Ctla-4變體的制作方法
【專利摘要】在此披露具有高親和力、效力以及穩(wěn)定性的細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)的變體。還披露用于例如以每月或更小頻率的劑量間隔進行皮下或靜脈內(nèi)給藥的高濃度的CTLA-4變體的配制物。還披露CTLA-4變體用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎以及其他炎性病癥的用途。還披露具有改進的穩(wěn)定性和更長的體內(nèi)半衰期的CTLA-4與IgG Fc的融合物。
NCIMB 41948
2012.03.13
【專利說明】CTLA-4變體
[0001] 對電子版提交的序列表的引用
[0002] 與本申請一起提交的ASCII文本文件形式的電子版提交的序列表（名稱： CTLA4101PlSequencelisting.txt;大?。?07,814 字節(jié)；以及創(chuàng)建日期：2012 年 5 月 11 日） 的內(nèi)容通過引用以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及包含細胞毒性T淋巴細胞抗原4 (CTLA-4)的變體（任選地與IgGFc 融合）的組合物，以及它們用于抑制T細胞活化，尤其是在如類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA)的炎性 病狀背景下抑制T細胞活化的治療用途。
[0004] 置量
[0005] 天然T細胞的活化被認為是通過一種雙信號機制而進行的。在遇到抗原呈遞細胞 (APC)時，T細胞受體（TCR)與主要組織相容性復(fù)合體（MHC)分子背景下的肽相互作用并且 由此向T細胞遞送第一活化信號。此初始信號不足以引起T細胞活化，并且來自共刺激受 體的第二信號是絕對需要的。最重要且最佳描述的共刺激受體之一是CD28,它與巨噬細胞、 樹突細胞以及B淋巴細胞和活化的T淋巴細胞表面上的CD80 (B7. 1)和CD86 (B7. 2)相互作 用。
[0006] CD86基因編碼I型膜蛋白（Swiss-Prot登錄號P33681)。選擇性剪接產(chǎn)生編碼不 同同種型的CD86基因的兩種轉(zhuǎn)錄物變體。已描述了另外的轉(zhuǎn)錄物變體，但它們的全長序列 尚未確定。
[0007] CD80 (Swiss-Prot登錄號P42081)中的相關(guān)蛋白質(zhì)具有與CD86相似的二級結(jié)構(gòu)。 ⑶80分別與⑶86共享26 %相同的氨基酸殘基和46 %相似的氨基酸殘基。⑶80在靜止 APC中僅以低水平表達，但在活化之后可以被上調(diào)。⑶80識別T細胞上的相同受體⑶28和 ⑶152 (CTLA-4)，但結(jié)合后者的親和力比⑶86高大約2至4倍。
[0008] 尚未鑒別到負責結(jié)合⑶28和/或CTLA-4的共享線性肽表位（埃利斯（Ellis) 等人，免疫學雜志（JImmunoU，156, 2700-2709)，但已發(fā)現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)（CD80和CD86的 IgV片層）中的保守殘基與CTLA-4相互作用（斯沃茨（Swartz)等人，自然（Nature), 410, 604-608)。
[0009] 來自⑶28的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致T細胞活化和CTLA-4共抑制受體的上調(diào)。CTLA-4是免 疫球蛋白超家族的一個成員。它以與⑶28相比增加的親和力和親合力結(jié)合⑶80和⑶86， 并且有效地下調(diào)活化信號。
[0010] 已假定了關(guān)于⑶80和⑶86在結(jié)合CTLA-4方面的相對作用的不同理論。斯 拉維克（Slavik)等人（免疫學研究（Immunol.Res.) 19 (1) : 1-241999)綜述了CD28/ CTLA-4和⑶80/⑶86家族的信號傳導(dǎo)和功能。桑瑟姆（Sansom)(免疫學（Immunology 101:169-1772000))概述了其中調(diào)查CD80與CD86之間的差異的一些研究。
[0011] 奧德拜西科（Odobasic)等人（免疫學124:503-5132008)調(diào)查了CD80和CD86在 效應(yīng)T細胞應(yīng)答中的作用。此研究調(diào)查了抗CD80和抗CD86單克隆抗體在抗原誘導(dǎo)的小鼠 關(guān)節(jié)炎模型中的作用。據(jù)報道，CD80和CD86兩者的阻斷引起與對照抗體治療的小鼠相比 疾病嚴重程度降低的趨勢?；谟脝为毧贵w治療的結(jié)果，作者推斷CD80通過下調(diào)全身性 IL-4并且增加關(guān)節(jié)中的T細胞累積而使關(guān)節(jié)炎惡化，而⑶86通過上調(diào)IL-17并且增加關(guān) 節(jié)中效應(yīng)T細胞的累積且不影響Thl或Th2發(fā)育而增大疾病嚴重程度。然而，此研究報道， 當CD80和CD86兩者皆被阻斷時沒有觀察到關(guān)節(jié)炎嚴重程度的進一步附加降低，從而表明 抑制任一共刺激分子足以獲得最大疾病改善。這一模型是基于對直接注射在關(guān)節(jié)間隙中的 抗原（在此研究中是BSA)的回憶應(yīng)答。
[0012] 另一研究使用鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型，涉及破壞對內(nèi)源性抗原（膠原）的耐受 性。在此研究中，報道⑶80和⑶86兩者的阻斷都是獲得最大益處所需要的（韋勃（Webb) 等人歐洲免疫學雜志（EurJ.Immunol) 26 (10) :2320-23281996)。
[0013] 一種包含連接至修飾的IgGlFc結(jié)構(gòu)域的CTLA-4的胞外結(jié)構(gòu)域的重組融合蛋白 ("CTLA-4-Ig"）已顯示體內(nèi)結(jié)合⑶80和⑶86,并且有效抑制⑶28介導(dǎo)的T細胞活化（科 林威斯基（Kliwinski)等人，自身免疫雜志（JAutoimmun. )2005 ;25 (3) :165-71)。
[0014] CTLA-4融合蛋白已被發(fā)展作為用于類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA)的治療劑。RA是一種導(dǎo) 致軟骨和骨質(zhì)破壞的進行性退行性疾病。有證據(jù)證明免疫系統(tǒng)的許多分支牽涉于導(dǎo)致成纖 維細胞樣滑膜細胞和破骨細胞介導(dǎo)的關(guān)節(jié)損傷以及軟骨和骨質(zhì)破壞的炎性過程中。多項 研究已顯示出滑膜中增加的T細胞活化，并且高達50%的浸潤發(fā)炎的血管翳的細胞是T淋 巴細胞。另外，RA患者滑膜中的T細胞表現(xiàn)出活化的效應(yīng)子表型，該效應(yīng)子表型展示出如 ⑶44、⑶69,⑶45R0、VLA-I以及⑶27的活化相關(guān)標志物的增加的表達。
[0015] 活化T細胞已顯示在建立和維持于RA滑膜中發(fā)現(xiàn)的病理性炎癥應(yīng)答方面起關(guān)鍵 作用?；罨疶細胞是促炎性細胞因子如IFNy、IL-17以及TNFa的重要來源。這些因子是 成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS)和巨噬細胞樣滑膜細胞（MLS)的強效活化劑，這些滑膜細胞 引起為軟骨破壞的介質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP)的分泌以及如IL-6、IL-1和TNFa的炎癥 介質(zhì)的分泌。活化的CD4+細胞還可以向B淋巴細胞提供同源幫助，從而導(dǎo)致進一步促使疾 病進展的抗體如類風濕性因子（RF)的產(chǎn)生。
[0016] 阿巴西普（Abatacept) (Orencia? )是一種含有與IgGl的Fc融合的CTLA-4的 胞外結(jié)構(gòu)域的CTLA-4Ig融合蛋白。所得可溶性蛋白是具有大約92kDa的分子量的二聚體。 已顯示它在臨床治療RA患者中具有有益作用，從而證明抑制涉及⑶80和⑶86的共刺激路 徑是一種可行的RA治療方法。使用阿巴西普的RA療法作為每月靜脈內(nèi)注射或每周皮下注 射來給與。
[0017] 阿巴西普在其⑶R3樣環(huán)中含有氨基酸六肽基序MYPPPY，這種基序是⑶28與 CTLA-4之間共享的，并且據(jù)報道是結(jié)合B7配體所必需的。在此基序中第一酪氨酸（Y)到 丙氨酸（A)的突變消除了與CD80的結(jié)合，而且導(dǎo)致與CD86的結(jié)合降低，而苯丙氨酸（F)取 代允許對CD80的完整親和力保留而CD86結(jié)合全部損失（哈里斯（Harris)等人，實驗醫(yī)學 雜志（J.Exp.Med.) (1997) 185:177-182)。CDR3樣和CDRl樣區(qū)域中的其他殘基對于阿巴西 普與其配體的相互作用而言同樣重要。因此，其中在位置104谷氨酸（E)代替亮氨酸（L) 和在位置29酪氨酸（Y)代替丙氨酸（A)的突變分子表現(xiàn)出與阿巴西普相比對CD80(B7-1) 的結(jié)合親合力大大約2倍并且對⑶86 (B7-2)的結(jié)合親合力大大約4倍。據(jù)報道這種化 合物LEA-29Y(貝拉西普），Nulojix?)對于結(jié)合⑶80具有與對于結(jié)合⑶86相似的親 和力（分別為3· 66nM和3· 21nM)。貝拉西普已被發(fā)展作為用于移植的免疫抑制劑（拉森 (Larsen)等人，美國移植雜志（Am.J.Transplantation) (2005)5:443-453 ;古普塔和烏摩 爾（Gupta&Womer)，藥物設(shè)計、開發(fā)與治療（DrugDesDevelopTher)4:375_3822010)，并且 最近被批準用于預(yù)防接受腎移植的成人患者中的器官排斥。阿巴西普本身顯示出針對移植 排斥有限的功效，這一發(fā)現(xiàn)被歸因于其對CD86依賴性共刺激的較低的抑制（與對CD80依 賴性共刺激的抑制相比）（古普塔和烏摩爾，同上）。
[0018] 用于皮下給藥的阿巴西普和貝拉西普的配制物描述于WO2007/07654中。
[0019] 先前已使用核糖體展示技術(shù)進行對改進的親和力和穩(wěn)定性的選擇以便分離改進 的CTLA-4變體。易錯PCR誘變（使整個基因序列突變）和定向誘變（靶向?qū)﹃P(guān)鍵區(qū)域的 突變）兩者對蛋白質(zhì)進化而言一直成功的。例如，WO2008/047150報道了與野生型相比顯 示出增加的活性和增加的穩(wěn)定性的CTLA-4的蛋白質(zhì)變體。
[0020] Maxygen公司報道了一種被指定為ASP2408的CTLA-4-Ig治療性分子其由普賽德 治療劑公司（PerseidTherapeuticsLLC)與安斯泰來制藥公司（AstellasPharmaInc) 合作開發(fā)用于治療RA。據(jù)報道，與Orencia?(阿巴西普）相比，CTLA-4-Ig顯示出改進的 效力（TO2〇〇9/〇58564)。
[0021] US6, 750, 334(R印Iigen公司）描述了CTLA-4-Cγ4,即一種包含與免疫球蛋白 的一部分融合的CTLA-4的可溶性融合蛋白。包含鉸鏈區(qū)以及CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的免疫球 蛋白恒定區(qū)通過至少一個氨基酸殘基的取代、添加或缺失而修飾，以便降低補體活化或Fc 受體相互作用。
[0022] Xencor公司最近描述了一種CTLA4-Ig分子，該分子包含變體CTLA-4部分和免疫 球蛋白Fc區(qū)（W0 2011/103584)。描述了CTLA-4部分的氨基酸序列中的多個氨基酸取代， 以用于產(chǎn)生具有更大T細胞抑制活性的CTLA4-Ig變體。WO2011/103584還描述了Fc修 飾，例如以用于改進與FeγR的結(jié)合，增強Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能和/或延長CTLA4-Ig的體 內(nèi)半衰期。
[0023] 發(fā)明概沭
[0024] 在第一方面，本發(fā)明提供為野生型CTLA-4的變體的CTLA-4多肽。本發(fā)明的CTLA-4 多肽可以具有一種或多種改進的特性，如相比野生型更高的效力、對CD80和/或CD86更高 的親和力、相對于CD86對CD80增強的選擇性、良好的交叉反應(yīng)性、和/或更高的穩(wěn)定性。
[0025] CTLA-4的改進可以通過人野生型人CTLA-4胞外結(jié)構(gòu)域（又稱為可溶性CTLA-4) 的氨基酸序列的突變來實現(xiàn)。一個或多個氨基酸突變（其可以是氨基酸取代、插入或缺失） 可以被引入CTLA-4氨基酸序列中，以便產(chǎn)生如在此所述的改進的CTLA-4多肽。該多肽可 以例如表現(xiàn)出相對于野生型CTLA-4而言增加的效力、親和力和/或穩(wěn)定性。
[0026] CTLA-4胞外結(jié)構(gòu)域包含野生型氨基酸序列SEQIDNO: 35。SEQIDNO: 35不是整 個胞外結(jié)構(gòu)域，而是阿巴西普（Orencia?)中所采用的區(qū)。
[0027] 本發(fā)明的CTLA-4多肽可以或可以不包含對應(yīng)于SEQIDN0:35的區(qū)域之外的另 外的CTLA-4殘基或序列。優(yōu)選本發(fā)明的CTLA-4多肽是可溶性的。因此通常它將不包含 CTLA-4跨膜區(qū)。
[0028] 在此鑒別的是CTLA-4氨基酸序列內(nèi)的多個突變，這些突變與改進的效力、親和力 和/或穩(wěn)定性是相關(guān)聯(lián)，或者這些突變可以出于如影響二聚作用等的其他目的而被引入。
[0029] 野生型CTLA-4中的氨基酸取代的實例是：116處的R、S、V或T;A24處的T;S25處 的N或P;G27處的S;V32處的I;D41處的G;S42處的G;V44處的E;M54處的K或V;N56 處的S或G;L58處的A、G、S或P;T59處的S或A;F60處的T;L61處的Q或P;D62處的G; D63處的Y;S64處的P;165處的N、D、V或T;S70處的A、T、M或H;Q80處的R;M85處的Q、 S、V、R、K或L;T87 處的S;K93 處的Q、Η、T、E或M;L104 處的R、Q或E;1106 處的V;N108 處的D或S;1115處的V或F以及C120處的S。氨基酸缺失的一個實例是T51的缺失。殘 基編號是參考圖IA和圖2中所示的CTLA-4序列，以第一殘基編號為位置1 "序列編號"。 圖1還示出用于比較的SwissProt編號。
[0030] CTLA-4變體可以具有人野生型可溶性CTLA-4中的例如多達十二個或多達二十 個氨基酸突變。這些突變可以包括以上所列舉的任何或全部氨基酸突變，以及任選地在這 些或在其他殘基位置處的一個或多個不同的突變，例如不同的取代。變體氨基酸序列可以 包含具有所列舉的氨基酸突變中的一個或多個（例如至少五個、六個或七個）的人野生型 CTLA-4 序列SEQIDN0:35。
[0031] CTLA-4多肽可包含與SEQIDNO:35具有至少70%、至少75%、至少80%、至少 85 %、至少90 %或至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列一致性的氨基酸序列或由其組 成。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4變體氨基酸序列的實例包括圖IA中所示的SEQID NO: 36-55的那些。CTLA-4變體可以包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的 " 1299"CTLA-4氨基酸序列。NCMB登錄號41948編碼與免疫球蛋白Fc區(qū)融合的1299CTLA-4 多肽。編碼的1299CTLA-4多肽、編碼的Fc區(qū)、以及包含與Fc區(qū)融合的1299CTLA-4多肽的 編碼的多肽（它們?nèi)慷际怯梢訬CMB登錄號41948保藏的核酸編碼）全部都是本發(fā)明的 單獨實施例。
[0033] 優(yōu)選的突變是選自以下各項的氨基酸取代：116處的R、S或V;A24處的T;S25處 的N;G27處的S;M54處的K;N56處的S;L58處的A或G;F60處的T;L61處的Q;D63處的 Y;S64處的P;165處的N或D;S70處的A;Q80處的R;M85處的Q或S;K93處的Q或H; 以及C120處的S。因此，變體氨基酸序列可以包含其中這些氨基酸殘基位置中的一個或多 個（例如至少五個或六個或全部）如所指定的被不同殘基取代的人野生型CTLA-4序列SEQ IDΝ0:35。
[0034] CTLA-4多肽序列優(yōu)選包含：位置16處的R、I、S或V;位置24處的T或A;位置25 處的N;位置27處的S或G;位置54處的M或K;位置56處的N或S;位置58處的A、L或 G;位置59處的T或S;位置60處的F或T;位置61處的L或Q;位置63處的D或Y;位置 64處的S或P;位置65處的I、N或D;位置70處的A或S;位置80處的Q或R;位置85處 的Q、M或S;位置93處的Q或H;和/或位置120處的C或S。其他殘基位置可以是人野生 型，或可以經(jīng)受一個或多個另外的突變。
[0035] CTLA-4多肽可以包含位置25處的N，表示取代此位置處的野生型S。該多肽可以 包含位置93處的Q或H，表示取代此位置處的野生型K。如稍后所述的實例所說明，在殘基 25和93處的這些取代被認為與CTLA-4的親和力、效力和/或穩(wěn)定性的改進緊密相關(guān)。
