一種重組茯苓免疫調(diào)節(jié)蛋白wcfip1及其抗體的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種重組茯苓免疫調(diào)節(jié)蛋白WCFIP1及其抗體的生產(chǎn)方法。步驟如下：人工合成WCFIP1成熟蛋白的基因，構(gòu)建pET28/WCFIPl原核表達(dá)載體，將重組載體PET28/WCFIP1轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中，得大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子；表達(dá)并純化WCFIP1重組蛋白，重組蛋白用于免疫小鼠，制備了抗血清；利用硫酸銨分離抗血清，制備了特異性較高的抗WCFIP1蛋白的抗體。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)WCFIP1高效表達(dá)和純化，并制備了高特異性抗體(如摘要附圖所示)。該重組蛋白和抗體的制備為WCFIP1蛋白檢測與功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種重組茯苓免疫調(diào)節(jié)蛋白WCFIP1及其抗體的生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)重組WCFIPl蛋白的生物技術(shù)，并利用該重組蛋 白免疫小鼠，通過制備抗血清、硫酸銨分級沉淀制備了高質(zhì)量的抗體。具體來說涉及一種 WCFIPl重組蛋白及其抗體的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 茯苓是中國的道地、大宗藥材。茯苓因其性平、味苦、無毒，具有滲濕利水、防癌抗 衰、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效，被稱為中國的四大原料藥之一，臨床中藥處方中65%都有茯 苓，也是當(dāng)前國際藥品市場最具潛力的天然藥物之一。同時(shí)被國家衛(wèi)生部、國家中藥管理局 列入"既是食品又是藥品的品種名單"。茯苓中的主要成分為膳食纖維，其比例占茯苓干重 的80%以上；其次為蛋白質(zhì)，約占茯苓干重的1. 5%。目前，對茯苓活性成分的研究主要集中 在非蛋白類的次生代謝產(chǎn)物上。茯苓有效成分的研究中，研究得最多的就是茯苓多糖，即茯 苓次聚糖，它具有抗腫瘤活性，其衍生物羧甲基茯苓糖已被證明具免疫促進(jìn)及抗腫瘤作用， 而U-茯苓多糖和羥乙基茯苓多糖則可抑制小鼠肉瘤細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能；其次是 茯苓的三萜類化合物，可抑制癌細(xì)胞增生，目前的研究發(fā)現(xiàn)茯苓三萜類化合物還具有抗炎、 抗腫瘤細(xì)胞生成及誘生集落刺激因子等作用。目前，對占茯苓干重1. 5%的茯苓蛋白的研究 幾乎沒有報(bào)道。
[0003] 國立臺灣大學(xué)的研究者從茯苓干燥菌核中經(jīng)由陰離子交換樹脂與膠體過濾層析 純化得到新免疫調(diào)節(jié)蛋白PCP。體外試驗(yàn)顯示該茯苓蛋白PCP能刺激RAW 264. 7巨噬細(xì) 胞產(chǎn)生TNF-α與IL-I β，同時(shí)亦能調(diào)控NF-kB相關(guān)基因的表現(xiàn)量。最近，臺灣大學(xué)的 研究者又發(fā)現(xiàn)了一種分子量大約為15 kDa的另一種免疫調(diào)節(jié)單體蛋白，該蛋白被命名為 WCFIP1，但還尚未對其具體功能進(jìn)行詳細(xì)研究。因此，對茯苓重要功能蛋白的研究將進(jìn)一步 增加茯苓及其產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值，為整個(gè)茯苓及其制品產(chǎn)業(yè)的開發(fā)提供新的思路和新的 產(chǎn)品。同時(shí)，檢測該蛋白的相應(yīng)抗體的制備將有利于該蛋白的檢測分析。建立可以大量生 產(chǎn)WCFIPl的技術(shù)將為茯苓蛋白類活性成分的應(yīng)用開發(fā)開創(chuàng)一個(gè)嶄新局面。因此，WCFIPl重 組蛋白極具開發(fā)價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，本發(fā)明提供一種重組WCFIPl蛋白及其高效表達(dá)、純化和制備方法，該方 法首次利用重組載體PET28和表達(dá)宿主大腸桿菌BL21菌株，實(shí)現(xiàn)了 WCFIPl的表達(dá)。利用 鎳親合層析可以快速將蛋白從細(xì)胞裂解液中分離出來，獲得高純度的WCFIPl包涵體蛋白。 將該蛋白與弗氏完全佐劑混合至完全乳化，將乳化的抗原免疫昆明小鼠，在2次加強(qiáng)免疫 后的第2周取小鼠的血液，并制備血清。在測定抗血清的效價(jià)后，分別利用50%和33%的硫 酸銨進(jìn)行分級沉淀和透析處理，初步分離純化抗血清。以經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可以表達(dá)WCFIPl蛋 白的大腸桿菌表達(dá)菌菌體總蛋白為檢測對象，對純化抗體的特異性進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)印跡 結(jié)果表明，通過上述方法制備的抗體具有很高的特異性。