Sclerostin結(jié)合劑的制作方法
【專利摘要】提供了與sclerostin蛋白質(zhì)表位，以及sclerostin結(jié)合劑，例如能夠與sclerostin結(jié)合的抗體相關(guān)的組合物和方法。
【專利說明】Sc I erost i n 結(jié)合劑
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00680024330.8、申請日為2006年4月28日的中國發(fā)明專利
申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]—般而言,本發(fā)明涉及sclerostin蛋白質(zhì)包括人sclerostin蛋白質(zhì)的表位，以及能夠與sclerostin或其片段結(jié)合的結(jié)合劑(例如抗體)。
[0003]發(fā)明背景
[0004]在個體一生中存在骨量變化的2或3個不同階段(參見Riggs，West J.Med.154: 63-77(1991))。第一個階段在男性和女性中都發(fā)生且進(jìn)展至獲得骨峰值。第一個階段通過由于骨膜附著率的軟骨內(nèi)生長板的線性生長和輻射生長達(dá)到。第二個階段對于松質(zhì)骨(扁骨例如椎骨和骨盆)約30歲開始且對于骨皮質(zhì)(例如四肢中發(fā)現(xiàn)的長骨)約40歲開始且持續(xù)至老年。這個階段的特征在于慢性骨丟失且在男性和女性中都發(fā)生。在女性中，還存在第三個階段的骨丟失，最可能是由于絕經(jīng)后的雌激素缺乏。單獨(dú)在這個階段時，女性可能丟失來自骨皮質(zhì)和來自小梁室的另外骨量(參見Riggs，同上)。
[0005]骨礦物質(zhì)含量的丟失可以由廣泛多樣的條件引起，且可以導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題。 例如，骨質(zhì)疏松癥是人中的衰弱性疾病，并且特征在于骨骼骨量和礦物質(zhì)密度的顯著減少， 骨結(jié)構(gòu)惡化，包括骨微結(jié)構(gòu)惡化以及受侵襲個體中骨脆性(即，骨強(qiáng)度減少)和對骨折的敏感性的相應(yīng)增加。在人中的骨質(zhì)疏松癥之前一般為臨床骨量減少(骨礦物質(zhì)密度以大于I 個標(biāo)準(zhǔn)差但小于2.5個標(biāo)準(zhǔn)差的程度低于年輕人骨的平均值)，所述臨床骨量減少是在美國大約25，000, 000人中發(fā)現(xiàn)的病癥。在美國還有7，000, 000-8, 000, 000名患者已診斷患有臨床骨質(zhì)疏松癥(定義為骨礦物質(zhì)含量以大 于2.5個標(biāo)準(zhǔn)差的程度低于成熟年輕人骨)。 在人群中的骨質(zhì)疏松癥的頻率隨著年齡增加。在高加索人中，骨質(zhì)疏松癥在女性中居多，在美國，女性占80%的骨質(zhì)疏松癥患者群。在老年人中增加的脆性和對骨骼骨的骨折的敏感性經(jīng)由這個群體中更大的意外跌倒危險而加重。髖、腕和椎骨骨折是與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的最常見損傷。尤其是髖骨折對于患者是極端不舒服和昂貴的，而且對于女性與高死亡率和發(fā)病率相關(guān)。
[0006]盡管骨質(zhì)疏松癥已視為由于骨量減少的骨折危險增加，但用于骨骼病癥的目前可用治療幾乎都不能增加成人的骨密度，并且大多數(shù)目前可用治療主要通過抑制進(jìn)一步的骨再吸收而不是刺激新骨生成來起作用。雌激素目前被開處方以延緩骨丟失。然而，關(guān)于患者是否獲得任何長期利益和雌激素對超過75歲的患者是否具有任何影響存在某些爭論。此夕卜，雌激素的使用被認(rèn)為增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的危險。降鈣素、骨鈣蛋白與維生素K、 或高劑量飲食鈣連同或不連同維生素D也已建議用于絕經(jīng)后女性。然而，高劑量的鈣通常具有不希望的胃腸副作用，且必須連續(xù)監(jiān)控血清和尿韓水平(例如Khosla和Riggs, Mayo Clin.Proc.70:978982,1995)。
[0007]關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的其他目前治療方法包括二膦酸鹽(例如,FosamaxTM、Actonel?、 Bonviva?, Zometa?、奧帕膦酸鹽、奈立膦酸鈉、替魯膦酸鈉片、骨磷)、甲狀旁腺激素、鈣受體拮抗劑(calcilytics)、擬I丐劑(calcimimetics)(例如cinacalcet)、他汀類藥物、促蛋白合成類固醇、鑭和鍶鹽，以及氟化鈉。然而此類治療通常伴隨不希望有的副作用(參見 Khosla 和 Riggs,同上)。
[0008]SOST基因的產(chǎn)物硬化素在硬化性骨化病(sclerosteosis)中不存在，所述硬化性骨化病是特征在于骨過度生長和強(qiáng)致密骨的骨骼疾病(Brunkow等人，Am.J.Hum.Genet.， 68:577-589, 2001 ；Balemans 等人，Hum.Mol.Genet.，10:537-543, 2001)。人硬化素的氨基酸序列由Brunkow等人(同上)報(bào)告且在本文中公開為SEQ ID NO:1。
[0009]發(fā)明簡述
[0010]本文公開的是可以用于增加骨形成、骨礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)含量、骨量(bone mass)、骨質(zhì)量(bone quality)和骨強(qiáng)度中的至少一種,且因此可以用于治療廣泛多樣病癥的組合物和方法，在所述病癥中骨形成、骨礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)含量、骨量、骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度中的至少一種的增加是希望的。本發(fā)明還提供了本文所述的其他相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
[0011]本發(fā)明涉及由本文公開的結(jié)合劑識別的人硬化素的區(qū)域(表位)，使用這些表位的方法，以及制備此類表位的方法。
[0012]本發(fā)明還涉及對鑒別為Loop2的硬化素區(qū)域特異的表位，以及與那個區(qū)域特異性結(jié)合的結(jié)合劑。
[0013]本發(fā)明還涉及對硬化素的胱氨酸結(jié)區(qū)域特異的表位，以及與那個區(qū)域特異性結(jié)合的結(jié)合劑例如抗體。
[0014]本發(fā)明涉及與硬化素特異性結(jié)合的結(jié)合劑例如抗體。結(jié)合劑可以通過其交叉阻斷本文公開的至少一種抗體與硬化素的結(jié)合和/或被本文公開的至少一種抗體交叉阻斷結(jié)合硬化素的能力來表征?？贵w及其他結(jié)合劑還可以通過在如本文公開的“人硬化素肽表位競爭結(jié)合測定法”中其與人硬化素肽的結(jié)合模式來表征。
[0015]本發(fā)明涉及可以增加哺乳動物中的骨形成、骨礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)含量、骨量、 骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度中的至少一種的結(jié)合劑，例如抗體。
[0016]本發(fā) 明涉及在基于細(xì)胞的礦化測定法中可以阻斷硬化素的抑制效應(yīng)的結(jié)合劑，例如抗體。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含通過至少一個二硫鍵連接的2、3或4個多肽片段并且代表硬化素的胱氨酸結(jié)(cystine-knot)的核心區(qū)的多肽構(gòu)建體，以及能夠與其特異性結(jié)合的抗體。
[0018]本發(fā)明涉及獲得適合于用作免疫原用于在哺乳動物中產(chǎn)生能夠與硬化素特異性結(jié)合的結(jié)合劑例如抗體的表位的方法；在某些實(shí)施方案中產(chǎn)生的結(jié)合劑能夠在體內(nèi)中和硬化素活性。
[0019]本發(fā)明涉及當(dāng)組合物施用于動物時用于誘發(fā)對硬化素特異的抗體的組合物，所述組合物包含具有 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO:64、SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO:
66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68 或 SEQ ID NO:69 的氨基酸序列的多肽。
[0020]本發(fā)明還涉及當(dāng)組合物施用于動物時用于誘發(fā)對硬化素特異的抗體的組合物，所述組合物包含基本上由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列組成的至少一種多肽；所述組合物可以包含SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的至少2種或至少3種；并且所述組合物可以包含SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5 中的所有 4 種氨基酸序列。
[0021]本發(fā)明進(jìn)一步涉及當(dāng)組合物施用于動物時用于誘發(fā)對硬化素特異的抗體的組合物，所述組合物包含具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO:2和4通過在第57和111位的氨基酸處(參考SEQ ID NO:1)的二硫鍵連接，并且SEQ ID NO:3和5通過(a)在第82和142位的氨基酸處(參考 SEQ ID NO:1)的二硫鍵、和(b)在第86和144位的氨基酸處(參考SEQ ID NO:1)的二硫鍵中的至少一個來連接；所述多肽可以保留SEQ ID NO:1的人硬化素的相應(yīng)多肽區(qū)域的三級結(jié)構(gòu)。
[0022]本發(fā)明還涉及基本上由SEQ ID NO:1的多重截短的人硬化素蛋白質(zhì)組成的多肽 T20.6，其中 SEQ ID NO:1 的氨基酸 1-50、65-72、91_100、118-137 和 150-190 在所述多肽中不存在；這種多肽可以通過人硬化素的胰蛋白酶消化來獲得，并且蛋白質(zhì)可以通過HPLC分級分離法來分離。
[0023]本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含SEQ ID NO:1的氨基酸51_64、73_90、101-117和138-149 的人硬化素的免疫原性部分T20.6，其中所述免疫原性部分包含至少下列一個:
[0024](a)氨基酸57和111之間的二硫鍵；
[0025](b)氨基酸82和142之間的二硫鍵；和
[0026](c)氨基酸86和144之間的二硫鍵；
[0027]所述免疫原性部分可以具有這些二硫鍵中的至少2個；并且所述免疫原性部分可以具有所有3個二硫鍵。
[0028]本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含SEQ ID NO:1的氨基酸57_64、73_86、111-117和138-144 的人硬化素的免疫原性部分T20.6衍生物，其中所述免疫原性部分包含至少下列一個:
[0029](a)氨基酸57和111之間的二硫鍵；
[0030](b)氨基酸82和142之間的二硫鍵；和
[0031](c)氨基酸86和144之間的二硫鍵；
[0032]所述免疫原性部分可以具有這些二硫鍵中的至少2個；并且所述免疫原性部分可以具有所有3個二硫鍵。
[0033]本發(fā)明再進(jìn)一步涉及基本上由在C末端和N末端截短的SEQ ID NO:1的人硬化素蛋白質(zhì)組成的多肽，其中SEQ ID NO:1的氨基酸1-85和112-190在所述多肽中不存在。
[0034]本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO:1的氨基酸86-111的人硬化素的免疫原性部分；所述免疫原性部分可以基本上由連續(xù)氨基酸CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC(SEQ ID NO:6)組成。
[0035]本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含SEQ ID NO:98的氨基酸92-109的大鼠硬化素的免疫原性部分；所述免疫原性部分可以基本上由連續(xù)氨基酸PNAIGRVKWWRPNGPDFR(SEQ ID NO:96) 組成。
[0036]本發(fā)明再進(jìn)一步涉及包含SEQ ID NO:98的氨基酸99-120的大鼠硬化素的免疫原性部分；所述免疫原性部分可以基本上由連續(xù)氨基酸KffffRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO:97)組成。
[0037]本發(fā)明涉及生產(chǎn)人硬化素的免疫原性部分的方法，其包括下列步驟:
[0038](a)處理人硬化素以達(dá)到完全胰蛋白酶消化；[0039](b)收集如通過以0.2ml/分鐘的流速使用0.05%三氟乙酸-溶于0.05% TFA的 90%乙腈的線性梯度從反相HPLC柱中洗脫測定的，平均分子量為7，122.0道爾頓(理論質(zhì)量7121.5的道爾頓)或保留時間為約20.6分鐘的胰蛋白酶消化樣品；和
[0040](c)純化免疫原性部分。
[0041]本發(fā)明涉及產(chǎn)生能夠與硬化素特異性結(jié)合的抗體的方法，其包括:
[0042](a)用包含 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:96 或 SEQ ID NO:97 的多肽的組合物免疫動物；
[0043](b)從動物中收集血清；和
[0044](C)從血清中分離能夠與硬化素特異性結(jié)合的抗體。
[0045]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生能夠與硬化素特異性結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括:
[0046](a)用包含多肽T20.6或T20.6衍生物的組合物免疫動物；
[0047](b)從動物中收集血清；和
[0048](c)從血清中分離能夠與硬化素特異性結(jié)合的抗體。
[0049]本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測生物樣品中的抗硬化素抗體的方法，其包括下列步驟
[0050](a)使生物樣品與基本上由 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:96 或 SEQ ID NO:97組成的多肽在允許抗體和所述多肽之間形成復(fù)合物的條件下接觸；和
