專利名稱：萃取方法和提純有效物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于從包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物(例如源自動(dòng)物或植物的萃取物以及酶反應(yīng)溶液)的水溶液中高純度和高產(chǎn)率地萃取含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的方法。
背景技術(shù)：
已知許多具有各種生理活性的天然化合物，以粗制藥物萃取物為代表。這些天然化合物也被稱為生理活性物質(zhì)。通常通過下述方法提純各種生理活性物質(zhì)，使用包含該生理活性物質(zhì)的材料和水、溫水或低濃度含水醇溶液進(jìn)行萃取以獲得萃取溶液，濃縮該萃取溶液，然后將濃縮的萃取溶液進(jìn)行柱色譜分離。然而，這種提純方法需要大的柱和與此相匹配的設(shè)備，以便得到大量生理活性物質(zhì)。小柱的效率很低。因此，提純的生理活性物質(zhì)非常昂貴。
對(duì)于通過溶劑萃取法提純生理活性物質(zhì)，人們已進(jìn)行了各種嘗試。但是，由于安全問題不能將下述方法用于食物，即向水溶液中加入原本與水不混溶的有機(jī)溶劑如乙酸乙酯、丁醇和氯仿，攪拌，并使溶液靜置以獲得兩相即水相和有機(jī)溶劑相，然后回收轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相的生理活性物質(zhì)。甚至在將生理活性物質(zhì)用于除食物以外的用途時(shí)，使用有機(jī)溶劑也不能有效萃取一些生理活性物質(zhì)，因?yàn)樯砘钚晕镔|(zhì)不能大量轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相。因?yàn)槟苡糜谑澄锏囊恍┯袡C(jī)溶劑如乙醇和丙酮是與水混溶的，這些有機(jī)溶劑不能用于從水溶液中萃取和提純生理活性物質(zhì)。
橙皮苷是典型的類黃酮，其包含在橙汁中。橙皮苷代表的類黃酮已知具有如下所述生理作用，例如，橙皮苷和蕓香苷以前被稱為維生素P，長(zhǎng)久以來人們就知道它們具有降血壓的作用(Shintaro Kamiya，Shin-Vitamin-Gaku，[New Vitamin Study](The Vitamin Societyof Japan)1969，439頁)。也有報(bào)道說，橙皮苷具有下列生理作用消炎作用，止痛作用(E，M.Galati等人，I1 Farmaco，49，709-712(1994))，抗變應(yīng)性作用(Hideaki Matsuda等人Yakugaku Zasshi[Journal of Pharmacology]，111，193-198(1991)，J.A.Da SilvaEmim等人；J.Pharm.Pharmacol.，46，118-712(1994))，降低LDL-膽固醇以改善血膽固醇水平的作用(M.T.Monforte等人；IlFarmaco，50，595-599(1995))，以及制癌作用(T.Tanaka，等人；Cancer Research，54，4653-4659(1994)，T.Tanaka，等人；Cancer Research，57，246-252(1997)，T.Tanaka，等人；Carcinogenesis，18，761-769(1997)，T.Tanaka，等人；Carcinogenesis，18，957-965(1997)).此外，在最近的研究中，人們預(yù)期橙皮苷也具有促進(jìn)脂肪前體細(xì)胞分化以便改善病癥如糖尿病的作用。洋芫荽甙具有很強(qiáng)的抗氧化活性。
包含洋芫荽甙和橙皮苷的藥劑用作靜脈機(jī)能不全、痔等的治療藥物(C.Labrid；Angiology，45，524-530(1994))。也有報(bào)道說，單獨(dú)的橙皮苷、單獨(dú)的洋芫荽甙以及橙皮苷和洋芫荽甙的混合物抑制口腔癌、食管癌、結(jié)腸直腸癌等(T.Tanaka，等人；CancerResearch，54，4653-4659(1994)，T.Tanaka，等人；CancerResearch，57，246-252(1997)，T.Tanaka，等人；Carcinogenesis，18，761-769(1997)，T.Tanaka，等人；Carcinogenesis，18，957-965(1997))。
已知柚皮苷和新橙皮苷為柑桔的苦素，用于食物和飲料以提供苦味。
此外，最近發(fā)現(xiàn)異黃酮能有效提高骨密度、抑制乳腺癌的發(fā)生等等(Toda等人；Foods and Ingredients Journal of Japan，No.172，83-89(1997))。
橙皮苷和蕓香苷原本不溶解于丙酮。
另一方面，類黃酮如橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和蕓香苷微溶于水中。為了克服這一障礙，即溶解度差，人們已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試來有效溶解這些難溶性化合物。例如，已經(jīng)公開了通過酶催糖基化作用提高類黃酮如橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和蕓香苷的溶解度的方法(日本公開專利7-107972)。
也公開了出于同一目的通過酶催糖基化作用提高除上述類黃酮以外的兒茶素、咖啡酸、曲酸、氫醌、兒茶酚、間苯二酚、原兒茶酸、五倍子酸、香草醛、黃豆苷原、染料木素、α-間二羥苯甲酸和間苯三酚的溶解度的方法(日本專利公告7-36758和T.Nishimura，J.Ferment.Bioeng.，78(1994)37頁)。
但是，因?yàn)檐毡旧淼乃苄员惶岣?，所以苷不能被有效萃取到與水不混溶的溶劑中。而且，由于安全問題，為從進(jìn)行了糖基化作用的酶反應(yīng)溶液中提純苷需要使用柱色譜法如吸附色譜法。
在常規(guī)提純方法中，為了從天然材料中獲得部分提純的類黃酮、兒茶素、苯酚及它們的苷，采用了使用天然材料和堿性水溶液、有機(jī)溶劑、熱水等來進(jìn)行萃取，然后通過柱色譜法提純萃取溶液的方法。但是，為了高產(chǎn)率低成本地獲得大量這些物質(zhì)，萃取和提純需要使用能用于食物的安全有機(jī)溶劑。但是，因?yàn)榭捎糜谑澄锏谋膳c水混溶，所以不可能使用丙酮來萃取這些物質(zhì)。大多數(shù)可有效用于食物和藥物領(lǐng)域的生理活性物質(zhì)具有如下性質(zhì)，即它們易溶于高極性溶劑如水、乙醇和丙酮，而難溶于低極性溶劑，因此它們不能被有效地從低極性溶劑中萃取出來。

發(fā)明內(nèi)容
作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使在使用本質(zhì)上難以和水相(其中有機(jī)溶劑與水或熱水混合)分離的有機(jī)溶劑時(shí)，如果包含生理活性物質(zhì)的水溶液中存在具有保水能力的物質(zhì)如糖類，則有可能在混合并攪拌水溶液和有機(jī)溶劑后很容易地從有機(jī)相分離水相。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)生理活性物質(zhì)轉(zhuǎn)入到有機(jī)相中。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過加入鹽(例如氯化鈉和檸檬酸鈉)或有機(jī)酸來增加水溶液的離子強(qiáng)度，即使存在糖類，不與水相分離的有機(jī)溶劑或難以與水相分離的有機(jī)溶劑也可以從水相中分離出來，生理活性物質(zhì)也可以有效地轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相中?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
本發(fā)明方法是萃取含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的方法，包括以下步驟使包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖類的水溶液與極性有機(jī)溶劑接觸，獲得水相與有機(jī)相，由此使含疏水基的水溶性有機(jī)化合物轉(zhuǎn)入有機(jī)相中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該水溶液的糖類濃度可以是每100ml水溶液至少12g糖類。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以是水溶性芳族化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以選自苯酚衍生物及其苷。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以選自氫醌苷、兒茶素、水楊苷、橙皮苷、橙皮苷基糖苷(hesperidinglycosides)、咖啡酸、水楊醇和鞣花單寧(elladitannin)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液可以進(jìn)一步包含相分離助劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，相分離助劑可以是鹽或有機(jī)酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，相分離助劑選自氯化鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂和硫酸銨。
在一個(gè)實(shí)施方案中，極性有機(jī)溶劑可以是四氫呋喃或乙腈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，極性有機(jī)溶劑可以是四氫呋喃、乙腈、丙酮或異丙醇。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以源自酶反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，酶反應(yīng)溶液可以是糖基化反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化反應(yīng)溶液可以是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以源自選自動(dòng)物或植物的有機(jī)體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以源自果汁。
在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液可以通過濃縮包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖類的酶反應(yīng)溶液來制備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，酶反應(yīng)溶液可以是糖基化反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化反應(yīng)溶液可以是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液可以通過濃縮或稀釋有機(jī)體的萃取物來制備，其中萃取物包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖類，有機(jī)體是動(dòng)物或植物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液可以通過濃縮果汁來制備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液可以通過將相分離助劑加入包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖類的酶反應(yīng)溶液或其濃縮物中來制備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，酶反應(yīng)溶液可以是糖基化反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化反應(yīng)溶液可以是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液可以通過將相分離助劑加入有機(jī)體的萃取物、其濃縮物或其稀釋液中來制備，其中該萃取物包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖類，該有機(jī)體是動(dòng)物或植物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液可以通過將相分離助劑加入果汁或其濃縮物中來制備。