解決上述問題的技術(shù)方案如下： WCFIPl重組蛋白的生產(chǎn)方法，主要包括以下步驟： (1) 合成WCFIPl基因：根據(jù)WCFIPl成熟蛋白的氨基酸序列，人工合成了該蛋白的DNA 序列，其序列如下：5 ' -GTCAACGTGACCTACGACCCTTTCTTCGACAATCCTAATAATTC TCTTTCATACGT TGCTTGCTCAGATGGAACTAATGGACTTCTTACCAAGGGTTACACTACTTTGGGTTCACTTCCAGATTTTCCTTACA TTGGTGGAGCATATGCTATCGCCGGTTGGAACTCTCCATCCTGTGGAACCTGCTGGGAATTGACTTACAACAACGTT TCTATTAATATCCTTGGTACTGACACAGCTGCCGGATTCAACATTGCTTTGACAGCTATGAATGTCCTTACTAATAA CGCCGCAGTTGATTTGGGAGAAGTTGACGCCGCCGCCATTCAGGTTGACTCTTCAGTCTGTGGTTTG-3'，合成的 基因克隆至PUC載體； (2) WCFIPl成熟基因的克隆：以合成的基因?yàn)槟０?，用特異?物擴(kuò)增出完整WCFIPl基因片段，所用WCFIPl特異引物中引入BamH I酶切位點(diǎn)和Hind ΠΙ酶切位點(diǎn)；回收PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒PMD20-T載體，得重組質(zhì)粒 WCFIPl/pMD20-T，經(jīng)過測序確定為讀碼框正確的重組載體； (3) 構(gòu)建原核表達(dá)載體：將表達(dá)載體pET28和步驟（2)所得的重組質(zhì)粒WCFIPl/pMD20-T 經(jīng)Hind ΠΙ及BamH I雙酶切并純化回收，并用T4 DNA連接酶連接，得重組載體pET28/ WCFIPl，將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPlO菌株中，再從TOPlO中提取重組載體pET28/ WCFIPl ;用熱激法，將重組載體pET28/WCFIPl轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中，經(jīng)LB Kan 抗性平板篩選得到大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子； (4) WCFIP1蛋白的表達(dá)：將步驟（3)所得的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子于37°C培養(yǎng)至OD6c?為 0. 6 - 0. 8,加入0. 05 - I. OmM的IPTG，于溫度為37°C的條件下誘導(dǎo)8-12小時(shí)，超聲破碎， 得到大量的WCFIPl重組蛋白； (5) WCFIP1蛋白的純化：利用鎳親合層析法對步驟（4)所得的WCFIPl融合蛋白進(jìn)行純 化； 在其中一些實(shí)施例中，步驟（1)合成的DNA序列如下：5' -GTCAACGTGACCTACGAC CCTTT CTTCGACAATCCTAATAATTCTCTTTCATACGTTGCTTGCTCAGATGGAACTAATGGACTTCTTACCAAGGGTTACA CTACTTTGGGTTCACTTCCAGATTTTCCTTACATTGGTGGAGCATATGCTATCGCCGGTTGGAACTCTCCATCCTGT GGAACCTGCTGGGAATTGACTTACAACAACGTTTCTATTAATATCCTTGGTACTGACACAGCTGCCGGATTCAACAT TGCTTTGACAGCTATGAATGTCCTTACTAATAACGCCGCAGTTGATTTGGGAGAAGTTGACGCCGCCGCCATTCAGG TTGACTCTTCAGTCTGTGGTTTG-3' ； 在其中一些實(shí)施例中，步驟（2)所述WCFIPl特異引物為： 上游引物：5 ' -GCGGATCCGGTCAACGTGACCTACGAC-3 ' ； 下游引物：5' -GCAAGCTTCAAACCACAGACTGAAG-3' ； 在其中一些實(shí)施例中，步驟（3)所述的表達(dá)載體為pET28,表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21 ; 在其中一些實(shí)施例中，步驟（4)所述的鎳親合層析方法中，所用的洗脫液為含有8M尿素和 300 mM咪唑的pH 8. 0 Tris-HCl溶液；所得的WCFIPl融合蛋白純度為90%以上； WCFIPl特異性抗體的制備方法，主要包括以下步驟： (1)免疫昆明小鼠：將純化得到的WCFIPl重組蛋白與弗氏完全佐劑混合到完全乳化， 采用腹腔注射的方法對小鼠進(jìn)行免疫。取免疫前小鼠血清用作陰性對照，向血清中加入終 濃度為0.02%疊氮鈉，置4° C冰箱中保存?zhèn)溆谩３醮蚊庖吆蟮牡?