以抗bmp9抗體作為有效成分的、對(duì)腎性貧血、癌性貧血等貧血的治療劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供與人BMP9(Bone morphogenetic protein-9)結(jié)合的抗BMP9單克隆抗體或其抗體片段、產(chǎn)生該抗體或該抗體片段的雜交瘤、編碼該抗體或該抗體片段的DNA、含有該DNA的載體、導(dǎo)入該載體而得到的轉(zhuǎn)化體、使用該雜交瘤或該轉(zhuǎn)化體的該抗體或該抗體片段的制造方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分的治療劑。另外，本發(fā)明提供含有該抗體或該抗體片段作為有效成分的、用于治療腎性貧血、癌性貧血等貧血的藥物組合物以及使用該藥物組合物的腎性貧血、癌性貧血等貧血的治療方法。
【專利說明】以抗BMP9抗體作為有效成分的、對(duì)腎性貧血、癌性貧血等 貧血的治療劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及與人BMP9 (Bone morphogenetic protein-9,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9)結(jié)合 的抗BMP9單克隆抗體或其抗體片段、產(chǎn)生該抗體或該抗體片段的雜交瘤、編碼該抗體或該 抗體片段的DNA、含有該DNA的載體、導(dǎo)入該載體而得到的轉(zhuǎn)化體、使用該雜交瘤或該轉(zhuǎn)化 體的該抗體或該抗體片段的制造方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分的治療劑。
[0002] 另外，本發(fā)明涉及含有該抗體或該抗體片段作為有效成分的、用于治療腎性貧血、 癌性貧血等貧血的藥物組合物以及使用該藥物組合物的腎性貧血、癌性貧血等貧血的治療 方法。

【背景技術(shù)】
[0003] BMP9 為 Bone morphogenetic protein 9 的簡(jiǎn)稱，別名也稱為 GDF2。BMP9 屬于包 含約20個(gè)種類的BMP (骨形態(tài)發(fā)生蛋白）家族分子，人BMP9為由429個(gè)氨基酸構(gòu)成的分泌 蛋白質(zhì)（非專利文獻(xiàn)1)。
[0004] 已知BMP9在胎兒期主要在脊髓或體節(jié)間膜表達(dá)，在成體期主要在肝臟表達(dá)（非專 利文獻(xiàn)2、3、4)，人BMP9為在血液中以2-12ng/mL的濃度存在的血液循環(huán)因子（非專利文獻(xiàn) 5)。
[0005] 關(guān)于BMP9在生物體內(nèi)的作用，迄今為止還沒有基于BMP9缺陷小鼠或抗BMP9抗體 對(duì)動(dòng)物的施用的報(bào)道，但有一些基于體外發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。例如，表現(xiàn)出對(duì)肥大軟骨細(xì)胞形成或 從間葉細(xì)胞向軟骨分化的促進(jìn)作用（非專利文獻(xiàn)6、7、8)，或者表現(xiàn)出對(duì)血液前體細(xì)胞產(chǎn)生 或集落形成的促進(jìn)作用（非專利文獻(xiàn)9)。但是，根據(jù)這些報(bào)道，極難預(yù)料到抗BMP9抗體在 生物體內(nèi)具有紅細(xì)胞造血作用。
[0006] 另外，作為抗BMP9單克隆抗體，對(duì)BMP9具有中和活性的單克隆抗體（克隆號(hào) 360107)已由安迪生物科技公司市售，但尚未獲知其他抗體。
[0007] 貧血是指"單位容積血液中的紅細(xì)胞數(shù)、血紅素濃度和血細(xì)胞比容值比正常降低 的狀態(tài)"（非專利文獻(xiàn)10)。在紅細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)中，各種各樣的因子發(fā)揮作用，但最重要且最 特異性的因子為促紅細(xì)胞生成素（以下記作ΕΡ0)。
[0008] EPO促進(jìn)晚期紅系祖細(xì)胞集落形成單位（colony-forming unit-erythroid : CFU-E)的增殖、分化，結(jié)果使生物體內(nèi)的紅細(xì)胞增加（非專利文獻(xiàn)10)。EPO為由165個(gè)氨 基酸構(gòu)成的分子量30kDa的糖蛋白激素，主要由腎臟產(chǎn)生（非專利文獻(xiàn)10)。
