一株黃曲霉生防菌的抗菌活性物質(zhì)及其分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗菌活性物質(zhì)，來自于萎縮芽孢桿菌，來源于下述制備方法：將萎縮芽孢桿菌接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上進行搖床培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心收集上清液，將所得上清液用過濾器過濾，即為包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液。進一步的，本發(fā)明還公開了所述抗菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)、分離純化的方法。
【專利說明】一株黃曲霉生防菌的抗菌活性物質(zhì)及其分離純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗菌活性物質(zhì)，尤其涉及來源于萎縮芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，屬于微生物學領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，微生物能夠產(chǎn)生具有抗細茵、抗真菌和抗病毒等作用的抗菌活性物質(zhì)。至今為止，青霉菌類細菌產(chǎn)生的青霉素、頭孢霉屬產(chǎn)生的頭孢菌素、鏈霉菌屬產(chǎn)生的鏈霉素、四環(huán)素及紅霉素等作為抗菌活性物質(zhì)已經(jīng)得到了廣泛的利用。
[0003]然而，由于這些抗菌活性物質(zhì)已經(jīng)長年使用，因此普遍導致細菌對這些抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生了耐受性，因此急需尋找新的、更加強有力的新型抗菌活性物質(zhì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)的需要，本發(fā)明提供了一種新型的、具有良好抗菌、抑菌活性的抗菌活性物質(zhì)，該抗菌活性物質(zhì)來源于萎縮芽孢桿菌，本發(fā)明還提供了此種抗菌活性物質(zhì)的分離純化方法。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本申請發(fā)明人多年來對各種桿菌進行了廣泛研究，并發(fā)現(xiàn)從土壤中分離得到的萎縮芽孢桿菌經(jīng)過培養(yǎng)能夠得到對細菌，尤其是黃曲霉菌具有極好的抑制效果，基于此發(fā)現(xiàn)申請了完成了本發(fā)明。
[0006]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:
萎縮芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，所述活性物質(zhì)來源于下述制備方法所制備:將萎縮芽孢桿菌接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上進行搖床培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心收集上清液，將所得上清液用過濾器過濾，即為包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液。
[0007]可以理解，本發(fā)明并不僅限于上述的抗菌活性物質(zhì)，還包括包含上述抗菌活性物質(zhì)的商業(yè)成品，例如抗菌劑，可以通過常規(guī)的制造方法將本發(fā)明的抗菌活性物質(zhì)與醫(yī)藥學上已知的容許的適當醫(yī)藥栽體組合形成制劑，此類商業(yè)產(chǎn)品通常是包含食品和清潔用品的抗菌劑，例如用于化妝水、乳液、洗面奶、護膚齊?、面膜、化妝油、防曬齊?、木材、紙張、油性漆、布、粘合劑、涂裝保護劑、食品保鮮劑(含飲料)、糖果、甜餅、零食等點心和輔助食品、清涼飲料等飲料和食品中，具體的用量可以根據(jù)已有藥學知識通過常規(guī)實驗得到。
[0008]在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了所述抗菌活性物質(zhì)的制備方法，包括下述步驟:1)將萎縮芽孢桿菌菌種接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)即得發(fā)酵液；2)將發(fā)酵液低溫下高速離心,收集上清液,用0.45um微型過濾器過濾，即為包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液。
[0009]通過上述步驟可以得到本發(fā)明的抗菌活性物質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所得到的上清液并非純度為100%的抗菌活性物質(zhì)，而是包含該抗菌活性物質(zhì)的溶液，在經(jīng)過更復雜的分離純化后才能得到高純度的抗菌活性物質(zhì)。該物質(zhì)含量濃度的高低只會影響用量，而不會影響單位含量物質(zhì)的效力。
[0010]在上述方法中，萎縮芽孢桿菌的接種培養(yǎng)條件可根據(jù)需要進行調(diào)整， 申請人:在大量研究中得出了較為優(yōu)選的培養(yǎng)條件:接種量:1- 5 % ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基裝液量:15-100mL/250mL ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基初始pH值:5.0-9.0 ;培養(yǎng)溫度:10-50 °C ;培養(yǎng)時間:12-60h ;培養(yǎng)所用搖床轉(zhuǎn)速:10-240r/min。
[0011]在上述培養(yǎng)條件下，所得上清液表現(xiàn)出一定的抗菌抑菌活性。
[0012] 申請人:對上述的條件進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度為35°C時能有效提高抗菌活性物質(zhì)的抑菌性能。
