肺靶向性抗肺泡表面活性蛋白a的納米抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術領域】，提供了一種新型的靶向肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的納米抗體及其制備方法。本發(fā)明的納米抗體含有如Q（X1)LVESGG(X2)V(X3)G(X4)SL(X5)LS(X6)E(X7)KG(X8)S(X9)T(X10)Y(X11)C(X12)S(X13)V(X14)R所示的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及該納米抗體的核酸編碼序列、制備方法及應用。使用免疫組化和體內(nèi)顯像的方法檢測出所獲得的納米抗體存在高度特異性肺靶向性。本發(fā)明將為肺部疾病的靶向治療提供重要工具。
【專利說明】肺靶向性抗肺泡表面活性蛋白A的納米抗體及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學和醫(yī)藥【技術領域】，涉及一種能特異性靶向肺泡表面活性蛋白 A(SP-A)的納米抗體。

【背景技術】
[0002] 20世紀初，諾貝爾獎獲得者德國科學家Paul Ehrlich針對未來藥物發(fā)展提出了 "魔法子彈"這一想法，即理想的治療藥物能只選擇性地破壞患病細胞而不影響健康細胞。 在過去的幾十年里，科學家們一直致力于探索這種理想藥物的開發(fā)。
[0003] 20世紀70年代，靶向給藥系統(tǒng)誕生，并在腫瘤治療應用領域得到了迅速發(fā)展。據(jù) 報道，目前在全球最暢銷的抗癌藥銷售額中，靶向抗癌藥物已占30%以上的份額，預測2015 年將升至55%。同時，隨著研究的逐步深入，新型靶向給藥載體的不斷出現(xiàn)及給藥途徑的拓 寬，靶向藥物的研究擴展至腫瘤以外的其他系統(tǒng)疾病的治療中。
[0004] 呼吸系統(tǒng)疾病的靶向藥物開發(fā)也是研究熱點之一，目前主要集中在以下方面： 1.通過吸入給藥實現(xiàn)部分氣道疾病的靶向治療。
[0005] 例如，從20世紀50年代始，吸入激素逐漸用于哮喘和coro的治療。此后，隨著吸 入藥物和裝置的不斷改進，目前吸入激素已成為哮喘和coro治療的主要措施。但吸入藥物 主要適用于氣道疾病的局部治療，而對于氣道之外的肺實質和肺間質性疾病，吸入激素因 生物利用度過低而療效較差。
[0006] 2.通過藥物載體實現(xiàn)藥物的被動肺靶向。
[0007] 目前已有多種藥物載體如脂質體、微粒、微球等用于肺靶向藥物的研究。然而，這 種被動靶向對組織器官的選擇性差，無法避免肝脾等其他器官的大量截留，因此，仍未獲得 理想的靶向效果。
[0008] 由于配體-受體或抗原-抗體結合是人體內(nèi)的一種特殊識別機制，據(jù)文獻報道，利 用該識別機制可實現(xiàn)藥物的主動靶向，增強藥物療效，減少副作用。比如用紫杉醇脂質體與 針對表皮生長因子的單克隆抗體制成的復合物，抗腫瘤效果較無單抗組增強25倍。因此， 要實現(xiàn)理想的肺主動靶向，尋找具有高度特異性的肺組織靶向分子和制備高親和力的靶向 配體是最關鍵的因素。現(xiàn)有研究表明，在肺組織中，II型肺泡上皮細胞是肺組織所特有的 具有增殖和分泌功能的細胞，約占肺實質細胞總數(shù)的16%。II型細胞能合成和分泌肺泡表 面活性物質。肺泡表面活性物質的主要成份為脂質（90%)和蛋白（10%)，其中蛋白成份 為特異性肺泡表面活性蛋白（surfactant protein，SP)。目前按SP被發(fā)現(xiàn)的先后命名為 SP-A、SP-B、SP-C、SP-D，其中SP-A是最早發(fā)現(xiàn)且在II型肺泡上皮細胞中強烈表達、信號最 為豐富的蛋白，而在肺外表達量極少，表現(xiàn)為高度肺特異性，是一種理想的特異性肺組織靶 向分子。
[0009] 理想的靶向配體除具有高親和力外，還應具備分子量小、穿透力強、免疫原性弱的 特點。抗原-抗體結合是最強的識別機制，因此，抗體是配體制備的首選。然而，完整的抗 體分子雖親和力高，但分子量大(相對分子量為150 000)，組織穿透能力弱，免疫原性強，并 不是理想的配體。隨著抗體工程、基因工程等技術的發(fā)展，對抗體進行工程化改造而成的抗 體片段（Fab、ScFv)現(xiàn)已具備了分子量小、免疫原性弱的優(yōu)勢，但相對完整抗體分子，其穩(wěn)定 性、親和力均降低。
