專利名稱：一種烷基化衍生試劑及其在肽段標記、質譜檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物大分子的標記，具體地說是一種烷基化衍生試劑及其在肽段標記、質譜檢測中的應用。
背景技術：
在后基因組學時代，蛋白質組分析受到越來越廣泛的關注。然而，蛋白質樣品組成的極端復雜性、寬動態(tài)范圍分布特別是翻譯后修飾的存在，使得其分析仍舊面臨著巨大的挑戰(zhàn)。以鳥槍法(Shotgun)為代表的bottom-up策略是復雜蛋白質組樣品分離鑒定最常采用的策略，這一策略首先將蛋白質樣品經(jīng)蛋白質酶酶切，產(chǎn)生的多肽混合物經(jīng)色譜分離后再通過質譜進行多肽鑒定?？梢?，質譜技術是蛋白質組研究必不可少的工具。然而，基于質譜技術的多肽分析策略其主要缺陷在于不同的肽段其離子化程度具有顯著的差異，此外，肽段還存在不充分離子化的問題，其主要原因在于不同的肽段具有不同的二級結構、分子量大小，帶電荷狀態(tài)以及親疏水性的差異，使得不同肽段的質譜檢測靈敏度具有顯著的差異。特別是對于復雜蛋白質樣品的分析，其寬動態(tài)范圍分布使得低豐度肽段，特別是一些藥物靶點蛋白質或生物標記物的酶切肽段受到高豐度肽段的抑制，其質譜檢測仍舊存在較大的困難。因此，改進肽段，特別是低豐度肽段的質譜檢測靈敏度具有重要意義。為了提高肽段特別是低豐度肽段的質譜離子化效率，近年來，通過化學衍生技術在多肽中引入易于離子化標簽的方法獲得了廣泛關注。Williams等合成了一系列疏水性的燒基化標簽(如:2_碘-N-辛燒基乙酰胺和2-碘-N-節(jié)基乙酰胺)以改善半胱氨酸肽段的質譜離子化效率(Williams D.K., Meadows C.ff., Bori 1.D., Hawkridge A.Μ., Comins
D.L.，Muddiman D.C .，J.Am.Chem.Soc.2008, 130:2122-2123)，B 型利鈉肽經(jīng) 2-碘-N-辛燒基乙酰胺衍生后，其質譜檢測限可降低約3.5倍(Shuford C.M., Comins D.L., WhittenJ.L., Burnett J.C., Muddiman D.C.，Analyst, 2010，135:36-41 )。Zabet-Moghaddam 等將疏水性標簽，碘乙酰苯胺，用于含半胱氨酸肽段的烷基化衍生，與碘乙酰胺(IAA)修飾相t匕，模式肽段經(jīng)碘乙酰苯胺衍生后其峰強度可提高4.6-6倍(Zabet-Moghaddam M., Shaikh
A.L., Niwayama S., J.Mass Spectrom.2012，47，1546-1553)。Vasicek 等將季銨化標簽，(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化胺，用于增強含半胱氨酸肽段在電子轉移裂解(ETD)質譜中的分析鑒定能力，牛血清白蛋白酶切產(chǎn)物經(jīng)衍生后其SEQUEST得分值可提高6倍，實現(xiàn)了高可信度的蛋白質鑒定(Vasicek L.，Brodbelt J.S.，Anal.Chem.2009，81，7876-7884)。盡管目前已有多種烷基化衍生試劑報道并應用于了半胱氨酸肽段的烷基化衍生，然而，多肽的質譜檢測靈敏度改善比較有限，目前僅限應用于合成肽段或標準蛋白質酶解產(chǎn)物的分析。因此，發(fā)展新型高效的烷基化衍生化試劑對于深入的蛋白質組研究具有重要的意義
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠增強含半胱氨酸肽段質譜分析的烷基化衍生試齊U，以實現(xiàn)多肽/蛋白質中巰基的選擇性衍生、高效標記，顯著地提高衍生肽段的質譜帶電荷數(shù)、離子化效率和檢測靈敏度，顯著提高含半胱氨酸肽段的質譜檢測能力。本發(fā)明進一步的目的是提供所述烷基化衍生試劑在肽段標記、質譜檢測中的應用。本發(fā)明所提供的烷基化衍生試劑1-[3-[(2_碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-3-丁基咪唑(IPBI)，如式(I )所示結構，
權利要求
1.一種如式(1)所示的烷基化衍生試劑，
2.權利要求1所述的烷基化衍生試劑的制備方法，其特征在于，以芳香季銨化咪唑為母體結構，通過縮合反應引入和肽段反應的活性碘乙酰胺功能基團。
3.根據(jù)權利要求2所述的烷基化衍生試劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: ①以1-丁基咪唑和3-溴丙胺氫溴酸鹽為原料，于80 90°C回流反應16-24小時即得中間產(chǎn)物溴化1-(3-氨丙基)-3- 丁基咪唑； ②以乙腈水為溶劑，制備溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑溶液，加入碘乙酸，在0-10°C條件下加入縮合劑進行縮合反應1-1.5小時，即得所述烷基化衍生試劑。
4.根據(jù)權利要求3所述的烷基化衍生試劑的 制備方法，其特征在于，所述縮合劑為N，N’-羰基二咪唑、1-羥基-苯并-三氮唑或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽。
5.權利要求1所述的烷基化衍生試劑在肽段的標記及質譜檢測中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的烷基化衍生試劑在肽段的標記及質譜檢測中的應用，其特征在于，所述烷基化衍生試劑與肽段/蛋白質中的半胱氨酸發(fā)生標記反應。
7.根據(jù)權利要求5所述的烷基化衍生試劑在肽段的標記及質譜檢測中的應用，其特征在于，肽段衍生方法包括以下步驟: ①將濃度為0.1-0.4mg/mL的肽段用pH介于8.0-8.5的緩沖液溶解，然后加入濃度為20mmol/L的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液，于50°C反應I小時，冷卻至室溫； ②向上述溶液中加入濃度為50mmol/L的IPBI50μ L，繼續(xù)于37°C反應2小時即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種烷基化衍生試劑及其在肽段標記、質譜檢測中的應用。所述烷基化衍生試劑為溴化1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-3-丁基咪唑(IPBI)，其結構如式(Ⅰ)所示。本發(fā)明所提供的烷基化衍生試劑以碘乙酰胺基為活性功能團，同時具有強疏水性、強氣相堿性且具有包含永久性正電荷的結構特征，可實現(xiàn)多肽/蛋白質中活性巰基的選擇性衍生和高效標記，可顯著地提高質譜分析中肽段的帶電荷數(shù)、離子化效率和檢測靈敏度，從而顯著提高含半胱氨酸肽段的檢出率。同時，本發(fā)明所提供的烷基化衍生試劑合成過程簡單、成本較低、反應重現(xiàn)性好，宜于推廣應用。
文檔編號C07D233/61GK103204812SQ20131014407
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月23日 優(yōu)先權日2013年4月23日
發(fā)明者喬曉強, 王蕊, 佘丹丹, 王濤 申請人:河北大學