周，對各免疫的小鼠進(jìn) 行再次免疫，再次免疫采用不完全弗氏佐與抗原充分完全乳化；間隔2周后進(jìn)行第2次加強(qiáng) 免疫，第2次加強(qiáng)免疫的方法與第一次加強(qiáng)免疫完全相同，于第2次加強(qiáng)免疫后的第10天， 剪尾取血10微升，將血液于TBST中稀釋50倍； (2) 抗血清效價(jià)的測定：將10 Pg/ml WCFIPl重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板，采用間接 ELISA的方法對抗血清的效價(jià)進(jìn)行測定，方法如下：1)包被：用0. 05 M pH 9. 6碳酸鹽包被 緩沖液將抗原稀釋至蛋白質(zhì)濃度為10 μ g/mL，每個(gè)反應(yīng)孔中加 0. I mL蛋白液，4°C孵育12 h，棄去孔內(nèi)溶液，用含0. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液（PBST)作洗滌緩沖液洗3次，每次3-5 min (簡稱洗漆，下同）；2)封閉：每孔中加 0.1 mL 5%的BSA，4°C孵育12 h，棄去孔內(nèi)溶液， 用PBST洗3次，每次3 min (同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔);3)加一抗：加經(jīng)一 定比例稀釋的抗體0.1 mL于上述已包被抗原的反應(yīng)孔中，置4 °C孵育12 h，然后用PBST洗 3次，每次3-5 min (同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔);4)加酶標(biāo)二抗：于各反應(yīng)孔 中，加入稀釋5, 000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG酶標(biāo)二抗0. I mL，37 °C孵 育I h，用PBST洗滌2次，再用PBS洗滌1次；5)加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入0. I mL 新配制的顯色液，放置于30 °C恒溫箱中反應(yīng)30 min ;6)終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入4 M 硫酸50 μ 1終止反應(yīng)；7)結(jié)果判定：在ELISA檢測儀上，于495 nm處，測定各孔的OD值， 若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2. 1倍，即為陽性。計(jì)算公式：（待測樣OD-空白0D) / (陰 性對照OD-空白0D)，兩者比值大于2. 1可判讀為陽性； (3) 抗血清的硫酸銨分級純化：取血清，加等體積的生理鹽水，攪拌并逐滴加入與稀釋 血清等體積的飽和硫酸銨至終濃度為50%飽和度，4° C靜置4 h，3000 g離心30 min，棄上 清，以生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨至飽和度為33%，4° C靜置4 h，3000 g離 心30 min，棄上清，沉淀溶于生理鹽水中。重復(fù)用33%飽和度的硫酸銨鹽析分級純化處理一 次，將最后離心所得沉淀以20 mM PBS (磷酸鹽緩沖液液，pH 7. 4)溶解并于10 kD的透析 袋中于20 mM PBS中透析去除硫酸銨； (4) 抗體特異性分析：將制備好的WCFIPl蛋白表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體總蛋白樣 品點(diǎn)樣到15%的SDS-PAGE膠中，對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，在電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板 上輕輕剝離并轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移緩沖液中，浸泡40-60 min ;按轉(zhuǎn)移凝膠的大小裁剪好濾紙和聚偏氟 乙烯（PVDF)膜，濾紙各邊應(yīng)比PVDF膜長2 mm，PVDF膜的各邊應(yīng)比PAGE膠的各邊長2 mm ; 將PVDF膜用100%甲醇浸泡30 s，將PVDF膜及濾紙一并浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡15 min ; 將膠、濾紙及PVDF膜取出，盡量避免污染濾紙和膜，按從下到上：濾紙-膜-膠-濾紙的順 序?qū)⑵湟来畏藕茫M量避免膠與膜之間產(chǎn)生氣泡；打開半干轉(zhuǎn)移儀，將濾紙-膜-膠-濾紙 放入轉(zhuǎn)移盤中，蓋好電源蓋子；接通電源，83 mmX75 mm大小的膜設(shè)定電流100 mA，電壓15 V ;實(shí)際設(shè)定中電壓15 V不變，按60 mm2設(shè)I mA的初始電流，設(shè)定轉(zhuǎn)膜時(shí)間為I h;轉(zhuǎn)移完 畢后，將PVDF轉(zhuǎn)移至含5%牛血清白蛋白的TBST中，4°C封閉12 h ;封閉結(jié)束后，加入稀釋1 萬倍的抗體到PVDF膜中，4°C孵育12 h，利用TBST洗膜3次，每次15分鐘；將膜轉(zhuǎn)至含有 HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG中，4°C孵育12 h，利用TBST洗膜3次，每次15分鐘；將膜置于 