一種從蜜蜂球囊菌中提取新沒藥烷倍半萜的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從蜜蜂球囊菌中提取新沒藥烷倍半萜的方法，包括：1)活化菌株；2)初級(jí)培養(yǎng)；3)次級(jí)培養(yǎng)；4)減壓抽濾得到菌液，菌液乙酸乙酯萃??；5)旋蒸濃縮；6)多次進(jìn)行200~300目硅膠柱層析，經(jīng)EI-MS、NMR、HMBC、NOESY譜圖分析證明新沒藥烷倍半萜Ⅰ首次在該菌種代謝物中提取到。
【專利說明】一種從蜜蜂球囊菌中提取新沒藥烷倍半萜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從蜜蜂球囊菌中提取新沒藥烷倍半萜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜜蜂球囊菌iAscosphaera apis)是以異宗配合的真菌。由于它能引起蜜蜂白堊病的發(fā)生，并且在蜜蜂幼蟲時(shí)期發(fā)生率極高，導(dǎo)致蜜蜂幼蟲極高的死亡率，這使得它的次生代謝產(chǎn)物在養(yǎng)蜂行業(yè)成為潛在的應(yīng)用。隨著研究的深入，近年來人們發(fā)現(xiàn)蜜蜂球囊菌的代謝產(chǎn)物具有抗氧化、抗菌等生物活性，這預(yù)示該菌在養(yǎng)蜂行業(yè)或醫(yī)藥上存在很大應(yīng)用價(jià)值。
[0003]蜜蜂球囊菌的代謝產(chǎn)物中含有亞麻油酸、萜類化合物、等多種具有抗炎、抗菌等活性物質(zhì)，因此，充分開發(fā)利用蜜蜂球囊菌，將有利于蜜蜂行業(yè)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種從蜜蜂球囊菌中提取新沒藥烷倍半萜的方法，以促進(jìn)其在養(yǎng)蜂行業(yè)藥理學(xué)的研究和作為先導(dǎo)化合物的開發(fā)和應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
本發(fā)明所用的蜜蜂球囊菌為蜜蜂球囊菌(梁勤，陳大福，王建鼎.營養(yǎng)生態(tài)條件對(duì)蜜蜂球囊菌生長及產(chǎn)孢的影響.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，9(4): 31-34)；
從蜜蜂球囊菌中提取新沒藥烷倍半萜I的方法包括以下步驟:
1)將蜜蜂球囊菌活化后，取菌塊接種PDB培養(yǎng)基中，在140 r/min、25°C條件下培養(yǎng)4天，按10%接種量再次轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，在160 r/min、25°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天。
[0006]2)抽濾得到菌液，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液旋蒸得菌絲體浸膏。
[0007]3)將菌液浸膏上200-300目硅膠柱，進(jìn)行粗分。先用石油醚洗脫，之后換石油醚:二氯甲烷體積比=8:1和石油醚:二氯甲烷體積比=5:1洗脫，TLC點(diǎn)板后將石油醚:二氯甲烷體積比=8:1和石油醚:二氯甲烷體積比=5:1合并收集該部位洗脫液，旋蒸濃縮；
4)將步驟3)中得到的濃縮物繼續(xù)上200-300目硅膠柱，以石油醚:丙酮體積比=30:1梯度洗脫，收集石油醚:丙酮體積比=10:1部位洗脫液，旋蒸濃縮。
[0008]5)將步驟4)中得到的濃縮物進(jìn)一步上200-300目硅膠柱，先以石油醚洗脫，之后換石油醚:丙酮體積比=8:1梯度洗脫，最后以乙酸乙酯:丙酮體積比=5:1梯度洗脫，收集乙酸乙酯:丙酮體積比=3:1部位洗脫液，旋蒸濃縮，經(jīng)E1-MS、NMR、HMBC譜圖分析證明為新沒藥烷倍半萜I。
[0009]所述PDB培養(yǎng)基的制備為:馬鈴薯去皮，切塊，稱取200g，沸水煮30min，6層紗布過濾，稱取20g葡萄糖,加蒸懼水定容至1000 mL, pH自然。高壓滅菌121°C,20min。
[0010]所述步驟I)中接種囷塊的大小為0.5 X 0.5cm,接種量為4塊。最后囷液乙酸乙酷萃取，乙酸乙酯部分共得0.7818g。
[0011]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明以繁殖快、周期短的真菌為材料，成本低，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，無需昂貴的儀器，通過多次進(jìn)行硅膠柱層析，提取到新沒藥烷倍半萜I。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是化合物的TLC。