本發(fā)明的提純方法是提純苯酚衍生物苷的方法，包括以下步驟首先將包含苯酚衍生物、苯酚衍生物苷和糖類的第一水溶液與極性有機(jī)溶劑接觸，獲得第一水相和包含少量水的有機(jī)相，由此苯酚衍生物和苯酚衍生物苷轉(zhuǎn)入有機(jī)相中；回收包含少量水的有機(jī)相；從包含少量水的有機(jī)相中除去極性有機(jī)溶劑，獲得包含苯酚衍生物和苯酚衍生物苷的第二水溶液；將第二水溶液與乙酸乙酯接觸，獲得第二水相和乙酸乙酯相，由此苯酚衍生物轉(zhuǎn)入乙酸乙酯相中；回收第二水相；濃縮和冷卻第二水相以沉淀苯酚衍生物苷。
在一個(gè)實(shí)施方案中，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷可以源自苯酚衍生物糖基化反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化反應(yīng)溶液可以是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一水溶液可以進(jìn)一步包含相分離助劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化反應(yīng)溶液可以是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示葡萄糖濃度對(duì)四氫呋喃萃取的影響。
圖2表示氫醌苷和葡萄糖轉(zhuǎn)入四氫呋喃相的轉(zhuǎn)移率。
具體實(shí)施例方式
在下文中將詳細(xì)描述本發(fā)明。除非另有說明，本文所用的濃度表示為每100立方厘米溶液中的克數(shù)。例如，“10％氯化鈉溶液”是指每100立方厘米溶液溶解10g氯化鈉的氯化鈉溶液。
本發(fā)明方法是萃取含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的方法。該方法包括以下步驟使包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖類的水溶液與極性有機(jī)溶劑接觸，獲得水相和有機(jī)相，使含疏水基的水溶性有機(jī)化合物轉(zhuǎn)入有機(jī)相中。
(1)含疏水基的水溶性有機(jī)化合物本文所用的“含疏水基的水溶性有機(jī)化合物”是指包含疏水基并且可溶于水的有機(jī)化合物。
本文所用的“水溶性”化合物是指在20℃下1升水可以溶解至少0.01g的化合物。在20℃下，優(yōu)選至少0.1g，更優(yōu)選至少1g，更優(yōu)選至少5g，最優(yōu)選至少10g含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以溶于1升水中。對(duì)于溶解度沒有特別的上限，雖然溶解度優(yōu)選為在20℃下1升水溶解不超過300g。更優(yōu)選溶解度是，在20℃下1升水溶解不超過100g。
疏水基優(yōu)選包含至少三個(gè)碳原子，更優(yōu)選包含芳族殘基的疏水基。含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的例子包括類黃酮、異黃酮、酚類化合物、類黃酮苷、異黃酮苷、酚類化合物苷、氫醌苷、蒽苷、水溶性芳族化合物(例如查耳酮苷)、萜烯苷、甾類糖苷、三萜類苷、生物堿苷和C-苷。優(yōu)選含疏水基的水溶性有機(jī)化合物是水溶性芳族化合物。
本文所用的“水溶性芳族化合物”是指可溶于水并且具有芳基的化合物。
水溶性芳族化合物優(yōu)選選自苯酚衍生物及其苷。
“苯酚衍生物”是指具有苯酚骨架(即苯環(huán))或類黃酮骨架，并且具有連接到苯酚骨架或類黃酮骨架的羥基的化合物，包括苯酚和曲酸。苯酚衍生物的例子包括在單個(gè)苯酚或類黃酮骨架上具有酚羥基的化合物，以及在單個(gè)苯酚或類黃酮骨架上具有至少兩個(gè)酚羥基的化合物。在下文中，為了方便起見，在單個(gè)苯酚或類黃酮骨架上具有一個(gè)酚羥基的化合物稱為單酚型化合物，在單個(gè)苯酚或類黃酮骨架上具有至少兩個(gè)酚羥基的化合物稱為多酚型化合物。
在單個(gè)苯酚或類黃酮骨架上具有兩個(gè)酚羥基的化合物稱為雙酚化合物。
具有酚羥基的苯酚衍生物苷也包括在苯酚衍生物的范圍內(nèi)。
在單個(gè)苯酚或類黃酮骨架上具有一個(gè)酚羥基的單酚型化合物的例子包括苯酚、水楊醇、曲酸、二甲氧基苯酚、撲熱息痛、香草醛和黃豆苷。
單酚化合物的例子也包括單酚型類黃酮型化合物。單酚型類黃酮型化合物的例子包括單酚型黃酮型化合物、單酚型異黃酮型化合物、單酚型黃酮醇型化合物、單酚型黃烷酮型化合物、單酚型二氫黃酮醇型化合物、單酚型兒茶素型化合物、單酚型嗅哢型化合物、單酚型查耳酮型化合物和單酚型二氫查耳酮型化合物。
二甲氧基苯酚的例子包括2，3-二甲氧基苯酚、2，4-二甲氧基苯酚、2，5-二甲氧基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、3，4-二甲氧基苯酚和3，5-二甲氧基苯酚。優(yōu)選3，4-二甲氧基苯酚和3，5-二甲氧基苯酚。
在單個(gè)苯酚或類黃酮骨架上具有至少兩個(gè)酚羥基的多酚型化合物的例子包括氫醌、橙皮素、表焙兒茶素、表兒茶精沒食子酸鹽、花色素型化合物、花色苷型化合物、咖啡酸、兒茶酚、間苯二酚、原兒茶酸、五倍子酸、染料木素、β-間二羥苯甲酸和間苯三酚。
雙酚化合物的例子也包括雙酚型類黃酮型化合物。雙酚型類黃酮型化合物的例子包括雙酚型黃酮型化合物、雙酚型異黃酮型化合物、雙酚型黃酮醇型化合物、雙酚型黃烷酮型化合物、雙酚型二氫黃酮醇型化合物、雙酚型兒茶素型化合物、雙酚型嗅哢型化合物、雙酚型查耳酮型化合物和雙酚型二氫查耳酮型化合物。
間二羥苯甲酸的例子包括α-間二羥苯甲酸、β-間二羥苯甲酸和γ-間二羥苯甲酸。在本發(fā)明中，優(yōu)選β-間二羥苯甲酸。
本文所用的“苯酚衍生物苷”是其中苯酚衍生物部分通過苷鍵與一個(gè)或多個(gè)糖類部分連接的物質(zhì)。苯酚衍生物苷可以是單吡喃葡萄糖苷(例如氫醌-O-α-D-吡喃葡萄糖苷、水楊苷、咖啡酸-O-α-D-吡喃葡萄糖苷、3，4-二甲氧基苯酚-O-α-D-吡喃葡萄糖苷和兒茶素-O-α-D-吡喃葡萄糖苷)、其中糖類部分再與上述單吡喃葡萄糖苷連接的二吡喃葡萄糖苷(例如橙皮苷衍生物)、三吡喃葡萄糖苷等。
本文所用的“苷”是其中糖苷配基通過苷鍵與一個(gè)或多個(gè)糖類部分連接的物質(zhì)。糖類部分的聚合度優(yōu)選1-10，更優(yōu)選1-5，更加優(yōu)選1-3。糖類部分可以是單糖部分或二糖部分。本文所用的葡糖苷包括在苷的定義內(nèi)。葡糖苷是一個(gè)或多個(gè)葡萄糖部分連接到糖苷配基上的苷。
含疏水基的水溶性有機(jī)化合物優(yōu)選選自水楊苷、松柏苷、熊果苷、番瀉葉苷、甜菊苷、rubsoside、蕓香苷、橙皮苷、柚皮苷、黃豆苷、染料木苷、barbaroin、香草醛、皂草苷、黃連素、堪非醇、黃芩苷、茵陳素兒茶素、延胡索堿、七葉苷原、表兒茶精、姜辣素、甘草甜素、洋芫荽甙、新橙皮苷、咖啡酸、水楊醇、鞣花單寧和氫醌。含疏水基的水溶性有機(jī)化合物更優(yōu)選選自氫醌苷、兒茶素、水楊苷、橙皮苷、橙皮苷基糖苷、咖啡酸、水楊醇和鞣花丹寧。
含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以以任何濃度存在于水溶液中。含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的濃度優(yōu)選0.01-50％，更優(yōu)選0.1-40％，更加優(yōu)選0.5-30％，還更加優(yōu)選1-20％，最優(yōu)選5-15％。如果存在于水溶液中的含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的濃度過低，則提純效率可能低。如果存在于水溶液中的含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的濃度過高，則含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可能發(fā)生沉淀。優(yōu)選的是含疏水基的水溶性有機(jī)化合物不發(fā)生沉淀的濃度。
含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可源自包含該含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的酶反應(yīng)溶液。本文所用的酶反應(yīng)溶液是指使所有原料都進(jìn)行酶反應(yīng)所獲得的溶液。這樣的酶反應(yīng)溶液的例子包括含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的糖基化反應(yīng)溶液、水解反應(yīng)溶液、轉(zhuǎn)移反應(yīng)和縮合反應(yīng)溶液。酶反應(yīng)溶液優(yōu)選包含糖。酶反應(yīng)溶液一般是反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行并且反應(yīng)產(chǎn)物已經(jīng)制成后的反應(yīng)溶液。
糖基化反應(yīng)的典型例子是用于糖基轉(zhuǎn)移受體的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其通過環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶催化。這種糖基轉(zhuǎn)移受體的例子包括在結(jié)構(gòu)中包含糖的類黃酮、在結(jié)構(gòu)中不包含糖的類黃酮、苯酚化合物和酚類化合物苷。典型糖基轉(zhuǎn)移受體的例子包括橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和蕓香苷。
糖基化反應(yīng)的另一個(gè)例子是用于糖基轉(zhuǎn)移受體的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其通過轉(zhuǎn)移型(transferring type)淀粉酶催化。這種糖基轉(zhuǎn)移受體的例子包括兒茶素、咖啡酸、曲酸、氫醌、兒茶酚、間苯二酚、原兒茶酸、五倍子酸、香草醛、黃豆苷、染料木素、α-間二羥苯甲酸和間苯三酚。
糖基化反應(yīng)溶液優(yōu)選是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
催化酶反應(yīng)的酶的例子除了環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)移型淀粉酶之外包括α-淀粉酶、支鏈淀粉酶、麥芽糖轉(zhuǎn)葡糖基酶、D-酶、新支鏈淀粉酶(neopullulanase)、環(huán)糊精酶、α-葡糖苷酶、纖維素酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶。