一小盒中，加入適量的ECL發(fā)光液，反應(yīng)2分鐘，將膜置于暗盒中并于暗室下將X-光片壓在 膜上；將X-光片利用顯影液進(jìn)行顯影和定影處理后，于空氣中干燥并拍照分析； 在一些實(shí)施例中，步驟（1)所述的免疫動(dòng)物是昆明小鼠，免疫所用的抗原是純化所得到 WCFIPl重組蛋白； 本發(fā)明所述的一種重組WCFIPl蛋白及其抗體的生產(chǎn)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)： 一是利用PET28載體和BL21菌株，實(shí)現(xiàn)了表達(dá)產(chǎn)物的高效表達(dá)；二是表達(dá)產(chǎn)物帶有 HisX6標(biāo)簽，摸索出一條有效純化重組融合WCFIPl蛋白的方法；三是利用昆明小鼠作為免 疫動(dòng)物，摸索出了一條高效的免疫動(dòng)物制備抗血清的方法；四是利用硫酸銨對抗體進(jìn)行了 純化，純化的抗體具有很高的特異性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0005] 圖1是表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證圖； 圖2是重組WCFIPl蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果的SDS-PAGE分析圖； 圖3是包涵體蛋白純化的SDS-PAGE分析圖； 圖4是抗血清效價(jià)的測定結(jié)果圖； 圖5是抗體特異性的Western Blot分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0006] 本發(fā)明選用大腸桿菌表達(dá)菌株BL21、載體擴(kuò)增菌株TOPlO和表達(dá)載體PET28均購 自美國Invritrogen公司。所用的培養(yǎng)基配方如下： 1) LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸餾水I L，高壓滅 囷，室溫保存； 2) LB/Kan平板：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸餾水I L，瓊脂粉15 g，高壓滅菌后，冷卻至7〇°C以下，加入I mL卡那霉素（Kan) (50mg/ml)，充分混均后倒板， 4 °C避光保存； 3) 50X TAE瓊脂糖凝膠電泳緩沖液：Tris堿121 g，冰乙酸28. 6 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 50 mL，加蒸餾水定容至500 mL，室溫保存； 4) 5XSDS-PAGE 上樣緩沖液：1 M Tris-HCl (pH 6. 8) 1. 25 mL，SDS 0· 5 g，BPB 25 mg,甘油2.5 mL，加去離子水溶解后定容至5 mL，分裝(每份約500 μ L)后于室溫保存， 使用時(shí)每份加入25 μ L β-巰基乙醇混勻； 5) 5 X SDS-PAGE 電泳緩沖液：Tris 15. I g，甘氨酸 94 g，SDS 5.0 g，加入約 800 mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜罥 L，室溫保存； 6) 考馬斯亮藍(lán)R-250染色液：考馬斯亮藍(lán)R-250 0. 25g，加入225 mL甲醇、46 mL 的冰乙酸、225 mL去離子水并攪拌均勻，濾紙去除顆粒物質(zhì)后，室溫保存； 7) 考馬斯亮藍(lán)脫色液：冰乙酸50 mL，甲醇150mL，去離子水300 mL，充分混合后， 室溫保存； 8) 菌體裂解液：10 mM Tri s-HCl，2 mM EDTA，調(diào) pH 8. 0 ; 9) 包涵體洗滌液：10 mM Tris-HCl，2mM EDTA，0. 1% 曲拉通，調(diào) pH 8. 0 ; 10) 裂解結(jié)合緩沖液：8 M尿素，10 mM Tris-HCl，調(diào)pH 8. 0 ; 11) 漂洗緩沖液：8 M 尿素，10 mM Tris-HCl，調(diào) pH 6.3 ; 12) 洗脫緩沖液：8 M 尿素，10 mM Tris-HCl，調(diào) pH 4.5 ; 13) 包被緩沖液（pH 9. 6 0. 05 M 碳酸鹽緩沖液）：NaC03 0. 59 g，NaHC03 2. 93 g，加 ddH20 至 1000 mL ; 14) 抗體稀釋液：牛血清白蛋白（BSA) 0. I g，加洗滌緩沖液至100 mL ; 15) 封閉緩沖液：加4% BSA于TBST中； 茯苓免疫調(diào)節(jié)蛋白WCFIPl重組蛋白及其抗體的生產(chǎn)方法，主要包括以下步驟： 1、 WCFIPl基因的合成：根據(jù)WCFIPl成熟蛋白的氨基酸序列，人工合成了該蛋白的DNA 序列，合成的DNA序列如下： SEQ ID NO:1 : 5 ' -GTCAACGTGACCTACGACCCTTTCTTCGACAATCCTAATAATTCTCTTTCATACGTTG CTTGCTCAGAT GGAACTAATGGACTTCTTACCAAGGGTTACACTACTTTGGGTTCACTTCCAGATTTTCCTTACATTGGTGGAGCATA TGCTATCGCCGGTTGGAACTCTCCATCCTGTGGAACCTGCTGGGAATTGACTTACAACAACGTTTCTATTAATATCC