一種分離提純多抗菌素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離提純多抗菌素的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。利用自主篩選的金色產(chǎn)色鏈霉菌NJYHWG66382發(fā)酵后，將發(fā)酵液用紗布過濾，濾出液加入脫氧膽酸鈉靜置，然后高速離心，取上清液加入三氯乙酸來沉淀蛋白質(zhì)，用有機溶劑進行超濾離心，離心后的沉淀在用凍干機凍干，最終得到的粉狀物即為多抗菌素，該物質(zhì)可用磷酸鹽緩沖溶液溶解后低溫保存。本發(fā)明是一種操作程序簡單，設(shè)備要求低，收率高的方法。
【專利說明】一種分離提純多抗菌素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種分離提純多抗菌素的方法，屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及發(fā)酵產(chǎn)物的提取、分離純化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多抗菌素(Polyoxins)也被稱為多抗菌素、多抗霉素、多氧霉素，是一種肽嘧啶核苷酸類的農(nóng)用抗生素，研究表明，多抗菌素由至少14種(Polyoxins A_N)單體結(jié)構(gòu)組成。從鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的多抗菌素主要是多抗菌素A和多抗菌素B兩種成分，其中多抗菌素B活性遠大于多抗菌素A，起主要抗菌作用。多抗菌素B熔點大約在160°C左右；常溫下易溶于水，不溶于有機溶劑；在PH2.5~3.0的酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定，對紫外光穩(wěn)定。
[0003]多抗菌素各種單體結(jié)構(gòu)都由一個核苷結(jié)構(gòu)和一個多肽結(jié)構(gòu)通過肽鍵連接起來，由于該結(jié)構(gòu)與幾丁質(zhì)合成酶的底物脲二磷-N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)相類似，因此對幾丁質(zhì)合成酶有強效的競爭性抑制作用，從而產(chǎn)生對灰霉病、霜霉病、早疫病、葉霜病、白粉病、枯萎病等多種真菌性植物病害的防治作用，是一種廣譜性抗生素類殺菌劑，具有較好的內(nèi)吸性。其主要特點是:菌種資源多，制劑劑型多，作用對象多，無毒，無刺激，無殘留。
[0004]自從日本理化研究所為首的科研機構(gòu)開發(fā)，并于1967年獲得農(nóng)用抗生素登記以來，多抗菌素為日本Kaken制藥株式會社所壟斷,雖然國內(nèi)也有廠家研發(fā)和生產(chǎn)，但無論從產(chǎn)品質(zhì)量上，還是發(fā)酵產(chǎn)量上，都遠達不到國外水品，甚至不能滿足國內(nèi)市場的需求，而進口國外的同類產(chǎn)品成本過高，導(dǎo)致這種高效的廣譜農(nóng)用抗生素遲遲不能在國內(nèi)大規(guī)模推廣應(yīng)用。目前，國內(nèi)對于多抗菌素的研究主要集中在發(fā)酵調(diào)控以及檢測分析方法上，對于從發(fā)酵液中分離提取多抗菌素的報道較少。因此，開發(fā)一種新型的操作程序簡單，設(shè)備要求低，收率高的多抗菌素提取方法是迫在眉睫的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了改進現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種分離提純多抗菌素的方法，采用三氯乙酸沉淀法結(jié)合多次有機溶劑清洗、離心純化從發(fā)酵液中提取高純度的多抗菌素，操作程序簡單，設(shè)備要求低，收率高。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種分離提純多抗菌素的方法，其具體步驟如下:
[0007](I)取鏈霉菌發(fā)酵液，用紗布過濾，發(fā)酵液過濾后繼續(xù)用冰水清洗紗布，收集濾過液，向濾過液中加入脫氧膽酸鈉溶液，靜置10~20min ；
[0008](2)將步驟(1)所得的濾過液進行離心，收集上清液；
[0009](3)將步驟(2)所得的上清液體轉(zhuǎn)移到容器中，加入三氯乙酸溶液，將容器密封后，0~4°C下靜置8~16h ；
[0010](4)將步驟(3)得到的溶液離心，棄上清液，用有機溶劑沖洗沉淀后移入超濾管內(nèi)；
[0011](5 )向步驟(4 )的超濾管內(nèi)加4~6倍體積步驟(4 )中的有機溶劑，稀釋；
[0012](6)將步驟(5)得到的液體離心后，繼續(xù)添加有機溶劑稀釋到步驟(5)中稀釋后溶液的體積數(shù)；