[0010] 1993年比利時科學家首次報道在駱駝類動物血中存在沒有輕鏈的重鏈抗體 (HCAbs)。該重鏈抗體的重鏈可變區(qū)（variable domain of heavy chains of HCAbs，VHH) 具有完整、獨立的抗原結合能力，若克隆該可變區(qū)，即可得到一個大小尺寸在納米級別的單 域抗體，又稱納米抗體（nanobodies?, Nbs)。納米抗體作為配體具有許多優(yōu)勢：1)分子量 小，組織穿透力強，親和力高。它是目前已知分子量最小的抗體分子，其相對分子量僅為15 〇〇〇 ;穿透能力明顯優(yōu)于完整抗體分子，與特異抗原的親和力達nmol級。2)結構穩(wěn)定，即使 在37°C放置一周或在高溫條件（90°C)下保存，或在離液劑、蛋白酶和極性PH值等強變性 條件下，均能保持高度穩(wěn)定性。3)免疫原性小，其基因與人源VH基因 III家族序列具有較高 的同源性，對人體的免疫原性弱，生物相容性好。由于納米抗體的這些優(yōu)勢，現(xiàn)作為一種新 型的抗體藥物正在廣泛研究。但其作為SP-A靶向配體及是否可實現(xiàn)肺靶向性的研究在國 內(nèi)外尚未見報導。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種肺靶向性的納米抗體及其應用。
[0012] SP-A是最早發(fā)現(xiàn)且在II型肺泡上皮細胞中強烈表達、信號最為豐富的蛋白，而在肺外 表達量極少，表現(xiàn)為高度肺特異性，是一種理想的特異性肺組織靶向分子。本發(fā)明首次用 SP-A作為抗原免疫羊駝，通過構建免疫抗體庫，利用親和淘篩對海量的抗體進行篩選確定 具有特異性肺靶向的基因，然后采用原核表達的方法獲得與SP-A具有高親和力的納米抗 體。并通過動物體內(nèi)、外實驗驗證了其可實現(xiàn)高度特異性肺組織靶向分布。
[0013] 本發(fā)明提供了一種靶向肺組織的納米抗體，亦可稱為SPA-Nb。所述的抗體含有 如 Q(x)2LVESGG(x)2V (x)2G(x) SL(x) LS(x)24E (xUKGWjUmxhYU) C(x)n4S(x) n5V(x)n6R (即SEQ ID NO 68)所示的氨基酸序列；x表示任意氨基酸；n2?n6為正整數(shù)； 1彡n2彡21 ;1彡n3彡19 ;1彡n4彡50 ;1彡n5彡22 ;1彡n6彡8。
[0014] 較好的，17彡n2彡21 ;n3為18或者19 ;16彡n4彡50 ;17彡n5彡22 ; n6為8 或者7。
[0015] 例如，所述的抗體含有如 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV xSGTISxYGM GffxRQAPGKG RExVSTIxSx GxTxxxxYYA DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL QMNSLKPEDT AxYYCxLxGx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxH RGQGxxxxxx xxxTQVTVSS xxEPKTPKPQ GPRGLAAAGA PVPYPDPLEP RAA (SEQ ID NO 69)所示的氨基酸序列；其中，x表示任意氨基酸。
[0016] 氨基酸的簡寫詳見表1。
[0017] 表1氨基酸的簡寫符號

【權利要求】
1. 一種靶向肺組織的納米抗體，其特征在于，所述的抗體含有如Q(x)2LVESGG(x) 2V (x)2G(x) SL(x) LS(x)24E (xLKGUhSWnJULYU)(:⑴^⑴^⑴^所示的氨基酸 序列；x表示任意氨基酸；n2?n6為正整數(shù)；1 < n2 < 21 ;1 < n3 < 19 ;1 < n4 < 50 ; 1彡n5彡22 ;1彡n6彡8。
2. 如權利要求1所述的納米抗體，其特征在于，所述的納米抗體含有如Q (XJ LVESGG(X2)V(X3)G (X4)SL(X5) LS(X6) E (X7) KG(X8) S(X9) T(X10) Y(Xn) C(X12) S(X13) V(X14) R所示的氨基酸序列；其中， Χ:是LQ或者VK ; X2 是 GS、GL、GR、GM、RL 或者 GT ; X3是QA、QP、QI、AP或者EV; X4是R、G或者E ; 父5是1(、隊1?、]\1或者1'; X6 是 CTASGSDYRWMYIARFRQCPGKER, CAASGRAFSVYAVGWYRQIPGNQR, CTASETTFEIYPMAWYRQAPGKQR、CAASGSDFSIYHMGWYRQAPGKQR、CAAS⑶ IFTLASMGWYREDLHKKR、 CEASGFTFDDYAIGWFRQAPGKER, CVALGFTLDGYAIGWFRQAPGKER, CTASKFHLDSYAVAWFRQTPGKER, CVVSGVTISNYGMTWVRQAPGKGL, CVVSGVTFNNYGMTWVRQAPGKGL, CVTSGFTFSRHDMSWVRQAPGKGP, CAASGFIFSRYDMGWVRQTPGKGR、CAASGIILNFYGMGWDRQTPGQGL、CTASEFTLDYHSIGWFRQAPGKER、 CAASGRAFSVYAVGWYRQPPGKQR、CEVSGSRGSIYFSGWYRQAPGKQR、CVASGSMFNFYGMAWYRQAPGKQR 或 者 RTFSGLYLHSSAFGWFPHVPREAR ; X7 是 GVAAIYTDDTDDSSPIYATSA、 MVAAISSGGNTKYSDSV、 LVAGINMISSTKYIDSV、 