[0036] 一個優(yōu)選氨基酸基序（在多種高效力變體中觀察到）是STQDYPN(SEQIDNO:69)。 位于殘基59-65處的此基序是處于一個環(huán)區(qū)中，該環(huán)區(qū)似乎在結(jié)合結(jié)構(gòu)中與CD80和CD86 緊密相鄰。因此，在某些實施例中，CTLA-4多肽包含在殘基59-65處的SEQIDN0:69。殘 基編號如圖IA(編號的上行，從1開始）和圖2中所示。當存在插入或缺失時，多肽的實際 殘基編號可能與參考序列不同。圖IA還不出用于比較的SwissProt編號。
[0037] 還可能合乎需要的是（例如）通過用S取代使位置120處的C突變，以便去除在 此位置處的CTLA-4分子之間形成的二硫鍵并且抑制CTLA-4二聚化。在其他情況下，合乎 需要的是保持或促進CTLA-4二聚化或更高的多聚化（例如，四聚體形成）。這可以例如通 過保留C120和/或通過添加二聚化結(jié)構(gòu)域（如通過使CTLA-4軛合至IgGFc區(qū)）而實現(xiàn)。 這類結(jié)構(gòu)域的添加以及包含CTLA-4的大分子的形成稍后將進一步討論。
[0038] CTLA-4多肽可以包含氨基酸序列SEQIDNO: 68,或者可以包含具有一個或多個突 變的SEQIDN0:68。例如CTLA-4多肽可以包含具有多達十二個突變，多達十個氨基酸突 變，或多達五個突變，例如一個、兩個或三個氨基酸突變的SEQIDNO:68。SEQIDNO:68在 圖2中示出，并且是在六個具有格外良好的功能活性的CTLA-4多肽的一個組中發(fā)現(xiàn)的殘基 的共有序列，這些CTLA-4多肽如實例中所述而產(chǎn)生。這六個多肽具有圖IA中所示的氨基 酸序列，其中SEQIDNO如下：SEQIDN0:43(變體 1299)、SEQIDN0:37(變體 1322)、SEQ IDN0:38(變體 1321)、SEQIDN0:36(變體 1315)、SEQIDN0:42(變體 1115)以及SEQID N0:47(變體1227)。這六個序列，以及在這六個序列中的任一個中具有一個或多個氨基酸 突變，例如多達十二個例如多達十個氨基酸突變，例如多達五個突變，例如一個、兩個或三 個氨基酸突變的變體代表本發(fā)明的各實例。CTLA-4多肽可以包含具有一個或多個氨基酸突 變，例如多達十二個例如多達十個氨基酸突變，例如多達五個突變，例如一個、兩個或三個 氨基酸突變的以NCMB登錄號41948保藏的"1299"CTLA-4多肽序列。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽可以包含如下氨基酸序列或由其組成，該氨基酸序列 與SEQIDNO:68,與SEQIDNO:36-55中的任一個，或與以NCMB登錄號41948保藏的 "1299"CTLA-4多肽序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少 95%、96%、97%、98%或 99% 的序列一致性。
[0040] 該或這些突變可以包含氨基酸取代或由其組成，并且可以任選地選自以下各項：
[0041] 殘基16處的T;殘基25處的P;殘基32處的I;殘基41處的G;殘基42處的G; 殘基44處的E;殘基54處的V;殘基56處的G;殘基58處的S或P;殘基59處的A;殘基 61處的P;殘基62處的G;殘基65處的V或T;殘基70處的T、M或H;殘基85處的V、R、K 或L;殘基87處的S;殘基93處的T、E或M;殘基104處的R、Q或E;殘基106處的V;殘基 108處的D或S;殘基115處的V或F;殘基120處的S;殘基51處的缺失。
[0042] 優(yōu)選地，多肽包含位置25處的N，和/或包含位置93處的Q或H。多肽可以任選 地包含位置120處的S。
[0043] 如上所指出，多肽優(yōu)選地包含位置16處的R、I、S或V;位置24處的T或A;位置25 處的N;位置27處的S或G;位置54處的M或K;位置56處的N或S;位置58處的A、L或G; 位置59處的T或S;位置60處的F或T;位置61處的L或Q;位置63處的D或Y;位置64 處的S或P;位置65處的I、N或D;位置70處的A或S;位置80處的Q或R;位置85處的 Q、M或S;位置93處的Q或H;和/或位置120處的C或S。因此，相對于野生型CTLA-4SEQ IDN0:35而言，該多肽包含以下氨基酸取代中的一個或多個，例如至少五個或六個或全部： 116處的R、S或V;A24處的T;S25處的N;G27處的S;M54處的K;N56處的S;L58處的A 或G;T59處的S;F60處的T;L61處的Q;D63處的Y;S64處的P;165處的N或D;S70處 的A;Q80處的R;M85處的Q或S;K93處的Q或Η。
[0044] 與野生型相比的SEQIDΝ0:36-55中的突變在圖IA中示出。根據(jù)本發(fā)明的多肽 可以包含具有在這些變體中例示的一個或多個突變，例如具有存在于SEQIDΝ0:36-55中 的任一個中的突變的組合的野生型CTLA-4SEQIDΝ0:35。一個多肽可以任選地包含如上所 討論的另外的突變，例如，任選地一個或兩個另外的突變。
[0045] 例如，一個多肽可以包含選自以下各項的突變的組合：
[0046] -1315 突變，SP116 處的S;S25 處的N;L58 處的G;S70 處的A;Q80 處的R;Μ85 處 的S;和Κ93處的Q;
[0047] -1322突變，即S25處的N;G27處的S;Μ54處的K;Ν56處的S;Τ59處的S;F60處 的T;L61處的Q;D63處的Y;S64處的P;165處的N;和K93處的Q;
[0048] -1321突變，即116處的S;S25處的N;M54處的K;L58處的G;S70處的A;Q80處 的R;M85處的S;和K93處的Q;
[0049] -1115 突變，SP116 處的V;S25 處的N;L58 處的G;S70 處的A;M85 處的Q ;和K93 處的Q;
[0050] -1299突變，即116處的R;A24處的T;S25處的N;G27處的S;L58處的A;S70處 的A;M85處的Q;和K93處的Q;以及
[0051] -1227突變，即116處的S;S25處的N;G27處的S;L58處的A;S70處的A;M85處 的Q;和K93處的H。
[0052] 因此，CTLA-4多肽可以是相對于野生型包含SEQIDNO:36-55中的任一個中的取 代的殘基的組合的多肽，例如它可以包含：
[0053] -殘基16處的S;殘基25處的N;殘基58處的G;殘基70處的A;殘基80處的R; 殘基85處的S;和殘基93處的Q;
[0054]-殘基25處的N ;殘基27處的S ;殘基54處的K ;殘基56處的S ;殘基59處的S ; 殘基60處的T;殘基61處的Q;殘基63處的Y;殘基64處的P;殘基65處的N;和殘基處 93 的Q;
[0055] -殘基16處的S;殘基25處的N;殘基54處的K;殘基58處的G;殘基70處的A; 殘基80處的R;殘基85處的S;和殘基93處的Q;
[0056] -殘基16處的V;殘基25處的N;殘基58處的G;殘基70處的A;殘基85處的Q; 和殘基93處的Q;
[0057]-殘基16處的R;殘基24處的T;殘基25處的N;殘基27處的S;殘基58處的A; 殘基70處的A;殘基85處的Q;和殘基93處的Q;或
[0058]-殘基16處的S;殘基25處的N;殘基27處的S;殘基58處的A;殘基70處的A; 殘基85處的Q;和殘基93處的H。
[0059] 突變優(yōu)選是取代，并且可以是保守取代。所謂"保守取代"是指用一個第二不同的 氨基酸殘基取代一個第一氨基酸殘基，其中該第一氨基酸殘基和第二氨基酸殘基具有生物 物理學特征相似的側(cè)鏈。相似的生物物理學特征包括疏水性、電荷、極性、或提供或接受氫 鍵的能力。保守取代的實例包括將絲氨酸改變成蘇氨酸或色氨酸，將谷氨酰胺改變成天冬 酰胺，將賴氨酸改變成精氨酸，將丙氨酸改變成纈氨酸，將天冬氨酸改變成谷氨酸，將纈氨 酸改變成異亮氨酸，將天冬酰胺改變成絲氨酸。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的多肽可以包括一個或多個氨基酸序列突變（氨基酸殘基的取代、缺 失和/或插入），并且小于約15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個。
[0061] 突變通常不產(chǎn)生功能損失，因此包含如此改變的氨基酸序列的多肽可保持結(jié)合人 CD80和/或CD86的能力。它可保持與未產(chǎn)生改變的多肽相同的結(jié)合親和力或功能，例如如 在此描述的測定中所測量。
[0062] 突變可包括以非天然存在的或非標準的氨基酸替換一個或多個氨基酸殘基、將一 個或多個氨基酸殘基修飾成非天然存在的或非標準的形式，或?qū)⒁粋€或多個非天然存在的 或非標準的氨基酸插入至序列中。本發(fā)明的序列中的改變的數(shù)量和位置的實例在此在別處 描述。天然存在的氨基酸包括20個"標準" 1-氨基酸，通過它們的標準單個字母代碼被鑒 別為G、A、V、L、I、Μ、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非標準氨基酸包括可并入多肽 骨架中或由現(xiàn)有氨基酸殘基的修飾來產(chǎn)生的任何其他殘基。非標準氨基酸可以是天然存 在或非天然存在的。幾個天然存在的非標準氨基酸在本領(lǐng)域中是已知的，如4-羥基脯氨 酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、N-乙酰絲氨酸等[富特&富特（Voet&Voet)，生物化學 (Biochemistry),第2版，（威利公司（Wiley)) 1995]。這些在它們的Ν-α位衍生的氨基酸 殘基將僅位于氨基酸序列的N末端。一般地，在本發(fā)明中，氨基酸為1-氨基酸，但它可以是 D-氨基酸。因此，改變可包括將1-氨基酸修飾為d-氨基酸，或用d-氨基酸來替換1-氨基 酸。甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式的氨基酸也是已知的，并且本發(fā)明中的氨基酸可經(jīng)受 這種修飾。
[0063] 本發(fā)明的多肽中的氨基酸序列可包含上述的非天然的或非標準的氨基酸。非標準 氨基酸（例如d-氨基酸）可以在合成過程中被并入氨基酸序列中，或在該氨基酸序列合成 之后通過"原始"標準氨基酸的修飾或替換被并入。
[0064] 使用非標準和/或非天然存在的氨基酸增加結(jié)構(gòu)和功能多樣性，并且因而可增加 實現(xiàn)所希望的結(jié)合以及中和特性的潛力。另外，d-氨基酸和類似物已顯示與標準1-氨基 酸相比具有不同的藥代動力學概況，這是由于具有1-氨基酸的多肽在給予至動物例如人 之后在體內(nèi)降解，從而意味著d-氨基酸有利于一些體內(nèi)應(yīng)用。
[0065] 可使用一個或多個選定VH和/或VL基因的隨機誘變以便產(chǎn)生整個可變結(jié)構(gòu)域內(nèi) 的突變來產(chǎn)生變體。這樣一種技術(shù)由格拉姆（Gram)等人[格拉姆等人，1992,美國科學院 院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，型:3576-3580]描述，他們使用易錯PCR?？墒褂玫牧硪?種方法是將誘變引導(dǎo)至多肽中的特定區(qū)或位置。這類技術(shù)由巴巴斯（Barbas)等人[巴巴 斯等人，1994,美國科學院院刊，M: 3809-3813]和希爾（Schier)等人[希爾等人，1996,分 子生物學雜志（J.Mol.Biol. )2^:551-567]披露。
[0066] 所有上述技術(shù)在本領(lǐng)域中為本身已知的并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用這類技 術(shù)以便使用本領(lǐng)域中的常規(guī)方法來提供本發(fā)明的多肽。
[0067]可用于計算兩個氨基酸序列的一致性％的算法包括例如BLAST[阿爾丘爾 (Altschul)等人（1990)分子生物學雜志215:405-410] ;FASTA[皮爾森和李普曼（Pearson andLipman) (1988)美國科學院院刊（PNASUSA)85:2444-2448];或例如采用缺省參數(shù)的 史密斯-沃特曼算法[史密斯和沃特曼（SmithandWaterman) (1981)分子生物學雜志 147:195-197]。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明，可提供含有如下CTLA-4多肽的組合物，這些CTLA-4多肽與野生型 CTLA-4相比具有改進的生物活性，如相對于CD86對CD80增強的的選擇性，更高的親和力 和/或更高的效力，和/或可以展示出良好的交叉反應(yīng)性，改進的穩(wěn)定性和/或延長的半衰 期。如在此所詳細討論，這類多肽可以促成更大的治療功效并且可以允許在減小或更小頻 率的劑量下實現(xiàn)治療益處。改進的穩(wěn)定性可以有助于制造和配制成藥用組合物。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽任選地軛合至IgGFc區(qū)，例如呈融合蛋白。Fc區(qū)可被 工程化以增加分子的體內(nèi)半衰期，并且促進組合物的整體穩(wěn)定性，同時避免不想要的Fc效 應(yīng)子功能。改進的穩(wěn)定性有助于例如針對皮下給藥以高濃度配制產(chǎn)品。
[0070] 附圖簡要說明
[0071]圖I. (A)CTLA-4 變體序列（SEQIDN0:36-55)與野生型人CTLA-4(SEQIDN0:35) 的比對。從野生型的突變以灰色框示出。除非另外指明，編號的上行（從1開始）是本申請 中提及的編號。SwissProt編號在下方示出以用于比較。⑶IgGlFc序列SEQIDNO:56、 SEQIDNO:57、SEQIDNO:58、SEQIDNO:59 以及SEQIDNO:60 的比對。除非另外指明， 編號的上行（從1開始）是本說明書中提及的編號。SwissProt編號在下方示出以用于比 較。
[0072] 圖2.CTLA-4多肽序列SEQIDN0:68。其中序列編號從Met開始作為位置1，SEQ IDN0:68具有 124個殘基，在殘基 16、24、27、54、56、58、59、60、61、63、64、65、70、80、85 以及 93處具可變性。在每個這些可變位置處的氨基酸殘基選自在每種情況下指示的殘基組。
[0073] 圖3.在以下測定中CTLA-4變體和Fc融合物型式的野生型CTLA-4的IC5tl曲線 圖：㈧Raji-Jurkat雙重細胞測定；(B)原代人⑶4+T細胞測定；（C)食蟹猴混合淋巴細胞 反應(yīng)測定。
[0074] 圖4.與其他相關(guān)蛋白質(zhì)配體相比，CTLA-4變體對⑶80和⑶86的特異性。（A)變 體 1299。（B)變體 1322。
[0075] 圖5.具有TM和YTE修飾的CTLA-4變體的零效應(yīng)子功能（ADCC和⑶C)的展示。 (A)ADCC。 （B)CDC。
[0076] 圖6.與Fc融合物型式的野生型CTLA-4相比，CTLA-4變體對⑶80和⑶86的單 價親和力的改進。
[0077] 圖7. (A)用于四聚體CTLA-4蛋白的構(gòu)建體設(shè)計。（B)RajiJurkat測定中對Fc融 合物型式的野生型CTLA-4與四聚體CTLA-4的效力比較。
[0078] 詳細說明
[0079] 除非另外說明，否則在本說明書中通篇使用的CTLA-4殘基的編號是如圖IA(上 行，序列編號）和圖2中所示。CTLA-4具有被切割下來的前導(dǎo)序列，并且成熟蛋白質(zhì)的至 少兩種不同的編號系統(tǒng)是可能的。CTLA-4序列可（除其他之外）以位置1的Ala開始（US 5, 434, 131)，或以位置1的Met開始（拉森等人，美國移植雜志（2005)5:443-453)。除非上 下文明確地規(guī)定，否則在此使用的編號系統(tǒng)是其中位置1為Met的編號系統(tǒng)。這還對應(yīng)于 通常用于指產(chǎn)品阿巴西普的殘基的編號。
[0080] 除非另外說明，否則在本說明書中通篇使用的Fc殘基的編號是如圖IB(上行，從 1開始）中所示。
[0081] 下列編號條款代表本發(fā)明的各方面：
[0082] 1. 一種分離的CTLA-4多肽，該分離的CTLA-4多肽與野生型CTLA-4SEQIDN0:35 相比具有更大的結(jié)合人CD80的親和力、更大的效力和/或更大的穩(wěn)定性，該多肽包含為SEQ IDN0:35的變體的氨基酸序列，其中該變體在SEQIDN0:35中包含以下氨基酸突變中的五 個或更多個：
[0083] 116 處的R、S、V或T;
[0084]A24 處的T;
[0085]S25 處的N或P;
[0086]G27 處的S;
[0087]V32 處的I;
[0088]D41 處的G;
[0089]S42 處的G;
[0090]V44 處的E;
[0091]M54 處的K;
[0092]N56 處的S或G;
[0093]L58 處的A、G、S或P;
[0094]T59 處的S或A;
[0095]F60 處的T;
[0096]L61 處的Q或P;
[0097]D62 處的G;
[0098]D63 處的Y;
[0099]S64 處的P;
[0100] 165 處的N、D、V 或T;
[0101]S70 處的A、T、M 或H;
[0102] Q80 處的R;
[0103]M85 處的Q、S、V、R、K或L;
[0104]T87 處的S;
[0105]K93 處的Q、H、T、E或M;
[0106]L104 處的R、Q或E;
[0107] 1106 處的V;
[0108]N108 處的D或S;
[0109] 1115 處的V或F;
[0110]C120 處的S;
[0111]T51處的缺失。
[0112] 2.根據(jù)條款1所述的CTLA-4多肽，其中該多肽包含與SEQIDNO:35至少70% - 致的氨基酸序列。