[0009] 腎臟疾病所伴有的貧血（腎性貧血）是由于作為EPO的產(chǎn)生組織的腎臟受到損傷 而使EPO的產(chǎn)生減少、紅細(xì)胞數(shù)減少的、慢性腎臟?。–KD)患者中頻率最高的并發(fā)癥（非專 利文獻(xiàn)11)。已知腎性貧血不僅會(huì)影響Q0L，而且還會(huì)影響心血管病變的發(fā)病、發(fā)展、腎功能 障礙的惡化（非專利文獻(xiàn)11、12)。
[0010] 作為腎性貧血治療劑的基因重組人促紅細(xì)胞生成素和最近銷售的血中半衰期長 的持續(xù)型的第二代EPO制劑被廣泛稱為ESA (erythropoiesis-stimulating agent,紅細(xì)胞 生成刺激劑）（非專利文獻(xiàn)13)。
[0011] ESA具有強(qiáng)有力的紅細(xì)胞造血作用，但腎衰竭透析患者中存在15?20%的、即使 施用ESA貧血改善效果也不足的病例（將其稱為ESA抵抗性貧血或ESA低反應(yīng)性貧血）（非 專利文獻(xiàn)13)。
[0012] 由大規(guī)模干預(yù)臨床試驗(yàn)（CREATE試驗(yàn)和CHOIR試驗(yàn)）的結(jié)果表明，對(duì)這樣的呈現(xiàn) ESA抵抗性的患者過量施用ESA會(huì)引起生命預(yù)后的惡化（非專利文獻(xiàn)11、12、13)?；谶@ 樣的背景，克服ESA抵抗性成為腎性貧血治療的一大課題，強(qiáng)烈期望開發(fā)出具有與EPO不同 的機(jī)制的新的紅細(xì)胞造血藥。
[0013] 另一方面，惡性腫瘤所伴有的貧血（癌性貧血）是在各種癌癥中觀察到的癥狀，作 為其原因，有如下兩點(diǎn)：與包括失血在內(nèi)的病情的惡化相隨、與化學(xué)療法或放射線療法等有 關(guān)（非專利文獻(xiàn)14)。
[0014] 雖然已表明ESA對(duì)癌性貧血也有效，但也指出了對(duì)于由施用ESA引起的促進(jìn)癌增 殖的可能性或血栓梗塞增加的擔(dān)心（非專利文獻(xiàn)14)，對(duì)于癌性貧血，也期望開發(fā)出具有與 EPO不同的機(jī)制的新的紅細(xì)胞造血藥。
[0015] 如上所述，對(duì)于腎性貧血和癌性貧血，要求具有與EPO不同的機(jī)制的紅細(xì)胞造血 藥。當(dāng)然，藥效的強(qiáng)度對(duì)藥劑而言也是必要的。具體而言，日本的開始施用ESA的基準(zhǔn)是： 對(duì)于透析患者而言，設(shè)定為血紅素濃度低于10g/dL，要求藥劑具有能夠?qū)⒀t素濃度控制 在10?llg/dL之間的藥效。另一方面，對(duì)于透析前期慢性腎臟病患者而言，設(shè)定為血紅素 濃度低于llg/dL的時(shí)刻，要求藥劑具有能夠?qū)⒀t素濃度控制在11?13g/dL之間的藥效 (非專利文獻(xiàn)15)。
[0016] 即，要求新的紅細(xì)胞造血藥具有EPO非依賴性、以及使血紅素濃度至少升高1? 2g/dL的程度的藥效這兩個(gè)特征。
[0017] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0018] 非專利文獻(xiàn)
[0019] 非專利文獻(xiàn) I J. Biol. Chem.，280, 26, 25111 (2005)
[0020] 非專利文獻(xiàn) 2 :Nat. Biotechnology, 21，294 (2〇〇3)
[0021] 非專利文獻(xiàn) 3 J. Biol. Chem.，275, 24, 17937 (2000)
[0022] 非專利文獻(xiàn) 4 :J. Physiology-Paris, 96, 53 (2002)
[0023] 非專利文獻(xiàn) 5 :Circ. Res.，102, 8, 914 (2008)
[0024] 非專利文獻(xiàn) 6 :Gene Ther.，11，17, 1312(2004)
[0025] 非專利文獻(xiàn) 7 J. Biol. Chem.，284, 1，649 (2009)
[0026] 非專利文獻(xiàn) 8 J. Boneminer. Res. ,26, 6, 1166(2011)
[0027] 非專利文獻(xiàn) 9 :Growth Factors, 21，2, 71 (2003)