LVAAITSGGSTNYADSV、LVAQLMSDGTANY⑶SV、EVSCISHNGGTTNYADSV、KISCISSIODSTNYDDSV、 AVSFINTSDDVTYFADSV、WISTIYSNGHTYSADSV、WISSIYSNGHTYSADSV、WISGIGTSGTSGRYASSV、 WVSGINSGGGRTYYADSV, GVSYVNNNGMTNYADSV, GVSCISYGDGTTFYTDSV, LVASITDGGSTNYADSV, LVASITSGGTTNYADSV、LVASIDSEGRTTNYPDSL 或者 GVAFLCNSGSDPIIHPE ; X8 是 RFTI、RVTI、RFSI、RFTA、RFTV 或者 IFTL ; X9 是 QDKDKNAVYLQMNSPKPED、 RDNDKNTMYLQMNSLKPED、 SDNAKNTVYLQMNSLKPED、 RDDVDTTVHLRMNTLQPSD、 RDNAKNTVYLQMNGLKPED、 RDTAKSTVFLQMNNLIPED、 RDNSKNTVYLQMNVLKPED、 RDNANNTLYLQMNSLKPED、 RDNAKNTLYLQMISLKPED、 RDNAKDTLYLQMDSLKPED、 RDDDKATLYLSMDGLKPED、 RDNAKNTMYLQMNSLKPED、 RDNAKNTVTLQMNSLKPED、 RDNARNTAYLDMNSLKVED、 RDNAKNTVYLQMNSLKPED、 RDDAKSTAYLQMNNLIPDD、RHCVKTVSPFEDNDTVEH、RDNAKNTLYLQMNSLKPED 或者空白； &。是 PT、AV、AD、AL、GL、AK、AN、AI、SV、GE、AM 或者空白； Xn表不一個任意氣基酸殘基或者空白； X12 Mi AARAFGGTWSLSSPDDFSAWGQGTQVTVS, NLDTTMVEGVEYWGQGTQVTVS, NADGVPEYSDYASGPVYWGQGTQVTVS, YIHTSREITWGRGTQVTVSQGESSAPQSSAPQATVS, AGARSGLCVFFELQDYDYWGQGTQVTVS, GADLLARCGRVWYFPPDLNYRGQGTQVTVS, AAVRSP GPTGPSMQPMWSVPDLYDYWGQGTQVTVS, KLTGETHRGQGTQVTVS, KLVGETHRGQGTQVTVS, RLTGETYRGQGTQVTVS、TTGGVYSAYVQPRGKGTQVTVS、VRFTVKTPQGYYYLNDFDYWGQGTQVTVS、 NVSAYTYRSNYYYPWGQANHVTVS, AASPGRLLLFRLCMSEDEYDFWGQGTQVTVS, NANYGGSVLYNYWGPGTQVTVS, NIGRYGLGGSWGQGTQVTVS, NAFRGRMYDYWGQGTQVTVS, PTHLVITHPCICIPSAMDYRGKGTLVPLS 或者空白； X13 是 STNEVCKWPPRPCGRRCAGA、 SHHSEDPGPRGLAAAGAP、 SEPKTPKPQGPRGLAAAGAP、 TEPKTPKPQGPRGLAAAGAP、 SKPTTPKPRAPKALRPQ、 SAHHSEDPGPRGLAAAGAP 或者 SQRKTRKAQGRARLADAGAP ； X14 是 PYPDPLEP、SGSAGTAC、PHADQMEQ、或者 PRCRIRF。
3. 如權利要求2所述的納米抗體，其特征在于，所述的Xn是Q、Y、H、V、或者F。
4. 如權利要求1所述的納米抗體，其特征在于，所述的抗體含有如SEQ ID NO 37?SEQ ID NO 67中任意一種所示的氨基酸序列。
5. -種編碼靶向肺組織的納米抗體的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子編碼權 利要求1所述的納米抗體。
6. 如權利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID N06?SEQ ID NO 36中任意一種所示。
7. 權利要求1所述的納米抗體的制備方法，其特征在于，該方法依次包括以下步驟： 用肺泡表面活性蛋白A作為抗原免疫羊駝； 篩選獲得能與肺泡表面活性蛋白A具有高結合力的基因序列； 對步驟（2)獲得的基因序列進行蛋白誘導表達。
8. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)所述的篩選采用親和淘篩的方 法。
9. 權利要求1所述的納米抗體在制備肺的靶向配體中的應用。
10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的納米抗體其特異性靶點為肺泡表面 活性蛋白A。
【文檔編號】C07K16/18GK104109207SQ201310134673
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年4月17日 優(yōu)先權日:2013年4月17日
【發(fā)明者】李惠萍, 王珊梅 申請人:上海市肺科醫(yī)院