[0013]更優(yōu)選的，所述步驟I)的培養(yǎng)條件為接種量:1.5% ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基裝液量:30mL/250mL ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基初始pH值:7.0 ;培養(yǎng)時間:48h ;培養(yǎng)所用搖床轉(zhuǎn)速:180r/min0
[0014]在上述培養(yǎng)條件下，所得到的抗菌活性物質(zhì)具有最佳的抑菌活性。
[0015]為了提高接種效率，在進行接種培養(yǎng)以前，將萎縮芽孢桿菌菌種接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)，加入無菌水以旋渦混合儀振蕩使菌體均勻分布。
[0016]優(yōu)選的，萎縮芽孢桿菌菌種接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)48h，所加入的無菌水含0.1%吐溫-80和0.1%瓊脂。
[0017]在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明還公開了對所得上清液進行分離純化的步驟，從而得到高純度的萎縮芽孢桿菌抗菌活性物質(zhì)純化物，該分離純化方法包括下述步驟:1)將包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液進行粗提，粗提方法為硫酸銨沉淀法；2)包含抗菌活性物質(zhì)的粗提物進行層析分離純化，包括脫鹽得到富集包含抗菌活性物質(zhì)的洗脫液和將脫鹽所得洗脫液進行離子交換層析將所得流出液收集、合并，濃縮得到萎縮芽孢桿菌抗菌活性物質(zhì)純化物的步驟。
[0018]優(yōu)選的，上述步驟I)采用硫酸銨沉淀法:將發(fā)酵上清液加入硫酸銨固體粉末至80%飽和度硫酸銨，離心收集沉淀。
[0019]優(yōu)選的,所述步驟2)采用 Sephadex G-25 脫鹽,采用 DEAE Sepharose Fast Flow進行離子交換層析。
[0020]在得到上述抗菌活性物質(zhì)后， 申請人:對該物質(zhì)的抗菌抑菌性能進行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的萎縮芽孢桿菌抗菌活性物質(zhì)具有廣泛的抗菌活性，尤其對于抑制黃曲霉菌效果顯著。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為S^hadex G_25脫鹽紫外檢測及抑菌率對照示意圖；
圖2為DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析效果示意圖。

【具體實施方式】
[0022]實施例1:萎縮芽孢桿菌抗菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)條件篩選
實驗材料:菌種采用萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus);營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基可采用市售任何的此類培養(yǎng)基，本發(fā)明所用此培養(yǎng)基的組成為:蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂 17g，蒸餾水 1000 1^，卩!17.2，1211:滅菌201^11。
[0023]測試所用黃曲霉來源:將黃曲霉菌種接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(PDA)上，30°C恒溫培養(yǎng)48h，向其中加入無菌水(含0.1%吐溫-80和0.1%瓊脂)，旋渦混合儀振蕩使孢子均勻分布，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為lX105CFU/mL，即為黃曲霉孢子懸浮液。
[0024]為了研究不同培養(yǎng)條件對抗菌活性物質(zhì)抑菌活性的影響， 申請人:按照下述六個因素進行了試驗:首先將萎縮芽孢桿菌菌種接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)48h，向其中加入無菌水(含0.1%吐溫-80和0.1%瓊脂)，旋渦混合儀振蕩使菌體均勻分布，然后以培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間，接種量，搖床轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)基初始PH環(huán)境，液體培養(yǎng)基裝液量作為6個因素，分別取5個水平設(shè)計正交實驗L25 ( 56)，通過方差分析和交互作用分析篩選出抗菌活性物質(zhì)抑菌率最好的培養(yǎng)條件。
[0025]1.1培養(yǎng)溫度的確定
將萎縮芽孢桿菌以1%的接種量接種至初始PH值為7.0的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，分別于10°C、20°C、30°C、40°C、50°C不同溫度條件下，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h后取出。將發(fā)酵液于4°C，8000r/min離心20min，收集上清液，并用0.45Mm微型過濾器過濾,檢測不同培養(yǎng)溫度無菌發(fā)酵上清液對黃曲霉的抑菌率。
[0026]1.2培養(yǎng)時間的確定
將萎縮芽孢桿菌以1%的接種量接種至初始PH值為7.0的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，于30°C，180 r/min搖床轉(zhuǎn)速條件下，分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h后取出，檢測不同培養(yǎng)時間無菌發(fā)酵上清液對黃曲霉的抑菌率。
[0027]1.3接種量的確定
將萎縮芽孢桿菌分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種至初始pH值為7.0的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，于30°C，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h后取出，檢測不同接種量無菌發(fā)酵上清液對黃曲霉的抑菌率。