[0028] 非專利文獻(xiàn)10 :標(biāo)準(zhǔn)血液病學(xué)（醫(yī)學(xué)書院）（2000)
[0029] 非專利文獻(xiàn)11 :血液7 口 7 (血液學(xué)前沿），18, 2, 17(2008)
[0030] 非專利文獻(xiàn)12 :腎與透析，71，2, 247(2011)
[0031] 非專利文獻(xiàn)13 :臨床透析，26, 2, 59(2010)
[0032] 非專利文獻(xiàn)14 :臨床透析，26, 2, 276(2010)
[0033] 非專利文獻(xiàn)15 :日本透析醫(yī)學(xué)會(huì)雜志，41，10, 661 (2008)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0034] 發(fā)明所要解決的問題
[0035] 本發(fā)明所要解決的問題在于，通過提供以抗BMP9抗體作為有效成分的治療劑來 改善腎性貧血、癌性貧血等貧血。
[0036] 用于解決問題的手段
[0037] 為了弄清楚抗BMP9抗體在生物體內(nèi)的作用，本發(fā)明人嘗試了使用BMP9缺陷小鼠 來獲得抗BMP9抗體，結(jié)果，成功地獲得了與現(xiàn)有抗體相比對(duì)BMP9的結(jié)合性顯著提高的抗 BMI^抗體。
[0038] 進(jìn)而，使用所獲得的抗體對(duì)抗BMP9抗體在生物體內(nèi)的作用進(jìn)行了深入研究，結(jié) 果，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，這些抗BMP9抗體具有紅細(xì)胞造血作用，而且該紅細(xì)胞造血作用優(yōu)于 現(xiàn)有抗體的作用強(qiáng)度，這些抗體抑制人BMP9與人BMPRII的結(jié)合。
[0039] 另外，由其作用機(jī)制分析明確了 ：獲得的抗體的紅細(xì)胞造血作用并非由血中EPO 濃度的升高介導(dǎo)，即，基于與EPO不同的機(jī)制產(chǎn)生。進(jìn)而，由使用作為腎性貧血模型的5/6 腎切除大鼠的分析還明確了：抗BMP9抗體對(duì)腎性貧血具有改善作用。
[0040] 基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人認(rèn)為能夠提供以抗BMP9抗體作為有效成分的、對(duì)腎性貧 血、癌性貧血等貧血的治療劑，從而完成了本發(fā)明。
[0041] SP，本發(fā)明涉及下述⑴?（16)。
[0042] (1) 一種單克隆抗體或該抗體片段，其為選自下述（a)?（e)中的一種抗體、或者 與該抗體競(jìng)爭(zhēng)地與人BMP9結(jié)合且與人BMP9的結(jié)合解離常數(shù)為lX10_ 1(lm〇l/L以下，
[0043] (a)包含互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining region，以下記作 CDR) 1 ? 3分別含有序列號(hào)54?56表不的氨基酸序列的抗體的重鏈且包含⑶Rl?3分別含有序列 號(hào)57?59表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈的抗體，
[0044] (b)包含⑶Rl?3分別含有序列號(hào)60?62表不的氨基酸序列的抗體的重鏈且包 含CDRl?3分別含有序列號(hào)63?65表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈的抗體，
[0045] (c)包含含有序列號(hào)48表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)且包含含有序列 號(hào)51表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體，
[0046] (d)包含含有序列號(hào)49表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)且包含含有序列 號(hào)52表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體，