[0113] 3.根據(jù)條款1或條款2所述的CTLA-4多肽，包含以下氨基酸突變中的五個或更多 個：
[0114] 116 處的R、S 或V;
[0115]A24 處的T;
[0116]S25 處的 N;
[0117]G27 處的 S;
[0118]M54 處的 K;
[0119]N56 處的 S;
[0120] L58 處的 A或 G;
[0121] T59 處的 S;
[0122] F60 處的 T;
[0123]L61 處的 Q;
[0124]D63 處的 Y;
[0125]S64 處的 P;
[0126] 165 處的 N或 D;
[0127]S70 處的 A;
[0128]Q80 處的 R;
[0129] M85 處的 Q或 S;
[0130] K93 處的 Q或 H;
[0131]C120 處的S。
[0132] 4.根據(jù)條款1或條款2所述的CTLA-4多肽，包含取代S25N或S25P。
[0133] 5.根據(jù)條款1至3中任一項所述的CTLA-4多肽，包含取代S25N、K93Q或K93H。
[0134] 6.根據(jù)條款1至5中任一項所述的CTLA-4多肽，包含與SEQIDNO: 36-55中的任 一個至少70 %、80 %、90 %、95 %或98 % -致的氨基酸序列，或與由以NCMB登錄號41948 保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列至少70%、80%、90%、95%、98%或99%-致的氨基 酸序列。
[0135] 7.根據(jù)條款1至6中任一項所述的CTLA-4多肽，包含殘基59-65處的氨基酸基序 SEQIDN0:69,該殘基編號是參照SEQIDN0:35。
[0136] 8.根據(jù)條款1至6中任一項所述的CTLA-4多肽，包含選自以下各項的突變的組 合：
[0137] -1315突變，S卩116處的S;S25處的N;L58處的G;S70處的A;Q80處的R;M85處 的S;和K93處的Q;
[0138] -1322突變，即S25處的N;G27處的S;M54處的K;N56處的S;T59處的S;F60處 的T;L61處的Q;D63處的Y;S64處的P;165處的N;和K93處的Q;
[0139] -1321突變，即116處的S;S25處的N;M54處的K;L58處的G;S70處的A;Q80處 的R;M85處的S;和K93處的Q;
[0140] -1115突變，S卩116處的V;S25處的N;L58處的G;S70處的A;M85處的Q;和K93 處的Q;
[0141] -1299突變，即116處的R;A24處的T;S25處的N;G27處的S;L58處的A;S70處 的A;M85處的Q;和K93處的Q;以及
[0142] -1227突變，即116處的S;S25處的N;G27處的S;L58處的A;S70處的A;M85處 的Q;和K93處的H。
[0143] 9.根據(jù)以上條款中任一項所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQIDNO: 36-55的氨基 酸序列，或者包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列，或者包 含具有多達十個氨基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
[0144] 10.根據(jù)以上條款中任一項所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQIDNO:36-55的氨 基酸序列，或者包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列，或者 包含具有多達五個氨基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
[0145] 11.根據(jù)條款10所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQIDNO:36-55的氨基酸序列， 或者包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列，或者包含具有多 達三個氨基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
[0146] 12.根據(jù)條款1或條款2所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQIDNO:36-55的氨基 酸序列，或者包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列。
[0147] 13.根據(jù)條款 12 所述的CTLA-4 多肽，包含選自SEQIDN0:43、SEQIDN0:37、SEQ IDNO:38、SEQIDNO:36、SEQIDNO:42、SEQIDNO:47 的氨基酸序列，或由以NCMB登錄 號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列。
[0148] 14. 一種分離的CTLA-4多肽，該分離的CTLA-4多肽與野生型CTLA-4SEQIDN0:35 相比具有更大的結(jié)合人CD80的親和力、更大的效力和/或更大的穩(wěn)定性，其中該多肽包 含：
[0149] (i)氨基酸序列SEQIDNO:68、SEQIDNO:43、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQ IDNO:36、SEQIDNO:42 或SEQIDNO:47;
[0150] (ii)為含有多達十個氨基酸突變的（i)的變體的氨基酸序列，其中殘基25未突變 并且是N;
[0151] (iii)為包含一個或多個氨基酸突變的⑴的變體的氨基酸序列，其中殘基25未 突變并且是N;該變體與（i)具有至少70%的序列一致性；或
[0152] (iv)由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列。
[0153] 15.根據(jù)條款 14 所述的CTLA-4 多肽，包含SEQIDNO:68、SEQIDNO:43、SEQID NO: 37、SEQIDNO: 38、SEQIDNO: 36、SEQIDNO: 42 或SEQIDNO: 47,或具有多達五個氨 基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
[0154] 16.根據(jù)條款 15 所述的CTLA-4 多肽，包含SEQIDNO:68、SEQIDNO:43、SEQID NO: 37、SEQIDNO: 38、SEQIDNO: 36、SEQIDNO: 42 或SEQIDNO: 47,或具有多達三個氨 基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
[0155] 17.根據(jù)條款14所述的CTLA-4多肽，其中該多肽包含與SEQIDNO:68、SEQID NO:43、SEQIDNO: 37、SEQIDNO: 38、SEQIDNO: 36、SEQIDNO:42 或SEQIDNO:47 具有 至少80 %序列一致性的氨基酸序列。
[0156] 18.根據(jù)條款17所述的CTLA-4多肽，其中該多肽包含與SEQIDNO:68、SEQID NO:43、SEQIDNO: 37、SEQIDNO: 38、SEQIDNO: 36、SEQIDNO:42 或SEQIDNO:47 具有 至少90%、95%、98%或99%序列一致性的氨基酸序列。
[0157] 19.根據(jù)以上條款中任一項所述的CTLA-4多肽，該多肽具有用于結(jié)合人⑶80的 50nM或更小的親和力，其中親和力為KD，如通過表面等離子體共振所確定。
[0158] 20.根據(jù)條款19所述的CTLA-4多肽，該多肽具有用于結(jié)合人⑶80的20nM或更小 的親和力，其中該親和力為KD，如通過表面等離子體共振所確定。
[0159] 21.根據(jù)以上條款中任一項所述的CTLA-4多肽，其中該多肽具有比野生型 CTLA-4(SEQIDN0:35)更大的結(jié)合人CD86的親和力。
[0160] 22.根據(jù)條款14至21中任一項所述的CTLA-4多肽，包含：
[0161]-殘基16處的S;殘基25處的N;殘基58處的G;殘基70處的A;殘基80處的R; 殘基85處的S;和殘基93處的Q;
[0162]-殘基25處的N ;殘基27處的S ;殘基54處的K ;殘基56處的S ;殘基59處的S ; 殘基60處的T;殘基61處的Q;殘基63處的Y;殘基64處的P;殘基65處的N;和殘基處 93 的Q;
[0163]-殘基16處的S;殘基25處的N;殘基54處的K;殘基58處的G;殘基70處的A; 殘基80處的R;殘基85處的S;和殘基93處的Q;
[0164]-殘基16處的V;殘基25處的N;殘基58處的G;殘基70處的A;殘基85處的Q; 和殘基93處的Q;
[0165]-殘基16處的R;殘基24處的T;殘基25處的N;殘基27處的S;殘基58處的A; 殘基70處的A;殘基85處的Q;和殘基93處的Q;或
[0166]-殘基16處的S;殘基25處的N;殘基27處的S;殘基58處的A;殘基70處的A; 殘基85處的Q;和殘基93處的H。
[0167] 23.根據(jù)條款14至22中任一項所述的CTLA-4多肽，包含氨基酸序列SEQID NO: 43、SEQIDNO: 37、SEQIDNO: 38、SEQIDNO: 36、SEQIDNO: 42 或SEQIDNO: 47,具有 多達三個氨基酸突變。
[0168] 24.根據(jù)條款14至18中任一項所述的CTLA-4多肽，包含：位置16處的R、I、S或 V;位置24處的T或A;位置27處的S或G;位置54處的M或K;位置56處的N或S;位置 58處的A、L或G;位置59處的T或S;位置60處的F或T;位置61處的L或Q;位置63處 的D或Y;位置64處的S或P;位置65處的I、N或D;位置70處的A或S;位置80處的Q 或R;位置85處的Q、M或S;位置93處的Q或H;以及位置120處的C或S。
[0169] 25.根據(jù)條款14至18中任一項所述的CTLA-4多肽，其中這些氨基酸突變選自以 下各項：殘基16處的T取代；殘基32處的I取代；殘基41處的G取代；殘基42處的G取 代；殘基44處的E取代；殘基56處的G取代；殘基58處的S或P取代；殘基59處的A取 代；殘基61處的P取代；殘基62處的G取代；殘基65處的V或T取代；殘基70處的T、M 或H取代；殘基85處的V、R、K或L取代；殘基87處的S取代；殘基93處的T、E或M取代； 殘基104處的R、Q或E取代；殘基106處的V取代；殘基108處的D或S取代；殘基115處 的V或F取代；殘基120處的S取代；殘基51處的缺失。
[0170] 26.根據(jù)條款14所述的CTLA-4多肽，包含氨基酸序列SEQIDN0:68、SEQID NO: 43、SEQIDNO: 37、SEQIDNO: 38、SEQIDNO: 36、SEQIDNO: 42 或SEQIDNO: 47,或者 包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列。
[0171] 27. -種分離的CTLA-4多肽，該分離的CTLA-4多肽所具有的結(jié)合⑶80的親和力 比結(jié)合⑶86的親和力大至少10倍。
[0172] 28.根據(jù)條款27所述的CTLA-4多肽，該多肽所具有的結(jié)合⑶80的親和力比結(jié)合 ⑶86的親和力大至少50倍。
[0173] 29.根據(jù)條款27或條款28所述的CTLA-4多肽，其中該多肽是如條款1至26中任 一項中所定義的。
[0174] 30.根據(jù)以上條款中任一項所述的CTLA-4多肽，該多肽軛合至IgGFc氨基酸序列。
[0175] 31.根據(jù)條款30所述的CTLA-4多肽，其中該IgGFc是被修飾以降低Fc效應(yīng)子功 能的人IgGIFc，并且包含天然人IgGlFc鉸鏈區(qū)。
[0176] 32.根據(jù)條款30或條款31所述的CTLA-4多肽，其中該IgGFc氨基酸序列包含人 IgGlFc區(qū)，其中以下殘基組中的一者或兩者被如下取代：
[0177] 殘基20處的F;殘基21處的E;殘基117處的S;以及
[0178] 殘基38處的Y;殘基40處的T;殘基42處的E，
[0179] 殘基編號參照SEQIDNO:56來定義。
[0180] 33.根據(jù)條款30至32中任一項所述的CTLA-4多肽，其中該IgGFc氨基酸序列包 含SEQIDNO:59。
[0181] 34. -種分離的CTLA-4多肽，包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的 1299CTLA-4-Ig氨基酸序列。
[0182] 35.根據(jù)以上條款中任一項所述的CTLA-4多肽，其中該多肽是呈多聚體形式。
[0183] 36.根據(jù)條款35所述的CTLA-4多肽，其中該CTLA-4多肽是呈二聚體形式。
[0184] 37.根據(jù)條款35所述的CTLA-4多肽，其中該CTLA-4多肽是呈四聚體形式。
[0185] 38.根據(jù)條款37所述的CTLA-4多肽，其中該四聚體包括兩對CTLA-4多肽，每對 包括與抗體輕鏈恒定區(qū)融合的一個CTLA-4多肽和與抗體重鏈恒定區(qū)融合的一個CTLA-4多 肽。
[0186] 39. -種含有核酸的宿主細胞，其中該核酸包含以NCMB登錄號41948保藏的 1299CTLA-4-Ig核酸序列。
[0187] 40. -種組合物，包含：
[0188] 根據(jù)以上條款中任一項所述的CTLA-4多肽；以及
[0189] 一種或多種藥用賦形劑。
[0190] 41. 一種組合物，包含：
[0191]CTLA-4多肽，該多肽包含氨基酸序列SEQIDN0:68、SEQIDN0:43、SEQIDN0:47、 SEQIDN0:38、SEQIDN0:36、SEQIDN0:42、SEQIDN0:47、或由以NC頂B登錄號41948保 藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列，該多肽軛合至IgGFe氨基酸序列；以及
[0192] 一種或多種藥用賦形劑。
[0193] 42.根據(jù)條款40或條款41所述的組合物，其中該CTLA-4多肽軛合至包含SEQID NO:59的IgGFe氨基酸序列。
[0194] 43.根據(jù)條款42所述的組合物，其中軛合至IgGFe的該CTLA-4多肽包含氨基酸 序列SEQIDN0:13、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15或SEQID NO:16。
[0195] 44. 一種組合物，包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的1299CTLA-4-Ig 多肽以及一種或多種藥用賦形劑。
[0196] 45.根據(jù)條款40至44中任一項所述的組合物，包含濃度為至少70mg/ml的CTLA-4 多肽。
[0197] 46.根據(jù)條款45所述的組合物，包含濃度為至少100mg/ml的CTLA-4多肽。
[0198] 47.根據(jù)條款1至38中任一項所述的CTLA-4多肽，或根據(jù)條款40至46中任一項 所述的組合物，用于在一種通過皮下或靜脈內(nèi)給藥治療患者的方法中使用。
[0199] 48.根據(jù)條款1至38中任一項所述的CTLA-4多肽，或根據(jù)條款40至46中任一項 所述的組合物，用于在一種治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、哮喘、克羅恩氏病、潰瘍性 結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或移植排斥的方法中使用。
[0200] 49.根據(jù)條款1至38中任一項所述的CTLA-4多肽，或根據(jù)條款40至46中任一 項所述的組合物，用于在一種治療方法中使用，該方法包括以28天的間隔向患者給與所述 CTLA-4多肽或所述組合物。
[0201] 50. -種通過使選自SEQIDNO:36-55的CTLA-4多肽氨基酸序列、或由以NCMB 登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列突變而產(chǎn)生另一種CTLA-4多肽的方 法，該方法包括：
[0202] 提供一種CTLA-4多肽，該多肽包含氨基酸序列SEQIDNO: 36-55或由以NCMB登 錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列或由其組成；
[0203] 在該氨基酸序列中引入一個或多個突變以提供另一種CTLA-4多肽；
[0204] 測試該另一種CTLA-4多肽的穩(wěn)定性、親和力和/或效力；以及
[0205] 將該另一種CTLA-4多肽配制到一種包含一種或多種藥用賦形劑的組合物中。
[0206] 51.根據(jù)條款50所述的方法，其中該另一種CTLA-4多肽被軛合至Fc區(qū)。
[0207] 生物效力
[0208] 可溶性CTLA-4與在T淋巴細胞表面上表達的⑶28競爭，從而抑制配體 ⑶80 (B7. 1)和⑶86 (B7. 2)與⑶28的結(jié)合，否則這將引起T淋巴細胞的共刺激和活化。因 此，可溶性CTLA-4抑制T淋巴細胞的活化。外源性可溶性CTLA-4實現(xiàn)的這種抑制的效力可 以在體外測定中確定。CTLA-4可以任選地軛合至另一個分子，例如，作為融合蛋白。例如， 可以存在IgGFc，如在此別處所描述。該測定可以用于使用野生型CTLA-4(任選地軛合至 Fc，視情況而定）作為對照，定性地確定CTLA-4多肽是比野生型效力更高還是更低，并且還 可以提供關(guān)于效力差異量級的定量信息。執(zhí)行這類測定和分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計顯著性以便可靠 地產(chǎn)生定性或定量信息的方法是本領(lǐng)域中已知的。