TTGGTACTGACACAGCTGCCGGATTCAACATTGCTTTGACAGCTATGAATGTCCTTACTAATAACGCCGCAGTTGAT TTGGGAGAAGTTGACGCCGCCGCCATTCAGGTTGACTCTTCAGTCTGTGGTTTG-3'，合成的基因克隆至 pUC 載體上； 2、 克隆WCFIPl基因 設(shè)計(jì)一對引物，以WCFIPl特異引物擴(kuò)增出完整的重組WCFIPl基因片段，所用WCFIPl 特異引物中引入BamH I酶切位點(diǎn)和Hindm酶切位點(diǎn)，PCR條件為：95°C預(yù)變性，4min，一 個(gè)熱循環(huán)；94 °C熱變性30 s，55 °C褪火30 s，72 °C延伸30 s，34個(gè)熱循環(huán)；72 °C復(fù)性10 min。所獲得的擴(kuò)增片斷連接到pMD20-T載體上(購自于廣州TAKARA公司），得到重組質(zhì)粒 WCFIPl/pMD20-T，用PCR，酶切和核酸測序鑒定，測定序列與Genebank公布的WCFIPl的序列 一致;WCFIPl特異引物為： SEQ ID NO:2 ： WCFIPl -上游引物：5' -GCGGATCCGGTCAACGTGACCTACGAC-3' ； SEQ ID NO:3 ： WCFIPl-下游引物：5' -GCAAGCTTCAAACCACAGACTGAAG-3' ；PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因； 3、 構(gòu)建原核表達(dá)載體 (1) 用經(jīng)過Hind ΠΙ和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒WCFIPl/pMD20-T，獲得目的片斷 WCFIPl，反應(yīng)體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司）： 質(zhì)粒 WCFIPl/pMD20-T 15 μ L IOXK緩沖液 5 yL Hind ΠΙ 5 U BamH I 5 U 無菌水 至50 μ L (2) 用Hind Π?和BamH I雙酶切ρΕΤ28,獲得載體片斷，反應(yīng)體系如下(所用內(nèi)切酶及 緩沖液均購自大連TAKARA公司）： 質(zhì)粒 pET28 15 μ L IOXK緩沖液 5 yL Hind ΠΙ 5 U BamH I 5 U 無菌水 至50 μ L (3) 由（1)及（2)步驟后所得目的片斷和載體片斷，DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑 盒購自大連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行； (4) 回收得到的目的片斷和載體用T4 DNA連接酶(購自大連TAKARA公司）進(jìn)行連接反 應(yīng)，反應(yīng)體系如下： 質(zhì)粒PET28片段 IyL 目的片段落 3 yL IOX緩沖液 I UL T4連接酶 （λ 5 μ L 無菌水 至10 μ L 得重組載體PET28/WCFIP1 ; (5) 轉(zhuǎn)化重組載體至大腸桿菌TOPlO PET28/WCFIP1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化凡co/i Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞，涂板，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)12小時(shí)；挑取培養(yǎng)板上長出的轉(zhuǎn)化子，接入5 mL A+/LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過 夜，提取重組質(zhì)粒；對來自不同單克隆菌落的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，15 μ L酶切體系： 12 μ L PET28/WCFIP1 重組質(zhì)粒 1. 5 μ L Buffer K 0.75 μ L BamH I 0. 75 μ L Hind ΠΙ 酶切條件：37°C水浴，3 h;酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定克隆結(jié)果，表達(dá)載體 的酶切驗(yàn)證如圖1所示。酶切結(jié)果顯示，重組載體經(jīng)雙酶切在約360 bp的位置有一特異 DNA條帶，其大小與WCFIPl基因的大小相符，表明pET28/WCFIPl重組載體被成功構(gòu)建； (6) 轉(zhuǎn)化重組載體至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 將陽性克隆的質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂板（LB Kan抗性平板)， 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，得到大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子； 