[0051](b)檢測復(fù)合物的.存在或缺乏，
[0052]其中復(fù)合物的存在表明生物樣品包含抗硬化素抗體。
[0053]本發(fā)明還涉及檢測生物樣品中的抗硬化素抗體的方法，其包括下列步驟
[0054](a)使生物樣品與多肽T20.6或T20.6衍生物在允許抗體和所述多肽之間形成復(fù)合物的條件下接觸；和
[0055](b)檢測復(fù)合物的存在或缺乏，
[0056]其中復(fù)合物的存在表明生物樣品包含抗硬化素抗體。
[0057]本發(fā)明進(jìn)一步涉及交叉阻斷抗體Ab-A、Ab_B、Ab_C或Ab-D中至少一種與硬化素蛋白質(zhì)的結(jié)合的硬化素結(jié)合劑，例如抗體。硬化素結(jié)合劑也可以被抗體Ab-A、Ab-B, Ab-C或 Ab-D中至少一種交叉阻斷與硬化素的結(jié)合。分離的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體等。
[0058]本發(fā)明進(jìn)一步涉及被抗體Ab-A、Ab-B、Ab-C或Ab-D中至少一種交叉阻斷與硬化素的結(jié)合的硬化素結(jié)合劑，例如抗體。分離的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體等。
[0059]本發(fā)明進(jìn)一步涉及交叉阻斷抗體l-24(Ab_l至Ab-24)中至少一種與硬化素蛋白質(zhì)的結(jié)合的硬化素結(jié)合劑，例如分離的抗體。硬化素結(jié)合劑也可以被抗體1-24(Ab-1至 Ab-24)中至少一種交叉阻斷與硬化素的結(jié)合。分離的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體或嵌合抗體。
[0060]本發(fā)明進(jìn)一步涉及被抗體l-24(Ab_l至Ab-24)中至少一種交叉阻斷與硬化素的結(jié)合的硬化素結(jié)合劑，例如分離的抗體；分離的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是多克隆抗體、 單克隆抗體、人源化抗體、人抗體或嵌合抗體。[0061]本發(fā)明進(jìn)一步涉及在“人硬化素肽表位競爭結(jié)合測定法”中顯示與人硬化素肽的結(jié)合模式類似于抗體Ab-A、Ab-B, Ab-C或Ab-D中至少一種顯示的那種的結(jié)合劑，例如分離的抗體；分離的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體或嵌合抗體。
[0062]本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療哺乳動物受試者中的低骨形成、低骨礦物質(zhì)密度、低骨礦物質(zhì)含量、低骨量、低骨質(zhì)量和低骨強(qiáng)度中的至少一種的方法，其包括給需要此類治療的受試者提供抗硬化素結(jié)合劑，其量足以增加骨形成、骨礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)含量、骨量、 骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度中的至少一種，其中所述抗硬化素結(jié)合劑包含抗體或其硬化素結(jié)合片段。
[0063]本發(fā)明還涉及分離的硬化素多肽或其片段，其中所述多肽包含6個保守的半胱氨酸殘基并且其片段包含SEQ ID NO:2的7-14個氨基酸；SEQ ID NO:3的8_17個氨基酸；SEQ ID NO:4的8-18個殘基；和SEQ ID NO:5的6_12個殘基，并且所述多肽或其片段通過SEQ ID NO:2和4之間，以及SEQ ID NO:3和5之間的二硫鍵來穩(wěn)定；所述多肽或片段可以包含 SEQ ID NO:2 的 10-14 個氨基酸；SEQ ID NO:3 的 14-17 個氨基酸；SEQ ID NO:4 的 13-18 個殘基；和SEQ ID NO:5的8-12個殘基；并且所述多肽或片段可以包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5。
[0064]本文提供了與人硬化素特異性結(jié)合的抗體?？贵w的特征在于其交叉阻斷本文公開的至少一種抗體與人硬化素的結(jié)合和/或被本文公開的至少一種抗體交叉阻斷與人硬化素的結(jié)合的能力。
[0065]還提供了可以增加哺乳動物中的骨形成、骨礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)含量、骨量、骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度中的至少一種的分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段。
[0066]還提供了在基于細(xì)胞的礦化測定法中可以阻斷硬化素的抑制效應(yīng)的分離的抗體， 或其抗原結(jié)合片段。
[0067]還提供了與人硬化素特異性結(jié)合，且具有選自下列SEQ ID NOs的至少一個⑶R 序列的結(jié)合劑例如抗體:39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、78、79、80、81、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、
111、112、113、114、115、116、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、 250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、 269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、 288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、351、352、353、358、359 和 360，及其變體，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段中和硬化素。
[0068]還提供了與人硬化素特異性結(jié)合，且具有選自下列SEQ ID NOs的至少一個⑶R 序列的結(jié)合劑例如抗體:39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、
57、58、59、60、61、62、78、79、80、81、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、
111、112、113、114、115、116、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、 250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、 269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、 288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、351、352、353、358、359 和 360，及其變體。
[0069]還提供了對蛋白質(zhì)的體內(nèi)活性重要的人硬化素區(qū)域。[0070]本發(fā)明的這些以及其他方面在參考下列詳細(xì)描述和附圖后將變得顯而易見。本文公開的所有參考文獻(xiàn)在此整體弓I入作為參考，如同每個參考文獻(xiàn)單獨(dú)引入一樣。
[0071]附圖簡述
[0072]圖1描述了關(guān)于成熟形式(信號肽被切除)的抗人硬化素和抗小鼠硬化素抗體 Ab-A的輕鏈(圖1A) (SEQ ID NO:23)和重鏈(圖1B) (SEQ ID NO:27)的氨基酸序列。
[0073]圖2描述了關(guān)于成熟形式(信號肽被切除)的抗人硬化素和抗小鼠硬化素抗體 Ab-B的輕鏈(圖2A) (SEQ ID NO:31)和重鏈(圖2B) (SEQ ID NO:35)的氨基酸序列。
[0074]圖3描述了關(guān)于成熟形式(信號肽被切除)的抗人硬化素和抗小鼠硬化素抗體 Ab-C的輕鏈(圖3A) (SEQ ID NO:15)和重鏈(圖3B) (SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。
[0075]圖4描述了關(guān)于成熟形式(信號肽被切除)的抗人硬化素和抗小鼠硬化素抗體 Ab-D的輕鏈(圖4A) (SEQ ID NO:7)和重鏈(圖4B) (SEQ ID NO:11)的氨基酸序列。
[0076]圖5描述了用媒介物、PTH(1-34)、Ab-A或Ab-B處理3周后在小鼠的2個骨骼部位(腰椎和脛骨干骺端)測量的骨礦物質(zhì)密度。
[0077]圖6描述了用媒介物、PTH(1_34)或Ab-C處理2周后在小鼠的2個骨骼部位(腰椎和脛骨干骺端)測量的骨礦物質(zhì)密度。
[0078]圖7描述了用媒介物或Ab-D處理3周后在小鼠的2個骨骼部位(腰椎和脛骨干骺端)測量的骨礦物質(zhì)密度。
[0079]圖8描述了成熟形式(信號肽被切除)的人硬化素(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。還描述了編碼成熟形式的人硬化素的人硬化素編碼區(qū)的核苷酸序列。8個半胱氨酸被編號Cl到C8。胱氨酸結(jié)由3個二硫鍵(C1-C5 ；C3-C7 ;C4_C8)形成。C2和C6也形成二硫鍵，然而這個二硫鍵不是胱氨酸結(jié)的部分。
[0080]圖9描述了人硬 化素的基本結(jié)構(gòu)的示意圖。存在N末端臂(從第一個Q到Cl)和 C末端臂(從C8到末端Y)。在這些臂之間存在胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)(由3個二硫鍵形成:C1_C5 ； C3-C7 ；C4-C8)和稱為 Loopl、Loop2 和 Loop3 的 3 個環(huán)。Loopl 和 Loop3 的遠(yuǎn)側(cè)區(qū)通過 C2-C6 二硫鍵連接。指出了可能的胰蛋白酶切割位點(diǎn)(精氨酸=R和賴氨酸=K)。指出了某些可能的AspN切割位點(diǎn)(只顯示了天冬氨酸⑶殘基)。
[0081]圖10描述了用胰蛋白酶或AspN消化后人硬化素的HPLC肽圖。指出了通過胰蛋白酶消化產(chǎn)生的人硬化素肽(T19.2、T20、T20.6和T21-22)，同樣指出了通過AspN消化后產(chǎn)生的人硬化素肽(AspN14.6、AspN18.6 和 AspN22.7-23.5)。
[0082]圖11描述了通過胰蛋白酶消化產(chǎn)生的分離的人硬化素二硫鍵合肽的序列和質(zhì)量信息。Seq.pos.=序列位置。Obs.=觀察到的。觀察到的質(zhì)量通過ESI_LC_MS分析測定。
[0083]圖12描述了通過AspN消化產(chǎn)生的分離的人硬化素肽的序列和質(zhì)量信息。 AspN22.7-23.5肽包含4個二硫鍵。Seq.pos.=序列位置。Obs.=觀察到的。觀察到的質(zhì)量通過ES1-LC-MS分析測定。
[0084]圖13顯示了通過胰蛋白酶消化產(chǎn)生的4種人硬化素肽(T19.2、T20、T20.6和 T21-22)的線性示意圖。
[0085]圖14顯不了通過AspN消化產(chǎn)生的5種人硬化素肽(AspN14.6、AspN18.6和 AspN22.7-23.5)的線性示意圖。AspN14.6HPLC峰由不通過任何二硫鍵連接的3種肽組成。
[0086]圖15顯示了來自基于Biacore的“人硬化素肽表位競爭結(jié)合測定法”的共振單位(Ru)信號。測定了與各種人硬化素肽(在溶液中)結(jié)合的Mab以及與完整成熟形式的人硬化素(固定在Biacore芯片上)結(jié)合的Mab。顯示了關(guān)于Ab-A的數(shù)據(jù)。使用的人硬化素肽是 T19.2、T20、T20.6、T21-22、AspN14.6、AspN18.6 和 AspN22.7-23.5。
[0087]圖16顯示了來自基于Biacore的“人硬化素肽表位競爭結(jié)合測定法”的共振單位 (Ru)信號。測定了與各種人硬化素肽(在溶液中)結(jié)合的Mab以及與完整成熟形式的人硬化素(固定在Biacore芯片上)結(jié)合的Mab。顯示了關(guān)于Ab-B的數(shù)據(jù)。使用的人硬化素肽是 T19.2、T20、T20.6、T21-22、AspN14.6、AspN18.6 和 AspN22.7-23.5。
[0088]圖17顯示了來自基于Biacore的“人硬化素肽表位競爭結(jié)合測定法”的共振單位 (Ru)信號。測定了與各種人硬化素肽(在溶液中)結(jié)合的Mab以及與完整成熟形式的人硬化素(固定在Biacore芯片上)結(jié)合的Mab。顯示了關(guān)于Ab-C的數(shù)據(jù)。使用的人硬化素肽是 T19.2、T20、T20.6、T21-22、AspN14.6、AspN18.6 和 AspN22.7-23.5。
[0089]圖18顯示了來自基于Biacore的“人硬化素肽表位競爭結(jié)合測定法”的共振單位 (Ru)信號。測定了與各種人硬化素肽(在溶液中)結(jié)合的Mab以及與完整成熟形式的人硬化素(固定在Biacore芯片上)結(jié)合的Mab。顯示了關(guān)于Ab-D的數(shù)據(jù)。使用的人硬化素肽是 T19.2、T20、T20.6、T21-22、AspN14.6、AspN18.6 和 AspN22.7-23.5。
[0090]圖19顯示了人硬化素的2種Mab結(jié)合表位。圖19A顯示了關(guān)于Ab-A和Ab-B與人硬化素結(jié)合的Loop2表位的序列(SEQ ID NO:6) 0圖19B顯示了關(guān)于Ab-C和Ab-D與人硬化素結(jié)合的T20.6表位的序列、二硫鍵合和示意圖(SEQ ID NO:2_5)。
[0091]圖20描述了用胰蛋白酶消化后的人硬化素的HPLC肽圖。圖20A顯示了人硬化素 Ab-D復(fù)合物的消化。圖20B顯示了單獨(dú)的人硬化素的消化。指出了 T19.2、T20、T20.6和 T21-22肽的峰。
[0092]圖21顯示了關(guān)于Ab-D與人硬化素結(jié)合的“T20.6衍生物I (胱氨酸結(jié)+4臂)”表位的序列、二硫鍵合和示意圖(SEQ ID NO:70-73)。
[0093]圖22顯示來自用于鑒定抗硬化素中和Mab的MC3T3_E1_BF成骨細(xì)胞系礦化測定法的結(jié)果。使用I U g/ml的小鼠硬化素(Scl)。使用10和g/ml的單克隆抗體。通過測量鈣來定量礦化(各種類型的不溶性磷酸鈣)程度。
`[0094]圖23顯示來自用于鑒定抗硬化素中和Mab的MC3T3_E1_BF成骨細(xì)胞系礦化測定法的結(jié)果。使用I U g/ml的人硬化素(Scl)。使用8和4 y g/ml的單克隆抗體。通過測量鈣來定量礦化(各種類型的不溶性磷酸鈣)程度。