[0209]CTLA-4多肽的結(jié)合可經(jīng)由IL-2的產(chǎn)生來測量，因為CTLA-4與⑶80和⑶86的結(jié) 合使IL-2產(chǎn)生減弱。合適的測定可以包括例如通過ELISA檢測所產(chǎn)生的IL-2的量。
[0210] IL-2產(chǎn)生的量的減少可以是部分的或總體的。在所測試的濃度下，CTLA-4多肽可 以使IL-2產(chǎn)生減少至少50 %、75 %或80 %，更優(yōu)選至少85 %、90 %或95 %。
[0211] 雙重細胞測定可以用于鑒別具有比野生型更高的效力的CTLA-4多肽。測定 CTLA-4多肽以便測量信號傳導(dǎo)的抑制。表達⑶28的T細胞（例如，Jurkat細胞）和表達 ⑶80和⑶86的B細胞（例如，Raji細胞）的共同培養(yǎng)導(dǎo)致IL-2的產(chǎn)生，這是由于在植物 血凝素（PHA)的存在下⑶28與配體⑶80和⑶86之間的相互作用。然后經(jīng)由ELISA檢測 IL-2。關(guān)于此測定的詳細工作實例，參見實例3。
[0212] 原代人T細胞活化測定可以用于進一步評定所選擇的多肽的效力?？梢愿鶕?jù) CTLA-4多肽抑制來自原代人⑶4+T淋巴細胞的⑶80/86介導(dǎo)的IL-2分泌的能力對它們進 行排序。還可以根據(jù)CTLA-4多肽在表達⑶80和⑶86的Raji細胞存在下抑制人⑶4+T 淋巴細胞的抗CD3刺激的增殖的能力對它們進行排序。增殖可以使用均勻發(fā)光測定（ATP Lite)來測定。此測定的一個優(yōu)點是，它測量了CTLA-4多肽阻斷原代人⑶4+T淋巴細胞的 活化的效力。關(guān)于此測定的詳細工作實例，參見實例4。
[0213] 根據(jù)本發(fā)明的某些CTLA-4多肽已顯示在測量T細胞活化的測定中以高效力結(jié)合 ⑶80和⑶86。CTLA-4多肽阻斷配體⑶80和⑶86,從而阻止來自這些分子的另外的活化信 號并且導(dǎo)致IL-2產(chǎn)生減少。
[0214]CTLA-4多肽的效力可以使用技術(shù)人員所已知的一種或多種測定和/或如在此所 描述或提及的來確定或測量。效力是以產(chǎn)生一種作用所需的量表示的活性的量度。典型地 在細胞測定中比較多肽的滴定并且報告IC5tl值。在功能性測定中，IC5tl是產(chǎn)品的濃度，此濃 度使生物應(yīng)答達減少其最大值的50%?？捎嬎鉏C5tl，方法是作為產(chǎn)品濃度的對數(shù)的函數(shù)將 最大生物應(yīng)答的％作圖，并且使用軟件程序如Prism(GraphPad)來將S形函數(shù)擬合至數(shù)據(jù) 以便產(chǎn)生IC5tl值。IC5tl值越低，產(chǎn)品的效力越大。
[0215]CTLA-4多肽可被描述為具有增大的效力，因為與參考（例如，野生型）CTLA-4多肽 相比，產(chǎn)生對IL-2產(chǎn)生的抑制所需的量更少。這也反映在所報告的IC5tl值中。與人野生型 CTLA-4(SEQIDΝ0:35)相比，優(yōu)選的CTLA-4多肽具有增大的效力。
[0216] 根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽可以具有比包含SEQID勵:35的野生型01^-4更大的 效力，其中效力是使用由B細胞活化的T細胞的IL-2產(chǎn)生測定中IC5tl的減小。效力可以比 野生型大至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍。如在此的 實例中所描述，一個多肽SEQIDNO: 36 (變體1315)顯示具有比野生型CTLA-4大大約120 倍的效力。效力可以比野生型大例如，多達150倍、多達130倍、多達120倍、多達100倍、 多達80倍、多達70倍或多達60倍。效力改進可以例如在比野生型大10倍至100倍的范 圍內(nèi)。
[0217]CTLA-4多肽的效力可以參考在此例示的CTLA-4多肽序列，而不是（或者并且）參 考野生型來測定，例如效力可以與SEQIDNO: 37 (變體1322)、SEQIDNO: 38 (變體1321)、 SEQIDNO: 43 (變體 1299)、SEQIDNO: 36 (變體 1315)、SEQIDNO: 42 (變體 1115)、SEQ IDNO: 47 (變體1227)或由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的變體1299中的任一個 相比較。因此，這些CTLA-4變體中的一個可以在測定中用作對照。CTLA-4多肽可以至少 與這些變體中的一個或多個一樣有效，例如，至少與SEQIDN0:43(變體1299)或SEQID N0:47(變體1227) -樣有效。CTLA-4多肽可以具有與SEQIDN0:36(變體1315)的效力 大約相同或小于其的效力。
[0218] 親和力
[0219]CTLA-4多肽結(jié)合⑶80或⑶86的親和力可以使用表面等離子體共振確定Kd來確 定為單價親和力。關(guān)于使用表面等離子體共振測量結(jié)合親和力并且確定Kd的工作實例，參 見實例8。所得Kd可以與野生型CTLA-4SEQIDNO: 35的Kd相比較，或者與CTLA-4多肽 SEQIDN0:37(變體1322)、SEQIDN0:38(變體1321)、SEQIDN0:43(變體1299)、SEQID NO: 36 (變體 1315)、SEQIDNO: 42 (變體 1115)、SEQIDNO: 47 (變體 1227)或由以NCMB 登錄號41948保藏的核酸編碼的變體1299之一的Kd相比較。與野生型CTLA-4的親和力 相比，CTLA-4多肽可以具有更大的結(jié)合人⑶86和/或人⑶80的親和力。
[0220] CTLA-4多肽所具有的結(jié)合人⑶80的親和力可以比野生型CTLA-4的親和力大，例 如比野生型大至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100 倍或至少 140 倍。CTLA-4 多肽可以具有至少SEQIDN0:43、SEQIDN0:37、SEQIDN0:38、SEQIDNO:36、SEQIDNO:42和SEQIDNO:47中的一個或多個的結(jié)合人CD80的親和力， 或至少由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4變體1299的親和力。CTLA-4多 肽所具有的結(jié)合人CD80的親和力可以與SEQIDN0:37的親和力大約相同或比其小。結(jié)合 人CD80的Kd可以是50nM或更小，例如25nM或更小、20nM或更小、或IOnM或更小。例如， Kd可以是在5至50nM的范圍內(nèi)。
[0221] CTLA-4多肽所具有的結(jié)合人⑶86的親和力可以比野生型CTLA-4的親和力大，例 如比野生型大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。CTLA-4多肽可以具有 至少SEQIDNO:43、SEQIDNO: 37、SEQIDNO: 38、SEQIDNO: 36、SEQIDNO:42 和SEQID NO:47中的一個或多個的結(jié)合人CD86的親和力，或至少由以NCMB登錄號41948保藏的核 酸編碼的CTLA-4變體1299的親和力。CTLA-4多肽所具有的結(jié)合人⑶86的親和力可以與 SEQIDN0:37的親和力大約相同或比其小。結(jié)合人⑶86的Kd可以是2μΜ或更小，例如 1.5μM或更小或1μM或更小。例如，Kd可以是在0.5至2μM的范圍內(nèi)。
[0222] 超過CD86的對CD80的選擇性
[0223] 在此描述的CTLA-4多肽可以結(jié)合⑶80和⑶86兩者，但可以優(yōu)先于⑶86選擇性地 結(jié)合⑶80。已知野生型CTLA-4具有相比結(jié)合⑶86的親和力更高的結(jié)合⑶80的親和力，并 且根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽也可以具有比結(jié)合CD86的親和力更大的結(jié)合CD80的親和力。 然而，與野生型CTLA-4相比，CTLA-4多肽可以具有優(yōu)先于⑶86的更大的結(jié)合⑶80的選擇 性。例如，在如在此所述的表面等離子體共振測定中，野生型CTLA-4表現(xiàn)出比結(jié)合CD86的 親和力大大約4倍的結(jié)合⑶80的親和力。相比之下，CTLA-4多肽可以表現(xiàn)出比結(jié)合⑶86 的親和力大超過10倍、超過20倍、超過30倍、超過40倍或超過50倍的結(jié)合CD80的親和 力。例如，CTLA-4多肽可以表現(xiàn)出比結(jié)合⑶86的親和力大多達120倍或130倍的結(jié)合⑶80 的親和力。因此，當與野生型CTLA-4的親和力相比時，CTLA-4多肽可以表現(xiàn)出比⑶86結(jié) 合親和力的增加更大的CD80結(jié)合親和力的增加。對于人CD80和人CD86,可以觀察到超過 ⑶86的對⑶80的選擇優(yōu)先。
[0224] 此外，對于來自食蟹猴的⑶80和⑶86,可以保持同樣的選擇優(yōu)先。超過⑶86的結(jié) 合CD80的親和力的成倍差異對于人和食蟹猴CD80和CD86而言可以是大約相同的。
[0225] 結(jié)合⑶80的親和力的改進將賦予醫(yī)學用途更好的生物學特征。通過結(jié)合⑶80(其 在活性免疫應(yīng)答的背景下在抗原呈遞細胞上被上調(diào)），CTLA-4抑制⑶80與T細胞上的⑶28 結(jié)合，從而阻斷至T細胞的活化信號。因此，CTLA-4多肽可以用于減弱體內(nèi)T細胞應(yīng)答，并 且治療其中這一點為有益的病狀，如在此別處所描述。
[0226] 通過工程化優(yōu)于⑶86選擇性地靶向⑶80的CTLA-4多肽，可以獲得結(jié)合⑶80的 相當大的親和力增加。雖然關(guān)于CD80和CD86的相對作用本文獻尚無定論，但本發(fā)明的多 肽優(yōu)于⑶86選擇性地結(jié)合⑶80并且表現(xiàn)出適于治療用途的極佳生物學特征，如在各種測 定中所示。不希望受理論束縛，本發(fā)明的CTLA-4多肽的屬性可以至少部分歸因于高的結(jié)合 ⑶80的親和力和/或相比⑶86對⑶80的優(yōu)先結(jié)合。
[0227] 各種數(shù)據(jù)表明CD80向T淋巴細胞遞送增加的活化信號的作用。例如：
[0228] 與⑶86轉(zhuǎn)導(dǎo)的CHO細胞相比，⑶80轉(zhuǎn)導(dǎo)的CHO細胞誘導(dǎo)從原代人T細胞增加的 IL-2 產(chǎn)生（斯拉維克（Slavik)等人，JBC274 (5) :3116-31241999);
[0229] 在JurkatT細胞（對細胞因子產(chǎn)生如IL-2重要的因子）中，與⑶86相比， ⑶80誘導(dǎo)增加的NFkB和AP-I轉(zhuǎn)錄因子活性（奧爾森（Olsson)等人，國際免疫學（Int. Immunol.) 10(4):499-5061998)；
[0230] 與⑶86相比，⑶80在與病毒感染的樹突細胞（對T細胞存活和增殖重要）相互 作用的⑶8+T細胞中誘導(dǎo)增加的⑶25表達（皮加瓦-加迪和亞歷山大-米勒（Pejawar-G addy&Alexander-Miller)，免疫學雜志 177:4495-4502 2006);以及
[0231] 在鼠過敏性哮喘模型中，使用突變的CTLA_4Ig分子，發(fā)現(xiàn)⑶80而非⑶86是肺嗜 酸性粒細胞增多的主要誘因（哈里斯等人，實驗醫(yī)學雜志185(1) 1997)。
[0232] 優(yōu)先地增加CTLA-4對⑶80的親和力可以因此通過靶向更高效的⑶80T細胞活化 途徑而改進T細胞活化的抑制。
[0233] 另外，存在一些證據(jù)證明⑶86信號傳導(dǎo)可以在一些疾病模型中具有有益的抗炎 作用。例如，在小鼠敗血癥模型中，觀察到嚴重程度和死亡率與CD80的上調(diào)和伴隨的CD86 的下調(diào)相關(guān)聯(lián)（諾蘭（Nolan)等人，公共科學圖書館期刊（PLoSONE) 4 (8) :6600 2009)。因 此，優(yōu)于⑶86選擇性結(jié)合⑶80可以提供一個優(yōu)點，因為這可以抑制⑶80結(jié)合⑶28,同時將 ⑶28的相互作用減少至更小的程度。
[0234] 在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)中可以發(fā)現(xiàn)⑶80和⑶86陽性細胞兩者，并且這兩 種B7分子的結(jié)合可促進療效，同時超過CD86的對CD80的選擇性可以進一步促進在抑制T 細胞活化方面的所希望的定量和定性作用。因此，本發(fā)明的CTLA-4多肽可以結(jié)合CD80和 ⑶86兩者，并且可以具有比野生型CTLA-4的親和力更高的對⑶80的親和力，并且還可以具 有比野生型CTLA-4的親和力更高的對⑶86的親和力。
[0235] 交叉反應(yīng)性
[0236] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽保持野生型CTLA-4的交叉反應(yīng)性特征。
[0237] CTLA-4多肽可顯示出用于結(jié)合食蟹猴和/或小鼠⑶80和⑶86,以及人⑶80和 ⑶86的交叉反應(yīng)性。對食蟹猴⑶80相比人⑶80的親和力的差異可以在10倍之內(nèi)、在5 倍之內(nèi)、在2倍之內(nèi)、在1. 5倍之內(nèi)或在1. 2倍之內(nèi)。對食蟹猴⑶86相比人⑶86的親和力 的差異可以在10倍之內(nèi)、在5倍之內(nèi)、在2倍之內(nèi)、在1. 5倍之內(nèi)或在1. 2倍之內(nèi)。對小鼠 ⑶80相比人⑶80的親和力的差異可以在10倍之內(nèi)、在5倍之內(nèi)、在2倍之內(nèi)、在1. 5倍之 內(nèi)或在1. 2倍之內(nèi)。對小鼠⑶86相比人⑶86的親和力的差異可以在10倍之內(nèi)、在5倍之 內(nèi)、在2倍之內(nèi)、在1.5倍之內(nèi)或在1.2倍之內(nèi)。
[0238]CTLA-4多肽可以抑制食蟹猴T淋巴細胞的活化，該活化抑制例如被測量為使用來 自食蟹猴的外周血單核細胞的混合淋巴細胞反應(yīng)中IL-2產(chǎn)生的抑制。在針對食蟹猴T淋 巴細胞的活化抑制的測定中，該多肽可以顯示出比野生型CTLA-4更大的效力。
[0239] 關(guān)于本發(fā)明的示例性CTLA-4多肽的物種交叉反應(yīng)性的數(shù)據(jù)在實例8中示出。
[0240]CTLA-4多肽可以顯示出對⑶80和⑶86優(yōu)先于B7家族中的其他相關(guān)蛋白質(zhì)的特 異性結(jié)合。因此，可能缺乏與PD-L2、B7-H1、B7-H2、B7-H3以及B7-H3B的交叉反應(yīng)性。
[0241] 用于確定特異性的測定是本領(lǐng)域中已知的。例如，可以使用酶免疫測定。關(guān)于合 適測定的工作實例，參見實例6。
[0242] 穩(wěn)定性
[0243]CTLA-4多肽優(yōu)選至少保持野生型CTLA-4的穩(wěn)定性，并且優(yōu)選比野生型更加穩(wěn)定， 例如如針對單獨CTLA-4或如下所述的軛合（例如，融合）至Fe區(qū)的CTLA-4所測量。
[0244] 據(jù)信，更穩(wěn)定的CTLA-4FC軛合物（"CTLA_4Ig"）將能夠更好地耐受皮下遞送所要 求的高（例如，彡l〇〇mg/ml)濃度配制物。
[0245] 可以在降解測定中測試穩(wěn)定性。典型地，這包括將產(chǎn)品在固定溫度（例如，5°C或 25°C)下孵育一段時間，例如一個月，并且確定在那個月內(nèi)的純度損失程度（降解程度）。 聚集和/或片段化可能造成純度損失，并且各自可以被單獨測量以確定一個百分比，兩個 值總計達到純度損失％。降解測定的工作實例在實例9和實例10中陳述。
[0246] 具有改進的穩(wěn)定性的CTLA-4多肽因為聚集減少可以更適于給藥途徑如皮下給 藥，聚集減少不僅增大功效而且降低中和或結(jié)合被激發(fā)的抗體的風險。
[0247] 與Fe軛合
[0248] 在一個實施例中，本發(fā)明提供一種親和力優(yōu)化的CTLA_4Ig分子，該分子任選地具 有延長的半衰期（例如，包含在此進一步描述的YTE突變），用于皮下或靜脈內(nèi)配制物，并且 用于每月、28天的間隔或更小頻率的給藥以用于治療中度至重度RA或如所述的其他病狀。
[0249] 本發(fā)明提供一種多肽，該多肽由CTLA-4多肽序列組成，或者包含一種肽或多肽序 列或軛合至該肽或多肽序列，例如軛合至抗體分子或抗體分子的一部分。例如，CTLA-4多 肽可以軛合至抗體Fe氨基酸序列，例如，IgGFe。一個Fe區(qū)包括一個鉸鏈區(qū)、一個CH2區(qū) 和一個CH3區(qū)。優(yōu)選地，IgG是人IgG，例如IgGl、IgG2或IgG4。
[0250]IgGl的同種異型變體是已知的。優(yōu)選地，IgGlFc區(qū)包含殘基142處的E和殘基 144處的M(編號對應(yīng)于SEQIDNO: 56,從1開始，如圖1中所不）。這種同種異型在一般群 體中得到充分體現(xiàn)。一種替代性IgGlFc區(qū)（代表一種不同的同種異型）包含殘基142處 的D和殘基144處的L。阿巴西普中采用這種同種異型。