[0047] (e)包含含有序列號(hào)128表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)且包含含有序列 號(hào)132表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體。
[0048] (2)如⑴所述的單克隆抗體或該抗體片段，其為與選自所述（a)?（e)中的一種 抗體所結(jié)合的表位結(jié)合的單克隆抗體。
[0049] (3)如（1)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其為基因重組抗體。
[0050] (4)如（3)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其為選自人嵌合抗體、人源化抗體和 人抗體中的基因重組抗體。
[0051] (5)選自下述（a)?（c)中的一種單克隆抗體或該抗體片段，
[0052] (a)包含⑶Rl?3分別含有序列號(hào)54?56表不的氨基酸序列的抗體的重鏈且包 含CDRl?3分別含有序列號(hào)57?59表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈的單克隆抗體及該 抗體片段，
[0053] (b)包含⑶Rl?3分別含有序列號(hào)60?62表不的氨基酸序列的抗體的重鏈且包 含CDRl?3分別含有序列號(hào)63?65表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈的單克隆抗體及該 抗體片段，
[0054] (c)包含含有序列號(hào)128表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)且包含含有序列 號(hào)132表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體及抗體片段。
[0055] (6)如⑴?（5)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體及該抗體片段，其與序列號(hào)67表示 的人BMP9成熟區(qū)的氨基酸序列中的至少第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met和 第93位的Pro結(jié)合。
[0056] (7)如⑴?（6)中任一項(xiàng)所述的抗體片段，其為選自Fab、Fab'、F(ab'）2、單鏈 抗體（scFv)、二聚體化V區(qū)（雙價(jià)抗體）、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)（dsFv)和包含CDR的肽中的 抗體片段。
[0057] (8) -種DNA，其編碼⑴?（7)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段。
[0058] (9) -種重組載體，其含有⑶所述的DNA。
[0059] (10) -種轉(zhuǎn)化株，其通過將（9)所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中而獲得。
[0060] (11) (1)?（7)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段的制造方法，其特征在 于，將（10)所述的轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成并蓄積（1)?（7)中任一 項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，并從培養(yǎng)物中收集該抗體或該抗體片段。
[0061] (12) -種伴有BMP9相關(guān)的貧血的疾病的治療劑，其含有與人BMP9結(jié)合并且抑制 人BMP9與人BMPRII的結(jié)合的單克隆抗體或該抗體片段作為有效成分。
[0062] (13) -種人BMP9的免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)定方法，其使用（1)?（7)中任一項(xiàng)所述的單 克隆抗體或該抗體片段。
[0063] (14) 一種藥物組合物，其包含（1)?（7)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片 段和藥理學(xué)上容許的載體。