包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的酶反應(yīng)溶液可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法設(shè)計(jì)和獲得。
含疏水基的水溶性有機(jī)化合物也可源自包含該含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的任何天然材料。例如，含疏水基的水溶性有機(jī)化合物可以源自有機(jī)體(例如動(dòng)物或植物)。或者，可以使用動(dòng)物萃取物或植物萃取物。動(dòng)物萃取物是指從動(dòng)物萃取的任何物質(zhì)。植物萃取物是指從植物中萃取的任何物質(zhì)。例如，可以使用從植物葉、莖、根、花、果實(shí)等中獲得的任何含疏水基的水溶性有機(jī)化合物。植物材料的例子包括大豆、加工的大豆制品、海參、五倍子、黃芩(ScutellariaRadix)、蘆薈、地黃(Rehmannia Radix)、人參(Panax ginseng)、芍藥(Paeoniae Radix)、梔子、甘草(Glycyrrhizae Radix)、柴胡(Bupleuri Radix)、大黃(Rhei rhizome)、蕺菜、越橘(Vacciniumvitis-idaea)、茶、Sweet tea(中國黑莓茶；Rubus suanissm S.Lee)和柑桔(例如橘子的果實(shí))?？梢允褂么嬖谟趧?dòng)物體中的任何含疏水基的水溶性有機(jī)化合物。
(2)糖本文所用的糖是指滿足通式Cn(H2O)m的化合物。糖根據(jù)組分即糖單元的數(shù)目分為單糖、寡糖和多糖。在本發(fā)明中，優(yōu)選單糖和寡糖。在本發(fā)明中，優(yōu)選可溶于水的，或者如果不溶于水但具有保水能力的糖。
單糖的例子包括D-葡萄糖、半乳糖、果糖、阿糖、木糖和鼠李糖。優(yōu)選的單糖是D-葡萄糖。
本文所用的寡糖是指通過2-10個(gè)單糖進(jìn)行脫水縮合獲得的物質(zhì)。寡糖優(yōu)選具有2-9個(gè)糖單元，更優(yōu)選2-8個(gè)糖單元，甚至更優(yōu)選2-7個(gè)糖單元。寡糖的例子包括蔗糖、乳糖、麥芽糖寡糖(malto-oligosaccharides)、半乳糖寡糖(galacto-oligosaccharides)、乳糖寡糖(lacto-oligosaccharides)和果糖寡糖(fructo-oligosaccharides)。麥芽糖寡糖的例子包括麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、麥芽八糖、麥芽九糖和麥芽十糖。寡糖可以是直鏈寡糖或者支鏈寡糖。寡糖可以具有分子內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。
本文所用的多糖是指通過至少11個(gè)單糖進(jìn)行脫水縮合產(chǎn)生的物質(zhì)。多糖優(yōu)選具有至少一個(gè)α-1，4鍵。多糖的例子包括糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉、淀粉、右旋糖酐和纖維素。
糊精是指通過化學(xué)或者酶催法降低淀粉分子量而獲得的物質(zhì)。糊精的例子包括英國樹膠、黃糊精、白糊精、PINE-DEX(MatsutaniChemical Industry Co.，Ltd.)、SUNDECK(Sanwa Cornstarch Co.Ltd.)和Tetrup(Hayashibara Shoji，Inc.)直鏈淀粉是由通過α-1，4鍵連接的葡萄糖單元組成的直鏈分子。直鏈淀粉包含在天然淀粉中。
支鏈淀粉是由通過α-1，4鍵連接在一起的葡萄糖單元組成的支鏈分子，所述葡萄糖單元上還連接有通過α-1，6鍵連接的葡萄糖單元。支鏈淀粉包含在天然淀粉中。例如，可以使用由100％支鏈淀粉組成的蠟質(zhì)種玉米淀粉作為支鏈淀粉。
淀粉是直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物?？梢允褂猛ǔＪ惺鄣娜魏蔚矸圩鳛榈矸?。包含在淀粉中的直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例變化取決于制備該淀粉的植物的類型。包含在糯米、蠟質(zhì)種玉米等中的大多數(shù)淀粉是支鏈淀粉。淀粉可以分成天然淀粉、淀粉降解產(chǎn)物和加工的淀粉。
天然淀粉根據(jù)其原料來源又分成塊莖淀粉和谷物淀粉。塊莖淀粉的例子包括馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、葛藤淀粉、蕨菜淀粉等。谷物淀粉的例子包括玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉等。
加工的淀粉是天然淀粉經(jīng)過處理如水解、酯化作用、凝膠化作用等從而帶來一些使其更便于利用的性能而獲得的淀粉?？色@得具有各種綜合性能(例如凝膠化起始溫度、淀粉糊粘度、淀粉糊透明度、老化穩(wěn)定性等)的多種加工的淀粉。各種類型的加工的淀粉都存在。這種淀粉的一個(gè)例子是如下獲得的淀粉，即將淀粉顆粒在不超過該淀粉凝膠化溫度的溫度下浸在酸中，從而劈開淀粉分子而不切斷淀粉顆粒。
淀粉降解產(chǎn)物是使淀粉經(jīng)過處理如酶處理、水解等獲得的寡糖或者多糖，其具有比處理之前更低的分子量。淀粉降解產(chǎn)物的例子包括通過脫支酶降解的淀粉、磷酸化酶降解的淀粉和通過部分水解降解的淀粉。
脫支酶降解淀粉是通過使脫支酶作用于淀粉來獲得的。通過不同程度地改變脫支酶的作用時(shí)間，可以獲得支鏈部分(即α-1，6-葡糖苷鍵)被分裂成任何程度的脫支酶降解淀粉。脫支酶降解淀粉的例子包括具有4-10,000個(gè)帶有1-20個(gè)α-1，6-葡糖苷鍵的糖單元的降解產(chǎn)物、具有3-500個(gè)不帶有任何α-1，6-葡糖苷鍵的糖單元的降解產(chǎn)物、麥芽寡糖和直鏈淀粉。在通過脫支酶降解淀粉的情況下，所得降解產(chǎn)物的分子量分布隨被降解的淀粉類型而變化。脫支酶降解的淀粉可以是具有各種長(zhǎng)度的糖鏈的混合物。
通過水解部分降解的糊精和淀粉是指通過酸、堿、酶等的作用部分降解淀粉所獲得的降解產(chǎn)物。在本發(fā)明中，經(jīng)水解部分降解的糊精和淀粉所包含的糖單元數(shù)優(yōu)選是約10-100,000，更優(yōu)選約50-50,000，甚至更優(yōu)選約100-10,000。就水解部分降解的糊精和淀粉而言，所得降解產(chǎn)物的分子量分布隨被降解的淀粉類型而變化。水解部分降解的糊精和淀粉可以是具有各種長(zhǎng)度的糖鏈的混合物。
右旋糖苷是指α-1，6-葡聚糖。
纖維素是由通過β-1，4-葡糖苷鍵連接在一起的葡萄糖單元組成的直鏈分子。
糖可以是單一化合物或多種化合物的混合物。
糖可以原本就含在含有含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的水溶液中，或者可以被加到含有含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的水溶液中。糖優(yōu)選原本就含在含有含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的水溶液中。這種水溶液的例子包括上述的糖基化反應(yīng)溶液和果汁。
糖優(yōu)選是小分子的。當(dāng)溶液包含相對(duì)高分子量的多糖(糖基化反應(yīng)溶液就是如此)時(shí)，可以將裂解糖鏈的酶(如葡糖淀粉酶)加到待反應(yīng)的溶液中，由此將多糖降解為單糖或寡糖。優(yōu)選在將水溶液與有機(jī)溶劑接觸前將其中的多糖降解為單糖或寡糖。優(yōu)選所有糖均溶于水溶液中。然而，糖可以部分懸浮在水溶液中，只要糖不妨礙水溶液與有機(jī)溶劑的分離。
水溶液中的糖濃度可以是任何濃度。優(yōu)選水溶液中的糖濃度至少為12％，更優(yōu)選至少20％，更加優(yōu)選至少30％，更加優(yōu)選至少40％，最優(yōu)選至少50％。只要糖和含疏水基的水溶性有機(jī)化合物不沉淀，糖濃度的上限可以是任何濃度。例如，上限為不超過90％，不超過80％，不超過70％，不超過60％，或不超過55％。
水溶液的糖濃度可以通過本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定。例如，一種簡(jiǎn)單方法是使用白利糖度(Brix scale)的測(cè)量方法。使用白利糖度的測(cè)量方法簡(jiǎn)單，但不能分別測(cè)定每一種糖。例如，為了分別測(cè)定每一種糖，可以使用柱LiChrosorb NH2(Merck制造；4.0×250毫米)并且使用25∶75(v/v)的水和乙腈的混合物作為流動(dòng)相，對(duì)含糖的水溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，并且可以使用RI檢測(cè)器測(cè)定洗脫物。
水溶液的pH值優(yōu)選為2-11，更優(yōu)選為3-9，甚至更優(yōu)選4-8。
(3)極性有機(jī)溶劑本文所用的“極性有機(jī)溶劑”是指對(duì)氧化鋁的溶劑強(qiáng)度(ε°)至少為0.4并可與蒸餾水混溶的有機(jī)溶劑。極性有機(jī)溶劑的溶劑強(qiáng)度優(yōu)選為0.42-0.98，更優(yōu)選0.44-0.95，最優(yōu)選0.44-0.90。極性有機(jī)溶劑可以是在20℃下的介電常數(shù)至少為7.0的有機(jī)溶劑。優(yōu)選極性有機(jī)溶劑在20℃下的介電常數(shù)為7.3-40.0，更優(yōu)選7.4-39.0，最優(yōu)選7.5-38.0。
對(duì)氧化鋁的溶劑強(qiáng)度的例子列在表1中。介電常數(shù)的例子列在表2中。用于本發(fā)明的極性有機(jī)溶劑的例子包括列在下表1和2中的極性有機(jī)溶劑，其溶劑強(qiáng)度或介電常數(shù)在上述范圍內(nèi)。
表1

表2溶劑 e異辛烷 1.94正己烷 1.88正庚烷 1.92二乙醚 4.33環(huán)己烷 2.02乙酸乙酯 6.02甲苯 2.38氯仿 4.81四氫呋喃 7.58苯 2.27丙酮 20.7二氯甲烷 8.93二噁烷 2.25丙醇 20.33乙醇 25.8二甲基甲酰胺 36.7乙腈 37.5乙酸 6.3二甲亞砜 4.7甲醇 32.7水 81.1e介電常數(shù)極性有機(jī)溶劑優(yōu)選為四氫呋喃、異丙醇、乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、丙醇、吡啶或二甲氧基亞砜，更優(yōu)選是四氫呋喃、異丙醇、乙腈或丙酮，最優(yōu)選是四氫呋喃或乙腈。當(dāng)水溶液還包含相分離助劑時(shí)，極性有機(jī)溶劑優(yōu)選是四氫呋喃、乙腈、丙酮或異丙醇，更優(yōu)選為丙酮或異丙醇。
極性有機(jī)溶劑優(yōu)選是單一化合物。然而，也可以使用至少兩種極性有機(jī)溶劑的混合物，只要有機(jī)相不分成兩相。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要來選擇適用于從水溶液中萃取含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的極性有機(jī)溶劑。
與水溶液接觸的極性有機(jī)溶劑的量典型地為水溶液體積的0.1-10倍，更優(yōu)選0.2-2倍。