[0251]IgGFe氨基酸序列可以包含具有某些突變的人IgG(例如IgGl或IgG4)Fe的氨 基酸序列。例如，在人IgG是IgGl時，氨基酸序列可以被突變以便減少或廢除Fe效應(yīng)子功 能，例如補體依賴性細胞毒性（CDC)和抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。Fe效應(yīng)子功能的去除 可以在已知常規(guī)測定中進行確認。關(guān)于確定ADCC和CDC的示例性測定，參見實例7。
[0252] 已知IgGl效應(yīng)子功能可以通過IgGlFc鉸鏈區(qū)的突變來降低。這一點的一個實例 在阿巴西普CTLA-4-IgGlFc構(gòu)建體中，該構(gòu)建體在IgGlFc區(qū)中并入一個突變的鉸鏈序列， 其中野生型C被突變?yōu)镾。阿巴西普的IgGl區(qū)包含氨基酸序列SEQIDNO: 71，該氨基酸序 列對應(yīng)于野生型人IgGlFc氨基酸序列SEQIDNO: 70,其中野生型C被S取代。這些取代是 在Fe區(qū)的殘基6、12以及15處。
[0253]SEQIDN0:70VEPKSCDKTHTCPPCPAPE
[0254]SEQIDNO:71QEPKSSDKTHTSPPSPAPE
[0255] 在本發(fā)明的背景中已出人意料地發(fā)現(xiàn)，這種突變降低了Fe結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，這樣 使得阿巴西普CTLA4-IgGlFc融合物具有比使用野生型IgGlFc序列的CTLA-4-IgGlFc融 合物整體更低的穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定性損失是不合需要的，盡管如此但它仍然對降低或避免 IgGlFc效應(yīng)子功能至關(guān)重要。
[0256] 軛合至本發(fā)明的CTLA-4多肽的Fe區(qū)優(yōu)選不包含SEQIDNO:71。優(yōu)選地，保留Fe 的殘基6、12和/或15處的半胱氨酸。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4-Fc軛合物包含野生 型人IgGlFc鉸鏈區(qū)。優(yōu)選地，F(xiàn)e區(qū)包含SEQIDNO:70。Fe區(qū)可以是如由以NCMB登錄號 41948保藏的核酸編碼的1299CTLA4-Ig多肽的Fe區(qū)。
[0257] 阿巴西普Fe回復(fù)突變?yōu)橐吧腿コ蒄e突變所致的不穩(wěn)定性，而這同時也恢復(fù) 了IgGlFc的效應(yīng)子功能，這在許多治療應(yīng)用中是不合需要的。因此，這種突變改進了阿巴 西普Fe結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，但卻以重新引入不合需要的效應(yīng)子功能為代價。
[0258] 可以使用具有更低的或不具有效應(yīng)子功能的其他IgGFe區(qū)，例如IgG2。
[0259] 本發(fā)明提供一種使用缺乏效應(yīng)子功能的IgGIFc，同時克服阿巴西普突變中所固 有的穩(wěn)定性降低問題的方式。根據(jù)本發(fā)明的Fe區(qū)可以是包含三重突變（TM)L20F、L21E、 P117S的IgGlFc(奧加捏相（Oganesyan)等人，2008,晶體學報D(ActaCrystallogrDBiol Crystallogr. )64:700-4)。這種突變降低Fe效應(yīng)子功能，而不降低穩(wěn)定性。因此，這樣一 種Fe結(jié)構(gòu)域有助于高濃度的CTLA-4-Fc構(gòu)建體的配制，這些構(gòu)建體適合于產(chǎn)生用于皮下給 藥的組合物。
[0260] 仍然另外的益處可以通過在Fe區(qū)中并入"YTE"突變來實現(xiàn)（道爾阿奎 (Dali，Acqua)等人，2006,生物化學雜志281:23514-24)。YTE突變提供延長的體內(nèi)半衰 期，這可以改進療效和/或可以允許在降低或減小的頻率劑量，如每月劑量下實現(xiàn)治療益 處。在本發(fā)明的產(chǎn)品中使用的Fe結(jié)構(gòu)域可以包含殘基38處的Y、殘基40處的T以及殘基 42處的E。這代表來自人IgGlFc的突變M38Y、S40T、T42E。
[0261] 除了上述YTE和/或三重突變，優(yōu)選的是Fe結(jié)構(gòu)域的其他殘基是野生型人IgG殘 基。人IgGlFc的一些改變是已知的，并且該Fe區(qū)可以包含具有YTE和/或三重突變的任 何人IgGl。
[0262] 優(yōu)選地，CTLA-4多肽軛合至IgGlFc氨基酸序列SEQIDNO:59。這包括人IgGlFc 鉸鏈區(qū)，缺乏阿巴西普C至S突變，并入三重突變以便降低效應(yīng)子功能，并且包括YTE半衰 期延長。
[0263] 在此描述的改進的Fe區(qū)可以與野生型CTLA-4聯(lián)合使用，但當軛合至根據(jù)本發(fā)明 的CTLA-4多肽時提供還另外的益處。CTLA-4多肽可以任選地經(jīng)由一個或多個連接氨基酸 或接頭肽在其C末端軛合至Fe區(qū)的N末端。優(yōu)選地，軛合物是CTLA-4-Fc融合蛋白。
[0264]例如，包含氨基酸序列SEQIDN0:43、SEQIDN0:37、SEQIDN0:38、SEQID N0:36、SEQIDN0:42或SEQIDN0:47的CTLA-4多肽可以軛合至IgGFe氨基酸序列SEQ IDNO:59或軛合至IgGFe氨基酸序列SEQIDNO:60。
[0265] 根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4-IgGFe融合蛋白可以包含SEQIDNO: 13、SEQIDNO: 11、 SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15 或SEQIDNO:16。
[0266] 由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的1299CTLA-4-IgGFe多肽是本發(fā)明的 一個實施例。如果需要，由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的1299CTLA-4多肽可以 可替代地軛合至不同的Fe區(qū)。
[0267]CTLA-4多肽產(chǎn)品
[0268]CTLA-4多肽（包括CTLA-4-Fc的）可以是單體的或多聚體的，例如二聚體的、三聚 體的、四聚體的或五聚體的。如在此別處所討論，CTLA-4可以形成二聚體。這種天然二聚 化可以通過將CTLA-4軛合至Fe結(jié)構(gòu)域或其他二聚化結(jié)構(gòu)域來促成。
[0269] 包含多個CTLA-4多肽的多肽多聚體是本發(fā)明的一方面。該多聚體內(nèi)的該多個 CTLA-4多肽可以是彼此相同或不同的。一種多聚體可以包含一些相同的多肽和/或一些不 同的多肽。一種多聚體可以包含一個或多個根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽，以及一個或多個其 他多肽。該一個或多個其他多肽可以包括例如，野生型CTLA-4和/或非CTLA-4多肽的多 肽。
[0270] 該多聚體可以是包含兩個根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽的二聚體，這些多肽可以是 相同的（同二聚體）或不同的（異二聚體）。
[0271] 該多聚體可以是包含四個根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽的四聚體，這些多肽可以是 全部相同的（同四聚體），或可以包括一個或多個根據(jù)本發(fā)明的不同的CTLA-4多肽（異四 聚體）。該多聚體可以是包含兩個根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽（彼此相同或不同）以及兩個 其他CTLA-4多肽（如野生型CTLA-4多肽）的四聚體。
[0272] 在CTLA-4是多聚體形式的情況下，CTLA-4多肽任選地與免疫球蛋白Fc區(qū)和/或 抗體分子軛合。軛合物可以或可以不包含抗體抗原結(jié)合位點VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域。
[0273] 本發(fā)明的一方面是一種軛合物，該軛合物包含一個或多個，例如兩個、三個、四個 或五個CTLA-4多肽以及抗體分子或抗體結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選人。二聚化CTLA-4結(jié)構(gòu)域可以軛合至 抗體重鏈-輕鏈對?？贵w分子可以包括兩個重鏈-輕鏈對，每個重鏈包括一個VH結(jié)構(gòu)域和 一個或多個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域（例如CHl、CH2和CH3)，并且每個輕鏈包括一個VL結(jié)構(gòu)域和一 個輕鏈恒定區(qū)，其中這兩個重鏈-輕鏈對通過重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的二聚化而連接，并且其中4 個CTLA-4多肽軛合至抗體分子，一個CTLA-4附接至四個可變結(jié)構(gòu)域中的每個。輕鏈恒定 區(qū)可以是λ或κ輕鏈。一對CTLA-4分子可以附接至每個VH-VL結(jié)構(gòu)域?qū)?，其中附接至VH 結(jié)構(gòu)域的CTLA-4多肽與附接至VL結(jié)構(gòu)域的CTLA-4多肽形成二聚體。優(yōu)選地，CTLA-4的C 末端與VH或VL結(jié)構(gòu)域的N末端融合。優(yōu)選地，VH和VL配對將不賦予與已知人抗原的任 何結(jié)合。
[0274] 任選地，使抗體VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的一些或全部缺失，這樣使得CTLA-4多肽被 包括在內(nèi)代替該VH和/或VL結(jié)構(gòu)域或代替該VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的一部分。二聚體因此 可以包括一對CTLA-4多肽，一個與抗體輕鏈恒定區(qū)融合，一個與抗體重鏈恒定區(qū)融合。四 聚體因此可以包括兩對CTLA-4多肽，每對包括與抗體輕鏈恒定區(qū)融合的一個CTLA-4多肽 和與抗體重鏈恒定區(qū)融合的一個CTLA-4多肽。如上所述，重鏈恒定區(qū)包括一個或多個重鏈 恒定結(jié)構(gòu)域，例如CH1、CH2和CH3,并且輕鏈恒定區(qū)可以是λ或κ。
[0275] 本發(fā)明還包括CTLA4五聚體?？梢匀芜x地通過所附接的抗體Fc區(qū)的五聚化將五 個CTLA4多肽組裝以便形成五聚體。使用IgM(其是天然五聚體的）的Fc區(qū)，五聚體形成 得到促進。因此，包含IgM(優(yōu)選人IgM)的Fc區(qū)的五個CTLA4-FC多肽可以被安排為五聚 體。已對五聚體CTLA4進行了描述（山田（Yamada)等人，微生物學與免疫學（Microbiol. Immunol.)40(7):513-5181996)。
[0276] 多聚體內(nèi)的多肽可以例如通過二硫鍵來共價連接。共價鍵可以存在于CTLA4多肽 之間和/或連接至CTLA-4多肽的任何Fc區(qū)之間。在采用Fc區(qū)和/或其他抗體結(jié)構(gòu)域的 情況下，多肽可以按照與這類Fc結(jié)構(gòu)域和/或其他抗體結(jié)構(gòu)域天然發(fā)生的方式相同的方式 連接。在CTLA-4多肽的半胱氨酸殘基之間二硫鍵的形成在此別處進行描述。
[0277] 這類多聚體和軛合物可以用于如在此針對CTLA-4多肽所描述的任何方法或任何 用途。多聚體結(jié)構(gòu)可以促進CTLA-4的生物活性，例如對T細胞活化的抑制。野生型CTLA-4 的抑制顯示以四聚體形式增強（實例11，圖7)。
[0278]CTLA-4多肽可以是標記的或未標記的。可以向CTLA-4序列或向軛合至其的Fe區(qū) 添加標記。
[0279] 該CTLA-4和/或Fe區(qū)可以是糖基化的或未糖基化的。優(yōu)選地，CTLA-4和/或Fe 攜帶它們的正常人糖基化。
[0280] 如在此描述的CTLA-4多肽可以被進一步修飾并開發(fā)以便提供改進的或改變的額 外變體。例如，在此描述的根據(jù)本發(fā)明的一種CTLA-4多肽的氨基酸序列可以通過引入一個 或多個突變（例如取代）來修飾，以便提供另一種CTLA-4多肽，然后可以例如如在此別處 所描述的測試該另一種CTLA-4多肽的效力、親和力（對于CD80和/或CD86)和/或穩(wěn)定 性。
[0281]CTLA-4多肽優(yōu)選地保持如在此描述的一種或多種所希望的功能特性。這類特性包 括結(jié)合⑶80和/或⑶86的能力；以比野生型CTLA-4更大的親和力結(jié)合⑶80和/或⑶86 的能力；和/或如在此針對本發(fā)明的CTLA-4多肽描述的效力、親和力和/或穩(wěn)定性，例如如 通過表面等離子體共振確定的50nM或更小的結(jié)合人CD80的KD。如在此所描述，與野生型 CTLA-4SEQID勵:35相比，本發(fā)明的(^1^-4多肽典型地具有更大的結(jié)合人^80的親和力、 更大的效力和/或更大的穩(wěn)定性。
[0282]CTLA-4多肽可以包含與SEQIDN0:36-55中的任一個，例如與SEQIDN0:43、SEQ IDN0:37、SEQIDN0:38、SEQIDN0:36、SEQIDN0:42 或SEQIDN0:47 具有至少 70%、 至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列或由其組 成。CTLA-4多肽可以包含與SEQIDNO:68具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、 至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列或由其組成。CTLA-4多肽可以包含與由以 NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列具有至少70%、至少80%、至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的氨基酸序列或由其組成。
[0283]CTLA-4多肽可以包含具有一個或多個氨基酸突變的SEQIDNO:36-55、SEQID NO: 68或由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列中的任一個或由其 組成。例如，CTLA-4多肽可以包含多達十二個，例如多達十個氨基酸突變，例如多達五個突 變，例如一個、兩個或三個氨基酸突變。突變的實例在此別處進行描述。
[0284] 引入一個或多個突變之后，可以針對所希望的功能特性測試CTLA-4多肽，這些特 性如結(jié)合⑶80和/或⑶86的能力；以比野生型CTLA-4更大的親和力結(jié)合⑶80和/或⑶86 的能力；和/或如在此針對本發(fā)明的CTLA-4多肽描述的效力、親和力和/或穩(wěn)定性，例如如 通過表面等離子體共振確定的50nM或更小的結(jié)合人CD80的KD。
[0285] 本發(fā)明的一個方面是一種方法，該方法包括
[0286] 提供一種包含如在此所描述的CTLA-4多肽氨基酸序列或由其組成的CTLA-4多 肽；
[0287] 在該氨基酸序列中引入一個或多個突變以提供另一種CTLA-4多肽；并且
[0288] 測試該另一種CTLA-4多肽的穩(wěn)定性、親和力和/或效力。
[0289]CTLA-4多肽氨基酸序列可以包含例如SEQIDNO36-55或SEQIDN0:68或由以 NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列中的任一個或由其組成。例如， 氨基酸序列可以是SEQID勵:43、37、36、38、42或47。
[0290] -個（含）與二十個（含）之間的突變可以被任選地引入，并且可以包括取代、 缺失、插入或任何這些的混合。例如，可以引入一個或多個取代，例如一個（含）與二十個 (含）之間的取代。
[0291] 用于測試該另一種CTLA-4多肽的穩(wěn)定性、親和力和/或效力的測定的實例在此進 行描述。該另一種多肽可以具有不顯著低于衍生其的CTLA-4多肽或大于衍生其的CTLA-4 多肽的穩(wěn)定性、親和力和/或效力。
[0292] 該方法可以包括確定該另一種CTLA-4多肽具有如在此針對本發(fā)明的CTLA-4多肽 描述的效力、親和力和/或穩(wěn)定性，例如確定它具有如通過表面等離子體共振確定的50nM 或更小的結(jié)合人CD80的KD。
[0293] 被鑒別為具有如在此針對本發(fā)明的CTLA-4多肽描述的效力、親和力和/或穩(wěn)定性 的另一種CTLA-4多肽然后可以被配制成一種藥用組合物或用于包括如在此描述的治療方 法的方法中。
[0294] 該方法可以包括將該另一種CTLA-4多肽配制到包含一種或多種藥學上可接受的 賦形劑的組合物中。這類組合物、它們的用途以及配制在此別處進行更詳細地描述。CTLA-4 多肽可以按在此描述的任何型式提供，例如它可以如所述的軛合至Fc區(qū)。
[0295] 可以產(chǎn)生編碼CTLA-4多肽，例如CTLA-4-Fc構(gòu)建體的核酸分子。例如，核酸分子 可以編碼根據(jù)本發(fā)明的任何CTLA-4多肽氨基酸序列或CTLA-4-Fc氨基酸序列。該核酸可 以包含以NCMB登錄號41948保藏的核酸序列，該核酸序列編碼1299CTLA-4-Ig多肽，或至 少編碼其CTLA-4多肽區(qū)。核酸分子可以被分離，并且可以包含于一種載體，例如一種用于 在細胞中表達該核酸的重組載體中。體外細胞可以包含該載體，并且可以用于表達CTLA-4 多肽或CTLA-4FC產(chǎn)品。多肽可以由具有NCMB保藏登錄號41948的大腸桿菌細胞系表達。