[0013](7)重復(fù)步驟(6) 3~5次，最終離心濃縮至步驟(5)稀釋后溶液體積的1/8~1/12 ；
[0014](8)將步驟(7)所得的濃縮液體轉(zhuǎn)移出，用凍干機凍干后，得到的粉狀物即為多抗菌素。
[0015]優(yōu)選步驟(1)中所述的紗布為80~120目，層數(shù)為3-6層，所述的清洗用的冰水與發(fā)酵液體積比為0.15~0.20:1 ;所述的冰水溫度為0~4°C。優(yōu)選步驟(1)中所述的脫氧膽酸鈉溶液的濃度為0.015~0.025g/mL ;添加的脫氧膽酸鈉溶液與最初鏈霉菌發(fā)酵液體積比為0.008~0.012:1。
[0016]優(yōu)選步驟(2)和(4)中所述的離心轉(zhuǎn)速為8000~lOOOOrpm，離心時間為20~30min,離心溫度為2~6°C。
[0017]優(yōu)選步驟(3)中所述的三氯乙酸溶液的濃度為0.8~1.2g/mL，添加的溶液與最初鏈霉菌發(fā)酵液體積比為0.10~0.15:1。
[0018]優(yōu)選步驟(4)中 所述的用于清洗的有機溶劑與步驟(1)中最初鏈霉菌發(fā)酵液的體積比為0.01~0.02:1。
[0019]優(yōu)選步驟(4)、(5)和(6)中所述的有機溶劑均為甲醇、乙醇或丙酮。
[0020]優(yōu)選步驟(5)中所述的超濾管的濾膜截留分子量為I~3kDa。
[0021]優(yōu)選步驟(6)中所述的離心轉(zhuǎn)速為4000~5000rpm,離心時間為30~40min,離心溫度為2~6°C。
[0022]本發(fā)明采用的鏈霉菌其分類命名為金色產(chǎn)色鏈霉菌，參據(jù)的微生物(株)為:NJYHWG66382，該菌株是本課題組自主篩選并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所)。其簡稱為CGMCC，保藏日期是2012年2月14日，登記入冊的編號是CGMCCN0.5756。
[0023]有益效果:
[0024]本發(fā)明所提供的方法操作程序簡單，設(shè)備要求低，收率高。
【具體實施方式】
[0025]以下結(jié)合實例來進一步解釋本發(fā)明，但實施案例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
[0026]實施例1
[0027](I)取鏈霉菌發(fā)酵液IOOmL,用3層80目紗布過濾，過濾完成后用15mL0°C冰水清洗紗布，收集濾過液，向濾過液中加入0.015g/mL脫氧膽酸鈉溶液0.8mL,常溫下靜置IOmin ；
[0028](2)將步驟(1)所得的濾過液以8000rpm在6°C下離心20min,收集上清液；
[0029](3)將步驟(2)所得的上清液體轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入0.8g/mL三氯乙酸溶液10mL，用保鮮膜將燒杯密封后，在4°C下靜置8h ；[0030](4)將步驟(3)燒杯中的溶液以8000rpm在6°C下離心20min,棄上清液,用ImL乙醇沖洗沉淀后轉(zhuǎn)移到濾膜截留分子量為IDa超濾管內(nèi)；
[0031](5)向步驟(4)的超濾管中加乙醇至總體積為4mL,以4000rpm在6°C離心30min后，繼續(xù)添加乙醇至4mL，重復(fù)此操作3次，最終離心直到液體剩余0.5mL,收集離心沉淀物；
[0032](6)將步驟(5)所得的沉淀物轉(zhuǎn)移到平板上，用凍干機凍干后，得到的粉狀物即為多抗菌素，并用2mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液溶解，測得其濃度為1.26mg/mL,隨后在-20 °C下保存。 [0033]實施例2
[0034](I)取鏈霉菌發(fā)酵液IOOmL,用5層100目紗布過濾，過濾完成后用25mL2°C冰水清洗紗布，收集濾過液，向濾過液中加入0.020g/mL脫氧膽酸鈉溶液lmL，常溫下靜置15min ；
[0035](2)將步驟(1)所得的濾過液以9000rpm在2°C下離心25min,收集上清液；
[0036](3)將步驟(2)所得的上清液體轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入lg/mL三氯乙酸溶液13mL，用保鮮膜將燒杯密封后，在2°C下靜置12h ；
[0037](4)將步驟(3)燒杯中的溶液以9000rpm在2°C下離心25min,棄上清液,用2mL甲醇沖洗沉淀后轉(zhuǎn)移到濾膜截留分子量為2kDa超濾管內(nèi)；
[0038](5)向步驟(4)的超濾管中加甲醇至總體積為IOmL,以4500rpm在2°C離心35min后，繼續(xù)添加甲醇至總體積為10mL，重復(fù)此操作4次，最終離心直到液體剩余l(xiāng)mL，收集離心沉淀物；