(4)相分離助劑水溶液可以包含相分離助劑。本文所用的“相分離助劑”是指有助于水溶液和極性有機(jī)溶劑的混合物分離成水相和有機(jī)相的物質(zhì)。注意，糖和含疏水基的水溶性有機(jī)化合物不是相分離助劑，即使它們具有促進(jìn)相分離的作用。相分離助劑可以是具有鹽析效應(yīng)的鹽和能增強(qiáng)離子強(qiáng)度的水溶性物質(zhì)。相分離助劑可以是鹽或有機(jī)酸。相分離助劑的例子包括但是不局限于，硫酸鹽(如硫酸銨和硫酸鎂)、鈉鹽(例如氯化鈉和和亞硫酸鈉)、磷酸鹽(例如磷酸鉀、磷酸鈉、磷酸鎂和磷酸銨)、乙酸鹽(例如乙酸鈉和乙酸鉀)、乳酸鹽(例如乳酸鈉和乳酸鎂)、有機(jī)酸(例如檸檬酸、檸檬酸鈉、抗壞血酸、抗壞血酸鈉和蘋果酸)和氯化銨。相分離助劑優(yōu)選是鹽，更優(yōu)選選自氯化鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂和硫酸銨。
相分離助劑可以包含在水溶液中，其數(shù)量足以促進(jìn)相分離。這種數(shù)量為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。水溶液中包含的相分離助劑的濃度優(yōu)選為至少5％，更優(yōu)選10％，更加優(yōu)選至少15％，最優(yōu)選至少20％。盡管優(yōu)選不超過50％并且更優(yōu)選不超過40％，但是相分離助劑的量沒有特定的上限。
優(yōu)選相分離助劑預(yù)先包含在水溶液中。然而，可以在水溶液和極性有機(jī)溶劑相互接觸的同時(shí)加入相分離助劑。
(制備包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的水溶液)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的水溶液。這種水溶液可以是在進(jìn)行了酶反應(yīng)后不經(jīng)任何處理的酶反應(yīng)溶液，或是在進(jìn)行了酶反應(yīng)后經(jīng)過濃縮、稀釋、過濾或pH調(diào)節(jié)的酶反應(yīng)溶液。具體地說，當(dāng)酶反應(yīng)溶液的粘度太高而不能攪拌時(shí)，優(yōu)選稀釋該酶反應(yīng)溶液?；蛘?，可以通過將相分離助劑加入包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的酶反應(yīng)溶液或其濃縮液中來制備水溶液。
水溶液也可以是選自動(dòng)物或植物的有機(jī)體的萃取物，其包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法萃取含有含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的動(dòng)物材料或植物材料來制備這種萃取物。示范性的萃取法包括將包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的動(dòng)物材料或植物材料加入萃取溶劑，如水(例如溫度超過0℃并低于40℃的水)、溫水(例如溫度不低于40℃并低于60℃的水)、熱水(例如溫度不低于60℃并低于100℃的水)、醇、吡啶、乙酸乙酯或其混合物；使含疏水基的水溶性有機(jī)化合物從動(dòng)物材料或植物材料中轉(zhuǎn)移到萃取溶劑中；從萃取溶劑中除去動(dòng)物材料和植物材料，獲得萃取溶液；并且根據(jù)需要濃縮或干燥萃取溶液。優(yōu)選萃取物不包含有機(jī)溶劑。當(dāng)萃取溶劑是有機(jī)溶劑時(shí)，優(yōu)選通過濃縮萃取溶液來除去有機(jī)溶劑。萃取物可以是液體或固體。通過壓榨動(dòng)物材料或植物材料所獲得的汁液在這里也包括在萃取物的定義范圍內(nèi)。優(yōu)選水溶液是果汁。動(dòng)物材料可以是整個(gè)動(dòng)物或動(dòng)物的任何器官或組織。植物材料可以是整個(gè)植物或植物的任何器官(例如花、果實(shí)、種子、根、莖和葉)或組織。待萃取的動(dòng)物材料和植物材料可以是未處理的或干燥過的。如果萃取物是水溶液，則可以將該萃取物直接用于本發(fā)明。可以通過濃縮、稀釋等從萃取物制備水溶液。具體地說，當(dāng)萃取物的粘度太高而不能攪拌時(shí)，優(yōu)選稀釋該萃取物。注意，只要所研究的含疏水基的水溶性有機(jī)化合物溶于用于本發(fā)明方法的水溶液中，就可以將任何其它的成分懸浮在其中?；蛘撸梢酝ㄟ^將相分離助劑加入包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的動(dòng)物萃取物、包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的植物萃取物或這些萃取物的濃縮液或稀釋液中來制備水溶液。例如，可以通過將相分離助劑加入果汁或其濃縮液中來制備水溶液。
優(yōu)選將選自水楊苷、松柏苷、熊果苷、番瀉葉苷、甜菊苷、rubsoside、蕓香苷、橙皮苷、柚皮苷、黃豆苷、染料木苷、barbaroin、香草醛、皂草苷、黃連素、堪非醇、黃芩苷、茵陳素、兒茶素、延胡索堿、七葉苷原、表兒茶精、姜辣素和甘草甜素的有效成分溶于萃取物溶液。
(含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的萃取)在本發(fā)明方法中，包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的水溶液與極性有機(jī)溶劑接觸，獲得水相和有機(jī)相，由此將含疏水基的水溶性有機(jī)化合物轉(zhuǎn)入有機(jī)相中。
可通過，例如混合水溶液和極性有機(jī)溶劑來使該水溶液和極性有機(jī)溶劑相互接觸。使水溶液和極性有機(jī)溶劑相互接觸也稱為萃取。水溶液和極性有機(jī)溶劑相互接觸時(shí)的溫度優(yōu)選為10-50℃，更優(yōu)選25-45℃，更加優(yōu)選20-40℃，最優(yōu)選25-35℃。
混合并攪拌水溶液和極性有機(jī)溶劑，隨后使其靜置，從而分離為水相和有機(jī)相。通常，水相和有機(jī)相形成各自的層，即水層和有機(jī)層。通常溶劑層具有更大的比重，所以是下層。在使用比重比水小的有機(jī)溶劑時(shí)，則一般水層是下層，而上層是有機(jī)層。
一般，水相包含少量極性有機(jī)溶劑，而有機(jī)相包含少量水。例如，將丙酮加入包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物(例如橙皮苷和蕓香苷)的水溶液或懸浮液，再攪拌，然后靜置。當(dāng)它們分成水相和有機(jī)相(丙酮相)時(shí)，就有少量水溶于丙酮相中。因此，與有機(jī)相中不含水的情況相比，含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的溶解度增加，使得該含疏水基的水溶性有機(jī)化合物有效地溶于丙酮中。
當(dāng)混合水溶液和極性有機(jī)溶劑使其相互接觸時(shí)，優(yōu)選攪拌混合物。攪拌方法的例子包括但是不局限于旋轉(zhuǎn)、搖動(dòng)以及同時(shí)旋轉(zhuǎn)并搖動(dòng)。為了有效地萃取和提純含疏水基的水溶性有機(jī)化合物，可以使用多級(jí)逆流分配設(shè)備(也稱為連續(xù)液-液萃取設(shè)備)。
(苯酚衍生物苷的提純)本發(fā)明方法特別適用于提純苯酚衍生物苷。苯酚衍生物苷的提純將作為實(shí)施例更詳細(xì)地進(jìn)行描述。
例如，可以通過在酶存在下使糖(例如麥芽寡糖或淀粉)與苯酚衍生物起反應(yīng)而形成苯酚衍生物苷。一般，該反應(yīng)在某一程度下到達(dá)平衡，不會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行。因此，在這一酶反應(yīng)溶液中存在苯酚衍生物、苯酚衍生物苷和糖。當(dāng)酶反應(yīng)溶液包含多糖或寡糖時(shí)，可以將糖解酶(如葡糖淀粉酶)加到該酶反應(yīng)溶液中，隨后進(jìn)行培養(yǎng)，以便將酶反應(yīng)溶液中的多糖或寡糖降解為單糖。多糖或寡糖降解為單糖增加了糖的摩爾值(即摩爾濃度)而沒有改變其總重，從而促進(jìn)了水相和有機(jī)相的分離。在將酶反應(yīng)溶液和極性有機(jī)溶劑相互接觸來獲得第一水相和包含少量水的有機(jī)相時(shí)，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷轉(zhuǎn)入有機(jī)相中。如上所述，為了促進(jìn)相分離，可以將相分離助劑加到水相中以獲得包含相分離助劑的水溶液，然后再將水溶液與極性有機(jī)溶劑接觸。
此后回收包含少量水的有機(jī)相。苯酚衍生物和苯酚衍生物苷包含疏水性部分，使其對(duì)于有機(jī)相具有比糖更高的親合力。因此，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷有效地轉(zhuǎn)入有機(jī)相中，而糖較少地轉(zhuǎn)入有機(jī)相中。因此，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷被萃取到回收的有機(jī)相中。通常，假定將相同總量的極性有機(jī)溶劑用于分配萃取，如果將極性有機(jī)溶劑分成若干等份并將這些等份用來從水溶液中多次進(jìn)行萃取，則萃取效率大于將總量的極性有機(jī)溶劑一次性與水溶液相接觸來進(jìn)行萃取時(shí)的萃取效率。因此，將如下步驟進(jìn)行兩次或多次使回收有機(jī)相后殘余的水相與極性有機(jī)溶劑相接觸，以便再次獲得水相和包含少量水的有機(jī)相，并且回收有機(jī)相。有機(jī)相的回收操作進(jìn)行至少兩次，獲得的有機(jī)相可以合并在一起并用于隨后的步驟。
此后從包含少量水的有機(jī)相中除去極性有機(jī)溶劑。從有機(jī)相中除去極性有機(jī)溶劑的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法。這種方法的例子包括使用蒸發(fā)器來進(jìn)行濃縮。可以完全除去極性有機(jī)溶劑，或保留少量極性有機(jī)溶劑，只要它不妨礙隨后的步驟就可以。除去極性有機(jī)溶劑后，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷留在含于極性有機(jī)溶劑中的少量水中。在這個(gè)去除步驟中，優(yōu)選避免許多水被除去。在這個(gè)去除步驟中，優(yōu)選苯酚衍生物和苯酚衍生物苷不發(fā)生沉淀。如果苯酚衍生物和苯酚衍生物苷沉淀，則優(yōu)選通過添加水來溶解苯酚衍生物和苯酚衍生物苷。因而獲得包含苯酚衍生物和苯酚衍生物苷的第二水溶液。
此后使第二水溶液與乙酸乙酯接觸來獲得第二水相和乙酸乙酯相，以便使苯酚衍生物轉(zhuǎn)入乙酸乙酯相中。
然后回收第二水相。因?yàn)楸椒友苌锊话詹糠郑员椒友苌飳?duì)于乙酸乙酯相具有比苯酚衍生物苷更高的親合力。因此，苯酚衍生物有效地轉(zhuǎn)入乙酸乙酯相中，而苯酚衍生物苷較少地轉(zhuǎn)入乙酸乙酯相中。因此，苯酚衍生物苷留在回收的水相中。當(dāng)少量糖留在第二溶液中時(shí)，糖將留在水相中。和使水溶液與極性有機(jī)溶劑接觸的步驟以及回收有機(jī)相的步驟一樣，可以將以下步驟進(jìn)行至少兩次使除去乙酸乙酯相后殘余的水相與乙酸乙酯接觸，以便再次獲得水相和乙酸乙酯相，并回收第二水相。
注意，盡管在本文所描述的方法中，使有機(jī)相與乙酸乙酯接觸的步驟在使水溶液與極性有機(jī)溶劑接觸的步驟以及回收有機(jī)相的步驟之后進(jìn)行，但是也可以在使水相與極性有機(jī)溶劑接觸前使水溶液與乙酸乙酯接觸并回收水相。
然后將第二水相濃縮并冷卻，以便沉淀苯酚衍生物苷。優(yōu)選將第二水相濃縮以使得苯酚衍生物苷在第二水相中的濃度達(dá)到至少10％，優(yōu)選至少15％，更優(yōu)選至少20％，最優(yōu)選至少25％。這利用苯酚衍生物苷在水中的飽和濃度比糖在水中的飽和濃度更低來進(jìn)行。例如，假定糖是葡萄糖而苯酚衍生物苷是氫醌苷，就利用了葡萄糖在水中的飽和濃度為約18％而氫醌苷在水中的飽和濃度為約10％。