[0095]圖24顯示來自用于鑒定抗硬化素中和Mab的MC3T3_E1_BF成骨細(xì)胞系礦化測定法的結(jié)果。使用I U g/ml的人硬化素(Scl)。使用10 u g/ml的單克隆抗體。通過測量鈣來定量礦化(各種類型的不溶性磷酸鈣)程度。
[0096]圖25描述了來自炎癥誘導(dǎo)的骨丟失SCID小鼠模型的結(jié)果。Ab-A的處理保護(hù)小鼠不受與結(jié)腸炎有關(guān)的炎癥相關(guān)性骨丟失，當(dāng)測量為總骨礦物質(zhì)密度(圖25A)、椎骨密度(圖 25B)和股骨密度(圖25C)時。
[0097]發(fā)明詳述
[0098]本發(fā)明涉及包含由與全長硬化素結(jié)合的抗體識別的表位的人硬化素蛋白質(zhì)區(qū)域， 以及制備和使用這些表位的方法。本發(fā)明還提供了與硬化素或硬化素的部分特異性結(jié)合的結(jié)合劑(例如抗體)，以及使用此類結(jié)合劑的方法。結(jié)合劑用于阻斷或削弱人硬化素與一種或多種配體的結(jié)合。
[0099]重組人硬化素/SOST 從 R&D Systems (Minneapolis, MN，USA ；2006 目錄 #1406-ST-025)商購可得。此外，重組小鼠硬化素/SOST 從 R&D Systems (Minneapolis, MN，USA;2006目錄#1589_ST_025)商購可得。研究級硬化素結(jié)合單克隆抗體從R&D Systems (Minneapolis, MN, USA ;小鼠單克隆:2006 目錄 #MAB1406 ;大鼠單克隆:2006 目錄 #MAB1589)商購可得。美國專利號6，395，511和6，803, 453以及美國專利公開20040009535 和20050106683 —般性涉及抗硬化素抗體。
[0100]如本文使用的，術(shù)語人硬化素意欲包括SEQ ID NO:1的蛋白質(zhì)及其等位基因變體。 硬化素可以通過使用肝素HP柱、使用鹽梯度洗脫宿主細(xì)胞培養(yǎng)液的過濾上清液從293T宿主細(xì)胞純化，所述293T宿主細(xì)胞已被編碼硬化素的基因轉(zhuǎn)染。制備和使用陽離子交換色譜法的進(jìn)一步純化在實(shí)施例1和2中描述。
[0101]如本文定義的，本發(fā)明的結(jié)合劑優(yōu)選是抗體。術(shù)語“抗體”指完整抗體或其結(jié)合片段?？贵w可以包含完整的抗體分子(包括具有全長重鏈和/或輕鏈的多克隆、單克隆、 嵌合、人源化、或人抗體)，或包含其抗原結(jié)合片段?？贵w片段包括F(ab' )2、Fab、Fab’、 Fv、Fe和Fd片段,且可以摻入單結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈抗體、特大型抗體(maxibodies)、微型抗體(minibody)、胞內(nèi)抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、v-NAR和雙-scFv內(nèi)(參見例如 Hollinger 和 Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23,9,1126-1136)。抗體多妝還在美國專利號6，703, 199中公開,包括纖連蛋白多肽單體(monobody)。其他抗體多肽在美國專利公開2005/0238646中公開，它們是單鏈多肽。
[0102]來源于抗體的抗原結(jié)合片段可以例如根據(jù)常規(guī)方法通過抗體的蛋白水解作用獲得，例如完整抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化。例如，抗體片段可以通過用胃蛋白酶酶促切割抗體來產(chǎn)生，以提供稱為F(ab' )2的55片段。這種片段可以使用硫醇還原劑進(jìn)一步切割以產(chǎn)生3.5S Fab’單價片段。任選地，切割反應(yīng)可以使用適合于巰基的封閉基來進(jìn)行， 所述巰基由二硫鍵切割產(chǎn)生。作為可替代方法，使用木瓜蛋白酶的酶促切割直接產(chǎn)生2個單價Fab片段和Fe片段。這些方法例如由Goldenberg,美國專利號4，331, 647, Nisonoff 等人,Arch.Biochem.Biophys.89:230,1960 ；Porter,Biochem.J.73:119,1959 ；Edelman 等人，在 Methods in Enzymologyl:422 (Academic Pressl967)中;以及由 Andrews, S.M.和 Titus, J.A.在 Current Protocols in Immunology 中(Co ligan J.E.,等人，eds), John Wiley & Sons, New York(2003)第 2.8.1-2.8.10 頁和第 2.1OA.1-2.1OA.5 頁描述。也可以使用用于切割抗體的其他方法，例如分開重鏈以形成單價輕-重鏈片段(Fd)，片段的進(jìn)一步切割，或其他酶促、化學(xué)或遺傳技術(shù)，條件是片段能與由完整抗體識別的抗原結(jié)合。
[0103]抗體片段也可以是任.何合成或遺傳工程化的蛋白質(zhì)。例如，抗體片段包括由輕鏈可變區(qū)組成的分離的片段，由重和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段，其中輕和重可變區(qū)通過肽連接子連接的重組單鏈多肽分子(scFv蛋白質(zhì))。
[0104]另一種形式的抗體片段是包含抗體的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)的肽。⑶R(也稱為“最小識別單位”、或“高變區(qū)”)可以通過構(gòu)建編碼目的⑶R的多核苷酸來獲得。此類多核苷酸例如通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的mRNA作為模板合成可變區(qū)來制備(參見，例如，Larrick 等人，Methods:A Companion to Methods in Enzymology2: 106,1991 ;Courtenay_Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,，，在Monoclonal Antibodies !Production, Engineering and Clinical Application 中， Ritter 等人，(eds.),第 166 頁(Cambridge University Press 1995);以及 Ward 等人， “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,，，在 Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 中，Birch 等人，(eds.), 第 137 頁(ffiley-Liss, Inc.1995))。
[0105]因此，在一個實(shí)施方案中，結(jié)合劑包含如本文所述的至少一個⑶R。結(jié)合劑可以包含如本文所述的至少2、3、4、5或6個⑶R。結(jié)合劑可以選一步包含本文所述抗體的至少一種可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可以具有任何大小或氨基酸組成，且一般將包含負(fù)責(zé)與人硬化素結(jié)合的至少一個⑶R序列，例如本文具體描述的⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3和/或輕鏈CDRs且與一個或多個構(gòu)架序列相鄰或在其框內(nèi)(in frame)。一般而言，可變(V)區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是免疫球蛋白重(Vh)和/或輕(\)鏈可變結(jié)構(gòu)域的任何合適排列。因此，例如，V 區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是單體且可以是Vh或\結(jié)構(gòu)域，其能夠如下所述以至少等于1x10_7M或更低的親和力獨(dú)立地結(jié)合人硬化素?？商娲?，V區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是二聚體且包含VH-VH、Vh-Vl或 Vl-Vl 二聚體。V區(qū)二聚體包含可以非共價結(jié)合的至少一條Vh和至少一條\鏈(下文稱為 Fv)。必要時，鏈可以直接共價偶聯(lián)，例如經(jīng)由2個可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵，或通過連接子例如肽連接子偶聯(lián)，以形成單鏈Fv (scFv)。
[0106]可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是任何天然存在的可變結(jié)構(gòu)域或其改造形式。改造形式意指已使用重組DNA改造技術(shù)制備的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。此類改造形式包括例如通過特異性抗體的氨基酸序列中的插入、刪除或變化由特異性抗體可變區(qū)制備的那些。具體例子包括包含至少一個CDR和任選地一個或多個構(gòu)架氨基酸來自第一種抗體以及可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的其余部分來自第二種抗體的改造的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。
[0107]可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可以在C末端氨基酸處與至少一種其他抗體結(jié)構(gòu)域或其片段共價附著。因此，例如，可變區(qū)結(jié)構(gòu)域中存在的VH結(jié)構(gòu)域可以與免疫球蛋白CHl結(jié)構(gòu)域或其片段連接。類似地，\結(jié)構(gòu)域可以與Ck結(jié)構(gòu)域或其片段連接。以這種方式，例如，抗體可以是 Fab片段，其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在其C末端處分別與CHl和Ck結(jié)構(gòu)域共價連接的結(jié)合的％和'結(jié)構(gòu)域。CHl結(jié)構(gòu)域可以用更多的氨基酸延伸，例如以提供如Fab’片段中發(fā)現(xiàn)的鉸鏈區(qū)或鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域的部分，或提供更多的結(jié)構(gòu)域，例如抗體CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
[0108]如本文描述的，結(jié)合劑包含這些⑶R中的至少一個。例如，一個或多個⑶R可以摻入已知抗體構(gòu)架區(qū)內(nèi)(IgGl，IgG2等)，或與合適媒介物綴合以增加其半衰期。合適媒介物包括但不限于Fe、聚乙二醇(PEG)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。這些和其他合適媒介物是本領(lǐng)域已知的。此類綴合的CDR肽可以是單體、二聚體、四聚體或其他形式。在一個實(shí)施方案中， 一種或多種水溶性聚合物在結(jié)合劑 的一個或多個特定位置處例如在氨基末端處結(jié)合。
[0109]在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合劑包含一種或多種水溶性聚合物附著物，包括但不限于，聚乙二醇、聚氧乙烯二醇、或聚丙二醇。參見，例如，美國專利號4，640，835、
4,496,689,4, 301，144,4,670,417,4, 791，192 和 4，179，337。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合劑衍生物包含一種或多種單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纖維素、或其他基于碳水化合物的聚合物、聚(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如丙三醇)和聚乙烯醇，以及此類聚合物的混合物。在某些實(shí)施方案中，一種或多種水溶性聚合物隨機(jī)附著至一條或多條側(cè)鏈。在某些實(shí)施方案中，PEG可以用于改善結(jié)合劑例如抗體的治療能力。某些此類方法例如在美國專利號6，133，426中討論，所述專利為了任何目的在此引入作為參考。
[0110]應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的結(jié)合劑可以具有至少一個氨基酸置換，條件是結(jié)合劑保留結(jié)合特異性。因此，關(guān)于結(jié)合劑結(jié)構(gòu)的修飾包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些可以包括不破壞結(jié)合劑的硬化素結(jié)合能力的保守或非保守性氨基酸置換。保守性氨基酸置換可以包含非天然存在的氨基酸殘基，這一般通過化學(xué)肽合成而不是通過在生物系統(tǒng)中合成而摻入。這些包括肽模擬物(peptidomimetics)和其他反向或倒轉(zhuǎn)形式的氨基酸部分。保守性氨基酸置換還可以涉及用標(biāo)準(zhǔn)化殘基置換天然氨基酸殘基，從而使得對那個位置處的氨基酸殘基的極性或電荷只有很小的影響或沒有影響。
[0111]非保守性置換可以涉及一類氨基酸或氨基酸模擬物的成員交換成具有不同物理性質(zhì)(例如大小、極性、疏水性、電荷)的另一類的成員。此類置換的殘基可以引入與非人抗體同源的人抗體區(qū)域內(nèi)，或分子的非同源區(qū)域內(nèi)。
[0112]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生在每個所需氨基酸殘基處包含單個氨基酸置換的測試變體。變體隨后可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的活性測定法來篩選。此類變體可以用于收集關(guān)于合適變體的信息。例如，如果發(fā)現(xiàn)特定氨基酸殘基的變化導(dǎo)致破壞、不希望地減少、或不合適的活性，那么具有此類變化的變體可以被避免。換言之，基于由此類常規(guī)實(shí)驗(yàn)收集的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定其中應(yīng)當(dāng)避免單獨(dú)的或與其他突變組合的置換的氨基酸。