[0064] (15) -種人BMP9相關(guān)的貧血的治療方法，其包括施用（1)?（7)中任一項(xiàng)所述的 單克隆抗體或該抗體片段。
[0065] (16) -種BMP9相關(guān)的貧血的治療方法，其包括施用與人BMP9結(jié)合并且抑制人 BMP9與人BMPRII的結(jié)合的單克隆抗體或該抗體片段。
[0066] 發(fā)明效果
[0067] 本發(fā)明的抗體是與現(xiàn)有抗體相比對(duì)BMP9的結(jié)合性顯著提高的抗BMP9抗體，具有 優(yōu)于現(xiàn)有抗體的作用強(qiáng)度的紅細(xì)胞造血作用，抑制人BMP9與人BMPRII的結(jié)合。另外，本發(fā) 明的抗體的紅細(xì)胞造血作用并非由血中EPO濃度的升高介導(dǎo)。此外，本發(fā)明的抗體對(duì)腎性 貧血具有改善作用。通過以具有這種特性的本發(fā)明的抗體作為有效成分，能夠提供對(duì)腎性 貧血、癌性貧血等貧血的治療劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0068] 圖1是表示小鼠 BMP9基因敲除用載體的結(jié)構(gòu)的圖。小鼠5'基因組表示BMP9基因 敲除載體5'同源區(qū)，Nec/表示新霉素抗性基因，小鼠3'基因組表示BMP9基因敲除載體3' 同源區(qū)，DT-A表示白喉毒素 A鏈基因，T3表示T3啟動(dòng)子，T7表示T7啟動(dòng)子，pBluescript 表不克隆載體。
[0069] 圖2是通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)測(cè)定獲得的抗BMP9單克隆抗體與人BMP9的 結(jié)合特異性而得到的圖?？v軸表示吸光度（450-570nm)。固相化的抗原為人BMP9時(shí)用黑色 表不，固相化的抗原為人BMPlO時(shí)用白色表不。
[0070] 圖3是通過ELISA測(cè)定獲得的抗BMP9單克隆抗體與人BMP9的結(jié)合性而得到的圖。 橫軸表示抗體濃度（ng/mL)，縱軸表示各抗體濃度下的吸光度（450-570nm)。6D10-1-1抗體 用Λ表示，10D5-2-3抗體用□表示，3B7-3-3抗體用表示，R&D抗體用?表示。
[0071] 圖4是表示獲得的抗ΒΜΡ9單克隆抗體對(duì)人ΒΜΡ9與標(biāo)記的R&D抗體的結(jié)合的抑制 作用的圖。橫軸表不未標(biāo)記的抗體濃度（ng/mL)，縱軸表不抑制活性（％)。6D10-1-1抗體 用Λ表示，10D5-2-3抗體用□表示，3B7-3-3抗體用表示，R&D抗體用?表示。
[0072] 圖5是表示獲得的抗ΒΜΡ9單克隆抗體對(duì)人ΒΜΡ9與BMPRII的結(jié)合的抑制作用的 圖?？v軸表示抑制活性（％)。
[0073] 圖6Α是表示短期施用（2周）獲得的抗ΒΜΡ9單克隆抗體對(duì)小鼠紅細(xì)胞造血產(chǎn)生 的作用的圖。圖6Α的圖表示紅細(xì)胞數(shù)的變化。圖的橫軸表示抗體施用量（mg/kg)，縱軸表 示紅細(xì)胞數(shù)（XIOVuL)。6D10-1-1抗體用Λ表示，10D5-2-3抗體用□表示，R&D抗體用· 表示。圖中的〇mg/kg的值表示介質(zhì)施用組的值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE、n = 6)。
[0074] 圖6B是表示短期施用（2周）獲得的抗BMP9單克隆抗體對(duì)小鼠紅細(xì)胞造血產(chǎn)生 的作用的圖。圖6B的圖表示血紅素濃度的變化。圖的橫軸表示抗體施用量（mg/kg)，縱軸 表示血紅素濃度（g/dL)。6D10-1-1抗體用Λ表示，10D5-2-3抗體用□表示，R&D抗體用· 表示。圖中的〇mg/kg的值表示介質(zhì)施用組的值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE、n = 6)。