(實(shí)施例)接下來，通過實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。
(實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1糖對(duì)相分離的影響)將葡萄糖、蔗糖和果糖用作各種糖的代表來研究其對(duì)水溶液和極性有機(jī)溶劑的相分離的影響。
具體地說，將葡萄糖、蔗糖或果糖溶于水中，制備10％、15％、20％、25％、30％和50％的水溶液。將10ml乙腈或四氫呋喃加入10ml的各種糖的水溶液中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。乙腈和四氫呋喃都是可與水混溶的極性有機(jī)溶劑，當(dāng)它們與水混合時(shí)，混合物不分離為水相和有機(jī)相。振搖后，將混合物靜置30分鐘，觀察混合物是否分成兩相，即水相和有機(jī)相。向各水溶液中加入四氫呋喃或乙腈的結(jié)果列在表3-5中。在表中，THF代表四氫呋喃，AcCN代表乙腈。
表3葡萄糖

是分離 否不分離表4蔗糖

是分離否不分離表5果糖

是分離 否不分離如表3-5所示，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈或四氫呋喃與糖的水溶液混合時(shí)，存在一定量的糖時(shí)就會(huì)發(fā)生相分離。
根據(jù)結(jié)果人們發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)含于水溶液中的糖的類型和濃度可能促進(jìn)相分離，例如優(yōu)選調(diào)節(jié)糖濃度為至少約12％。
(實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2鹽對(duì)相分離的影響)接下來研究鹽對(duì)相分離的影響。
具體地說，將氯化鈉分別加入葡萄糖濃度為25％或50％以及20％或10％的葡萄糖水溶液中，制備含氯化鈉的葡萄糖水溶液。將10ml丙酮或異丙醇(其是極性有機(jī)溶劑)加入10ml的各種水溶液中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。振搖后，將混合物靜置30分鐘，觀察混合物是否分成兩相。結(jié)果列在表6中。
表6

是分離 否不分離將檸檬酸鈉加入糊精濃度為25％的水溶液中，加入糊精濃度為20％的水溶液中，制備含檸檬酸鈉的糊精水溶液。注意，糊精是MatsutaniChemical Industry Co.，Ltd.制造的PINE-DEX #1，其DE為7-9。本文所用的“DE”是顯示淀粉降解度的指數(shù)，其是糖變?yōu)槠咸烟呛蠛塘繙p少的百分?jǐn)?shù)。將硫酸鎂加入葡萄糖濃度為25％的水溶液中，加入葡萄糖濃度為10％的水溶液中，制備含硫酸鎂的葡萄糖水溶液。將10ml丙酮(其是極性有機(jī)溶劑)加入10ml的各種水溶液中，隨后用分離劑強(qiáng)烈攪拌5分鐘。
攪拌后，將混合物靜置30分鐘，觀察混合物是否分成兩相。結(jié)果列在表7中。
表7

是分離 否不分離如表6和7所示，將含氯化鈉的葡萄糖水溶液、含檸檬酸鈉的糊精水溶液和含硫酸鎂的葡萄糖水溶液分別與丙酮或異丙醇混合時(shí)發(fā)生相分離。加入鹽如氯化鈉、檸檬酸鈉或硫酸鎂可以導(dǎo)致極性有機(jī)溶劑發(fā)生相分離，而在50％的糖的水溶液的情況下其卻不發(fā)生相分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽如氯化鈉可用作相分離助劑。人們相信，鹽通過提高溶解有該鹽的水溶液的離子強(qiáng)度而起到相分離助劑的作用。因此，任何能夠提高離子強(qiáng)度的物質(zhì)都被認(rèn)為能夠用作相分離助劑。
(實(shí)施例1萃取兒茶素)(實(shí)施例1a)將1g兒茶素混合物(SUNPHENON；Taiyo Kagaku Co.，Ltd.制造)溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml四氫呋喃加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障旅娴南?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的兒茶素的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，兒茶素起始量的94.1％被萃取進(jìn)入四氫呋喃相中。
(實(shí)施例1b)除使用10ml乙腈來代替10ml四氫呋喃外，進(jìn)行同實(shí)施例1a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，兒茶素起始量的84.4％被萃取進(jìn)入乙腈相中。
(實(shí)施例2萃取兒茶素)(實(shí)施例2a)將1g兒茶素混合物(SUNPHENONTaiyo Kagaku制造)溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化鈉的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml丙酮加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的兒茶素的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，兒茶素起始量的91.8％被萃取進(jìn)入丙酮相中。
(實(shí)施例2b)除使用10ml異丙醇來代替10ml丙酮外，進(jìn)行同實(shí)施例2a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，兒茶素起始量的93.2％被萃取進(jìn)入異丙醇相中。
(實(shí)施例3萃取橙皮苷基糖苷)(實(shí)施例3a)將1g橙皮苷基糖苷(Toyo Sugar Refining Co.，Ltd.制造)溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml四氫呋喃加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的橙皮苷基糖苷的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，橙皮苷基糖苷起始量的50.0％被萃取進(jìn)入四氫呋喃相中。另外，通過在四氫呋喃萃取后向回收的水相中加入5ml四氫呋喃再進(jìn)行兩次類似的操作和測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萃取了總共80.0％的橙皮苷基糖苷。
(實(shí)施例3b)除使用10ml乙腈來代替10ml四氫呋喃外，進(jìn)行同實(shí)施例3a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，橙皮苷基糖苷起始量的27.6％被萃取進(jìn)入乙腈相中。
(實(shí)施例4萃取橙皮苷基糖苷)(實(shí)施例4a)將1g橙皮苷基糖苷(Toyo Sugar Refining Co.，Ltd.)溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化鈉的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml丙酮加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的橙皮苷基糖苷的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，橙皮苷基糖苷起始量的43.5％被萃取進(jìn)入丙酮相中。另外，通過在丙酮提取后向回收的水相中加入5ml丙酮再進(jìn)行兩次類似的操作和測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萃取了總共90.0％的橙皮苷基糖苷。
(實(shí)施例4b)除使用10ml異丙醇來代替10ml丙酮外，進(jìn)行同實(shí)施例4a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，橙皮苷基糖苷起始量的32.0％被萃取進(jìn)入異丙醇相中。
(實(shí)施例5萃取水楊苷)(實(shí)施例5a)將1g水楊苷溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml四氫呋喃加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相。回收下層相(水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的水楊苷的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，水楊苷起始量的96.5％被萃取進(jìn)入四氫呋喃相中。
(實(shí)施例5b)除使用10ml乙腈來代替10ml四氫呋喃外，進(jìn)行同實(shí)施例5a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，水楊苷起始量的98.1％被萃取進(jìn)入乙腈相中。
(實(shí)施例6萃取水楊苷)(實(shí)施例6a)將1g水楊苷溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化鈉的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml丙酮加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的水楊苷的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，水楊苷起始量的58.0％被萃取進(jìn)入丙酮相中。
(實(shí)施例6b)除使用10ml異丙醇來代替10ml丙酮外，進(jìn)行同實(shí)施例6a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，水楊苷起始量的97.0％被萃取進(jìn)入異丙醇相中。
(實(shí)施例7萃取咖啡酸)(實(shí)施例7a)將1g咖啡酸溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml四氫呋喃加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的咖啡酸的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，咖啡酸起始量的88.6％被萃取進(jìn)入四氫呋喃相中。
(實(shí)施例7b)除使用10ml乙腈來代替10ml四氫呋喃外，進(jìn)行同實(shí)施例7a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，咖啡酸起始量的76.2％被萃取進(jìn)入乙腈相中。
(實(shí)施例8萃取咖啡酸)(實(shí)施例8a)將1g咖啡酸溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化鈉的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml丙酮加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振播5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的咖啡酸的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，咖啡酸起始量的78.2％被萃取進(jìn)入丙酮相中。