[0113]本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用眾所周知的技術(shù)確定如本文所述的多肽的合適變體。 在某些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒定通過靶向被認(rèn)為對活性不重要的區(qū)域可以進(jìn)行改變而不破壞活性的分子的合適區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，可以鑒定在類似多肽中是保守的分子殘基和部分。在某些實(shí)施方案中，甚至可以在對生物活性或結(jié)構(gòu)可能重要的區(qū)域?qū)嵤┍Ｊ匕被嶂脫Q而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結(jié)構(gòu)。
[0114]另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以檢查鑒定類似多肽中對活性或結(jié)構(gòu)重要的殘基的結(jié)構(gòu)-功能研究。鑒于此類比較，可以預(yù)測蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的重要性，所述氨基酸殘基對應(yīng)在類似蛋白質(zhì)中對活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇對于此類預(yù)測重要的氨基酸殘基的化學(xué)類似的氨基酸置換。
[0115]本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以分析3維結(jié)構(gòu)以及與類似多肽中的那種結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸序列。鑒于此類信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測關(guān)于其3維結(jié)構(gòu)的抗體的氨基酸殘基比對。在某些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇不對預(yù)測在蛋白質(zhì)表面上的氨基酸殘基進(jìn)行基團(tuán)變化，因?yàn)?此類殘基可能涉及與其他分子的重要相互作用。
[0116]眾多科學(xué)出版物已致力于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。參見Moult J., Curr.0p.1n Biotech.,7(4):422-427(1996)， Chou 等人，Biochemistry,13(2):222-245(1974) ；Chou 等人，Biochemistry,113(2):211-222(1974) ；Chou 等人，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，47:45-148 (1978) ；Chou 等人，Ann.Rev.Biochem.，47:251-276 和 Chou 等人， Biophys.J.,26:367-384(1979)。此外，計(jì)算機(jī)程序目前可用于幫助預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的一種方法基于同源性建模。例如，具有大于30%的序列同一丨丨生，或大于40% 的相似性的2種多肽或蛋白質(zhì)通常具有類似的結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)。近來發(fā)展的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)已提供增強(qiáng)的二級結(jié)構(gòu)可預(yù)測性，包括多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)可能的折疊數(shù)目。參見 Holm 等人，Nucl.Acid.Res.，27 (I):244-247 (1999)。已建議(Brenner 等人，Curr.0p.Struct.Biol.,7(3):369-376(1997))在給定多肽或蛋白質(zhì)中存在有限數(shù)目的折疊，并
且一旦關(guān)鍵數(shù)目的結(jié)構(gòu)已確定，那么結(jié)構(gòu)預(yù)測將明顯變得更精確。
[0117]預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的另外方法包括“穿線(threading) ”(Jones, D., Curr.0pin.Struct.Biol.,7(3):377-87(1997) ；Sippl 等人，Structure, 4 (I): 15-19 (1996))，“特征分析(profile analysis) ” (Bowie 等人，Science, 253: 164-170 (1991) ；Gribskov 等人，Meth.Enzym., 183: 146-159 (1990) ；Gribskov 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.,84(13): 4355-4358(1987))，和“進(jìn)化連鎖(evolutionary linkage) ” (參見 Holm,同上(1999)，和 Brenner,同上(1997))。
[0118]在某些實(shí)施方案中，結(jié)合劑的變體包括其中與親本多肽的氨基酸序列相比糖基化位點(diǎn)的數(shù)目和/或類型已改變的糖基化變體。在某些實(shí)施方案中，變體包含比天然蛋白質(zhì)數(shù)目更多或更少的N連接糖基化位點(diǎn)。N連接糖基化位點(diǎn)的特征在于下列序列:Asn-X-Ser 或Asn-X-Thr，其中指定為X的氨基酸殘基可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸殘基。創(chuàng)造這種序列的氨基酸殘基置換提供了用于添加N連接糖鏈的潛在新位點(diǎn)?？商娲?，消除這種序列的置換將去除現(xiàn)有的N連接糖鏈。還提供了 N連接糖鏈的重排，其中一個或多個N 連接糖基化位點(diǎn)(一般是天然存在的那些)被消除并且一個或多個新N連接位點(diǎn)被創(chuàng)造。 另外優(yōu)選的抗體變體包括半胱氨酸變體，其中與親本氨基酸序列比較一個或多個半胱氨酸殘基被刪除或以另一種氨基酸(例如絲氨酸)置換。當(dāng)抗體必須重折疊成生物學(xué)活性構(gòu)象時，例如分離不溶性包含體后，半胱氨酸變體可能是有用的。半胱氨酸變體一般具有比天然蛋白質(zhì)更少的半胱氨酸殘基，并且一般具有偶數(shù)數(shù)目以最小化由不成對的半胱氨酸引起的相互作用。
[0119]所需氨基酸置換(無論是保守的還是不保守的)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在此類置換需要時進(jìn)行確定。在某些實(shí)施方案中，氨基酸置換可以用于鑒定針對硬化素的抗體的重要?dú)埢?，或增加或減少如本文所述的針對硬化素的抗體的親和力。
[0120]根據(jù)某些實(shí)施方案，優(yōu)選的氨基酸置換是下列那些:(I)減少對蛋白水解的敏感性，(2)減少對氧化的敏感性，(3)改變用于形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合親和力，(4)改變結(jié)合親和力，和/或(4)給予或修飾關(guān)于此類多肽的其他生理化學(xué)或功能特性。根據(jù)某些實(shí)施方案，單個或多個氨基酸置換(在某些實(shí)施方案中，保守性氨基酸置換)可以在天然存在的序列中(在某些實(shí)施方案中，在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外的多肽部分中)進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，保守性氨基酸置換一般基本上不改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征(例如，替換氨基酸不應(yīng)趨向破壞親本序列中存在的螺旋，或破裂親本序列特有的其他類型的二級結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域公認(rèn)的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的例子在Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed.,ff.H.Freeman and Company,New York(1984)) ；Introduction to Protein Structure(C.Branden 和 J.Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991));以及Thornton等人，Na ture354:105 (1991)中得到描述，所述參考文獻(xiàn) 各自引入本文作為參考。
[0121]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合劑可以與聚合物、脂質(zhì)或其他部分化學(xué)結(jié)合。
[0122]結(jié)合劑可以包含摻入生物相容性構(gòu)架結(jié)構(gòu)內(nèi)的本文所述的至少一個⑶R。在一個例子中，生物相容性構(gòu)架結(jié)構(gòu)包含足以形成構(gòu)象穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)支撐、或構(gòu)架、或支架的多肽或其部分，其能夠顯示在局部表面區(qū)域中與抗原結(jié)合的一種或多種氨基酸序列(例如，CDR、 可變區(qū)等)。此類結(jié)構(gòu)可以是天然存在的多肽或多肽“折疊”(結(jié)構(gòu)基序)，或可以具有相對于天然存在的多肽或折疊的一種或多種修飾，例如氨基酸添加、刪除或置換。這些支架可以來源于任何物種(或超過一種的物種)的多肽，例如人、其他哺乳動物、其他脊椎動物、無脊椎動物、植物、細(xì)菌或病毒。
[0123]生物相容性構(gòu)架結(jié)構(gòu)一般基于除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以外的蛋白質(zhì)支架或骨架。例如，可以使用基于纖連蛋白、錨蛋白、lipocalin、新制癌菌素(neocarzinostain)、細(xì)胞色素 b、CPl鋅指、PST1、卷曲螺旋、LAC1-D1、Z結(jié)構(gòu)域和tendramisat結(jié)構(gòu)域的那些(參見例如， Nygren 和 Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology,7,463-469)。
[0124]在優(yōu)選實(shí)施方案中，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的結(jié)合劑包括本文所述的人源化抗體。人源化抗體例如本文所述的那些可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)產(chǎn)生(Zhang，W.，等人， Molecular Immunology.42 (12):1445-1451, 2005 ;Hwang W.等人，Methods.36 (I):35-42, 2005 ；Dall ' Acqua WF,等人，Methods 36(1):43-60, 2005 ；和 Clark, M., Immunology Today.21(8):397-402,2000)。
[0125]另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到合適的結(jié)合劑包括這些抗體的部分，例如如本文具體公開的⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3、⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中的一個或多個。⑶R-Hl、 ⑶R-H2、⑶R-H3、⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3區(qū)域中的至少一個可以具有至少一個氨基酸置換，條件是結(jié)合劑保留未置換CDR的結(jié)合特異性。結(jié)合劑的非CDR部分可以是非蛋白質(zhì)分子，其中結(jié)合劑交叉阻斷本文公開的抗體與硬化素的結(jié)合和/或中和硬化素。結(jié)合劑的非 CDR部分可以是非蛋白質(zhì)分子，其中結(jié)合劑在“人硬化素肽表位競爭結(jié)合測定法”中顯示與人硬化素肽的結(jié)合模式類似于至少一種下列抗體顯示的那種:Ab-A、Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-1 1、Ab-12、Ab-13、Ab-14、 Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 和 Ab_24，和 / 或中和硬化素。結(jié)合劑的非⑶R部分可以由氨基酸組成，其中結(jié)合劑是重組結(jié)合蛋白或合成肽，并且所述重組結(jié)合蛋白交叉阻斷本文公開抗體與硬化素的結(jié)合和/或中和硬化素。結(jié)合劑的非 CDR部分可以由氨基酸組成，其中結(jié)合劑是重組結(jié)合蛋白，并且所述重組結(jié)合蛋白在“人硬化素肽表位競爭結(jié)合測定法”(下文描述)中顯示與人硬化素肽的結(jié)合模式類似于至少一種下列抗體顯示的那種:Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、 Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、 Ab-21、Ab-22、Ab-23 和 Ab_24，和 / 或中和硬化素。
[0126]當(dāng)抗體包含如上所述的⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3、⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中的一個或多個時，它可以通過由包含編碼這些序列的DNA的宿主細(xì)胞表達(dá)來獲得。編碼每個CDR序列的DNA可以在CDR氨基酸序列的基礎(chǔ)上測定，且適當(dāng)時使用寡核苷酸合成技術(shù)、定點(diǎn)誘變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)與任何所需的抗體可變區(qū)構(gòu)架和恒定區(qū) DNA序列一起合成。編碼可變區(qū)構(gòu)架和恒定區(qū) 的DNA對于本領(lǐng)域技術(shù)人員由遺傳序列數(shù)據(jù)庫例如GenBank?可廣泛獲得。上述每個cdr —般將位于可變區(qū)構(gòu)架中根據(jù)Kabat 編號系統(tǒng)在重鏈的位置31-35 (CDR-Hl)、50-65 (CDR-H2)和95-102 (CDR-H3)和輕鏈的位置 24-34 (CDR-Ll)、50-56 (CDR-L2)和 89-97 (CDR-L3)處(Kabat 等人，1987 在 Sequences of Proteins of Immunological Interest 中，U.S.Department of Health and HumanServices, NIH, USA)。