[0296] 如在此描述的CTLA-4多肽可以通過包括從編碼核酸表達多肽的一種方法來產(chǎn) 生。這可以方便地通過在引起或允許CTLA-4多肽表達的適當條件下在含有這種載體的培 養(yǎng)基中生長宿主細胞而實現(xiàn)。CTLA-4多肽還可以在體外系統(tǒng)，如網(wǎng)織紅細胞裂解物中表達。 通過表達產(chǎn)生CTLA-4多肽之后，可以常規(guī)地測試其活性，例如其結(jié)合⑶86或⑶80的能力。
[0297] 用于在各種不同的宿主細胞中克隆并表達多肽的系統(tǒng)是眾所周知的，并且可以用 于表達在此描述的CTLA-4多肽，包括CTLA-4-Fc多肽。適合的宿主細胞包括細菌、真核細 胞（如哺乳動物細胞和酵母）以及桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域中可用于表達異源多肽的哺乳動 物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、COS細胞以及許多其他細胞。 常見的優(yōu)選細菌宿主是大腸桿菌?？蛇x擇或構(gòu)建合適載體，它們含有適當?shù)恼{(diào)控序列，包括 啟動子序列、終止子片段、多腺苷酸化序列、增強子序列、標志物基因以及視情況的其他序 列。視情況而定，載體可以是質(zhì)粒、病毒，例如噬菌體或噬菌粒。用于例如在核酸構(gòu)建體制 備、誘變、測序，將DNA引入細胞和基因表達以及蛋白質(zhì)分析中操作核酸的許多技術(shù)和方案 是已知的。
[0298] 通常，編碼根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽的核酸被提供為分離物、呈分離的和/或純 化的形式，或者不含或基本上不含污染物。核酸可以是完全或部分合成的，并且可以包括基 因組DNA、cDNA或RNA。
[0299] 核酸可以作為可復(fù)制載體的一部分來提供，并且本發(fā)明還提供的是包含編碼本發(fā) 明的CTLA-4多肽的核酸的載體，具體是所編碼的多肽可在適當條件下從其表達的任何表 達載體；以及含有任何這種載體或核酸的宿主細胞。在此背景下的表達載體是這樣一種核 酸分子，該核酸分子包含編碼感興趣的多肽的核酸以及用于在體外表達系統(tǒng)（例如網(wǎng)織紅 細胞裂解物）中或在體內(nèi)例如在如COS或CHO細胞的真核細胞中或在如大腸桿菌的原核細 胞中表達多肽的適當調(diào)控序列。
[0300] 如在此所披露，宿主細胞可以含有核酸。本發(fā)明的核酸可以整合至宿主細胞的基 因組（例如染色體）中。整合可根據(jù)標準技術(shù)通過將促進與基因組重組的序列包含在內(nèi)來 促成。核酸可以在細胞內(nèi)的染色體外載體上。
[0301] 核酸可以被引入宿主細胞中。引入，通?？梢裕ㄌ貏e是對于體外引入來說）被稱 為（但不限于）"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)染"，可以采用任何可用的技術(shù)。對于真核細胞，合適技術(shù)可 以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒例如牛痘（或?qū)τ?昆蟲細胞，使用桿狀病毒）的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)。對于細菌細胞，合適技術(shù)可以包括 氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔以及使用噬菌體來轉(zhuǎn)染。
[0302] 標志物基因（如抗生素抗性或敏感性基因）可以用于鑒別含有感興趣的核酸的克 隆，如本領(lǐng)域所眾所周知的。
[0303] 引入之后可以引起或允許從核酸表達，方法是例如通過在用于表達基因的條件下 培養(yǎng)宿主細胞（其可以包括實際轉(zhuǎn)化的細胞，但更可能的是細胞將是轉(zhuǎn)化的細胞的后代）， 這樣使得產(chǎn)生所編碼的多肽。如果多肽被表達為與適當?shù)男盘柷皩?dǎo)肽偶聯(lián)，它可從細胞分 泌到培養(yǎng)基中。通過表達產(chǎn)生之后，可以根據(jù)具體情況將多肽從宿主細胞和/或培養(yǎng)基中 分離和/或純化，并且隨后根據(jù)需要例如在一種可以包含一種或多種額外的組分的組合 物，如包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑、媒介物或載體的藥用組合物的配制中使用 (例如，參見下文）。
[0304] 根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽可以例如在通過從編碼核酸表達而產(chǎn)生之后（例如使 用一種抗體）來分離和/或純化。因此，CTLA-4多肽可以被提供為不含或基本上不含污染 物。CTLA-4多肽可以被提供為不含或基本上不含其他多肽。分離的和/或純化的CTLA-4 多肽可以在一種可以包含至少一種額外組分的組合物，例如包含一種藥學上可接受的賦形 齊U、媒介物或載體的藥用組合物的配制中使用。包含根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽的組合物可 以用于預(yù)防性和/或治療性治療，如在此別處所討論。
[0305] 因此，本發(fā)明的一個方面是一種包含本發(fā)明的CTLA-4多肽（任選地軛合至IgGFc 的CTLA-4多肽）以及一種或多種藥用賦形劑的組合物。根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽的許多 實例在此別處描述，并且任一種可以軛合至Fc區(qū)。
[0306] 例如，該組合物可以包含以下各項或由其組成：
[0307] -種軛合至IgGFc氨基酸序列SEQIDNO: 59的CTLA-4多肽，該多肽包含氨基酸 序列SEQIDNO: 43 (變體 1299)、SEQIDNO: 37 (變體 1322)、SEQIDNO: 38 (變體 1321)、 SEQIDNO: 36 (變體 1315)、SEQIDNO: 42 (變體 1115)或SEQIDNO: 47 (變體 1227);以及
[0308] 一種或多種藥用賦形劑。
[0309] 該組合物可以包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的1299CTLA-4Ig多 肽以及一種或多種藥用賦形劑或由其組成。
[0310]例如，CTLA-4 多肽可以包含氨基酸序列SEQIDNO: 13、SEQIDNO: 11、SEQID NO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15 或SEQIDNO:16。
[0311] 根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含濃度為至少70mg/ml，例如至少80mg/ml、至少 90mg/ml或至少lOOmg/ml的CTLA-4多肽。濃度被計算為包括糖基化的多肽的質(zhì)量，并且在 存在Fc區(qū)時將Fc區(qū)包括在內(nèi)。多肽濃度可以通過標準分光光度測量方法，基于所計算的 包括糖基化（如果存在）的多肽的質(zhì)量使用一個消光系數(shù)來確定。當存在糖基化時，可假 定它是完整的。合適的方法在實例中進行說明。例如，可以使用1.09的消光系數(shù)來確定濃 度，如針對1299CTLA-4-Fc所例示的。
[0312] 配制物和醫(yī)學用途
[0313]本發(fā)明的CTLA-4多肽可以通過每月給藥或更小頻率給藥來給與。低頻率給藥通 常是所希望的以便減輕患者和臨床醫(yī)生的負擔，但會涉及較低療效的風險和/或產(chǎn)品劑量 增加的需求。根據(jù)本發(fā)明的效力、親和力和/或半衰期的改進降低了這類風險并且提供了 與先前給藥方案相比更低或更小頻率給藥的可能性。
[0314]對于許多患者來說，將要求在延長的時間段內(nèi)進行治療，例如持續(xù)許多年，并且可 能持續(xù)患者的一生。因此設(shè)想將給與多個劑量。劑量之間的間隔可以是數(shù)天、一周或一月 的數(shù)量級。優(yōu)選地，以至少或大約14、21或28天的間隔進行給藥。優(yōu)選地，通過以28天或 更大間隔的給藥（例如每月給藥）進行皮下遞送而對患者給藥。
[0315]給藥可以是靜脈內(nèi)的或通過任何其他合適的給藥途徑。例如，可以通過皮下注射 給與CTLA-4多肽，這有助于患者在家自我給藥并且提供與靜脈內(nèi)給藥方案相比減少患者 到訪診所的潛在優(yōu)勢。
[0316] 與用于靜脈內(nèi)給藥的配制物相比，將CTLA-4配制到適合于皮下給藥的減小體積 中典型地要求更大濃度的CTLA-4產(chǎn)品。對于皮下給藥，至少70mg/ml的濃度典型地是優(yōu)選 的，更優(yōu)選地至少l〇〇mg/ml。根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4組合物的改進的穩(wěn)定性有助于例如針對 皮下給藥以高濃度配制。
[0317]根據(jù)本發(fā)明并且用于根據(jù)本發(fā)明使用的藥用組合物除了活性成分以外，還可以包 含一種藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他材料。 這些材料應(yīng)無毒并且不應(yīng)干擾活性成分的功效。載體或其他材料的確切性質(zhì)將取決于給藥 途徑，給藥途徑可以是任何合適的途徑，但最可能的是注射（用或不用針），尤其是皮下注 射。其他優(yōu)選的給藥途徑包括通過吸入給藥或鼻內(nèi)給藥。
[0318]對于靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射，活性成分將呈胃腸外可接受的水溶液形式，該溶液 不含熱原質(zhì)并且具有適合的pH、等滲性以及穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠使用例如等 滲媒介物，如氯化鈉注射液、林格氏注射液、或乳酸鹽林格氏注射液來制備合適溶液。需要 時，可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
[0319]根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽可以用于診斷或治療人或動物身體，優(yōu)選人的方法中。
[0320] 治療方法可以包括給與根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽，例如給與包含該CTLA-4多肽 的藥用組合物。如在此描述的CTLA-4多肽或包含CTLA-4多肽的組合物可以用于在通過皮 下或靜脈內(nèi)給藥治療患者的方法中使用。
[0321]CTLA-4多肽可以優(yōu)選通過以"預(yù)防有效量"或"治療有效量"（視情況而定，但預(yù) 防可被視為療法）給藥而提供給個體，這足以對個體顯示出益處。所給予的實際量以及給 予的速率和時程將取決于正治療的疾病的性質(zhì)和嚴重程度。治療處方，例如劑量等的確定， 屬于全科醫(yī)生和其他醫(yī)生的職責。
[0322]取決于待治療的病狀，組合物可單獨或與其他治療組合，同時或順序地給予。
[0323] CTLA-4多肽適用于減弱T細胞應(yīng)答，并且因此可以用于治療其中T細胞應(yīng)答減弱 是有益的病狀。CTLA-4多肽可以用于提供治療益處的臨床適應(yīng)癥包括自身免疫性疾病和/ 或炎性疾病。治療適應(yīng)癥的實例是類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA)、幼年型關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、 銀屑病、多發(fā)性硬化癥、哮喘、克羅恩氏病、狼瘡腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、移植 排斥、I型糖尿病、干燥綜合癥和潰瘍性結(jié)腸炎，以及其他自身免疫性病狀如脫發(fā)。根據(jù)本 發(fā)明的CTLA-4多肽被視為特別適合于患有中度至重度RA的患者。
[0324] 用根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽或藥用組合物治療的患者可以是患有中度至重度活 動性RA的那些患者，不管先前或正在用合成的緩解疾病的抗風濕藥（DMRD)或用不同于 CTLA-4,例如不同于阿巴西普的生物制劑進行治療。根據(jù)本發(fā)明的CTLA-4多肽可以用于通 過單一療法，結(jié)合常規(guī)DMARD(在對常規(guī)DMARD應(yīng)答不足的患者中，或在生物制劑失效患者 中）來治療患者。
[0325] 可以監(jiān)測治療功效，并且可以獲得關(guān)于關(guān)節(jié)損傷進展和/或患者功能的數(shù)據(jù)。
[0326] 實例
[0327] 以下CTLA4_Ig序列已保藏在NCMB:
[0328] 大腸桿菌DH5a變體 1299 =NCMB41948
[0329] 保藏日期=2012年3月13日
[0330] 用于優(yōu)化CTLA-4FC融合分子的生物效力的策略由兩個主要活動組成。一個活動 是利用核糖體展示執(zhí)行CTLA-4結(jié)構(gòu)域的定向進化以便選擇該結(jié)構(gòu)域的改進的對配體CD80 和CD86的親和力，以及改進的穩(wěn)定性。對來自核糖體展示選擇的輸出（由不同群體的 CTLA-4變體組成）進行測序，并且將編碼獨特序列的那些與Fc融合配偶體一起表達以用 于直接在體外T細胞刺激測定中測試。此方法的優(yōu)點是在生物相關(guān)測定中以藥物樣型式， 即在促進二聚化的Fc結(jié)構(gòu)域的背景下對許多不同的CTLA-4變體（>1，000被測試）進行排 序。此策略的另一個特征是執(zhí)行與改進的生物功能相關(guān)聯(lián)的那些CTLA-4突變的重組，以便 通過協(xié)同作用實現(xiàn)效力的進一步增加。
[0331] 這種方法能夠同時選擇更高親和力的CTLA-4變體和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。親和力選擇 采用降低濃度的靶配體（在此情況下是CD80/86)，以便選擇性地富集更高親和力的CTLA-4 變體。改進的穩(wěn)定性選擇使用去穩(wěn)定劑如DTT，或疏水相互作用色譜（HIC)珠粒來從選擇池 中除去不太穩(wěn)定或更易于解折疊的那些變體。因此，穩(wěn)定性和親和力壓力可以應(yīng)用于一個 單一選擇中，而不是追求并行方法。
[0332] 第二個活動是合理地工程化Fc結(jié)構(gòu)域以便引入已知除去Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能并 且增強分子的體內(nèi)循環(huán)半衰期的突變。不同的變體Fc區(qū)被制備為與CTLA-4的融合物并且 在加速的體外穩(wěn)定性研究中進行測試以便選擇具有最佳穩(wěn)定性特征的Fc區(qū)。
[0333] 在進行這兩個并行活動和后續(xù)篩選之后，將最具效力的CTLA-4結(jié)構(gòu)域（如通過在 多個體外T細胞刺激測定中的抑制所測量的）與最穩(wěn)定的工程化Fc結(jié)構(gòu)域（如通過加速 的體外穩(wěn)定性研究所測量的）組合。針對生物效力和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的另外體外測試允許以 最終藥物型式對分子進行相對排序。
[0334] 實例I.CTLA-4奪體f庫的構(gòu)律和針對改講的效力和穩(wěn)定件的核糖體展示詵擇
[0335] 對單體人CTLA-4結(jié)構(gòu)域進行核糖體展示，該結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于Swiss-Prot登記號 P16410,胞外結(jié)構(gòu)域的殘基38-161，無Fc區(qū)附加。此序列（SEQIDNO: 35)也被稱為野生型 CTLA-4。通過將所要求的人CTLA-4cDNA的部分克隆到含有核糖體展示所要求的5'和3' 調(diào)控元件的載體中來獲得CTLA-4核糖體展示構(gòu)建體（漢斯（Hanes)等人，酶學方法（Meth. Enzymol.) (2000) 328:404)。此構(gòu)建體包含T7RNA聚合酶啟動子序列，其后是CTLA-4編碼 序列上游的原核生物核糖體結(jié)合位點（夏因-達爾加諾序列（Shine-Dalgarnosequence)。 將人CTLA-4的二聚化界面中的氨基酸120 (或根據(jù)Swiss-Prot登記號P16410中的編號的 位置157)處的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸以防止CTLA-4分子以核糖體展示型式二聚化，不然 這可能會干擾改進的CTLA-4序列的選擇。在CTLA-4序列下游，來自絲狀噬菌體的基因III 蛋白的一部分被包括在內(nèi)作為一個間隔區(qū)，以便允許CTLA4變體從核糖體隧道中展示出。 CTLA-4核糖體展示構(gòu)建體還含有mRNA水平的5'和3'莖環(huán)序列，以便幫助使mRNA文庫穩(wěn) 定而免于核酸酶降解。
[0336] 易錯文庫