(實(shí)施例8b)除使用10ml異丙醇來代替10ml丙酮外，進(jìn)行同實(shí)施例8a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，咖啡酸起始量的87.2％被萃取進(jìn)入異丙醇相中。
(實(shí)施例9萃取水楊醇)(實(shí)施例9a)將1g水楊醇溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml四氫呋喃加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的水楊醇的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，水楊醇原料的98.7％被萃取進(jìn)入四氫呋喃相中。
(實(shí)施例9b)除使用10ml乙腈來代替10ml四氫呋喃外，進(jìn)行同實(shí)施例9a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，水楊醇起始量的98.2％被萃取進(jìn)入乙腈相中。
(實(shí)施例10萃取水楊醇)(實(shí)施例10a)將1g水楊醇溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化鈉的水溶液中，得到水溶液樣品。測(cè)定水溶液樣品在280nm處的吸光度。將10ml丙酮加入10ml的水溶液樣品中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的水楊醇的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，水楊醇起始量的87.7％被萃取進(jìn)入丙酮相中。
(實(shí)施例10b)除使用10ml異丙醇來代替10ml丙酮外，進(jìn)行同實(shí)施例10a的另外的萃取操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，水楊醇起始量的98.7％被萃取進(jìn)入異丙醇相中。
(實(shí)施例11萃取鞣花單寧及其聚合物)(實(shí)施例11a)用水將甜茶萃取物水溶液(SUNTENCHA；Suntory Ltd.制造)稀釋兩倍，獲得兩倍稀釋液。加入葡萄糖和氯化鈉，并溶于該兩倍稀釋液中，其濃度分別為10％和10％，得到水溶液。測(cè)定水溶液在280nm處的吸光度。將20ml丙酮加入20ml的水溶液中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥障聦酉?水相)，測(cè)定其體積和在280nm處的吸光度。由下層相在280nm處的吸光度減少和下層相的溶液體積計(jì)算出萃取進(jìn)入上層相(極性有機(jī)溶劑相)的有效成分(即鞣花單寧及其聚合物)的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單次萃取操作，43.1％的有效成分被萃取進(jìn)入丙酮相中。另外，丙酮相中的著色程度是水相的約1/3。因而發(fā)現(xiàn)，通過萃取操作，萃取了有效成分，并獲得了脫色作用效果。
(實(shí)施例12從果汁中萃取橙皮苷)將10ml的15％氯化鈉溶液加入10ml臍橙汁濃縮物(五倍濃縮物)中，攪拌均勻，由此得到水溶液。通過使用柱ODS進(jìn)行HPLC測(cè)定所用臍橙汁濃縮物中的橙皮苷量，其中流動(dòng)相為20∶80的乙腈和水的混合物，流速為0.5ml/min，柱溫為40℃。在280nm處檢測(cè)洗脫物的吸光度。檢測(cè)橙皮苷量的具體方法描述在日本公開專利8-80177中。將20ml丙酮加入20ml的所得水溶液中，隨后用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。此后將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相。回收上層相(極性有機(jī)溶劑相)，并測(cè)定其體積。如上所述使用HPLC測(cè)定橙皮苷的量。結(jié)果，通過單次萃取操作，75％的橙皮苷被萃取進(jìn)入丙酮相中。
(實(shí)施例13從糖基化反應(yīng)溶液中萃取橙皮苷)用鹽酸將溶解有5％可溶性淀粉(Merck制造)和0.5％橙皮苷的水溶液調(diào)節(jié)至pH9.0。將耐堿性的CGTase(描述在日本公開專利7-107972中)加入水溶液，至濃度為5單元/ml。其后在37℃下進(jìn)行16小時(shí)的酶反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后，收集一部分酶反應(yīng)溶液，通過HPLC分析法測(cè)定橙皮苷和橙皮苷基糖苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為20∶80的乙腈和水的混合物，流速為0.5ml/min，柱溫為40℃。在280nm處檢測(cè)洗脫物的吸光度。分析橙皮苷和橙皮苷基糖苷量的方法描述在日本公開專利8-80177中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于酶反應(yīng)，使得反應(yīng)開始時(shí)加入的橙皮苷的約80％轉(zhuǎn)變?yōu)槌绕ぼ栈擒铡?br> 其后，酶反應(yīng)后將葡萄糖和氯化鈉加入并溶于酶反應(yīng)溶液中，其濃度分別為20％和10％，得到包含葡萄糖和氯化鈉的酶反應(yīng)溶液。將等體積的丙酮加入該包含葡萄糖和氯化鈉的酶反應(yīng)溶液中，隨后使用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相。收集上層丙酮相并測(cè)定其體積，如上所述通過HPLC測(cè)定溶于丙酮相中的橙皮苷基糖苷的量。結(jié)果，酶反應(yīng)結(jié)束后存在于酶反應(yīng)溶液中的橙皮苷基糖苷的約45％被萃取進(jìn)入丙酮相。另外，將等于酶反應(yīng)溶液一半體積的丙酮加入下層水相，攪拌，靜置，然后回收上層相。再進(jìn)行三次同樣的萃取操作。結(jié)果能夠回收所有的橙皮苷基糖苷。
(實(shí)施例14從糖基化反應(yīng)溶液中萃取氫醌苷)用5N的氫氧化鈉水溶液將溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE為7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氫醌的水溶液調(diào)節(jié)為pH6.5。將糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公開專利6-277053中)加入該水溶液中，濃度為20單元/ml。其后，在45℃下培養(yǎng)40小時(shí)，發(fā)生氫醌糖基化反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后，收集一部分酶反應(yīng)溶液，通過HPLC分析法測(cè)定氫醌和氫醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速為0.5ml/min，柱溫為40℃。通過紫外分光光度法檢測(cè)洗脫物中氫醌和氫醌苷的量。使用酶反應(yīng)溶液，通過HPLC分析法測(cè)定產(chǎn)物麥芽寡糖的量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為25∶75的水和乙腈的混合物，流速為1.0ml/min，柱溫為40℃。通過RI檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物中的麥芽寡糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于酶反應(yīng)，使得約35％的氫醌轉(zhuǎn)變?yōu)闅漉?，并且使糊精降解為葡萄糖和麥芽寡糖。另外，在酶反?yīng)結(jié)束后將葡糖淀粉酶(NagaseChemtex制造；商品名為XL-4)加入酶反應(yīng)溶液中，濃度為8.8單元/ml，隨后在45℃下培養(yǎng)3小時(shí)，由此將酶反應(yīng)溶液中的寡糖降解為葡萄糖。
其后，在寡糖降解結(jié)束后將等體積的四氫呋喃加入酶反應(yīng)溶液中，隨后使用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥丈蠈铀臍溥秽?，并測(cè)定其體積。如上所述通過HPLC分析溶于四氫呋喃相中的氫醌苷的量。結(jié)果，酶反應(yīng)結(jié)束后存在于酶反應(yīng)溶液中的氫醌苷的約65％被萃取進(jìn)入四氫呋喃相。另外，將等于酶反應(yīng)溶液一半體積的四氫呋喃加入下層水相中，攪拌，靜置，然后回收上層相。再進(jìn)行三次萃取操作。結(jié)果能夠回收所有的氫醌苷。
(實(shí)施例15從糖基化反應(yīng)溶液中萃取氫醌苷)用5N的氫氧化鈉水溶液將溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE為7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氫醌的水溶液調(diào)節(jié)為pH6.5。將糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公開專利6-277053中)加入該水溶液中，濃度為20單元/ml。其后，在45℃下培養(yǎng)40小時(shí)，產(chǎn)生氫醌糖基化反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后，收集一部分酶反應(yīng)溶液，通過HPLC分析法測(cè)定氫醌和氫醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速為0.5ml/min，柱溫為40℃。通過紫外分光光度法檢測(cè)洗脫物中氫醌和氫醌苷的量。使用酶反應(yīng)溶液，通過HPLC分析法測(cè)定產(chǎn)物麥芽寡糖的量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為25∶75的水和乙腈的混合物，流速為1.0ml/min，柱溫為40℃。通過RI檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物中的麥芽寡糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于酶反應(yīng)，使得約35％的氫醌轉(zhuǎn)變?yōu)闅漉?，并且使糊精降解為葡萄糖和麥芽寡糖。另外，在酶反?yīng)結(jié)束后將葡糖淀粉酶(NagaseChemtex制造；商品名為XL-4)加入酶反應(yīng)溶液中，濃度為8.8單位/ml，隨后在45℃下培養(yǎng)3小時(shí)，由此將酶反應(yīng)溶液中的寡糖降解為葡萄糖。
其后，在寡糖降解后使用蒸發(fā)器將酶反應(yīng)溶液真空濃縮，濃縮系數(shù)為約1.4。將硫酸銨加入該濃縮物中，濃度為20％，得到包含硫酸銨的濃縮物。將等體積的丙酮加入該包含硫酸銨的濃縮物中，隨后使用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。將混合物靜置30分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥丈蠈颖?，并測(cè)定其體積。如上所述通過HPLC分析溶于丙酮相中的氫醌苷的量。結(jié)果，酶反應(yīng)結(jié)束后存在于酶反應(yīng)溶液中的氫醌苷的約60％被萃取進(jìn)入丙酮相。另外，將等于濃縮物0.8倍體積的丙酮加入下層水相中，攪拌，靜置，然后回收上層相。再進(jìn)行三次同樣的萃取操作。結(jié)果能夠回收所有的氫醌苷。