4、WCFIPl融合蛋白的表達(dá) 挑取轉(zhuǎn)化子單菌，接種至5 mL含70 mg/L硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，250 rpm，搖床振蕩培養(yǎng)過夜，按1%接種量接種至200 mL含70 mg/L硫酸卡那霉素的LB液體培 養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中，37 °C，250 rpm，搖床振蕩培養(yǎng)至OD6qq=O. 6-0.8,加入IPTG至終 濃度為0.05-1福，將搖床轉(zhuǎn)速調(diào)至200 rpm，37 °C誘導(dǎo)表達(dá)8-12 h;誘導(dǎo)完成后10, 000 g， 室溫下離心3 min，收獲經(jīng)離心得到的菌體，將菌體于PBS中超聲破碎、離心，分別取裂解液 上清和沉淀蛋白，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，于沸水中變性5 min，利用15%SDS-PAGE對樣 品進(jìn)行電泳分離，考馬斯亮蘭-R250染色結(jié)果如圖2所示，WCFIPl蛋白實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，其分子 量大小約為15 kDa，與預(yù)期分子量大小完全相符，說明目標(biāo)蛋白為不可溶的包涵體蛋白； 5、 包涵體WCFIPl重組蛋白的純化 離心得到的菌體按原來菌液總體積的1/10的比例加入裂解緩沖液(含溶菌酶)，并轉(zhuǎn)移 至高速離心管中，37 °C放置I h;將其在-80 °C低溫和37 °C水浴中反復(fù)凍融3次；將離 心管插入冰中，超聲波破碎細(xì)胞，超聲條件為：功率100 W，時(shí)間5 min，每超聲6 S間歇2 S ; 超聲破碎后，12, 000 g，15 min，4 °C，離心，棄上清；往離心管中加入等體積的PBST，劇烈渦 旋，充分重懸沉淀，12, 000 g, 15 min,4 °C,離心,棄上清,重復(fù)洗漆三次；最后，向所得的沉 淀中加入相當(dāng)于每次洗滌所用PBST1/10體積的變性裂解結(jié)合緩沖液，劇烈渦旋，充分重懸 沉淀，冰浴8 h，每1-2 h渦旋1-2 min; 15, 000 g，30 min，4 °C，離心，收獲上清液。將所得 上清于沸水中變性5 min，利用15%SDS-PAGE對樣品進(jìn)行電泳分離，考馬斯亮蘭-R250染色 結(jié)果如圖3所示，WCFIPl蛋白實(shí)現(xiàn)了初步純化，其分子量大小約為15 kDa，與預(yù)期分子量 大小完全相符。該方法可以除去包涵體蛋白中的部分雜蛋白，使WCFIPl重組蛋白的純度提 商； 將經(jīng)過鎳離子化處理的親和層析樹脂加入到簡裝柱中，用5倍樹脂體積的MilliQ水洗 柱3-5次；往柱中加入3倍體積的變性裂解結(jié)合緩沖液平衡樹脂3次；將含有融合蛋白的裂 解液加入到親和層析柱中，直至全部穿過樹脂；5倍于樹脂體積的變性裂解緩沖液，洗柱3 次；向親和層析柱中加5倍于樹脂體積的洗滌緩沖液，洗柱5次；最后加入相當(dāng)于純化前的 含融合蛋白溶液1/2體積的洗脫緩沖液洗柱兩次，將得到的洗脫液分裝保存于-20 °C。將 所得蛋白于沸水中變性5 min，利用15%SDS-PAGE對樣品進(jìn)行電泳分離，考馬斯亮蘭-R250 染色結(jié)果如圖3所示，利用不同濃度的咪唑洗脫可以使WCFIPl蛋白實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的純化， 純化蛋白的分子量大小約為15 kDa。最后，收集8M尿素和300 mM咪唑的pH 8.0 Tris-HCl 溶液的洗脫蛋白，該方法可以除去包涵體蛋白中的大部分雜蛋白，所得的WCFIPl融合蛋白 純度為95%以上； 6、 多克隆抗體的制備 (1) 免疫小鼠：昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，將純化的蛋白濃度調(diào)至0.4 mg/mL，按1:1的 體積比，加入弗氏完全佐劑，腹腔免疫注射小鼠，每只小鼠注射0. 5 mL (注射抗原100 μ g/ 只小鼠）；每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫時(shí)使用弗氏不完全佐劑，加強(qiáng)免疫時(shí)注射的方 法與劑量與初次免疫相同，共加強(qiáng)免疫3次，于第3次加強(qiáng)免疫結(jié)束后的第3 d，斷尾取血； (2) 抗血清效價(jià)的測定：將10 Pg/ml抗原包被96孔酶標(biāo)板，采用間接ELISA對抗血清 的效價(jià)進(jìn)行測定，方法如下：?包被：用0.05 M pH 9. 6碳酸鹽包被緩沖液將抗原稀釋至蛋 白質(zhì)濃度為10 μ g/mL。每個(gè)反應(yīng)孔中加0.1 mL，4°C孵育12 h。棄去孔內(nèi)溶液，用T BST 洗3次，每次3-5 min (簡稱洗漆，下同）;@封閉：每孔中加0. I mL 5%的BSA，4°C孵育12 h，棄去孔內(nèi)溶液，用T BST洗3次，每次3 min (同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)； (!)