[0127]一旦被合成，編碼本發(fā)明抗體或其片段的DNA就可以使用許多已知表達(dá)載體根據(jù)用于核酸切除、連接、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的各種眾所周知操作中的任何一種進(jìn)行增殖和表達(dá)。因此，在某些實(shí)施方案中抗體片段的表達(dá)在原核細(xì)胞例如大腸桿菌(Escherichia coli)中可能是優(yōu)選的(參見例如，Pluckthun等人，1989Methods Enzymol.178:497-515)。在某些其他實(shí)施方案中，抗體或其片段的表達(dá)在真核宿主細(xì)胞中可能是優(yōu)選的，包括酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、動物細(xì)胞(包括哺乳動物細(xì)胞)或植物細(xì)胞。合適的動物細(xì)胞的例子包括但不限于骨髓瘤(例如小鼠NSO系)、COS、CH0、或雜交瘤細(xì)胞。植物細(xì)胞的例子包括煙草、玉米、大豆和水稻細(xì)胞。
[0128]包含編碼抗體可變和/或恒定區(qū)的DNA的一種或多種可復(fù)制的表達(dá)載體可以被制備并用于轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞系，例如非生產(chǎn)性骨髓瘤細(xì)胞系，例如小鼠NSO系，或其中抗體生產(chǎn)將發(fā)生的細(xì)菌例如大腸桿菌(E.coli)。為了獲得有效轉(zhuǎn)錄和翻譯，每種載體中的DNA序列應(yīng)當(dāng)包括與可變結(jié)構(gòu)域序列可操作地連接的合適的調(diào)節(jié)序列，特別是啟動子和前導(dǎo)序列。用于以這種方式生產(chǎn)抗體的具體方法一般是眾所周知和常規(guī)使用的。例如，基本分子生物學(xué)操作由 Maniatis 等人，(Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory, New York, 1989 ;還參見 Maniatis 等人,第三版，Cold SpringHarbor Laboratory, New York, (2001))描述。DNA 測序可以如 Sanger 等人，(PNAS74:5463, (1977))和Amersham International pic測序手冊中描述的進(jìn)行，并且定點(diǎn)誘變可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法來進(jìn)行(Kramer 等人，Nucleic Acids Res.12:9441, (1984) ；KunkelProc.Natl.Acad.Sc1.USA82:488-92(1985) ；KunkeI 等人，Methods in Enzymol.154:367-82(1987) ；the Anglian Biotechnology Ltd handbook)。另外，眾多出版物描述了適合于通過DNA操作、表達(dá)載體制備以及合適細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)來制備抗體的技術(shù)(MountainA和Adair,J R in Biotechnology and G`enetic Engineering Reviews(ed.Tombs,M P,10,Chapterl, 1992, Intercept,Andover, UK) ；uCurrent Protocols in Molecular Biology，，，1999, F.M.Ausubel(ed.), Wiley Interscience, New York)。
[0129]當(dāng)希望改善包含一個或多個上述⑶R的根據(jù)本發(fā)明的抗體的親和力時，可以通過眾多親和力成熟方案來獲得，包括維持CDR (Yang等人，J.Mol.Biol.，254，392-403，1995)、鏈改組(Marks等人，Bio/Technology, 10, 779-783,1992)、使用大腸桿菌的突變菌株(Low等人，J.Mol.Biol.，250, 350-368,1996)、DNA 改組(Patten 等人，Curr.0pin.Biotechnol.，8，724-733，1997)、噬菌體展示(Thompson 等人，J.Mol.Biol.，256，7-88,1996)和性別PCR(Crameri,等人,Na ture, 391, 288-291,1998)。所有這些親和力成熟方法由Vaughan等人(Na ture Biotechnology, 16，535-539，1998)討論。
[0130]根據(jù)本發(fā)明的其他抗體可以通過如本文所述和本領(lǐng)域已知的常規(guī)免疫接種和細(xì)胞融合操作來獲得。本發(fā)明的單克隆抗體可以使用各種已知技術(shù)來產(chǎn)生。一般而言，與特定抗原結(jié)合的單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得(參見，例如，Kohler等人，Na ture256:495,1975 ;Coligan 等人，(eds.), Current Protocols in Immunology,I:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sonsl991);美國專利號 RE32, 011，4, 902，614，4, 543，439和 4，411，993 ;Monoclonal Antibodies, Hybridomas:A New Dimension in BiologicalAnalyses, Plenum Press, Kennett, McKearn,和 Bechtol (eds.) (1980);以及 Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow 和 Lane(eds.), Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1988) ;Picksley等人,“Production of monoclonal antibodies against proteinsexpressed inE.coli,，，在 DNA Cloning2 !Expression Systems 中，第二版，Glover 等人，(eds.),第93頁(Oxford University Pressl995))。抗體片段可以使用任何合適的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如蛋白水解消化，或任選地通過蛋白水解消化(例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)隨后為二硫鍵的輕度還原和烷化由此衍生。可替代地，此類片段還可以通過如本文所述的重組遺傳工程技術(shù)來產(chǎn)生。
[0131]單克隆抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域已知和本文描述的方法通過用包含SEQ ID N0:1的人硬化素或其片段的免疫原注射動物，例如大鼠、倉鼠、兔、或優(yōu)選地小鼠，包括例如轉(zhuǎn)基因或敲除的動物來獲得。特異性抗體產(chǎn)生的存在可以在最初注射后和/或在加強(qiáng)注射后，通過獲得血清樣品且使用本領(lǐng)域已知和本文描述的幾種免疫檢測方法中的任何一種檢測與人硬化素或肽結(jié)合的抗體的存在進(jìn)行監(jiān)控。從產(chǎn)生所需抗體的動物中取出淋巴樣細(xì)胞，最通常地來自脾或淋巴結(jié)的細(xì)胞，以獲得B淋巴細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞隨后與藥物致敏的骨髓瘤細(xì)胞融合配偶體融合，優(yōu)選與被免疫動物是同基因的且任選地具有其他所需特性(例如，不能表達(dá)內(nèi)源性Ig基因產(chǎn)物的任何配偶體，例如P3X63-Ag8.653 (ATCC N0.CRL1580) ；NS0,SP20)，以產(chǎn)生雜交瘤，這是永生的真核細(xì)胞系。淋巴樣(例如脾)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可以與膜融合促進(jìn)劑例如聚乙二醇或非離子型去污劑組合數(shù)分鐘，隨后以低密度在支持雜交瘤細(xì)胞但不支持未融合的骨髓瘤細(xì)胞生長的選擇性培養(yǎng)基上鋪板。優(yōu)選的選擇性培養(yǎng)基是HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)。在足夠時間通常為約I至2周后，觀察到細(xì)胞集落。分離單個集落，且可以使用本領(lǐng)域已知和本文描述的各種免疫測定法中的任何一種測試由細(xì)胞產(chǎn)生的抗體與人硬化素的結(jié)合活性?？寺‰s交瘤(例如通過有限稀釋克隆法或通過軟瓊脂斑分離)，且選擇并培養(yǎng)產(chǎn)生對硬化素特異的抗體的陽性克隆。來自雜交瘤培養(yǎng)的單克隆抗體可以從雜交瘤培養(yǎng)物的上清液中分離。用于生產(chǎn)鼠類單克隆抗體的可替代方法是將雜交瘤細(xì)胞注射到同基因小鼠的腹膜腔內(nèi)，例如已處理(例如姥鮫烷預(yù)處理的)以促進(jìn)包含單克隆抗體的腹水形成的小鼠。單克隆抗體可以通過各種良好建立的技術(shù)進(jìn)行分離和純化。此類分離技術(shù)包括用A蛋白瓊脂.糖的親和色譜法、大小排阻色譜法和離子交換色譜法(參見例如 Coligan 在第 2.7.1-2.7.12 頁和第 2.9.1-2.9.3 頁；Baines 等人，“Purificationof Immunoglobulin G(IgG), ” 在 Methods in Molecular Biology 中，第 10 卷,第 79-104頁(The Humana Press, Inc.1992))。單克隆抗體可以通過親和色譜法使用基于抗體的具體特性(例如重或輕鏈同種型、結(jié)合特異性等)選擇的合適配體進(jìn)行純化。固定在固體載體上的合適配體的例子包括A蛋白、G蛋白、抗恒定區(qū)(輕鏈或重鏈)抗體、抗獨(dú)特型抗體、和TGF-β結(jié)合蛋白、或其片段或變體。
[0132]本發(fā)明的抗體還可以是人單克隆抗體。人單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的許多技術(shù)來產(chǎn)生。此類方法包括但不限于，人外周血細(xì)胞(例如包含B淋巴細(xì)胞)的EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化、人B細(xì)胞的體外免疫接種、攜帶插入的人免疫球蛋白基因的來自免疫轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞融合、從人免疫球蛋白V區(qū)噬菌體文庫中分離、或如本領(lǐng)域已知和基于本文公開內(nèi)容的其他操作。例如，人單克隆抗體可以由轉(zhuǎn)基因小鼠獲得，所述轉(zhuǎn)基因小鼠已進(jìn)行改造以響應(yīng)抗原攻擊而產(chǎn)生特異性人抗體。用于由轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法例如由 Green 等人，Na ture Genet.7:13,1994 ;Lonberg 等人，Na ture368:856,1994 ；Taylor 等人，Int.Tmmun.6:579,1994 ;美國專利號 5，877, 397 ；Bruggemann 等人，1997Curr.0pin.Biotechnol.8:455-58 ；Jakobovits 等人，1995Ann.N.Y.Acad.Sc1.764:525-35描述。通過這種技術(shù)將人重和輕鏈基因座的元件引入來源于胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系內(nèi)，所述胚胎干細(xì)胞系包含靶向斷裂的內(nèi)源性重鏈和輕鏈基因座(同樣參見Bruggemann等人，Curr.0pin.Biotechnol.8:455-58 (1997))。例如，人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因可以是小基因構(gòu)建體、或在酵母人工染色體上的轉(zhuǎn)基因座(transloci)，其在小鼠淋巴樣細(xì)胞中經(jīng)歷B細(xì)胞特異性DNA重排和高突變。人單克隆抗體可以通過免疫轉(zhuǎn)基因小鼠來獲得，所述轉(zhuǎn)基因小鼠隨后可以產(chǎn)生對硬化素特異的人抗體。免疫轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴樣細(xì)胞可以根據(jù)本文所述方法用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。包含人抗體的多克隆血清還可以從免疫動物的血液中獲得。
[0133]用于產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體的另一種方法包括通過EBV轉(zhuǎn)化使人外周血細(xì)胞永生。參見例如美國專利號4，464，456。產(chǎn)生與硬化素特異性結(jié)合的單克隆抗體的此類永生化B細(xì)胞系(或類淋巴母細(xì)胞系)可以通過如本文提供的免疫檢測方法例如ELISA進(jìn)行鑒定，隨后通過標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)進(jìn)行分離。產(chǎn)生抗硬化素抗體的類淋巴母細(xì)胞系的穩(wěn)定性可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法(參見,例如,Glasky等人，Hybridoma8:377-89(1989))通過使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系與鼠類淋巴瘤融合以產(chǎn)生小鼠-人雜交細(xì)胞系得到改善。產(chǎn)生人單克隆抗體的另一種方法是體外免疫接種，這包括用人硬化素預(yù)處理人脾B細(xì)胞，隨后使預(yù)處理的B細(xì)胞與異雜交(heterohybrid)融合配偶體融合。參見，例如，Boerner 等人，1991J.1mmunol.147:86_95。