(實(shí)施例16從糖基化反應(yīng)溶液中萃取氫醌苷)用5N的氫氧化鈉水溶液將溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE為7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氫醌的水溶液調(diào)節(jié)為pH6.5。將糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公開專利6-277053中)加入該水溶液中，濃度為20單元/ml。其后，在45℃下培養(yǎng)40小時(shí)，發(fā)生氫醌糖基化反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后，收集一部分酶反應(yīng)溶液，通過HPLC分析法測(cè)定氫醌和氫醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速為0.5ml/min，柱溫為40℃。通過紫外分光光度法檢測(cè)洗脫物中氫醌和氫醌苷的量。使用酶反應(yīng)溶液，通過HPLC分析法測(cè)定產(chǎn)物麥芽寡糖的量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為25∶75的水和乙腈的混合物，流速為1.0ml/min，柱溫為40℃。通過RI檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物中的麥芽寡糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于醇反應(yīng)，使得約35％的氫醌轉(zhuǎn)變?yōu)闅漉?，并且使糊精降解為葡萄糖和麥芽寡糖。另外，在酶反?yīng)結(jié)束后將葡糖淀粉酶(NagaseChemtex制造；商品名為XL-4)加入酶反應(yīng)溶液中，濃度為8.8單元/ml，隨后在45℃下培養(yǎng)3小時(shí)，由此將酶反應(yīng)溶液中的寡糖降解為葡萄糖。
其后，在寡糖降解結(jié)束后將等體積的乙腈加入酶反應(yīng)溶液中，隨后使用分液漏斗強(qiáng)烈振搖5分鐘。將混合物靜置1小時(shí)。結(jié)果混合物分成兩相?；厥丈蠈右译嫦啵y(cè)定其量。如上所述通過HPLC分析溶于乙腈相中的氫醌苷的量。結(jié)果，酶反應(yīng)結(jié)束后存在于酶反應(yīng)溶液中的氫醌苷的約30％被萃取進(jìn)入乙腈相。另外，將與酶反應(yīng)溶液等體積的乙腈加入下層水相中，攪拌，靜置，然后回收上層相。再進(jìn)行五次同樣的萃取操作。結(jié)果，能夠回收酶反應(yīng)結(jié)束后存在于酶反應(yīng)溶液中約90％的氫醌苷。
(實(shí)施例17研究葡糖淀粉酶處理的條件)使用糊精或淀粉作為原料進(jìn)行糖基化酶反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后的酶反應(yīng)溶液中存在大量比原料分子量更低的葡萄糖和糊精。甚至總糖濃度相同時(shí)，摩爾值越高，則越少的糖轉(zhuǎn)入有機(jī)相。因此，為了將糖基化酶反應(yīng)結(jié)束后殘余的糊精有效地降解為葡萄糖，而研究了糊精降解反應(yīng)的條件。
用5N的氫氧化鈉水溶液將溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE為7-9Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氫醌的水溶液調(diào)節(jié)為pH6.5。將糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公開專利6-277053中)加入該水溶液中，濃度為20單元/ml。其后，在45℃下培養(yǎng)40小時(shí)，產(chǎn)生氫醌糖基化反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后將1.4μl(1倍量)、2.1μl(1.5倍量)或2.8μl(2倍量)的葡糖淀粉酶(Nagase Chemtex制造；商品名為XL-4)加入1ml的糖基化反應(yīng)溶液中。其后在45℃下將混合物培養(yǎng)3或4小時(shí)。培養(yǎng)后，通過HPLC分析法確定溶液中葡萄糖和麥芽糖的含量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為25∶75的水和乙腈的混合物，流速為1.0ml/min，柱溫為40℃。通過RI檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物中的葡萄糖和麥芽糖。通過HPLC分析法檢測(cè)洗脫物中氫醌和氫醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速為0.5ml/min，柱溫為40℃.通過紫外分光光度法檢測(cè)洗脫物中氫醌和氫醌苷的量?；谒脷漉蜌漉?HQG)的量計(jì)算氫醌糖基化率。結(jié)果列在下表8中。
表8

甚至使用1倍量的葡糖淀粉酶進(jìn)行糖降解3或4小時(shí)時(shí)，酶反應(yīng)溶液也具有與加入葡糖淀粉酶之前基本上相同的組成。因此說明，使用1倍的葡糖淀粉酶時(shí)，延長(zhǎng)反應(yīng)約一或二小時(shí)不可能顯著地減少麥芽糖的量。
另外，甚至增加葡糖淀粉酶的量也不會(huì)顯著改變糖基化率。這表明，葡糖淀粉酶能夠降解糊精，而不降解所希望的產(chǎn)物氫醌苷。因此發(fā)現(xiàn)，對(duì)于促進(jìn)糊精降解，增加葡糖淀粉酶的量比延長(zhǎng)降解反應(yīng)時(shí)間更有效。
接下來研究各種葡糖淀粉酶處理的不同對(duì)THF處理的影響。將1ml(XL-4)處理溶液和1ml THF混合在一起，隨后使用分液漏斗劇烈振蕩1分鐘。振蕩后將混合物靜置1小時(shí)。結(jié)果混合物分成兩相。回收水相。向水相中加入水至1ml。使用水相通過HPLC分析法測(cè)定葡萄糖和麥芽糖的量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為25∶75的水和乙腈的混合物，流速為1.0ml/min，柱溫為40℃。通過RI檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物中的葡萄糖和麥芽糖。通過HPLC分析法檢測(cè)洗脫物中氫醌和氫醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速為0.5ml/min，柱溫為40℃。通過紫外分光光度法測(cè)定洗脫物中氫醌和氫醌苷的量?；谒媒Y(jié)果和上述葡萄糖濃度，計(jì)算用THF萃取前的麥芽糖濃度和HQG濃度，以及進(jìn)入THF相的萃取率。結(jié)果列在下表9中。
表9

結(jié)果證實(shí)，通過葡糖淀粉酶處理增加葡萄糖濃度的同時(shí)，往往抑制了葡萄糖被萃取進(jìn)入THF相。
也證實(shí)了這樣的趨勢(shì)，即被加到樣品中的葡糖淀粉酶的量越多，則與THF一起振蕩并分離后回收的水相的體積就越小(轉(zhuǎn)入四氫呋喃相的水量就越小)。
(實(shí)施例18糖濃度對(duì)萃取進(jìn)入四氫呋喃相的影響)研究了水溶液中葡萄糖濃度對(duì)萃取進(jìn)入四氫呋喃(THF)相的影響。
首先，制備包含42％葡萄糖和9％氫醌苷的水溶液。順序地用水稀釋該水溶液來制備葡萄糖濃度為40％到20％的水溶液。當(dāng)然，稀釋該水溶液時(shí)，不僅稀釋了葡萄糖而且也稀釋了氫醌苷。將5ml的THF加入5ml的所制備的水溶液中，隨后在30℃使用混合器強(qiáng)烈攪拌5分鐘。攪拌后，將混合物在3000rpm下離心分離5分鐘?；厥丈蠈拥南?。在葡萄糖濃度降低時(shí)，四氫呋喃相的量減少了。當(dāng)葡萄糖濃度是20％時(shí)，通過單次萃取操作不發(fā)生相分離。再次將5ml的THF加入下層相中，然后類似地回收上層相。將由該水溶液得到的兩個(gè)上層相加在一起。通過HPLC分析法測(cè)定葡萄糖和麥芽糖的含量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為25∶75的水和乙腈的混合物，流速為1.0ml/min，柱溫為40℃。通過RI檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物中的葡萄糖和麥芽糖。通過HPLC分析法檢測(cè)洗脫物中氫醌和氫醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流動(dòng)相為80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速為0.5ml/min，柱溫為40℃。通過紫外分光光度法測(cè)定洗脫物中氫醌和氫醌苷的量。
結(jié)果顯示在圖1中。如圖1所示，氫醌苷的轉(zhuǎn)移速率并不是很依賴于葡萄糖的濃度。相反，隨葡萄糖濃度增加葡萄糖的轉(zhuǎn)移速率降低。因此發(fā)現(xiàn)，如果萃取中使用的水溶液的糖濃度增加，糖向極性有機(jī)溶劑相的轉(zhuǎn)移將小于含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的轉(zhuǎn)移，由此能夠得到高純度的含疏水基的水溶性有機(jī)化合物。
(實(shí)施例19糖基化反應(yīng)溶液濃度對(duì)氫醌苷萃取的影響)如上述實(shí)施例18所示，人們發(fā)現(xiàn)如果水溶液的糖濃度增加，糖向有機(jī)相的轉(zhuǎn)移受到抑制，從而使含疏水基的水溶性有機(jī)化合物有效地轉(zhuǎn)入有機(jī)相中。因此證實(shí)，無論是否濃縮包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的酶反應(yīng)溶液，都抑制了糖向有機(jī)相的轉(zhuǎn)移，使得含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的提取效率增加。
用5N的氫氧化鈉水溶液將溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE為7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氫醌的水溶液調(diào)節(jié)為pH6.5。將糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公開專利6-277053中)加入該水溶液中，濃度為20單元/ml。因此，在45℃下培養(yǎng)40小時(shí)，發(fā)生氫醌糖基化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將2.1μl(1.5倍量)的葡糖淀粉酶(Nagase Chemtex制造商品名為XL-4)加入每毫升的糖基化反應(yīng)溶液中。其后在45℃下進(jìn)行4小時(shí)葡糖淀粉酶處理，由此得到反應(yīng)溶液。
通過蒸發(fā)器將5ml反應(yīng)溶液凝縮為體積的80％(4.0ml)或70％(3.5ml)。將等體積THF加入未濃縮的反應(yīng)溶液、80％濃縮物或70％濃縮物中，隨后使用混合器強(qiáng)烈振蕩1分鐘。在30℃的條件下進(jìn)行萃取。將混合物靜置1小時(shí)。該混合物分成兩相。回收上面的THF相。如上所述通過HPLC分析得到的THF相中葡萄糖、麥芽糖和氫醌苷的含量。將以下步驟再重復(fù)兩次再次將等于水相0.5倍量的THF加入下層水相中，振蕩，萃取，然后回收上層THF相。將得到的THF相合并在一起。注意，盡管在相分離的過程中在濃縮物中產(chǎn)生了中間層，但是該中間層被歸入水相中。結(jié)果列在下表10-12中。