[0028]1.4搖床轉(zhuǎn)速的確定
將萎縮芽孢桿菌以1%的接種量接種至初始PH值為7.0的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，培養(yǎng)溫度30°C，分別于10、60、120、180、240 r/min搖床轉(zhuǎn)速條件下，培養(yǎng)48h后取出，檢測不同搖床轉(zhuǎn)速各組無菌發(fā)酵上清液對黃曲霉的抑菌率。
[0029]1.5培養(yǎng)基初始pH值得確定
將萎縮芽孢桿菌分別以1%的接種量接種至初始PH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，于30°C，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h后取出，檢測不同初始PH值無菌發(fā)酵上清液對黃曲霉的抑菌率。
[0030]1.6液體培養(yǎng)基裝液量的確定
將萎縮芽孢桿菌分別以1%的接種量接種至初始PH值為7.0的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量分別為15、30、50、75、100111172501^，于301:，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h后取出，檢測不同裝液量無菌發(fā)酵上清液對黃曲霉的抑菌率。
[0031]采用下述方法評價各條件下的抑菌效果:取ImL萎縮芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)無菌上清液于平板中，傾注入20mL PDA培養(yǎng)基搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，用直徑6_的無菌打孔器在平板中央打孔，向孔中注入1yL濃度為I X 105CFU/mL的黃曲霉孢子懸液，以無菌空白培養(yǎng)基代替上清液做對照。30°C恒溫靜置培養(yǎng)5d后，用游標卡尺十字交叉法測量黃曲霉直徑，以抑菌率表示發(fā)酵培養(yǎng)液無菌上清液的抗菌效果，取平均值作為測定結(jié)果，每個處理重復3次。以無菌上清液對黃曲霉的抑菌率作為指標來衡量最優(yōu)培養(yǎng)條件。
[0032]測試結(jié)果如下:
表1不同培養(yǎng)條件無菌發(fā)酵上清液對黃曲霉的抑菌率

【權(quán)利要求】
1.萎縮芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，其特征在于所述活性物質(zhì)來源于下述制備方法所制備:將萎縮芽孢桿菌接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上進行搖床培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心收集上清液，將所得上清液用過濾器過濾，即為包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液。
2.權(quán)利要求1所述的抗菌活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟:1)將萎縮芽孢桿菌菌種接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)即得發(fā)酵液；2)將發(fā)酵液低溫下高速離心，收集上清液，用0.45um微型過濾器過濾，即為包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)的培養(yǎng)條件為接種量:.1-5% ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基裝液量:15-100mL/250mL ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基初始pH值:5.0-9.0 ;培養(yǎng)溫度:10-50°C ;培養(yǎng)時間:12-60h ;培養(yǎng)所用搖床轉(zhuǎn)速:10-240r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)的培養(yǎng)溫度為35°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)的培養(yǎng)條件為接種量:.1.5% ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基裝液量:30mL/250mL ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基初始pH值:7.0 ;培養(yǎng)時間:.48h ;培養(yǎng)所用搖床轉(zhuǎn)速:180r/min。
6.權(quán)利要求1所述的抗菌活性物質(zhì)的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟:1)將包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液進行粗提，粗提方法為硫酸銨沉淀法，將發(fā)酵上清液加入硫酸銨固體粉末至80%飽和度硫酸銨，離心收集沉淀。
7.2)包含抗菌活性物質(zhì)的粗提物進行層析分離純化，包括脫鹽得到富集包含抗菌活性物質(zhì)的洗脫液和將脫鹽所得洗脫液進行離子交換層析將所得流出液收集、合并，濃縮得到萎縮芽孢桿菌抗菌活性物質(zhì)純化物的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離純化方法，其特征在于所述步驟2)采用SephadexG_25脫鹽，采用DEAE Sepharose Fast Flow進行離子交換層析。
【文檔編號】C07K1/18GK104178543SQ201310252661
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月25日
【發(fā)明者】秦文, 劉丁, 張志清, 葉勁松, 李瑩露 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學