[0134]在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生抗人硬化素抗體的B細(xì)胞被選擇，且輕鏈和重鏈可變區(qū)根據(jù)本領(lǐng)域已知(W092/02551 ;美國專利 5，627，052 ；Babcook 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93 =7843-48(1996))和本文描述的分子生物學(xué)技術(shù)由B細(xì)胞進(jìn)行克隆。來自免疫動物的B細(xì)胞可以通過選擇產(chǎn)生與硬化素特異性結(jié)合的抗體的細(xì)胞從脾、淋巴結(jié)或外周血樣品中分離。B細(xì)胞還可以從人中例如從外周血樣品中分離。用于檢測產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的單一 B細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如通過空斑形成、熒光激活細(xì)胞分選、體外刺激隨后檢測特異性抗 體等。用于選擇產(chǎn)生特異性抗體的B細(xì)胞的方法包括，例如在包含人硬化素的軟瓊脂中制備B細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。通過B細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體與抗原結(jié)合導(dǎo)致形成復(fù)合物，所述復(fù)合物作為免疫沉淀物可能是看得見的。選擇產(chǎn)生所需抗體的B細(xì)胞后，特異性抗體基因可以根據(jù)本領(lǐng)域已知和本文所述方法通過分離和擴(kuò)增DNA或mRNA進(jìn)行克隆。
[0135]用于獲得本發(fā)明抗體的另外方法是經(jīng)由噬菌體展示。參見，例如，Winter等人，1994Annu.Rev.Tmmunol.12:433-55 ；Burton 等人，1994Adv.Tmmunol.57:191_280。人或鼠類免疫球蛋白可變區(qū)基因組合文庫可以在噬菌體載體中制備，所述噬菌體載體可以進(jìn)行篩選以選擇與TGF-β結(jié)合蛋白或其變體或片段特異性結(jié)合的Ig片段(Fab、Fv, sFv、或其多聚體)ο 參見，例如，美國專利號 5，223，409 ；Huse 等人，1989Science246:1275-81 ；Sastry等人，Proc.Na tl.Acad.Sc1.USA86:5728-32 (1989) ;Alting_Mees 等人,Strategies inMolecular Biology3:1-9(1990) ;Kang 等人，1991Proc.Na tl.Acad.Sc1.USA88:4363-66;Hoogenboom 等人，1992J.Molec.Biol.227:381-388 ；Schlebusch 等人，1997Hybridomal6:47-52以及其中引用的參考文獻(xiàn)。例如，包含編碼Ig可變區(qū)片段的多個多核苷酸序列的文庫可以插入絲狀噬菌體例如M13或其變體的基因組內(nèi)，與編碼噬菌體外殼蛋白的序列按讀碼框融合。融合蛋白可以是外殼蛋白與輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的融合。根據(jù)某些實(shí)施方案，免疫球蛋白Fab片段還可以在噬菌體顆粒上展示(參見，例如，美國專利號5,698,426)。
[0136]免疫球蛋白重和輕鏈cDNA表達(dá)文庫還可以在λ噬菌體中制備，例如使用λImmunoZap?(H)和 λ ImmunoZap?(L)載體(Stratagene,La Jolla,California)。簡言之，mRNA從B細(xì)胞群中分離，并用于在λ ImmunoZap (H)和λ ImmunoZap (L)載體中制備免疫球蛋白重和輕鏈cDNA表達(dá)文庫。這些載體可以單獨(dú)篩選或共表達(dá)以形成Fab片段或抗體(參見Huse等人，同上；還參見Sastry等人，同上)。陽性空斑隨后可以轉(zhuǎn)變成允許從大腸桿菌高水平表達(dá)單克隆抗體片段的非裂解性質(zhì)粒。
[0137]在一個實(shí)施方案中，在雜交瘤中，表達(dá)目的單克隆抗體的基因的可變區(qū)使用核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增。這些引物可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員合成，或可以由商購可得來源購買。(參見，例如，Stratagene (La Jolla, California),它出售用于小鼠和人可變區(qū)的引物,包括用于VHa，VHb、VHc;、VHd、CH1、八和Q區(qū)的引物)。這些引物可以用于擴(kuò)增重或輕鏈可變區(qū)，所述重或輕鏈可變區(qū)隨后可以分別插入載體例如ImmunoZAP?H或ImmunoZAp?L (Stratagene)內(nèi)。這些載體隨后可以引入大腸桿菌、酵母、或基于哺乳動物的系統(tǒng)內(nèi)用于表達(dá)。包含融合的Vh和Vl結(jié)構(gòu)域的大量單鏈蛋白質(zhì)可以使用這些方法產(chǎn)生(參見Bird等人,Science242:423-426，1988)。
[0138]一旦產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的抗體的細(xì)胞已使用任何上述免疫接種和其他技術(shù)獲得，特異性抗體基因就可以根據(jù)如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)操作通過由此分離和擴(kuò)增DNA或mRNA進(jìn)行克隆。由此產(chǎn)生的抗體可以進(jìn)行測序并且鑒定的⑶R和編碼⑶R的DNA可以如先前所述進(jìn)行處理以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的其他抗體。
[0139]優(yōu)選地結(jié)合劑與硬化素特異性結(jié)合。如同所有結(jié)合劑和結(jié)合測定法一樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解結(jié)合劑不應(yīng)與其可檢測地結(jié)合以便在治療上有效且合適的各種部分對于列舉將是無窮盡和不實(shí)際的。因此，對于本文公開的結(jié)合劑，術(shù)語“特異性結(jié)合”指結(jié)合劑以比它與無關(guān)的對照蛋白質(zhì) 的結(jié)合更大的親和力與硬化素優(yōu)選人硬化素結(jié)合的能力。優(yōu)選地對照蛋白質(zhì)是雞蛋蛋白溶菌酶。優(yōu)選地結(jié)合劑與硬化素結(jié)合的親和力是與對照蛋白質(zhì)的親和力的至少50、100、250、500、1000或10，000倍。結(jié)合劑對于人硬化素的親和力可以小于或等于1χ10_7Μ、小于或等于1χ10_8Μ、小于或等于1χ10_9Μ、小于或等于ΙχΙΟ,Μ、小于或等于1χ10_ηΜ、或小于或等于1χ10_12Μ。
[0140]親和力可以通過親和力ELISA測定法進(jìn)行測定。在某些實(shí)施方案中，親和力可以通過BIAcore測定法進(jìn)行測定。在某些實(shí)施方案中，親和力可以通過動力學(xué)方法進(jìn)行測定。在某些實(shí)施方案中，親和力可以通過平衡/溶解法進(jìn)行測定。此類方法在本文中進(jìn)一步詳細(xì)描述或是本領(lǐng)域已知的。
[0141]本發(fā)明的硬化素結(jié)合劑優(yōu)選在本文描述的基于細(xì)胞的測定法和/或本文描述的體內(nèi)測定法中調(diào)節(jié)硬化素功能，和/或與本文描述的一種或多種表位結(jié)合，和/或交叉阻斷本申請中描述的抗體之一的結(jié)合，和/或被本申請中描述的抗體之一交叉阻斷與硬化素的結(jié)合。因此此類結(jié)合劑可以使用本文描述的測定法進(jìn)行鑒定。
[0142]在某些實(shí)施方案中，結(jié)合劑通過首先鑒定抗體來產(chǎn)生，所述抗體在本文描述的基于細(xì)胞和/或體內(nèi)測定法中與本文提供的一種或多種表位結(jié)合和/或中和，和/或交叉阻斷本申請中描述的抗體，和/或被本申請中描述的抗體之一交叉阻斷與硬化素的結(jié)合。來自這些抗體的CDR區(qū)隨后用于插入合適的生物相容性構(gòu)架內(nèi)以產(chǎn)生硬化素結(jié)合劑。結(jié)合劑的非CDR部分可以由氨基酸組成，或可以是非蛋白質(zhì)分子。本文描述的測定法允許表征結(jié)合劑。優(yōu)選地本發(fā)明的結(jié)合劑是如本文定義的抗體。
[0143]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解某些蛋白質(zhì)例如抗體可以經(jīng)歷各種翻譯后修飾。這些修飾的類型和程度通常取決于用于表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞系以及培養(yǎng)條件。此類修飾可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪(diketopiperizine)形成、天冬氨酸異構(gòu)化和天冬酰胺脫酰胺的變化。常見的修飾是由于羧肽酶的作用失去羧基末端堿性殘基(例如賴氨酸或精氨酸)(如 Harris, RJ.Journal of Chroma tography705: 129-134,1995 中描述的)。
[0144]稱為Ab-A、Ab-B, Ab-C, Ab-D和Ab_l的抗體在下文描述。“HC”指重鏈和“LC”指輕鏈。對于下文的某些抗體，CDR是帶方框陰影的和恒定(C)區(qū)以粗體斜體顯示。
[0145]Ab-D
[0146]抗體D (在本文中也稱為Ab-D和Mab-D)是顯示與硬化素高親和力結(jié)合的小鼠抗體。Ab-D的BIAcore結(jié)合模式顯示于圖18中。
[0147]成熟形式(信號肽被去除)的Ab-D輕鏈的氨基酸序列:
[0148]
【權(quán)利要求】
1.一種硬化素結(jié)合劑，其交叉阻斷至少一種下列抗體與硬化素的結(jié)合:Ab-A、Ab-B, Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、 Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 和 Ab_24。
2.權(quán)利要求1的硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑被至少一種下列抗體交叉阻斷與硬化素的結(jié)合:Ab_A、Ab-B> Ab-C> Ab-D、Ab-1、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、Ab_8、 Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、 Ab-22、Ab-23 和 Ab_24。
3.一種硬化素結(jié)合劑，其被至少一種下列抗體交叉阻斷與硬化素的結(jié)合:Ab-A、Ab-B, Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、 Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab_16、Ab_17、Ab_18、Ab_19、Ab_20、Ab_21、Ab_22、Ab-23 和 Ab_24。
4.權(quán)利要求1或3的硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑交叉阻斷或被交叉阻斷的能力是在Biacore測定法中進(jìn)行檢測的。
5.權(quán)利要求1或3的硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑交叉阻斷或被交叉阻斷的能力是在ELISA測定法中進(jìn)行檢測的。
6.權(quán)利要求1或3的硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑是抗體。
7.權(quán)利要求1或3的硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑可以增加哺乳動物中的骨形成、骨礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)含量、骨量、骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度中的至少一種。
8.權(quán)利要求1或3的硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑在基于細(xì)胞的礦化測定法中可以阻斷硬化素的抑制效應(yīng)。
9.一種硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑在基于細(xì)胞的礦化測定法中可以阻斷硬化素的抑制效應(yīng)。
10.一種硬化素結(jié)合劑，其與Loop2表位結(jié)合。
11.一種硬化素結(jié)合劑，其與T20.6表位結(jié)合。
12.—種硬化素結(jié)合劑，其與“T20.6衍生物I (胱氨酸結(jié)+4臂)”表位結(jié)合。
13.權(quán)利要求7-12中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑是抗體。
14.一種硬化素結(jié)合劑，其包含與選自下列SEQ ID NOs的⑶R具有至少75%同一性的至少一個 CDR 序列:39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、78、79、80、81、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、 112、113、114、115、116、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、 251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、 270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、 289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、351、352、353、358、359 和 360.