表10未濃縮的淀粉酶處理反應(yīng)溶液(兩倍稀釋液的Brix濃度(Bx)＝24.5)

表1180％濃縮物(2倍稀釋物Bx＝29.5)(葡萄糖22.7％，麥芽糖1.3％，HQG13.5％)

表1270％濃縮物(2倍稀釋物Bx＝34.0)(葡萄糖25.8％，麥芽糖1.9％，HQG15.2％)

結(jié)果正如所預(yù)料的那樣，在濃縮了葡糖淀粉酶后處理反應(yīng)溶液后進(jìn)行THF萃取能夠抑制萃取進(jìn)入THF相的葡萄糖的量，使其為從未濃縮的溶液中萃取時(shí)的約50-60％。
(實(shí)施例20含疏水基的水溶性有機(jī)化合物對(duì)相分離的影響)如實(shí)施例17所述，使用THF萃取糖基化反應(yīng)溶液時(shí)，即使葡萄糖濃度不超過20％水相也能與有機(jī)相完全分離，并且THF相大于水相。另一方面，在上述實(shí)施例18中，用水將含有42％葡萄糖和9％氫醌苷的溶液(基本不含氫醌)稀釋至葡萄糖濃度為20％時(shí)，盡管加入了THF也不能使相分離。因此，要研究含疏水基的水溶性有機(jī)化合物對(duì)于相分離的影響。
將氫醌加入在上述實(shí)施例18中制備的含20％葡萄糖的稀釋物中，使?jié)舛葹?0％，由此得到水溶液。向該水溶液中加入等體積的THF，隨后使用混合器攪拌5分鐘。此后將該混合物靜置1小時(shí)。結(jié)果，THF相與水相完全分離。另外，水混合進(jìn)入THF相，導(dǎo)致THF相大于水相?；厥誘HF相。如上所述通過HPLC測(cè)定THF中的氫醌苷含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萃取出的氫醌苷的量多于不加入氫醌時(shí)的情況。據(jù)信原因是通過向水相中加入能很好溶于THF相的物質(zhì)如氫醌，就不容易使THF轉(zhuǎn)入水相，以致分離更有效，并且高濃度的氫醌溶于THF使得氫醌促進(jìn)苷的轉(zhuǎn)移。
(實(shí)施例21溫度對(duì)于萃取進(jìn)入四氫呋喃相的影響)研究溫度對(duì)于萃取進(jìn)入四氫呋喃相的影響。
先用5N的氫氧化鈉水溶液將溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE為7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氫醌的水溶液調(diào)節(jié)為pH6.5。將糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公開專利6-277053中)加入該水溶液中，濃度為20單元/ml。其后，在45℃下培養(yǎng)40小時(shí)，發(fā)生氫醌糖基化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將2.1μl(1.5倍量)的葡糖淀粉酶(Nagase Chemtex制造商品名為XL-4)加入每個(gè)1毫升的糖基化反應(yīng)溶液中。其后在45℃下將該混合物培養(yǎng)4小時(shí)，由此得到葡糖淀粉酶后處理反應(yīng)溶液。
將5ml的THF加入5ml葡糖淀粉酶后處理反應(yīng)溶液中，隨后使用混合器在3、10、22或45℃下攪拌5分鐘。其后以3000rpm的轉(zhuǎn)速將該混合物離心分離5分鐘。結(jié)果混合物分成兩相?；厥账?。向該水相中加入水至體積為5ml，得到水溶液。調(diào)整后如上所述通過HPLC測(cè)定該水溶液的氫醌、氫醌苷和葡萄糖濃度。
結(jié)果列在表13中。
表13水溶液的氫醌、氫醌苷和葡萄糖濃度

單位％基于表13的結(jié)果計(jì)算氫醌苷和葡萄糖的轉(zhuǎn)移率。
圖2顯示了轉(zhuǎn)移率圖。
從表13和圖2可以看出，當(dāng)萃取溫度低時(shí)，大量糖轉(zhuǎn)入THF相中。當(dāng)溫度增加時(shí)，氫醌、氫醌苷和葡萄糖向THF相的轉(zhuǎn)移率降低。其原因被認(rèn)為是由于HQG和葡萄糖在水相中的溶解度隨溫度升高而增加，使得向THF相的轉(zhuǎn)移降低。另外，溫度越高，氫醌苷和葡萄糖轉(zhuǎn)移率之間的差值就越大。
因此發(fā)現(xiàn)，通過在盡可能高的溫度下進(jìn)行萃取能夠更大地提高氫醌苷的純度。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明提供了一種萃取含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的方法。本發(fā)明的萃取方法和提純方法能被用作從各種動(dòng)植物中萃取和提純有效成分的技術(shù)，或用作從各種酶反應(yīng)溶液中萃取和提純有效成分的技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的方法能夠很容易地并廉價(jià)地分離和提純含疏水基的水溶性有機(jī)化合物。
權(quán)利要求
1.一種萃取含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的方法，其包括以下步驟使包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的水溶液與極性有機(jī)溶劑相接觸，得到水相和有機(jī)相，由此使含疏水基的水溶性有機(jī)化合物轉(zhuǎn)入有機(jī)相。
2.權(quán)利要求1的方法，其中水溶液的糖濃度為每100ml水溶液至少12g糖。
3.權(quán)利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有機(jī)化合物是水溶性芳族化合物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有機(jī)化合物選自苯酚衍生物及其苷。
5.權(quán)利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有機(jī)化合物選自氫醌苷、兒茶素、水楊苷、橙皮苷、橙皮苷基糖苷、咖啡酸、水楊醇和鞣花單寧。
6.權(quán)利要求1的方法，其中水溶液還包含相分離助劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中相分離助劑是鹽或有機(jī)酸。
8.權(quán)利要求6的方法，其中相分離助劑選自氯化鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂和硫酸銨。
9.權(quán)利要求1的方法，其中極性有機(jī)溶劑是四氫呋喃或乙腈。
10.權(quán)利要求6的方法，其中極性有機(jī)溶劑是四氫呋喃、乙腈、丙酮或異丙醇。
11.權(quán)利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有機(jī)化合物源自酶反應(yīng)溶液。
12.權(quán)利要求11的方法，其中酶反應(yīng)溶液是糖基化反應(yīng)溶液。
13.權(quán)利要求12的方法，其中糖基化反應(yīng)溶液是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
14.權(quán)利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有機(jī)化合物源自于選自動(dòng)物或植物的有機(jī)體。
15.權(quán)利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有機(jī)化合物源自于果汁。
16.權(quán)利要求1的方法，其中水溶液通過濃縮包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的酶反應(yīng)溶液而制備。
17.權(quán)利要求16的方法，其中酶反應(yīng)溶液是糖基化反應(yīng)溶液。
18.權(quán)利要求17的方法，其中糖基化反應(yīng)溶液是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
19.權(quán)利要求1的方法，其中水溶液通過濃縮或稀釋有機(jī)體的萃取物來制備，其中該萃取物包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖，并且該有機(jī)體是動(dòng)物或植物。
20.權(quán)利要求1的方法，其中水溶液通過濃縮果汁而制備。
21.權(quán)利要求6的方法，其中水溶液通過將相分離助劑加入包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的酶反應(yīng)溶液或其濃縮液來制備。
22.權(quán)利要求21的方法，其中酶反應(yīng)溶液是糖基化反應(yīng)溶液。
23.權(quán)利要求22的方法，其中糖基化反應(yīng)溶液是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
24.權(quán)利要求6的方法，其中水溶液通過將相分離助劑加入有機(jī)體的萃取物、其濃縮物或其稀釋液中來制備，其中該萃取物包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖，并且該有機(jī)體是動(dòng)物或植物。
25.權(quán)利要求6的方法，其中水溶液通過將相分離助劑加入果汁或其濃縮液中來制備。
26.一種提純苯酚衍生物苷的方法，其包括以下步驟將包含苯酚衍生物、苯酚衍生物苷和糖的第一水溶液與極性有機(jī)溶劑相接觸，得到第一水相和包含少量水的有機(jī)相，由此使苯酚衍生物和苯酚衍生物苷轉(zhuǎn)入有機(jī)相；回收包含少量水的有機(jī)相；從包含少量水的有機(jī)相中除去極性有機(jī)溶劑，得到包含苯酚衍生物和苯酚衍生物苷的第二水溶液；使第二水溶液與乙酸乙酯接觸，獲得第二水相和乙酸乙酯相，由此使苯酚衍生物轉(zhuǎn)入乙酸乙酯相中；回收第二水相；和將第二水相濃縮并冷卻，以便沉淀苯酚衍生物苷。
27.權(quán)利要求26的方法，其中苯酚衍生物和苯酚衍生物苷源自苯酚衍生物糖基化反應(yīng)溶液。
28.權(quán)利要求27的方法，其中糖基化反應(yīng)溶液是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
29.權(quán)利要求26的方法，其中第一水溶液還包含相分離助劑。
30.權(quán)利要求29的方法，其中糖基化反應(yīng)溶液是橙皮苷或氫醌的糖基化反應(yīng)溶液。
全文摘要
一種萃取含疏水基的水溶性有機(jī)化合物的方法，包括以下步驟使包含含疏水基的水溶性有機(jī)化合物和糖的水溶液與極性有機(jī)溶劑接觸，獲得水相與有機(jī)相，由此使含疏水基的水溶性有機(jī)化合物轉(zhuǎn)入有機(jī)相中。水溶液的糖濃度可以是每100ml水溶液至少12g糖。該水溶液還可以包含相分離助劑。相分離助劑選自氯化鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂和硫酸銨。
文檔編號(hào)C07H17/00GK1589246SQ0282300
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2002年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月20日
發(fā)明者栗木隆, 西村隆久, 杉本和久 申請(qǐng)人:江崎格力高株式會(huì)社