[0075] 圖7A是表示長期施用（2個(gè)月）獲得的抗BMP9單克隆抗體對(duì)小鼠紅細(xì)胞造血產(chǎn)生 的作用的圖。圖7A的圖表示紅細(xì)胞數(shù)的變化。圖的縱軸表示紅細(xì)胞數(shù)（X IO4/μ L)。圖中 的誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE、n = 8)。各種抗體施用組的測(cè)定值相對(duì)于介質(zhì)施用組的測(cè)定值 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異檢驗(yàn)使用學(xué)生t檢驗(yàn)（Student's t-test)來分析，**表示P <0.01， *** 表示 P < 0· 001。
[0076] 圖7B是表示長期施用（2個(gè)月）獲得的抗BMP9單克隆抗體對(duì)小鼠紅細(xì)胞造血產(chǎn)生 的作用的圖。圖7B的圖表示血紅素濃度的變化。圖的縱軸表示血紅素濃度（g/dL)。圖中 的誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE、n = 8)。各種抗體施用組的測(cè)定值相對(duì)于介質(zhì)施用組的測(cè)定值 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異檢驗(yàn)使用學(xué)生t檢驗(yàn)來分析，**表示P < 〇· 01，***表示P < 〇· 001。
[0077] 圖8是表示長期施用獲得的抗BMP9單克隆抗體對(duì)小鼠血中促紅細(xì)胞生成素（EPO) 濃度產(chǎn)生的影響的圖?？v軸表示小鼠 EPO濃度（pg/mL)。圖中的誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE、 η = 8)。
[0078] 圖9Α是表示短期施用（2周）獲得的抗ΒΜΡ9單克隆抗體對(duì)大鼠紅細(xì)胞造血產(chǎn)生 的作用的圖。圖9Α的圖表示紅細(xì)胞數(shù)的變化。圖的縱軸表示紅細(xì)胞數(shù)（X IO4/μ L)。圖中 的誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE、n = 6)。各種抗體施用組的測(cè)定值相對(duì)于介質(zhì)施用組的測(cè)定值 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異檢驗(yàn)使用學(xué)生t檢驗(yàn)來分析，*表示P < 〇· 05, **表示P < 0· 01，*** 表示 P < 0· 001。
[0079] 圖9B是表示短期施用（2周）獲得的抗BMP9單克隆抗體對(duì)大鼠紅細(xì)胞造血產(chǎn)生 的作用的圖。圖9B的圖表示血紅素濃度的變化。圖的縱軸表示血紅素濃度（g/dL)。圖中 的誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE、n = 6)。各種抗體施用組的測(cè)定值相對(duì)于介質(zhì)施用組的測(cè)定值 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異檢驗(yàn)使用學(xué)生t檢驗(yàn)來分析，*表示P < 〇· 05, **表示P < 0· 01，*** 表示 P < 0· 001。
[0080] 圖IOA是表示施用獲得的抗BMP9單克隆抗體對(duì)腎性貧血大鼠模型產(chǎn)生的作用的 圖。圖IOA的圖表示紅細(xì)胞數(shù)的變化。圖的橫軸表示抗體施用后的經(jīng)過時(shí)間（周），圖的縱 軸表示紅細(xì)胞數(shù)（Xl〇 4/yL)。假手術(shù)個(gè)體的介質(zhì)施用組用〇表示，5/6腎切除手術(shù)個(gè)體的 介質(zhì)施用組用?表示，5/6腎切除手術(shù)個(gè)體的6D10-1-1抗體施用組用Λ表示，5/6腎切除手 術(shù)個(gè)體的10D5-2-3抗體施用組用□表示。圖中Omg/kg的值表示介質(zhì)組的值，誤差線表示 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SE、介質(zhì)施用組η = 5、除此以外的組η = 8)。