[0337] 將上述人CTLA-4核糖體展示構(gòu)建體用作如下一個模板，在該模板上使用易錯PCR 產(chǎn)生隨機變體文庫。根據(jù)制造商的說明書使用多樣化PCR隨機誘變試劑盒（Clontech公 司）對CTLA-4基因應(yīng)用易錯PCR。定制反應(yīng)以提供平均每個分子四個氨基酸突變，以及具 有大約2. 5XIOltl個變體分子的文庫。將這個隨機誘變程序進一步并入選擇過程中，在其中 它被應(yīng)用于第三輪選擇的輸出，以便在進一步選擇之前將更多的多樣性引入到結(jié)合劑富集 群體上。
[0338] '環(huán)4'定向文庫
[0339] 人CTLA-4核糖體展不構(gòu)建體還用作如下一個模板，在該模板上產(chǎn)生一個變體文 庫，這些變體具有靶向CTLA-4分子的一個區(qū)的具有促進與⑶80和⑶86的相互作用的潛力 的誘變。檢查人CTLA-4 :人⑶80復(fù)合物（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB) :1I8L)以及人CTLA-4 :人 CD86復(fù)合物（PDB:1185)的共晶結(jié)構(gòu)以便觀察分子之間，特別是緊鄰配體的CTLA-4的氨基 酸側(cè)鏈之間的結(jié)合相互作用。觀察到包含氨基酸位置59至65(或根據(jù)CTLA-4SWissPr〇t 登記號P16410編號的位置96至102)的人CTLA-4蛋白質(zhì)（SEQID35)的一個區(qū)域形成在 ⑶80和⑶86方向上延伸的一個環(huán)。使用飽和（NNS)誘變將此區(qū)域中的每個殘基完全隨機 化以便產(chǎn)生具有大約3. 4X101°個變體分子的文庫。通過標準技術(shù)使用重疊寡核苷酸（SEQ IDNO:33和SEQIDNO:34)來構(gòu)建此'環(huán)4'文庫。
[0340] 針對改進的親和力和穩(wěn)定性的選擇
[0341] 使用如漢斯等人（酶學方法（2000)328:404))中描述的基于核糖體展示親和力的 選擇進行對人CTLA-4變體與人⑶80和⑶86的改進的結(jié)合的選擇。簡言之，將CTLA-4變 體DNA文庫轉(zhuǎn)錄并且然后在不含細胞的原核翻譯系統(tǒng)中翻譯，并且使翻譯反應(yīng)停止以便產(chǎn) 生三元核糖體展示選擇復(fù)合物（mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)），然后將這些復(fù)合物與人CD80或人 ⑶86Fc融合蛋白（R&D系統(tǒng)公司）一起孵育。通過與蛋白G包被的磁珠（Dynal) -起孵育 來捕獲CD80或CD86結(jié)合復(fù)合物，并且通過磁性分離來回收結(jié)合的三元復(fù)合物，同時將未結(jié) 合的復(fù)合物洗掉。通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR回收編碼結(jié)合的CTLA-4變體的mRNA。為驅(qū)動對具有 改進的結(jié)合的CTLA-4變體的選擇，使用降低濃度的CD80或CD86在若干輪次內(nèi)重復(fù)選擇過 程。
[0342] 結(jié)合針對改進的對CD80和CD86的親和力的選擇，同時通過針對改進的穩(wěn)定性的 核糖體展示選擇CTLA-4變體池。在早期選擇輪次（第1輪和第3輪）中，使用DTT施加有 利于回收更穩(wěn)定的CTLA-4變體的選擇壓力（杰姆特斯（Jermutus)等人，美國科學院院刊， 2001年1月2日；98 (1) : 75-80)。在翻譯反應(yīng)中包括最終濃度0. 5mM的DTT，之后將反應(yīng)與 疏水相互作用色譜（HIC)瓊脂糖珠粒（通用醫(yī)療（GEHealthcare))的漿料一起孵育，同樣 是在0.5mMDTT存在下進行。HIC步驟用于捕獲折疊不佳的變體并且通過離心將它們從反 應(yīng)中除去，之后與CD80 -起孵育并且如上所述進行親和力選擇。
[0343] 熱點誘變文庫以及關(guān)鍵突變的合理重組
[0344] 在從易錯PCR和環(huán)4定向文庫中初始篩選CTLA-4變體之后，鑒別與改進的活性 相關(guān)的突變并且使用它們來設(shè)計另外的CTLA-4變體。在一個策略中，構(gòu)建熱點誘變文庫， 其中將SEQIDN0:35的位置16、25、58、70、85以及93(或根據(jù)（：1'1^-45￥丨88?1'(^登記號 P16410編號的位置53、62、95、107、122以及130)在單個文庫中使用飽和（剛5)誘變完全隨 機化。該文庫是使用重疊和誘變寡核苷酸（SEQIDNO:61 (含）至SEQIDNO:67 (含））來 創(chuàng)建。然后如上所述針對改進的親和力對此文庫進行選擇。
[0345] 在一種替代方法中，將從易錯、環(huán)4以及熱點誘變文庫中鑒別的較小數(shù)量的突變 (這些突變與改進的活性相關(guān)）通過寡核苷酸定向的誘變進行組合，以便產(chǎn)生合理重組體， 然后直接測試這些重組體的生物活性。為此策略選擇的突變是：I16S、S25N、S25P、G27S、 M54K、N56S、L58G、T59S、F60T、L61Q、L61P、D62G、D63Y、S64P、I65N、I65V、S70A、Q80R、M85S 以及K93Q(或根據(jù)CTLA-4SwissProt登記號P16410 編號為：I53S、S62N、S62P、G64S、M91K、 N93S、L95G、T96S、F97T、L98Q、L98P、D99G、D100Y、S101P、I102N、I102V、S107A、Q117R、M122S 以及K130Q)。
[0346]實例2.CTLA-4野牛型和作為Fc融合蛋白的奪體的表汰
[0347] 將來自核糖體展示選擇的變體CTLA-4基因克隆到載體pEU7. 1中。此載體允許 CTLA-4基因作為與IgGlFc區(qū)（SEQIDN0:56)的框內(nèi)融合物而表達。將核糖體展示輸出進 行PCR擴增并且克隆到pEU7.1中，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5-a細胞中。用于PCR克隆的 寡核苷酸還被設(shè)計成將位置120處的絲氨酸（根據(jù)Swiss-Prot登記號P16410中的編號的 殘基157)回復(fù)成野生型氨基酸半胱氨酸。在對單獨轉(zhuǎn)化體測序之后，選擇總計超過1，000 個具有獨特CTLA-4氨基酸序列的變體以用于蛋白質(zhì)表達。在88個變體的批次中，將編碼 質(zhì)粒DNA根據(jù)供應(yīng)商方案（凱杰（Qiagen))進行純化并且通過分光光度法在260nm下進行 量化，這樣使得DNA濃度可以用于計算用于轉(zhuǎn)染的DNA的正確量。
[0348] 來自24孔板的CTLA-4蛋白質(zhì)的表達、純化以及量化
[0349] 將3ml的中國倉鼠卵巢（CHO)細胞（ECACC)以每毫升1百萬個細胞接種于 含有25μΜL-氨基亞砜蛋氨酸（西格瑪（Sigma)M5379)的⑶-CHO培養(yǎng)基（英杰 (Invitrogen) 10743-029)中的24孔板（沃特曼（Whatman) 734-2558)的單獨孔中。將含有 細胞的24孔板用可透氣的夾層蓋（Applikon生物技術(shù)公司（biotechnology) ,Z365001224) 密封并且放置在用于深孔板的夾具（Applikon生物技術(shù)公司，Z365001700)上。在 250印111，80%濕度，5%0)2和371：下?lián)u蕩細胞。對于轉(zhuǎn)染，將含有3以8質(zhì)粒0嫩的5(^1 NaCl(150mM)與含有 21μg的線性 25kDaPEI(Polysciences公司，23966)的 50μINaCl 混合。將所形成的DNA-PEI復(fù)合物添加到細胞中，允許在復(fù)合物形成開始與添加到細胞中 之間不超過15分鐘。轉(zhuǎn)染后16至24小時，通過添加300μ1/孔的⑶-CHO高效進料B(英 杰Α10240)喂養(yǎng)細胞。在250rpm，80%濕度，5%0)2和371：下?lián)u蕩板，持續(xù)另外5至6天， 以便允許蛋白質(zhì)表達至生長培養(yǎng)基中。表達之后，通過在3000rpm下離心10分鐘使含有蛋 白質(zhì)的用過的培養(yǎng)基澄清。使用FreedomEvo?液體處理機器人（帝肯瑞士（Tecan))將 澄清的上清液（1.2ml)重新分布于96孔過濾板（3MEmpore公司，12146036)中。使用真空 泵和QIAvac6S真空歧管（凱杰）通過過濾除去殘留細胞碎片。處理I. 8ml的澄清的過濾 的上清液以用于純化，該純化是在Minitrack(RTM)液體處理機器人（珀金埃爾默（Perkin Elmer))上使用PhyTip(RTM)蛋白A親和柱（普邁（Phynexus) ,PTP-92-20-01，20μ1 樹脂 床體積）而進行。通過 500μINaP(20mM，ρΗ7·0)調(diào)節(jié)PhyTip(RTM)柱。PhyTip(RTM)柱 然后通過以6X300μ1批次經(jīng)過粗上清液來加載，用200μID-PBS、200μINaP(20mM，pH 7.0)洗滌，用 120μIIOOmMHEPES140mMNaCl(pH3)洗脫并且用 20μIHEPES(1M，pH8.0) 中和。
[0350] 將純化的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到96孔黑聚丙烯板（格瑞那（Greiner)，655209)，隨后添加 145μ1PBS、0.02%Tween20、lmg/mlBSA、0.05%疊氮化鈉緩沖液（Octet緩沖液）。在相 同緩沖液中使用先前純化的CTLA-4野生型Fc融合蛋白產(chǎn)生標準曲線。在黑聚丙烯板中， 以150μ1體積，以500μg/ml的起始濃度以及3倍稀釋制備一組標準濃度。使用具有蛋 白A包被的生物傳感器（ForteBio公司，18-0004)的OctetRED，使用120秒的讀取時間與 200rpm的流速執(zhí)行量化。具有8個生物傳感器的一個柱用于樣品的每個96孔板。通過在 96孔板中添加200μIIOmM甘氨酸（pH1. 7)(西格瑪，G-7403)生成生物傳感器。在處理 下批樣品之前,通過添加200μIOctet緩沖液中和生物傳感器。以30秒的時間和200rpm 的流速執(zhí)行3個再生/中和循環(huán)。通過使用OctetRED數(shù)據(jù)分析軟件包比較未知物與標準 曲線之間的結(jié)合率來確定未知樣品的濃度。
[0351] 更大規(guī)模的CTLA-4蛋白質(zhì)的表達、純化以及量化
[0352] 為了更大規(guī)模地制備作為Fc融合物的單獨CTLA-4蛋白質(zhì)，應(yīng)用如用于24孔板 方法的相同的一般步驟。從大腸桿菌細胞制備含有作為與IgGlFc的框內(nèi)融合物的變體 CTLA-4基因的質(zhì)粒。為了以>100mg的規(guī)模制備蛋白質(zhì)，通過基因合成制備含有與IgGlFc 基因直接同框的CTLA-4基因的整個構(gòu)建體。在所有情況下，制備編碼感興趣的蛋白質(zhì)的質(zhì) 粒DNA并且將這些質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到CHO細胞中用于表達。代替24孔板，在從培養(yǎng)上清液純 化之前，在組織培養(yǎng)瓶或波袋（wave-bags)中生長更大體積的細胞。匯集收獲物并且過濾， 之后通過蛋白A色譜法純化。將培養(yǎng)上清液加載到適當大小的陶瓷蛋白A(Bi〇S印ra)柱上， 并且用50mMTris-Hcl(pH8. 0)、250mMNaCl洗滌。將結(jié)合的IgG使用0.IM檸檬酸鈉（pH 3. 0)從柱洗脫并且通過添加Tris-Hcl(pH9. 0)進行中和。使用NaplO柱（GE, 17-0854-02) 將洗脫的物質(zhì)緩沖液更換為PBS，并且基于蛋白質(zhì)的氨基酸序列使用一個消光系數(shù)以分光 光度法確定IgG的濃度。使用SEC-HPLC和SDS-PAGE分析純化的蛋白質(zhì)的聚集或降解。
[0353] 實例3.Raii(B細朐）和TurkatCT細朐）雙重細朐測定中CTLA-4奪體的牛物活 性
[0354] 此處描述的篩選策略包括在體外T細胞刺激測定中測量超過1，000個CTLA-4變 體（與Fc融合配偶體一起表達）的生物活性。測試來自所有不同的誘變策略（包括易錯 PCR、靶向誘變、熱點重組以及合理重組）的CTLA-4變體的生物活性，并且根據(jù)它們相對于 野生型CTLA-4(SEQIDNO:35)(也以Fc融合物型式表達）的生物活性對它們進行排序。
[0355] 為了確定CTLA-4變體的生物活性，向由Raji(B細胞）和Jurkat(T細胞）細胞組 成的雙重細胞測定中添加樣品。CD28(由Jurkat細胞表達）與CD80 (B7-1)和CD86 (B7-2)配體（在Raji細胞上表達）的相互作用結(jié)合用于T細胞受體（如PHA(植物血凝素）的 共同活化信號導(dǎo)致白細胞介素-2(IL-2)從Jurkat細胞中釋放。可溶性CTLA-4可以結(jié)合 ⑶80和⑶86配體，從而阻斷它們與⑶28的相互作用并且減弱此應(yīng)答。因此，CTLA-4Ig克 隆的效力通過如在IL-2HTRF測定（CisBio64IL2PEC)中所測量的對IL-2從T細胞中釋放 的抑制來確定。
[0356] 384孔低蛋白結(jié)合板（格瑞那#781280)用于對測試樣品進行十一次1/3連續(xù)稀 釋，這些測試樣品是在完全生長培養(yǎng)基（RPMI1640Glutamax，英杰#61870,10%FBS，1%盤 尼西林/鏈霉素，英杰#15140)中制備的。所有樣品稀釋從5-30μg/ml最1?樣品濃度開始， 以一式兩份對細胞進行。
[0357] 將Raji和Jurkat懸浮細胞從瓶中轉(zhuǎn)移到離心小瓶中并且在240g下旋轉(zhuǎn)5分鐘。 兩種細胞系皆以750, 000個細胞/ml的濃度重懸浮于生長培養(yǎng)基中，并且各自以0.02ml/ 孔（=15, 000個細胞/細胞系/孔）接種到384孔Maxisorp板（Nunc464718)中。將 0. 02ml從樣品稀釋板轉(zhuǎn)移到細胞板，并且向所有其他孔中添加0. 02ml的40μg/mlPHA(西 格瑪#L-1668)(或0. 02ml培養(yǎng)基，陰性對照孔）以得到最終濃度10μg/ml，并且在37°C與 5%CO2 一起孵育。
[0358] 20-24小時之后，收獲細胞上清液并且使用商業(yè)IL-2HTRF試劑盒（CisBio 64IL2PEC)測量IL-2分泌。簡言之；抗hIL-2穴狀化合物（供體熒光團）和抗hIL-2d2 (受 體熒光團）的'主液混合物'是通過1/200稀釋于新鮮制成的軛合物緩沖液（0. 2%BSA/0. 8M KF/PBS)中而制成的。使用1/2稀釋于培養(yǎng)基中最高濃度為2ng/ml的IL-2(NIBSC#96/504) 生成八點標準曲線。將相等體積的試劑主液混合物與樣品混合于384孔低體積測定板 (Costar3676)中并且在室溫下孵育3-168小時。使用320nm的激發(fā)波長以及620nm和 665nm的發(fā)射波長在Envision(拍金埃爾默）上讀取板。
[0359] 針對每個孔如下計算ΛF%和特異性結(jié)合值：
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的CTLA-4多肽，該分離的CTLA-4多肽與野生型CTLA-4SEQIDN0:35相比 具有更大的結(jié)合人CD80的親和力、更大的效力和/或更大的穩(wěn)定性，該多肽包含為SEQ ID N0:35的變體的氨基酸序列，其中該變體包含SEQ ID N0:35中的以下氨基酸突變中的五個 或更多個： 116 處的 R、S、V或 T; A24處的T ; S25處的N或P ; G27處的S ; V32處的I ; D41處的G ; S42處的G ; V44處的E ; M54處的K ; N56處的S或G ; L58 處的 A、G、S 或P ; T59處的S或A; F60處的T ; L61處的Q或P ; D62處的G ; D63處的Y ; S64處的P ; 165 處的 N、D、V或 T ; S70 處的 A、T、M 或 Η ; Q80處的R ; Μ85 處的 Q、S、V、R、K 或L; T87處的S ; K93 處的 Q、H、T、E 或Μ ; L104處的R、Q或Ε ; 1106處的V ; N108處的D或S ; 1115處的V或F ; C120處的S ; T51處的缺失。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CTLA-4多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:35至少70% - 致的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的CTLA-4多肽，包含以下氨基酸突變中的五個或 更多個： 116處的R、S或V; A24處的T ; S25處的N ; G27處的S ; M54處的K ; Ν56處的S ; L58處的A或G ; T59處的S ; F60處的T ; L61處的Q ; D63處的Y ; S64處的Ρ ; 165處的Ν或D ; S70處的A ; Q80處的R ; M85處的Q或S ; K93處的Q或Η; C120處的S。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的CTLA-4多肽，包含取代S25N或S25P。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的CTLA-4多肽，包含取代S25N、K93Q或K93H。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的CTLA-4多肽，包含與SEQ ID NO: 36-55中的 任一個至少70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或99 % -致的氨基酸序列，或與由以NCMB登錄號 41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列至少70%、80%、90%、95%、98%或99%-致 的氨基酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的CTLA-4多肽，包含殘基59-65處的氨基酸基序 SEQ ID N0:69,該殘基編號是參照SEQ ID N0:35。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的CTLA-4多肽，包含選自以下各項的突變的組 合： -1315突變，S卩116處的S ;S25處的N ;L58處的G ;S70處的A ;Q80處的R ;M85處的S ; 和K93處的Q ; -1322突變，即S25處的N ;G27處的S ;M54處的K ;N56處的S ;T59處的S ;F60處的T ; L61處的Q ;D63處的Y ;S64處的P ;165處的N ;和K93處的Q ; -1321突變，即116處的S ;S25處的Ν ;M54處的K ;L58處的G ;S70處的A ;Q80處的R ; M85處的S ;和K93處的Q ; -1115突變，S卩116處的V ;S25處的N ;L58處的G ;S70處的A ;M85處的Q ;和K93處的 Q； -1299突變，S卩116處的R ;A24處的T ;S25處的N ;G27處的S ;L58處的A ;S70處的A ; M85處的Q;和K93處的Q;以及 -1227突變，S卩116處的S ;S25處的N ;G27處的S ;L58處的A ;S70處的A ;M85處的Q ; 和K93處的Η。
9. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQ ID NO: 36-55的氨基 酸序列，或者包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列，或者包 含具有多達十個氨基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
10. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQ ID N0:36-55的氨 基酸序列，或者包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列，或者 包含具有多達五個氨基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQ ID NO:36-55的氨基酸序列， 或者包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列，或者包含具有多 達三個氨基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQ ID NO:36-55的 氨基酸序列，或者包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的CTLA-4多肽，包含選自SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:47 的氨基酸序列，或由以 NCMB 登錄 號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列。
14. 一種分離的CTLA-4多肽，該分離的CTLA-4多肽與野生型CTLA-4SEQ ID N0:35相 比具有更大的結(jié)合人CD80的親和力、更大的效力和/或更大的穩(wěn)定性，其中該多肽包含： (i) 氨基酸序列 SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:37、SEQ ID N0:38、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42 或 SEQ ID NO:47; (ii) 為含有多達十個氨基酸突變的（i)的變體的氨基酸序列，其中殘基25未突變并且 是N ; (iii) 為包含一個或多個氨基酸突變的（i)的變體的氨基酸序列，其中殘基25未突變 并且是N ;該變體與（i)具有至少70 %的序列一致性；或 (iv) 由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的CTLA-4多肽，包含SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:43、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 42 或 SEQ ID NO: 47,或具有多達五個氨 基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的CTLA-4多肽，包含SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:43、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 42 或 SEQ ID NO: 47,或具有多達三個氨 基酸突變的那些序列中的任一個的變體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的CTLA-4多肽，其中該多肽包含與SEQ ID N0:68、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO:42 或 SEQ ID NO:47 具有 至少80%序列一致性的氨基酸序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的CTLA-4多肽，其中該多肽包含與SEQ ID N0:68、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO:42 或 SEQ ID NO:47 具有 至少90%、95%、98%或99%序列一致性的氨基酸序列。
19. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的CTLA-4多肽，該多肽具有用于結(jié)合人CD80的 50nM或更小的親和力，其中親和力為K D，如通過表面等離子體共振所確定的。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的CTLA-4多肽，該多肽具有用于結(jié)合人CD80的20nM或更小 的親和力，其中該親和力為KD，如通過表面等離子體共振所確定的。
21. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的CTLA-4多肽，其中該多肽具有比野生型 CTLA-4(SEQ ID N0:35)更大的結(jié)合人CD86的親和力。
22. 根據(jù)權(quán)利要求14至21中任一項所述的CTLA-4多肽，包含： _殘基16處的S ;殘基25處的N ;殘基58處的G ;殘基70處的A ;殘基80處的R ;殘基 85處的S ;和殘基93處的Q ; -殘基25處的N ;殘基27處的S ;殘基54處的K ;殘基56處的S ;殘基59處的S ;殘基 60處的T ;殘基61處的Q ;殘基63處的Y ;殘基64處的P ;殘基65處的N ;和殘基93處的 Q ； -殘基16處的S ;殘基25處的N ;殘基54處的K ;殘基58處的G ;殘基70處的A ;殘基 80處的R ;殘基85處的S ;和殘基93處的Q ; -殘基16處的V ;殘基25處的N ;殘基58處的G ;殘基70處的A ;殘基85處的Q ;和殘 基93處的Q ; -殘基16處的R ;殘基24處的T ;殘基25處的N ;殘基27處的S ;殘基58處的A ;殘基 70處的A ;殘基85處的Q ;和殘基93處的Q ;或 -殘基16處的S ;殘基25處的N ;殘基27處的S ;殘基58處的A ;殘基70處的A ;殘基 85處的Q ;和殘基93處的H。
23. 根據(jù)權(quán)利要求14至22中任一項所述的CTLA-4多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:43、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:36、SEQIDNO:42或SEQIDNO:47，具有 多達三個氨基酸突變。
24. 根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項所述的CTLA-4多肽，包含：位置16處的R、I、S或 V ;位置24處的T或A ;位置27處的S或G ;位置54處的Μ或K ;位置56處的N或S ;位置 58處的A、L或G ;位置59處的Τ或S ;位置60處的F或Τ ;位置61處的L或Q ;位置63處 的D或Y ;位置64處的S或P ;位置65處的I、N或D ;位置70處的A或S ;位置80處的Q 或R;位置85處的Q、M或S ;位置93處的Q或H;以及位置120處的C或S。
25. 根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項所述的CTLA-4多肽，其中這些氨基酸突變選自以 下各項：殘基16處的T取代；殘基32處的I取代；殘基41處的G取代；殘基42處的G取 代；殘基44處的E取代；殘基56處的G取代；殘基58處的S或P取代；殘基59處的A取 代；殘基61處的P取代；殘基62處的G取代；殘基65處的V或T取代；殘基70處的Τ、Μ 或Η取代；殘基85處的V、R、K或L取代；殘基87處的S取代；殘基93處的Τ、Ε或Μ取代； 殘基104處的R、Q或Ε取代；殘基106處的V取代；殘基108處的D或S取代；殘基115處 的V或F取代；殘基120處的S取代；殘基51處的缺失。
26. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的CTLA-4多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 42 或 SEQ ID NO: 47,或者 包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列。
27. -種分離的CTLA-4多肽，該分離的CTLA-4多肽所具有的結(jié)合⑶80的親和力比結(jié) 合⑶86的親和力大至少10倍。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的CTLA-4多肽，該多肽所具有的結(jié)合CD80的親和力比結(jié)合 ⑶86的親和力大至少50倍。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的CTLA-4多肽，其中該多肽是如權(quán)利要求1 至26中任一項所定義的。
30. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的CTLA-4多肽，該多肽軛合至IgG Fc氨基酸序 列。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的CTLA-4多肽，其中該IgG Fc是被修飾以降低Fc效應(yīng)子功 能的人IgGIFc，并且包含天然人IgGIFc鉸鏈區(qū)。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30或權(quán)利要求31所述的CTLA-4多肽，其中該IgGFc氨基酸序列包 含人IgGIFc區(qū)，其中以下殘基組中的一者或兩者被如下取代： 殘基20處的F ;殘基21處的E ;殘基117處的S ;以及 殘基38處的Y，殘基40處的T，殘基42處的E， 該殘基編號參照SEQ ID NO:56來定義。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30至32中任一項所述的CTLA-4多肽，其中該IgGFc氨基酸序列包 含 SEQ ID NO:59。
34. -種分離的CTLA-4多肽，包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的 1299CTLA-4-Ig氨基酸序列。
35. 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的CTLA-4多肽，其中該多肽是呈多聚體形式。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的CTLA-4多肽，其中該CTLA-4多肽是呈二聚體形式。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的CTLA-4多肽，其中該CTLA-4多肽是呈四聚體形式。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的CTLA-4多肽，其中該四聚體包括兩對CTLA-4多肽，每對 包括與抗體輕鏈恒定區(qū)融合的一個CTLA-4多肽和與抗體重鏈恒定區(qū)融合的一個CTLA-4多 肽。
39. -種含有核酸的宿主細胞，其中該核酸包含以NCMB登錄號41948保藏的 1299CTLA-4-Ig 核酸序列。
40. -種組合物，包含： 根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的CTLA-4多肽；以及 一種或多種藥用賦形劑。
41. 一種組合物，包含： CTLA-4 多肽，該多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 47,或由以 NCMB 登錄號 41948 保藏 的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列，該多肽軛合至IgG Fc氨基酸序列；以及 一種或多種藥用賦形劑。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40或權(quán)利要求41所述的組合物，其中該CTLA-4多肽軛合至包含SEQ ID NO:59的IgG Fc氨基酸序列。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中軛合至IgG Fc的該CTLA-4多肽包含氨基酸 序列SEQIDN0:13、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15或SEQID NO:16。
44. 一種組合物，包含由以NCMB登錄號41948保藏的核酸編碼的1299CTLA-4-Ig多肽 以及一種或多種藥用賦形劑。
45. 根據(jù)權(quán)利要求40至44中任一項所述的組合物，包含濃度為至少70mg/ml的CTLA-4 多肽。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，包含濃度為至少100mg/ml的CTLA-4多肽。
47. 根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一項所述的CTLA-4多肽，或根據(jù)權(quán)利要求40至46中任 一項所述的組合物，用于在一種通過皮下或靜脈內(nèi)給藥治療患者的方法中使用。
48. 根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一項所述的CTLA-4多肽，或根據(jù)權(quán)利要求40至46中任 一項所述的組合物，用于在一種治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、哮喘、克羅恩氏病、潰 瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或移植排斥的方法中使用。
49. 根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一項所述的CTLA-4多肽，或根據(jù)權(quán)利要求40至46中任 一項所述的組合物，用于在一種治療方法中使用，該方法包括以28天的間隔向患者給與所 述CTLA-4多肽或所述組合物。
50. -種通過使選自SEQ ID NO 36-55的CTLA-4多肽氨基酸序列、或由以NCMB登錄 號41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列突變而產(chǎn)生另一種CTLA-4多肽的方法，該 方法包括： 提供一種CTLA-4多肽，該多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO 36-55或由以NCMB登錄號 41948保藏的核酸編碼的CTLA-4氨基酸序列或由其組成； 在該氨基酸序列中引入一個或多個突變以提供另一種CTLA-4多肽； 測試該另一種CTLA-4多肽的穩(wěn)定性、親和力和/或效力；并且 將該另一種CTLA-4多肽配制到一種包含一種或多種藥用賦形劑的組合物中。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中該另一種CTLA-4多肽被軛合至Fc區(qū)。
【文檔編號】C07K1/00GK104302309SQ201380024763
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月11日
【發(fā)明者】R·敏特爾, J·杜思韋特, J·莫桑, M·鮑恩, S·拉斯特, C·普里韋曾特夫 申請人:米迪繆尼有限公司