15.權(quán)利要求14的硬化素結(jié)合劑，其包含至少2個所述⑶R。
16.權(quán)利要求14的硬化素結(jié)合劑，其包含6個所述⑶R。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的硬化素結(jié)合劑，其中所述同一性百分比是85%。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的硬化素結(jié)合劑，其中所述同一性百分比是95%。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的硬化素結(jié)合劑，其包含:a)SEQ ID NOs:39、40 和 41 的 CDR 序列；b)SEQ ID NOs:42,43 和 44 的 CDR 序列；c)SEQ ID NOs:45、46 和 47 的 CDR 序列；d)SEQ ID NOs:48、49 和 50 的 CDR 序列；e)SEQID NOs:51、52 和 53 的 CDR 序列;f)SEQ ID NOs:54,55 和 56 的 CDR 序列；g)SEQ ID NOs:57,58 和 59 的 CDR 序列；h)SEQ ID NOs:60,61 和 62 的 CDR 序列；i)SEQ ID NOs:275,276 和 277 的 CDR 序列； j) SEQ ID NOs:287,288 和 289 的 CDR 序列； k) SEQ ID NOs:278,279 和 280 的 CDR 序列；I)SEQ ID NOs =290,291 和 292 的 CDR 序列； m) SEQ ID NOs:78、79 和 80 的 CDR 序列；n) SEQ ID NOs =245,246 和 247 的 CDR 序列；o)SEQ ID NOs:81、99 和 100 的 CDR 序列； p) SEQ ID NOs:248、249 和 250 的 CDR 序列 q) SEQ ID NOs: 101、102 和 103 的 CDR 序列； r) SEQ ID NOs:251、252 和 253 的 CDR 序列; s)SEQ ID NOs: 104、105 和 106 的 CDR 序列 t)SEQ ID NOs:254,255 和 256 的 CDR 序列； u) SEQ ID NOs: 107、108 和 109 的 CDR 序列 v) SEQ ID NOs:257,258 和 259 的 CDR 序列 w) SEQ ID NOs:110、111 和 112 的 CDR 序列； x) SEQ ID NOs:260,261 和 262 的 CDR 序列； y) SEQ ID NOs:281、282 和 283 的 CDR 序列； z)SEQ ID NOs:293,294 和 295 的 CDR 序列； aa) SEQ ID NOs: 113、114 和 115 的 CDR 序列； bb) SEQ ID NOs:263,264 和 265 的 CDR 序列； cc) SEQ ID NOs =284,285 和 286 的 CDR 序列； dd) SEQ ID NOs ;296、297 和 298 的 CDR 序列； ee) SEQ ID NOs:116、237 和 238 的 CDR 序列； ff) SEQ ID NOs:266,267 和 268 的 CDR 序列； gg) SEQ ID NOs =239,240 和 241 的 CDR 序列； hh) SEQ ID NOs =269,270 和 271 的 CDR 序列； ii) SEQ ID NOs:272,273 和 274 的 CDR 序列； jj)SEQ ID NOs:242,243 和 244 的 CDR 序列； kk) SEQ ID NOs:351、352 和 353 的 CDR 序列；或 II)SEQ ID NOs:358、359 和 360 的 CDR 序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的硬化素結(jié)合劑，其包含:a)SEQ ID NOs:54,55 和 56 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:51、52 和 53 的 CDR 序列；b)SEQID NOs:60,61 和 62 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:57、58 和 59 的 CDR 序列；c)SEQID NOs:48,49 和 50 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:45,46 和 47 的 CDR 序列；d)SEQ ID NOs:42,43 和 44 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:39、40 和 41 的 CDR 序列；e)SEQID NOs:275、276 和 277 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:287、288 和 289 的 CDR 序列；f)SEQ ID NOs:278、279 和 280 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:290、291 和 292 的 CDR 序列；g)SEQ ID NOs:78、79 和 80 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:245、246 和 247 的 CDR 序列；h)SEQ ID NOs:81、99 和 100 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:248、249 和 250 的 CDR 序 列；i)SEQID NOs:101,102 103 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:251、252 和 253 的 CDR 序列；j) SEQ ID NOs: 104、105 和 106 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:254、255 和 256 的 CDR 序列；k) SEQ ID NOs: 107、108 和 109 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:257、258 和 259 的 CDR 序列；1)SEQ ID NOs:110、111 和 112 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:260、261 和 262 的 CDR序列；m) SEQ ID NOs:281、282 和 283 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:293、294 和 295 的 CDR 序列；n) SEQ ID NOs:113、114 和 115 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:263、264 和 265 的 CDR 序列；o)SEQ ID NOs:284、285 和 286 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:296、297 和 298 的 CDR 序列；p)SEQ ID NOs:116、237 和 238 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:266、267 和 268 的 CDR 序列；q) SEQ ID NOs:239、240 和 241 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:269、270 和 271 的 CDR 序列；r) SEQ ID NOs:242、243 和 244 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:272、273 和 274 的 CDR 序列；或s)SEQ ID NOs:351、352 和 353 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:358、359 和 360 的 CDR 序列。
21.權(quán)利要求14-20中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑，其中所述硬化素結(jié)合劑是抗體。
22.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-12和14-20中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述硬化素結(jié)合劑是抗體。
24.—種硬化素結(jié)合劑，其包含與選自下列SEQ ID NOs的⑶R具有至少75%同一性的至少一個 CDR 序列:245、246、247、78、79、80、269、270、271、239、240 和 241。
25.一種硬化素結(jié)合劑，其包含與選自⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3、⑶R-L1、⑶R-L2和 ⑶R-L3的⑶R具有至少75%同一性的至少一個⑶R序列，其中⑶R-Hl具有SEQ ID NO:245 或SEQ ID NO:269中給出的序列，CDR-H2具有SEQ ID NO:246或SEQ ID NO:270中給出的序列，CDR-H3 具有 SEQ ID NO:247 或 SEQ ID NO:271 中給出的序列，CDR-Ll 具有 SEQ ID NO:78 或 SEQ ID NO:239 中給出的序列，CDR-L2 具有 SEQ ID NO:79 或 SEQ ID NO:240 中給出的序列，和CDR-L3具有SEQ ID NO:80或SEQ ID N0241中給出的序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的硬化素結(jié)合劑，其包含3個⑶R，即⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中(a)CDR-Hl 是 SEQ ID NO:245，CDR-H2 是 SEQ ID NO:246 和 CDR-H3 是 SEQ ID NO:247或(b)CDR-Hl 是 SEQ ID NO:269，CDR-H2 是 SEQ ID NO:270 和 CDR-H3 是 SEQ ID NO:271。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的硬化素結(jié)合劑，其包含3個⑶R，即⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中(a)CDRLl 是 SEQ ID NO:78，CDR-L2 是 SEQ ID NO:79 和 CDR-L3 是 SEQ ID NO:80 ;或(b)CDRLl是 SEQ ID NO:239，CDR-L2 是 SEQ ID NO:240 和 CDR-L3 是 SEQ ID NO:2410
28.根據(jù)權(quán)利要求25的硬化素結(jié)合劑，其包含6個⑶R，即⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3、 CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3，其中(a)CDR-Hl 是 SEQ ID NO:245，CDR-H2 是 SEQ ID NO:246，CDR-H3 是 SEQ ID NO:247， CDR-Ll 是 SEQ ID NO:78，CDR-L2 是 SEQ ID NO:79 和 CDR-L3 是 SEQ ID NO:80 ;或`(b)CDR-Hl 是 SEQ ID NO:269，CDR-H2 是 SEQ ID NO:270，CDR-H3 是 SEQ ID NO:271， CDR-Ll 是 SEQ ID NO:239，CDR-L2 是 SEQ ID NO:240 和 CDR-L3 是 SEQ ID NO:241。
29.根據(jù)權(quán)利要求24-48中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑，其是抗體。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的硬化素結(jié)合劑，其包含重鏈，其中所述重鏈包含與SEQID NO: 333 ；SEQ ID NO:378 ；SEQ ID NO:327 ；SEQ ID NO:329 ;*SEQ ID NO:366 中給出的序列具有至少85%同一性的多肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的硬化素結(jié)合劑，其包含輕鏈，其中所述輕鏈包含與SEQID NO: 332 ；SEQ ID NO:376 ；SEQ ID NO:314 ；SEQ ID NO:328 ;*SEQ ID NO:364 中給出的序列具有至少85%同一性的多肽。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的硬化素結(jié)合劑，其包含重鏈和輕鏈，其中(a)所述重鏈包含與SEQID NO:333中給出的序列具有至少85%同一性的多肽并且所述輕鏈包含與SEQ ID NO:332中給出的序列具有至少85%同一性的多肽；或(b)所述重鏈包含與SEQID NO:378中給出的序列具有至少85%同一性的多肽并且所述輕鏈包含與SEQ ID NO:376中給出的序列具有至少85%同一性的多肽；或(c)所述重鏈包含與SEQID NO:327中給出的序列具有至少85%同一性的多肽并且所述輕鏈包含與SEQ ID NO:314中給出的序列具有至少85%同一性的多肽；或(d)所述重鏈包含與SEQID NO:329中給出的序列具有至少85%同一性的多肽并且所述輕鏈包含與SEQ ID NO:328中給出的序列具有至少85%同一性的多肽；或(e)所述重鏈包含與SEQID NO:366中給出的序列具有至少85%同一性的多肽并且所述輕鏈包含與SEQ ID NO:364中給出的序列具有至少85%同一性的多肽。
33.根據(jù)權(quán)利要求24-32中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑，其包含輕鏈和/或重鏈恒定區(qū)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的硬化素結(jié)合劑，其包含IgG4或IgG2恒定區(qū)。
35.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含CDR Hl、H2和H3且包含具有SEQ ID NO:137中提供的序列的多肽或其變體的重鏈，其中所述CDR分別與SEQ ID NO =245,246和247至少 75%同一；以及包含⑶R L1、L2和L3且包含具有SEQ ID NO:133中提供的序列的多肽或其變體的輕鏈，其中所述⑶R分別與SEQ ID N0:78、79和80至少75%同一。
36.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含⑶R Hl、H2和H3且包含具有SEQ ID NO:145或 392中提供的序列的多肽或其變體的重鏈，其中所述⑶R分別與SEQ ID NO:245、246和247 至少75%同一；以及包含⑶R L1、L2和L3且包含具有SEQ ID NO:141中提供的序列的多肽或其變體的輕鏈，其中所述⑶R分別與SEQ ID NO:78、79和80至少75%同一。
37.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含⑶R Hl、H2和H3且包含具有SEQ ID NO:335中提供的序列的多肽或其變體的重鏈，其中所述CDR分別與SEQ ID NO =269,270和271至少 75%同一；以及包含⑶R L1、L2和L3且包含具有SEQ ID NO:334中提供的序列的多肽或其變體的輕鏈，其中所述CDR分別與SEQ ID NO:239、240和241至少75%同一。
38.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含⑶R Hl、H2和H3且包含具有SEQ ID NO:331中提供的序列的多肽或其變體的重鏈，其中所述⑶R分別與SEQ ID NO =269,270和271至少 75%同一；以及包含⑶R L1、L2和L3且包含具有SEQ ID NO:330中提供的序列的多肽或其變體的輕鏈，其中所述CDR分別與SEQ ID NO:239、240和241至少75%同一。
39.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含⑶R Hl、H2和H3且包含具有SEQ ID NO:345或 396中提供的序列的多肽或其變體的重鏈，其中所述⑶R分別與SEQ ID NO:269、270和271 至少75%同一；以及包含⑶R L1、L2和L3且包含具有SEQ ID NO:341中提供的序列的多肽或其變體的輕鏈，其中所述⑶R分別與SEQ ID NO =239,240和241至少75%同一。
40.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含具有SEQ ID NO:137中提供的序列的多肽的重鏈，以及包含具有SEQ ID NO:133中提供的序列的多肽的輕鏈。
41.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含具有SEQ ID NO:145或392中提供的序列的多肽的重鏈，以及包含具有SEQ ID NO:141中提供的序列的多肽的輕鏈。
42.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含具有SEQ ID NO:335中提供的序列的多肽的重鏈，以及包含具有SEQ ID NO:334中提供的序列的多肽的輕鏈。.