[0013]圖2是化合物的的1H NMR譜。
[0014]圖3是化合物的13C NMR譜。
[0015]圖4是化合物的DEPT 135譜。
[0016]圖5是化合物的E1-MS譜。
[0017]圖6是化合物的HMBC譜。
[0018]圖7是化合物的COSY譜。
[0019]圖8是化合物的NOESY譜。
[0020]圖9是化合物的結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1:
新沒藥烷倍半萜的制備
1)將蜜蜂球囊菌(梁勤，陳大福，王建鼎.營養(yǎng)生態(tài)條件對(duì)蜜蜂球囊菌生長及產(chǎn)孢的影響.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，9(4): 31-34)活化后，以0.5 X 0.5cm (4塊)接種于PDB培養(yǎng)基(馬鈴薯去皮，切塊，稱取200g，沸水煮30min，6層紗布過濾，稱取20g葡萄糖，加蒸餾水定容至lOOOmL，pH自然。分裝到250ml三角瓶中，每瓶裝100ml，高壓滅菌121°C，20min。)中，在160r/min、25°C條件下連續(xù)培養(yǎng)4天即初級(jí)培養(yǎng)，按10%接種量再次轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在160r/min、25°C條件下連續(xù)培養(yǎng)7天即次級(jí)培養(yǎng)；
2)減壓抽濾得到菌液，用乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次。合并萃取液，旋蒸得菌液浸膏。
[0022]3)將菌液浸膏上200-300目硅膠柱，進(jìn)行粗分。先用石油醚洗脫，再之后換二氯甲烷:丙酮體積比=8:1和二氯甲烷:丙酮體積比5:1洗脫，TLC點(diǎn)板后確認(rèn)兩部分洗脫液洗脫成分相同，將兩部分合并收集該部位洗脫液，旋蒸濃縮；
4)將3)中得到的濃縮物繼續(xù)上200-300目硅膠柱，以石油醚:丙酮體積比=30:1梯度洗脫，收集石油醚:丙酮體積比=10:1部位洗脫液，旋蒸濃縮。
[0023]5)將4)中得到的濃縮物進(jìn)一步上200-300目硅膠柱，先以石油醚洗脫，之后換石油醚:丙酮體積比=8:1梯度洗脫，最后以乙酸乙酯:丙酮甲烷體積比=5:1梯度洗脫，收集乙酸乙酯:丙酮體積比=3:1部位洗脫液，旋蒸濃縮，經(jīng)HREMS、NMR, HMBC譜圖分析證明為新沒藥烷倍半萜I。
[0024]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種從蜜蜂球囊菌中提取新沒藥烷倍半萜的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)將蜜蜂球囊菌活化后，取菌塊接種到PDB培養(yǎng)基中，在140r/min、25°C條件下培養(yǎng)4天，按10%接種量再次轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，在160 r/min、25°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天； 2)抽濾得到菌液，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液旋蒸得菌液浸膏； 3)將菌液浸膏上200-300目硅膠柱，進(jìn)行粗分，先用石油醚洗脫，再之后換二氯甲烷:丙酮體積比=8:1和二氯甲烷:丙酮體積比5:1洗脫:收集并合并兩部分的洗脫液，旋蒸濃縮； 4)將步驟3)中得到的濃縮物繼續(xù)上200-300目硅膠柱，以二氯甲烷:丙酮體積比=30:1梯度洗脫，收集二氯甲烷:丙酮體積比=10:1部位洗脫液，旋蒸濃縮； 5)將步驟4)中得到的濃縮物進(jìn)一步上200-300目硅膠柱，先以石油醚洗脫，之后換石油醚:丙酮體積比=8:1梯度洗脫，最后以乙酸乙酯:丙酮體積比=5:1梯度洗脫，收集乙酸乙酯:丙酮體積比=3:1部位洗脫液，旋蒸濃縮，得到無色針狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蜜蜂球囊菌中提取新沒藥烷倍半萜的方法，其特征在于:所述步驟I)中接種菌塊 的大小為0.5X0.5cm，接種量為4塊。
【文檔編號(hào)】C07C35/18GK103449973SQ201310402594
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月7日
【發(fā)明者】邱君志, 張以盼, 郭慶豐, 何肖云, 孟麗雪, 曹麗萍, 董冬, 李小霞, 凃潔, 姚靈丹 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)