[0081] 圖IOB是表示施用獲得的抗ΒΜΡ9單克隆抗體對(duì)腎性貧血大鼠模型產(chǎn)生的作用的 圖。圖IOB的圖表示血紅素濃度的變化。圖的橫軸表示抗體施用后的經(jīng)過時(shí)間（周），圖的 縱軸表示血紅素濃度（g/dL)。假手術(shù)個(gè)體的介質(zhì)施用組用〇表示，5/6腎切除手術(shù)個(gè)體的 介質(zhì)施用組用?表示，5/6腎切除手術(shù)個(gè)體的6D10-1-1抗體施用組用Λ表示，5/6腎切除手 術(shù)個(gè)體的10D5-2-3抗體施用組用□表示。圖中Omg/kg的值表示介質(zhì)組的值，誤差線表示 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SE、介質(zhì)施用組η = 5、除此以外的組η = 8)。
[0082] 圖IlA是表示獲得的抗ΒΜΡ9單克隆抗體與人ΒΜΡ9的復(fù)合物對(duì)來源于人BMPlO 依賴性人ALKl的信號(hào)的作用的圖。圖IlA的圖表示6D10-1-1抗體與人ΒΜΡ9的復(fù)合物 的結(jié)果。圖的橫軸表示人BMPlO的添加濃度，縱軸表示相對(duì)的熒光素酶發(fā)光量（Relative Luciferase Unit,相對(duì)突光素酶活性單位）?？笲MP9單克隆抗體（3 μ g/mL)單獨(dú)添加組 用表示，抗BMP9單克隆抗體（3yg/mL)與2ng/mL人BMP9的復(fù)合物添加組用Λ表示，抗 ΒΜΡ9單克隆抗體（3 μ g/mL)與10ng/mL人ΒΜΡ9的復(fù)合物添加組用〇表示。
[0083] 圖IlB是表示獲得的抗BMP9單克隆抗體與人BMP9的復(fù)合物對(duì)來源于人BMPlO 依賴性人ALKl的信號(hào)的作用的圖。圖IlB的圖表示10D5-2-3抗體與人BMP9的復(fù)合物 的結(jié)果。圖的橫軸表示人BMPlO的添加濃度，縱軸表示相對(duì)的熒光素酶發(fā)光量（Relative Luciferase Unit)?？笲MP9單克隆抗體（3 μ g/mL)單獨(dú)添加組用表示，抗BMP9單克隆 抗體（3 μ g/mL)與2ng/mL人BMP9的復(fù)合物添加組用Λ表示，抗BMP9單克隆抗體（3 μ g/ mL)與10ng/mL人BMP9的復(fù)合物添加組用〇表示。
[0084] 圖12表示制作的10D5-2-3抗體人源化抗體的重鏈可變區(qū)。
[0085] 圖13表示制作的10D5-2-3抗體人源化抗體的輕鏈可變區(qū)。

【具體實(shí)施方式】
[0086] 本發(fā)明涉及與人BMP9結(jié)合的單克隆抗體。
[0087] 本發(fā)明中，與抗體競(jìng)爭(zhēng)地與人BMP9結(jié)合的抗體是指人BMP9上具有與本發(fā)明的單 克隆抗體的表位相同或部分相同的表位（也稱為抗原決定簇）并與該表位結(jié)合的抗體。
[0088] 同與本發(fā)明的單克隆抗體所結(jié)合的表位相同的表位結(jié)合的抗體是指識(shí)別并結(jié)合 與本發(fā)明的單克隆抗體所識(shí)別的人BMP9的氨基酸序列相同的序列的抗體。
[0089] 人BMP9具有序列號(hào)66表示的氨基酸序列并以單鏈的前體蛋白質(zhì)（Pre-Pro體） 的形式合成。該單鏈的Pre-Pro體的序列號(hào)66表示的氨基酸序列中的第1位至第22位的 信號(hào)肽區(qū)域在高爾基體中被切斷后，經(jīng)由存在于第392位的半胱氨酸殘基間的二硫鍵形成 二聚體（Pro二聚體）。
[0090] 然后，利用弗林蛋白樣蛋白酶在序列號(hào)66表示的氨基酸序列的第319位與第320 位的氨基酸殘基間切斷，分割為不具有二硫鍵的N末端側(cè)片段的前肽區(qū)域（包含序列號(hào)66 表示的氨基酸序列中第23位的氨基酸至第319位的氨基酸的肽）和由序列號(hào)67表示的氨 基酸序列構(gòu)成的C末端側(cè)片段（成熟區(qū)）。
[0091] 在切掉前肽區(qū)域后，上述成熟區(qū)通過序列號(hào)67的第73位上殘留的半胱氨酸殘基 間的二硫鍵形成二聚體（以下記作成熟二聚體）。2分子被切掉的N末端側(cè)的前肽區(qū)域 與1分子的該成熟二聚體通過非共價(jià)鍵形成復(fù)合物，并以該復(fù)合物的形式從細(xì)胞中分泌 [J. Biol. Chem.，280 (26)，25111 (2005)]。成熟二聚體和在成熟二聚體上結(jié)合有N末端前肽 區(qū)域的復(fù)合物均具有BMP9的功能。