加一抗：加入定比例稀釋的抗體0. I mL于上述已包被抗原的反應(yīng)孔中，置4 °C孵育12 h。然后用T BST洗3次，每次3-5 min (同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）；@加 酶標(biāo)二抗：于各反應(yīng)孔中，加入稀釋5, OOO倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG酶 標(biāo)二抗0. I mL。37 °C孵育I h，用PBST洗滌2次，再用PBS洗滌1次；?加底物液顯色： 于各反應(yīng)孔中加入0.1 mL新配制的顯色液，放置于30 °C恒溫箱中反應(yīng)30 min 終止反 應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入4 M硫酸50 μ 1，終止反應(yīng)；?結(jié)果判定：于495 nm處，測定各孔的 OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2. 1倍，即為陽性。計(jì)算公式：（待測樣OD-空白OD) /(陰性對照OD-空白0D)，兩者比值大于2.1可判讀為陽性。血清效價(jià)測定的結(jié)果如圖4 所示，該抗血清的效價(jià)在64000倍以上； (3)抗血清的初步純化：取血清，加等量生理鹽水，攪拌并逐滴加入與稀釋血清等量的 飽和硫酸銨至終濃度為50%飽和度，4° C靜置4 h，3000 g離心30 min，棄上清，以生理鹽 水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨至飽和度為33%，4° C靜置4 h。3000 g離心30 min， 棄上清，沉淀溶于生理鹽水中。重復(fù)用33%飽和度的硫酸銨鹽析處理，將最后離心所得沉淀 以20 mM PBS (pH 7. 4)溶解并于10 kD的透析袋中于20 mM PBS中透析去除硫酸銨； 7、抗體特異性分析 將制備好的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的WCFIPl表達(dá)菌的菌體總蛋白樣品點(diǎn)樣到15%的SDS-PAGE 膠中，對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，在電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上輕輕剝離并轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移緩沖 液中，浸泡40-60 min ;按轉(zhuǎn)移凝膠的大小裁剪好濾紙和PVDF膜，濾紙各邊應(yīng)比PVDF膜長 2 mm，PVDF膜的各邊應(yīng)比PAGE膠的各邊長2 mm ;將PVDF膜用100%甲醇浸泡30 s，將PVDF 膜及濾紙一并浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡15 min ;將膠、濾紙及PVDF膜取出，盡量避免污染 濾紙和膜，按從下到上：濾紙-膜-膠-濾紙的順序?qū)⑵湟来畏藕茫淮蜷_半干轉(zhuǎn)移儀，將濾 紙 -膜-膠-濾紙放入轉(zhuǎn)移盤中，蓋好電源蓋子；接通電源，83 _X75 mm大小的膜設(shè)定電 流100 mA，電壓15 V ;實(shí)際設(shè)定中電壓15 V不變，按60 mm2設(shè)I mA的初始電流，設(shè)定轉(zhuǎn)膜 時(shí)間為I h ;轉(zhuǎn)移完畢后，封閉12 h ;封閉結(jié)束后，加入稀釋1萬倍的抗體到PVDF膜中，4°C 孵育12 h，利用TBST洗膜3次，每次15分鐘；將膜轉(zhuǎn)至含有HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG中， 4°C孵育12 h，利用TBST洗膜3次，每次15分鐘；將膜置于一小盒中，加入適量的ECL發(fā)光 液，反應(yīng)2分鐘，將膜置于暗盒內(nèi)并于暗室中將X-光片壓在膜上；將X-光片進(jìn)行顯影和定 影處理，X-光片于空氣中干燥并拍照分析。WB結(jié)果都表明，僅在WCFIPl表達(dá)菌的菌體包涵 體蛋白的約15 kDa處檢測到了特異條帶，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子菌體總蛋白未檢測到 相應(yīng)條帶，說明制備的抗體具有很高的特異性(如圖5所示）； 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組茯苓免疫調(diào)節(jié)蛋白WCFIPl及其抗體的生產(chǎn)方法，其特征在于，一種WCFIPl 重組蛋白的生產(chǎn)方法，主要包括以下步驟： (1)合成WCFIPl基因：根據(jù)WCFIPl成熟蛋白的氨基酸序列，人工合成了該蛋白的DNA 序列；（2) WCFIPl成熟基因的克隆：用特異引物擴(kuò)增出完整的基因片段，所用WCFIPl特異 引物中引入BamH I酶切位點(diǎn)和Hind III酶切位點(diǎn)，回收PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD20-T載體，得質(zhì)粒WCFIPl/pMD20-T，經(jīng)過測序 