[0039](6)將步驟(5)所得的沉淀物轉(zhuǎn)移到平板上，用凍干機凍干后，得到的粉狀物即為多抗菌素，并用2mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液溶解，測得其濃度為1.33mg/mL,隨后在-20 °C下保存。
[0040]實施例3
[0041](I)取鏈霉菌發(fā)酵液IOOmL,用6層120目紗布過濾，過濾完成后用30mL4°C冰水清洗紗布，收集濾過液，向濾過液中加入0.025g/mL脫氧膽酸鈉溶液1.2mL，常溫下靜置20min ；
[0042](2)將步驟(1)所得的濾過液以1000Orpm在fC下離心30min，收集上清液；(3)將步驟(2)所得的上清液體轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入1.2g/mL三氯乙酸溶液15mL，用保鮮膜將燒杯密封后，在0°C下靜置16h;
[0043](4)將步驟(3)燒杯中的溶液以1000Orpm在4°C下離心30min,棄上清液,用2mL丙酮沖洗沉淀后轉(zhuǎn)移到濾膜截留分子量為3kDa超濾管內(nèi)；
[0044](5)向步驟(4)的超濾管中加丙酮總體積為12mL，以5000rpm在4°C離心40min后，繼續(xù)添加丙酮至總體積為12mL，重復(fù)此操作5次，最終離心直到液體剩余l(xiāng)mL，收集離心沉淀物；
[0045](6)將步驟(5)所得的沉淀物轉(zhuǎn)移到平板上，用凍干機凍干后，得到的粉狀物即為多抗菌素，并用2mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液溶解，測得其濃度為1.52mg/mL,隨后在-20 °C下保存。
【權(quán)利要求】
1.一種分離提純多抗菌素的方法，其具體步驟如下: (1)取鏈霉菌發(fā)酵液，用紗布過濾，發(fā)酵液過濾后繼續(xù)用冰水清洗紗布，收集濾過液，向濾過液中加入脫氧膽酸鈉溶液，靜置10~20min ； (2)將步驟(1)所得的濾過液進行離心，收集上清液； (3)將步驟(2)所得的上清液體轉(zhuǎn)移到容器中，加入三氯乙酸溶液，將容器密封后，0~4°C下靜置8~16h ； (4)將步驟(3)得到的溶液離心，棄上清液，用有機溶劑沖洗沉淀后移入超濾管內(nèi)； (5)向步驟(4)的超濾管內(nèi)加4~6倍體積步驟(4)中的有機溶劑，稀釋； (6)將步驟(5)得到的液體離心后，繼續(xù)添加有機溶劑稀釋到步驟(5)中稀釋后溶液的體積數(shù)； (7)重復(fù)步驟(6)3~5次，最終離心濃縮至步驟(5)稀釋后溶液體積的1/8~1/12 ； (8)將步驟(7)所得的濃縮液體轉(zhuǎn)移出，用凍干機凍干后，得到的粉狀物即為多抗菌素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(1)中所述的紗布為80~120目，層數(shù)為3-6層，所述的清洗用的冰水與發(fā)酵液體積比為0.15~0.20:1 ;所述的冰水溫度為0 ~4℃
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(1)中所述的脫氧膽酸鈉溶液的濃度為0.015~0.025g/mL ;添加的脫氧膽酸鈉溶液與最初鏈霉菌發(fā)酵液體積比為0.008~0.012:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(2)和(4)中所述的離心轉(zhuǎn)速為8000~1000Orpm,離心時間為20~30min,離心溫度為2~6°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(3)中所述的三氯乙酸溶液的濃度為0.8~1.2g/mL，添加的溶液與最初鏈霉菌發(fā)酵液體積比為0.10~0.15:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(4)中所述的用于清洗的有機溶劑與步驟(1)中最初鏈霉菌發(fā)酵液的體積比為0.01~0.02:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(4)、(5)和(6)中所述的有機溶劑均為甲醇、乙醇或丙酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(5)中所述的超濾管的濾膜截留分子量為I~3kDa。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(6)中所述的離心轉(zhuǎn)速為4000~5000rpm,離心時間為30~40min,離心溫度為2~6°C。
【文檔編號】C07K5/083GK103613641SQ201310556551
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】胡永紅, 支文標(biāo), 楊文革, 曹崢, 李佼佼, 殷晶晶 申請人:南京工業(yè)大學(xué)