火木層孔菌中環(huán)二肽c7在抗禽流感h5n1病毒上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel（裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌Phellinusbaumii、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）發(fā)酵液和子實(shí)體中分離的具有抗禽流感活性的一種環(huán)二肽C7。本發(fā)明首次公開了一種環(huán)二肽的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)在于：發(fā)現(xiàn)了這種環(huán)二肽的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【專利說明】火木層孔菌中環(huán)二肽C7在抗禽流感H5N1病毒上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質(zhì)的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013年8月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC N0.8108，分類名稱為火木層孔菌Phellinusigniarius，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
【背景技術(shù)】
[0002]通常生物學(xué)中所指的環(huán)肽是指以氨基酸肽鍵形成的化合物，在植物化學(xué)中這一概念被擴(kuò)大成以酰胺鍵形成的一類化合物，因此范圍被擴(kuò)大至包括有機(jī)胺類和大環(huán)生物堿類，根據(jù)成環(huán)與否分為環(huán)肽和直鏈肽。已報(bào)道的環(huán)肽類化合物具有多方面的生物活性，包括抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗瘧、安眠、抑制血小板聚集、降壓、抑制酪氨酸酶、抑制環(huán)氧化酶、抑制脂質(zhì)過氧化酶、雌性激素樣、免疫抑制等生物活性。
[0003]由于環(huán)肽的前體-直鏈肽所包含的氨基酸的數(shù)目和種類的千差萬別，造成了環(huán)肽合成方法的多樣化。對某種直鏈肽表現(xiàn)出高效，快速縮合作用的試劑和方法對另外一種肽鏈就可能變得低效或無效。
[0004]一種環(huán)二肽具有抗菌等多種重要的生理活性，如今，未見到有抗情流感病毒活性的報(bào)到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的一種環(huán)二肽C7。本發(fā)明首次公開了這種一種環(huán)二肽的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。
[0006]本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)在于:發(fā)現(xiàn)了該種一種環(huán)二肽C7的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0008](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ；(4)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60~90%，乙醇優(yōu)選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優(yōu)選為濃縮液體積的3-6倍；
(5)對步驟(4)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0009]然后從火木層孔菌粗提物中環(huán)二肽C7，步驟如下:火木層孔菌粗提物一正相硅膠層析一甲醇梯度洗脫一正相硅膠層析一HPLC檢測一高壓反相制備一HPLC檢測一甲醇凝膠層析一1D-HNMR —環(huán)二肽 C7。
[0010]具體方法為:
(1)制備火木層孔菌粗提物；
(2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次；
(3)收集上述步驟(2)得到的最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫；
(4)將步驟(3)得到的產(chǎn)物進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；
(5)使用HPLC檢測收集的步驟(4)的洗脫`液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；
(6)將步驟(5)得到的產(chǎn)物進(jìn)行高壓反`相層析，洗脫劑為甲醇與水；
(7)收集洗脫液，減壓蒸干，進(jìn)行HPLC檢測，
(8)再次進(jìn)行甲醇凝膠層析，收集洗脫液，減壓干燥，即為環(huán)二肽C7。
[0011]優(yōu)選的，提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，洗脫劑為氯仿和甲醇。
[0012]提取步驟(3)中所述的洗脫劑為甲醇。
[0013]提取步驟(4)中所述的正相硅膠為200-300目。
[0014]提取步驟(5)中所述的HPLC條件為Omin:100%水，IOmin:100%甲醇。
[0015]提取步驟(6)所述的反相材料為C-18或者C-8，洗脫劑為甲醇:水=30%_80%，反相層析次數(shù)為2-4次。
[0016]提取步驟(7)所述的HPLC出鋒時(shí)間為5.20-5.58min。
[0017]提取步驟(8)所述的凝膠類型為Sephadex LH-20。
[0018](四)【具體實(shí)施方式】 實(shí)例1:
火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到3時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度IOO轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0019](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0020]然后稱取350g粗提物，與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠，柱高1.2m，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=100:1,50:1分別洗脫3，4，4，4個(gè)柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1, Fr_2，F(xiàn)r-3,Fr-4。將Fr-4用甲醇溶解，進(jìn)行甲醇凝膠層析，收集洗脫液，適當(dāng)合并，再次與等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200目正相硅膠，進(jìn)行正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿與甲醇。經(jīng)HPLC檢測，條件為Omin:100%水，IOmin:100%甲醇，出峰時(shí)間為5.25。合并有目標(biāo)吸收峰的洗脫液，然后，進(jìn)行高壓反相制備，A相為水，B相為甲醇。收集洗脫液，減壓蒸干，HPLC檢測，條件為Omin:100%水，IOmin:100%甲醇，出峰時(shí)間為5.25。適當(dāng)合并，進(jìn)行1D-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為δ 7.29(ddd, J = 31.0, 18.0, 7.0 Hz, 6H)，5.87 (s, 1H)，4.28 (d, J = 7.7 Hz, 1H)，4.07(t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.67 - 3.53 (m, 3H)，2.80 (dd, J = 14.5, 10.4 Hz, 1H)，