43.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含具有SEQ ID NO:331中提供的序列的多肽的重鏈，以及包含具有SEQ ID NO:330中提供的序列的多肽的輕鏈。
44.一種硬化素結(jié)合劑，其具有:包含具有SEQ ID NO:345或396中提供的序列的多肽的重鏈，以及包含具有SEQ ID NO:341中提供的序列的多肽的輕鏈。
45.根據(jù)權(quán)利要求24-44中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑，其與一種或多種效應(yīng)分子或報(bào)道分子連接。
46.一種分離的多核苷酸序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求24-44中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑。
47.—種克隆或表達(dá)載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求46的一種或多種多核苷酸序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的載體，其中所述載體包含SEQID NO: 134、136、138、140、142、 144、146、148、308、310、312、342、344、346、348、349、365、367、373、375 和 379 中給出的至少一種序列。
49.一種宿主細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求47或權(quán)利要求48的一種或多種克隆或表達(dá)載體。
50.一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求24-44中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求49的宿主細(xì)胞和分離所述硬化素結(jié)合劑。
51.一種藥物組合物，其包含與一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合的根據(jù)權(quán)利要求24-45中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的藥物組合物，其還包含其他活性成分。
53.根據(jù)權(quán)利要求24-45中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑或根據(jù)權(quán)利要求51或權(quán)利要求 52的藥物組合物，用于治療或預(yù)防由硬化素介導(dǎo)或與硬化素水平增加相關(guān)的病理性病癥。
54.一種用于治療哺乳動物受試者中的骨相關(guān)病癥的方法，其包括給需要此類治療的受試者提供權(quán)利要求22的藥物組合物。
55.一種用于治療哺乳動物受試者中的骨相關(guān)病癥的方法，其包括給需要此類治療的受試者提供權(quán)利要求23的藥物組合物。
56.一種用于治療哺乳動物受試者中的骨相關(guān)病癥的方法，其包括給需要此類治療的受試者提供權(quán)利要求51的藥物組合物。
57.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中所述骨相關(guān)病癥是至少一種下列病癥:軟骨發(fā)育不全，顱骨鎖骨發(fā)育不良，內(nèi)生軟骨瘤病，纖維性結(jié)構(gòu)不良，高歇病，低磷酸鹽血癥佝僂病，馬方綜合征，多發(fā)性遺傳性外生骨疣，神經(jīng)纖維瘤病，成骨不全，骨硬化癥，全身脆弱性骨硬化，硬化損傷，假關(guān)節(jié)，化膿性骨髓炎，牙周病，抗癲癇藥誘導(dǎo)的骨丟失，原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，家族性甲狀旁腺功能亢進(jìn)綜合征，失重誘導(dǎo)的骨丟失，男性中的骨質(zhì)疏松癥，絕經(jīng)后的骨丟失，骨關(guān)節(jié)炎，腎性骨營養(yǎng)不良，骨浸潤性病癥，口部骨丟失，頜骨壞死， 青少年佩吉特病，肢骨紋狀肥厚，代謝性骨病，肥大細(xì)胞增多癥，鐮狀細(xì)胞性貧血/病，器官移植相關(guān)性骨丟失，腎移植相關(guān)性骨丟失，全身性紅斑狼瘡，強(qiáng)直性脊柱炎，癲癇，青少年關(guān)節(jié)炎，地中海貧血，粘多糖貯積病，法布里病，特納綜合征，唐氏綜合征，克蘭費(fèi)爾特綜合征， 麻風(fēng)病，佩特茲病，青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸，嬰兒期發(fā)病性多系統(tǒng)炎性疾病，溫徹斯特綜合征，門克斯病，威爾遜病，局部缺血性骨病(例如累-卡-佩病、局限性游走性骨質(zhì)疏松)， 貧 血狀態(tài)，由類固醇引起的病癥，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨丟失，肝素誘導(dǎo)的骨丟失，骨髓病癥， 壞血病，營養(yǎng)不良，鈣缺乏，骨質(zhì)疏松癥，骨量減少，酒精中毒，慢性肝病，絕經(jīng)后狀態(tài)，慢性炎性病癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎性腸病，潰瘍性結(jié)腸炎，炎性結(jié)腸炎，克羅恩病，月經(jīng)過少，無月經(jīng)，妊娠，糖尿病，甲狀腺功能亢進(jìn)，甲狀腺病癥，甲狀旁腺病癥，庫欣病，肢端肥大癥，性腺機(jī)能減退，制動或廢用，反射交感性營養(yǎng)不良綜合征，局限性骨質(zhì)疏松，骨軟化癥，與關(guān)節(jié)置換術(shù)相關(guān)的骨丟失，HIV相關(guān)的骨丟失，與生長激素缺少相關(guān)的骨丟失，與囊性纖維化相關(guān)的骨丟失，化學(xué)治療相關(guān)性骨丟失，腫瘤誘導(dǎo)的骨丟失，癌癥相關(guān)的骨丟失，激素消融性骨丟失(hormone ablative bone loss),多發(fā)性骨髓瘤，藥物誘導(dǎo)的骨丟失,神經(jīng)性厭食癥，疾病相關(guān)的面骨丟失，疾病相關(guān)的顱骨丟失，疾病相關(guān)的頜骨丟失，疾病相關(guān)的頭蓋骨丟失，與衰老相關(guān)的骨丟失，與衰老相關(guān)的面骨丟失，與衰老相關(guān)的顱骨丟失，與衰老相關(guān)的頜骨丟失，和與衰老相關(guān)的頭蓋骨丟失，以及與太空旅行相關(guān)的骨丟失。
58.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述骨相關(guān)病癥是至少一種下列病癥:軟骨發(fā)育不全，顱骨鎖骨發(fā)育不良，內(nèi)生軟骨瘤病，纖維性結(jié)構(gòu)不良，高歇病，低磷酸鹽血癥佝僂病，馬方綜合征，多發(fā)性遺傳性外生骨疣，神經(jīng)纖維瘤病，成骨不全，骨硬化癥，全身脆弱性骨硬化，硬化損傷，假關(guān)節(jié)，化膿性骨髓炎，牙周病，抗癲癇藥誘導(dǎo)的骨丟失，原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，家族性甲狀旁腺功能亢進(jìn)綜合征，失重誘導(dǎo)的骨丟失，男性中的骨質(zhì)疏松癥，絕經(jīng)后的骨丟失，骨關(guān)節(jié)炎，腎性骨營養(yǎng)不良，骨浸潤性病癥，口部骨丟失，頜骨壞死， 青少年佩吉特病，肢骨紋狀肥厚，代謝性骨病，肥大細(xì)胞增多癥，鐮狀細(xì)胞性貧血/病，器官移植相關(guān)性骨丟失，腎移植相關(guān)性骨丟失，全身性紅斑狼瘡，強(qiáng)直性脊柱炎，癲癇，青少年關(guān)節(jié)炎，地中海貧血，粘多糖貯積病，法布里病，特納綜合征，唐綜合征，克蘭費(fèi)爾特綜合征，麻風(fēng)病，佩特茲病，青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸，嬰兒期發(fā)病性多系統(tǒng)炎性疾病，溫徹斯特綜合征， 門克斯病，威爾遜病，局部缺血性骨病(例如累-卡-佩病、局限性游走性骨質(zhì)疏松)，貧血狀態(tài)，由類固醇引起的病癥，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨丟失，肝素誘導(dǎo)的骨丟失，骨髓病癥，壞血病，營養(yǎng)不良，鈣缺乏，骨質(zhì)疏松癥，骨量減少，酒精中毒，慢性肝病，絕經(jīng)后狀態(tài)，慢性炎性病癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎性腸病，潰瘍性結(jié)腸炎，炎性結(jié)腸炎，克羅恩病，月經(jīng)過少，無月經(jīng)，妊娠，糖尿病，甲狀腺功能亢進(jìn)，甲狀腺病癥，甲狀旁腺病癥，庫欣病，肢端肥大癥，性腺機(jī)能減退，制動或廢用，反射交感性營養(yǎng)不良綜合征，局限性骨質(zhì)疏松，骨軟化癥，與關(guān)節(jié)置換術(shù)相關(guān)的骨丟失，HI V相關(guān)的骨丟失，與生長激素缺少相關(guān)的骨丟失，與囊性纖維化相關(guān)的骨丟失，化學(xué)治療相關(guān)性骨丟失，腫瘤誘導(dǎo)的骨丟失，癌癥相關(guān)的骨丟失，激素消融性骨丟失，多發(fā)性骨髓瘤，藥物誘導(dǎo)的骨丟失，神經(jīng)性厭食癥，疾病相關(guān)的面骨丟失，疾病相關(guān)的顱骨丟失，疾病相關(guān)的頜骨丟失，疾病相關(guān)的頭蓋骨丟失，與衰老相關(guān)的骨丟失，與衰老相關(guān)的面骨丟失，與衰老相關(guān)的顱骨丟失，與衰老相關(guān)的頜骨丟失，與衰老相關(guān)的頭蓋骨丟失，以及與太空旅行相關(guān)的骨丟失。
59.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述骨相關(guān)病癥是至少一種下列病癥:軟骨發(fā)育不全，顱骨鎖骨發(fā)育不良，內(nèi)生軟骨瘤病，纖維性結(jié)構(gòu)不良，高歇病，低磷酸鹽血癥佝僂病，馬方綜合征，多發(fā)性遺傳性外生骨疣，神經(jīng)纖維瘤病，成骨不全，骨硬化癥，全身脆弱性骨硬化，硬化損傷，假關(guān)節(jié)，化膿性骨髓炎，牙周病，抗癲癇藥誘導(dǎo)的骨丟失，原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，家族性甲狀旁腺功能亢進(jìn)綜合征，失重誘導(dǎo)的骨丟失，男性中的骨質(zhì)疏松癥，絕經(jīng)后的骨丟失，骨關(guān)節(jié)炎，腎性骨營養(yǎng)不良，骨浸潤性病癥，口部骨丟失，頜骨壞死， 青少年佩吉特病，肢骨紋狀肥厚，代謝性骨病，肥大細(xì)胞增多癥，鐮狀細(xì)胞性貧血/病，器官移植相關(guān)性骨丟失，腎移植相關(guān)性骨丟失，全身性紅斑狼瘡，強(qiáng)直性脊柱炎，癲癇，青少年關(guān)節(jié)炎，地中海貧血，粘多糖貯積病，法布里病，特納綜合征，唐氏綜合征，克蘭費(fèi)爾特綜合征， 麻風(fēng)病，佩特茲病，青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸，嬰兒期發(fā)病性多系統(tǒng)炎性疾病，溫徹斯特綜合征，門克斯病，威爾遜病，局部缺血性骨病(例如累-卡-佩病、局限性游走性骨質(zhì)疏松)， 貧血狀態(tài)，由類固 醇引起的病癥，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨丟失，肝素誘導(dǎo)的骨丟失，骨髓病癥， 壞血病，營養(yǎng)不良，鈣缺乏，骨質(zhì)疏松癥，骨量減少，酒精中毒，慢性肝病，絕經(jīng)后狀態(tài)，慢性炎性病癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎性腸病，潰瘍性結(jié)腸炎，炎性結(jié)腸炎，克羅恩病，月經(jīng)過少，無月經(jīng)，妊娠，糖尿病，甲狀腺功能亢進(jìn)，甲狀腺病癥，甲狀旁腺病癥，庫欣病，肢端肥大癥，性腺機(jī)能減退，制動或廢用，反射交感性營養(yǎng)不良綜合征，局限性骨質(zhì)疏松，骨軟化癥，與關(guān)節(jié)置換術(shù)相關(guān)的骨丟失，HIV相關(guān)的骨丟失，與生長激素缺少相關(guān)的骨丟失，與囊性纖維化相關(guān)的骨丟失，化學(xué)治療相關(guān)性骨丟失，腫瘤誘導(dǎo)的骨丟失，癌癥相關(guān)的骨丟失，激素消融性骨丟失，多發(fā)性骨髓瘤，藥物誘導(dǎo)的骨丟失，神經(jīng)性厭食癥，疾病相關(guān)的面骨丟失，疾病相關(guān)的顱骨丟失，疾病相關(guān)的頜骨丟失，疾病相關(guān)的頭蓋骨丟失，與衰老相關(guān)的骨丟失，與衰老相關(guān)的面骨丟失，與衰老相關(guān)的顱骨丟失，與衰老相關(guān)的頜骨丟失，與衰老相關(guān)的頭蓋骨丟失，以及與太空旅行相關(guān)的骨丟失。
60.一種增加哺乳動物中的骨形成、骨礦物質(zhì)含量、骨量、骨礦物質(zhì)密度、骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度中的至少一種的方法，其包括給所述哺乳動物施用權(quán)利要求22的藥物組合物。
61.一種增加哺乳動物中的骨形成、骨礦物質(zhì)含量、骨量、骨礦物質(zhì)密度、骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度中的至少一種的方法，其包括給所述哺乳動物施用權(quán)利要求23的藥物組合物。
62.一種增加哺乳動物中的骨形成、骨礦物質(zhì)含量、骨量、骨礦物質(zhì)密度、骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度中的至少一種的方法，其包括給所述哺乳動物施用權(quán)利要求51的藥物組合物。
63.—種改善經(jīng)歷一種或多種下列手術(shù)的哺乳動物中的結(jié)果的方法:矯形術(shù)，牙科手術(shù)，植入手術(shù)，關(guān)節(jié)置換術(shù)，骨移植術(shù)，骨美容手術(shù)和骨修復(fù)例如骨折愈合、骨不連愈合、延遲的連接愈合和面部重建，所述方法包括在所述操作、置換、移植、手術(shù)或修復(fù)之前、之時和 /或之后給所述哺乳動物施用權(quán)利要求22的藥物組合物。
64.—種改善經(jīng)歷一種或多種下列手術(shù)的哺乳動物中的結(jié)果的方法:矯形術(shù)，牙科手術(shù)，植入手術(shù)，關(guān)節(jié)置換術(shù)，骨移植術(shù)，骨美容手術(shù)和骨修復(fù)例如骨折愈合、骨不連愈合、延遲的連接愈合和面部重建，所述方法包括在所述操作、置換、移植、手術(shù)或修復(fù)之前、之時和 /或之后給所述哺乳動物施用權(quán)利要求23的藥物組合物。
65.—種改善經(jīng)歷一 種或多種下列手術(shù)的哺乳動物中的結(jié)果的方法:矯形術(shù)，牙科手術(shù)，植入手術(shù)，關(guān)節(jié)置換術(shù)，骨移植術(shù)，骨美容手術(shù)和骨修復(fù)例如骨折愈合、骨不連愈合、延遲的連接愈合和面部重建，所述方法包括在所述操作、置換、移植、手術(shù)或修復(fù)之前、之時和 /或之后給所述哺乳動物施用權(quán)利要求51的藥物組合物。
66.一種抗體，其中所述抗體是 Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、 Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 或 Ab_24。
67.一種診斷試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1、3、9-12和14-20中任何一項(xiàng)的硬化素結(jié)合劑。
68.—種診斷試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求6的抗體。
69.—種診斷試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求21的抗體。
70.一種診斷試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求29的抗體。
71.一種多肽，其包含至少一種下列 SEQ ID Nos:39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、78、79、80、81、99、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、237、238、239、240、241、242、243、 244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、 263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、 282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、351、352、 353、358、359 和 360。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的多肽，其與Fc、PEG、白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白中的至少一種綴合。
【文檔編號】C07K14/51GK103435698SQ201310191210
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2006年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2005年5月3日
【發(fā)明者】C·帕斯蒂, M·K·羅賓森, K·格雷厄姆, A·J·亨利, K·S·霍夫曼, J·萊瑟姆, A·勞森, H·S·魯, A·波普爾韋爾, W·沈, D·溫克勒, A·G·溫特斯 申請人:Ucb醫(yī)藥有限公司, 安進(jìn)公司