確定為正確表達(dá)序列；（3)構(gòu)建原核表達(dá)載體：將表達(dá)載體pET28和步驟（2)所得的質(zhì)粒 WCFIPl/pMD20-T經(jīng)過Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并利用T4 DNA連接酶連接，得 重組載體PET28/WCFIP1 ; (4)大腸桿菌表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化子的篩選：將步驟（3)所得的重組載 體PET28/WCFIP1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPlO菌株中，再從大腸桿菌TOPlO菌株中提取重組載體 PET28/WCFIP1 ;用熱激法將重組載體pET28/WCFIPl轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中，利用 LB卡那霉素（Kan)抗性平板篩選得到包含有重組載體pET28/WCFIPl的大腸桿菌表達(dá)菌株 轉(zhuǎn)化子；（5) WCFIPl重組蛋白的表達(dá)：將步驟（4)所述的pET28/WCFIPl大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化 子在37°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4-0. 8時(shí)，加入濃度為0. 05-1. 0 mM的IPTG，于37°C誘導(dǎo)8-12 小時(shí)，超聲破碎，離心取上清液，得大量重組蛋白WCFIPl ; (6)WCFIP1重組蛋白的純化：利用 鎳親合層析法對WCFIPl重組蛋白進(jìn)行純化。
2. -種WCFIPl特異性抗體的生產(chǎn)方法，其特征在于，主要包括以下步驟： (1)將抗原與弗氏完全佐劑混合至完全乳化，將乳化的抗原免疫昆明小鼠，在初次免疫 結(jié)束后的第3周對經(jīng)免疫的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫，兩次加強(qiáng)免疫間隔2 周，在第2次加強(qiáng)免疫后的第2周取小鼠的血液，并制備血清；（2)將WCFIPl重組蛋白包被 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA)板，測定抗血清的效價(jià)，并分別利用50%和33%的硫酸銨進(jìn)行 分級沉淀和透析處理，對抗血清進(jìn)行初步分離純化；（3)以經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可以表達(dá)WCFIPl蛋 白的大腸桿菌表達(dá)菌菌體總蛋白為檢測對象，對純化抗體的特異性進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)印跡 結(jié)果表明，通過上述方法制備的抗體具有很高的靈敏度和特異性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（1)所述，合成的WCFIPl基序 列如下：5'-GTCAACGTGACCTACGACCCTTTCTTCGACAATCCTAATAATTCTCTTTCATA CGTTGCTTGCTC AGATGGAACTAATGGACTTCTTACCAAGGGTTACACTACTTTGGGTTCACTTCCAGATTTTCCTTACATTGGTGGAG CATATGCTATCGCCGGTTGGAACTCTCCATCCTGTGGAACCTGCTGGGAATTGACTTACAACAACGTTTCTATTAAT ATCCTTGGTACTGACACAGCTGCCGGATTCAACATTGCTTTGACAGCTATGAATGTCCTTACTAATAACGCCGCAGT TGATTTGGGAGAAGTTGACGCCGCCGCCATTCAGGTTGACTCTTCAGTCTGTGGTTTG-3 ,〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，步驟（2)所用的引物序列如下：上游引物：5'-GCG GATCCGGTCAACGTGACCTACGAC-3'，下游引物：5' -GCAAGCTTCAAACCACAGACT GAAG-3'。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（4)所述的表達(dá)載體為pET28， 表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟（3)所述的以IPTG誘導(dǎo)可以表 達(dá)WCFIPl蛋白的大腸桿菌表達(dá)菌株的菌體總蛋白為檢測對象，對純化抗體的特異性進(jìn)行 分析，分析結(jié)果顯示通過該方法制備的抗體具有很高的特異性和靈敏度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法制得的重組WCFIPl蛋白及其抗體。
【文檔編號】C07K16/06GK104212828SQ201310215631
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月3日
【發(fā)明者】胡興, 李洪波, 牛友芽 申請人:懷化學(xué)院