2.36 - 2.28 (m, 2H)，2.08 - 1.80 (m, 5H).證明是(L-脯氨酸 L-苯丙氨酸)。
[0021](7)采用步驟(6)得到的化合物進(jìn)行對MDCK細(xì)胞毒性的測定，確定其半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。
[0022]在96孔板上，100 μ l/孔加入4X IO5Iiir1濃度的MDCK細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，在單層細(xì)胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重復(fù)3孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照。置370C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液上清，100 μl/孔加入5 mg.Hir1MTT的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)Ih后，棄MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振蕩5_10 min，待結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測492nm處的OD值。計(jì)算出樣品的半數(shù)中毒濃度(CC50)及最大安全濃度。當(dāng)加樣組的OD492值不顯著低于細(xì)胞對照組OD492時(shí)，此濃度即為樣品的最大安全濃度。
[0023]環(huán)二肽C7各質(zhì)量濃度組(n=12)
【權(quán)利要求】
1.環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述環(huán)二肽C7為(L-脯氨酸L-苯丙氨酸)。
2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于環(huán)二肽C7是從火木層孔菌中提取的，提取步驟順序如下: (1)制備火木層孔菌粗提物； (2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次； (3)收集上述步驟(2)得到的最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫； (4)將步驟(3)得到的產(chǎn)物進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (5)使用HPLC檢測收集的步驟(4)的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (6)將步驟(5)得到的產(chǎn)物進(jìn)行高壓反相層析，洗脫劑為甲醇與水； (7)收集洗脫液，減壓蒸干，進(jìn)行HPLC檢測， (8)再次進(jìn)行甲醇凝膠層析，收集洗脫液，減壓干燥，即為環(huán)二肽C7。
3.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述火木層孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r /min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可得到火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液； (2)取步驟(1)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ； (3)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(2)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60~90% ； (4)對步驟(3)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ； (5)將將步驟(4)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
4.如權(quán)利要求3所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述液體培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%。
5.如權(quán)利要求3所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于火木層孔菌粗提物制備步驟(3)的乙醇為濃度65%-95%食用乙醇，所用體積為3-6倍體積。
6.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，洗脫劑為氯仿和甲醇；步驟(3)中所述的洗脫劑為甲醇。
7.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(4)中所述的正相硅膠為200-300目。
8.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)中所述的HPLC條件為Omin:100%水，IOmin:100%甲醇。
9.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6)所述的反相材料為C-18或者C-8，洗脫劑為甲醇:水=30%-80%，反相層析次數(shù)為2-4次。
10.如權(quán)利要求2 所述的環(huán)二肽C7在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(7)所述的HPLC出鋒時(shí)間為5.20-5.58min，步驟(8)所述的凝膠類型為S印hadexLH-20。
【文檔編號】C07D487/04GK103800331SQ201310401652
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】趙晨, 宋愛榮, 孔超, 黃芳, 孫效樂 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)