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性堿性氨基酸，可互換。類似地，疏水性氨基 酸異亮氨酸，可被亮氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸替代。可相互取代的中性親水性氨基酸包括天 冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸。
[0048] 本發(fā)明的"取代"或"修飾"包括由天然存在的氨基酸經(jīng)過改變和修飾得到的那些 氨基酸。
[0049] 因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，在本發(fā)明的上下文中，保守性替換在本領(lǐng)域中被認為是一個 氨基酸被另一個具有相似特性的氨基酸所取代。保守性替換的示例如下面表1所示：
[0050] 表1:保守性替換I
【權(quán)利要求】
1. 包含如下氨基酸序列⑴的肽： Xi-KKKIK-F-EI-X^d) (SEQ ID NO ：1) 其中Xi為空缺、賴氨酸殘基或纈氨酸-賴氨酸； x2為空缺、賴氨酸殘基或賴氨酸-異亮氨酸； x3為空缺或1至4個氨基酸的氨基酸序列； 以及Ψ為不同于精氨酸的氨基酸殘基； 或者經(jīng)一種或多種化學(xué)修飾衍生自序列（I)的抗蛋白水解肽，或經(jīng)一個或多個保守性 替換衍生自序列（I)的基本上同源的肽。
2. 權(quán)利要求1的肽，其中Ψ對于精氨酸而言是非保守的，優(yōu)選為丙氨酸。
3. 權(quán)利要求1或2任一項的肽，其中 Xi為纈氨酸-賴氨酸； χ2為賴氨酸-異亮氨酸； 以及&為空缺。
4. 權(quán)利要求3的肽，其為 VKKKKIKAEIKI(SEQ ID NO ：2)
5·權(quán)利要求3的肽，其為VKKKKIKKEIKI(SEQIDN0:10)或VKKKKIKNEIKI(SEQIDN0 : 11)。
6. 包含權(quán)利要求1至5任一項的肽的載體，所述肽作為細胞穿膜肽與目標分子相偶聯(lián)。
7. 權(quán)利要求6的載體，其為包含權(quán)利要求1至5任一項的肽的嵌合肽構(gòu)建體，所述肽作 為細胞穿膜肽與促細胞凋亡肽融合，其中所述細胞穿膜肽優(yōu)選與促細胞凋亡肽的N末端融 合。
8. 權(quán)利要求7的嵌合肽構(gòu)建體，其中所述促細胞凋亡肽包含序列￥-\3^1'0)-\13-1-乂 5-EQWA-X6-S-X7 (SEQ ID NO ：3), 其中 X4a為纈氨酸或異亮氨酸； X4b為天冬氨酸或甘氨酸； X5為苯丙氨酸或亮氨酸； X6為精氨酸或組氨酸； X7為空缺或谷氨酰胺，或谷氨酰胺-天冬酰胺，或谷氨酰胺-天冬酰胺-亮氨酸；或 經(jīng)一種或多種化學(xué)修飾衍生自所述促細胞凋亡肽的抗蛋白水解肽，或經(jīng)一個或多個保 守性替換衍生自SEQ ID NO :3的基本上同源的肽。
9. 權(quán)利要求8的嵌合肽構(gòu)建體，其中 X4a為纈氨酸； X4b為天冬氨酸； χ5為苯丙氨酸； 以及χ6為組氨酸。
10. 權(quán)利要求9的嵌合肽構(gòu)建體，其為 VKKKKIKAEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(SEQ ID NO ：4) 或 VKKKKIKAEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL(SEQ ID N0:5)。
11. 權(quán)利要求7的嵌合肽構(gòu)建體，其中所述促細胞凋亡肽包含如下序列或由如下序列 組成： a) 氨基酸序列 DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID N0:8); b) 與SEQ ID NO :8基本上同源、優(yōu)選與SEQ ID NO :8至少80%的同一性，且誘導(dǎo)細胞 凋亡的氨基酸序列；或 c) 誘導(dǎo)細胞凋亡的以及經(jīng)一種或多種化學(xué)修飾衍生自a)或b)中定義的肽的抗蛋白水 解肽。
12. 權(quán)利要求11的嵌合肽構(gòu)建體，其中所述促細胞凋亡肽包含序列 DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO :9)或由序列 DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO :9)組 成。
13. 權(quán)利要求12的嵌合肽構(gòu)建體，其選自： VKKKKIKAEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO： 16) VKKKKIKKEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID N0:17)以及 VKKKKIKNEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID N0:18)。
14. 核酸，其包含編碼權(quán)利要求1至5任一項的肽或者權(quán)利要求7至13任一項的嵌合 肽構(gòu)建體的序列。
15. 包含核酸的載體，所述載體用于基因治療或者體內(nèi)或離體基因轉(zhuǎn)移，所述核酸包含 (i)編碼權(quán)利要求1至5任一項的肽的核苷酸序列，以及與（i)偶聯(lián)的（ii)目標核苷酸序 列。
16. 權(quán)利要求7至13任一項所定義的嵌合肽構(gòu)建體或編碼所述嵌合肽構(gòu)建體的核酸用 于體外抑制細胞增殖的用途。
17. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求15中所定義的載體，或者如權(quán)利要求7至13任一項 所定義的嵌合肽構(gòu)建體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
18. 權(quán)利要求17的藥物組合物，其用于治療過度增生性疾病，其中所述過度增生性疾 病優(yōu)選是 -α)非癌性過度增生性疾病，其選自：牛皮癬、良性前列腺肥大、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性 腸病、骨性關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管閉塞、再狹窄、動脈粥樣硬 化以及口腔毛狀白斑，和/或 -(ii)癌癥，其選自：急性粒細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金 氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞、皮膚T細胞淋巴瘤，以及腦癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、頭頸 癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、頭癌、頸癌、腎癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、食道癌和甲狀腺癌，葡 萄膜黑色素瘤以及黑色素瘤； 其中所述過度增生性疾病優(yōu)選腫瘤，優(yōu)選人類患者的癌性腫瘤，仍然優(yōu)選淋巴瘤，甚至 更為優(yōu)選慢性淋巴細胞白血?。–LL); 或寄生蟲疾病，其中所述寄生蟲疾病優(yōu)選是由于選自椎體蟲屬（Trypanosoma)、泰勒爾 梨楽蟲屬（Theileria)或痕原蟲屬（Plasmodium)的寄生蟲感染所造成的。
【文檔編號】C07K19/00GK104271147SQ201280065370
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月27日
【發(fā)明者】安赫利塔·雷沃略加西亞, 法里博·內(nèi)馬蒂, 迪迪埃·德科丹, 熱羅尼莫·布拉沃西西利亞, 耶穌馬里亞·福米納亞古鐵雷斯 申請人:巴黎第六大學(xué), 法國居里學(xué)院