[0092] 因此，作為本發(fā)明中的人BMP9,也包括包含序列號(hào)66或GenBank登記號(hào) NP_057288表示的氨基酸序列中與成熟區(qū)相當(dāng)?shù)牡?20位至第429位的氨基酸序列（序列 號(hào)67)且具有人BMP9的功能的多肽、包含在與成熟區(qū)相當(dāng)?shù)牡?20位至第429位的氨基酸 序列（序列號(hào)67)中缺失、取代或添加一個(gè)以上的氨基酸而成的氨基酸序列且具有人BMP9 的功能的多肽、具有與序列號(hào)67表示的氨基酸序列具有60%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選 90%以上的同源性的氨基酸序列的多肽、包含與序列號(hào)67表示的氨基酸序列具有最優(yōu)選 95%以上的同源性的氨基酸序列且具有人BMP9的功能的多肽、以及上述成熟二聚體和在 成熟二聚體上結(jié)合有N末端前肽區(qū)域的復(fù)合物。
[0093] 作為上述的BMP9的功能，是指BMP9參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)中，BMP9與屬于TGFii超家族的I型和II型這兩種受體結(jié)合，由此使該受體活化，使 Smad 1/5/8磷酸化，進(jìn)而，通過磷酸化而被活化的Smad 1/5/8與SmacM形成復(fù)合物后，移動(dòng)到 核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。
[0094] 作為I型受體，可以列舉ALKl和ALK2。另外，作為II型受體，可以列舉BMP II型 受體（BMPRII)、激活素 IIa型受體（ActRIIa)和激活素 IIb型受體（ActRIIb)。
[0095] 作為得到具有在序列號(hào)67表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個(gè)以上的氨 基酸而成的氨基酸序列的多肽的方法，可以列舉如下方法：使用定點(diǎn)誘變法[Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南），第二版（冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社， 1989) !Current Protocols in molecular Biology (最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法），約翰威立 父子出版公司（1987-1997);恥。161。六(^(18 1^86&1'(*，10,6487(1982)丨1'0(3.恥七1.六。&(1· Sci. USA, 79, 6409 (1982) ；Gene, 34, 315 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)] 等，在例如編碼具有序列號(hào)67表示的氨基酸序列的多肽的基因中導(dǎo)入定點(diǎn)突變。
[0096] 缺失、取代或添加的氨基酸數(shù)沒有特別限定，優(yōu)選為一個(gè)至數(shù)十個(gè)、例如1?20個(gè) 的氨基酸，更優(yōu)選為一個(gè)至數(shù)個(gè)、例如1?5個(gè)的氨基酸。
[0097] 作為編碼人BMP9的基因，可以列舉序列號(hào)68或GenBank登記號(hào)NM_016204表示 的堿基序列。其中，由在與成熟區(qū)相當(dāng)?shù)男蛄刑?hào)69表示的堿基序列中缺失、取代或添加一 個(gè)以上的堿基而成的堿基序列構(gòu)成并且包含編碼具有人BMP9的功能的多肽的DNA的基因、 由與序列號(hào)69表不的喊基序列具有至少60%以上的同源性的喊基序列、優(yōu)選具有80%以 上的同源性的堿基序列、更優(yōu)選具有95%以上的同源性的堿基序列構(gòu)成并且包含編碼具有 人BMP9的功能的多膚的DNA的基因、以及由在嚴(yán)格條件下與具有序列號(hào)69表不的喊基序 列的DNA雜交的DNA構(gòu)成并且包含編碼具有人BMP9的功能的多肽的DNA的基因等也包括 在本發(fā)明的編碼人BMP9的基因中。
[0098] 作為在嚴(yán)格條件下雜交的DNA，是指使用具有序列號(hào)69表示的堿基序列的DNA作 為探針，通過菌落雜交法、噬菌斑雜交法、DNA印跡（Southern blot)雜交法或DNA微陣列 法等得到的能夠雜交的DNA。
[0099] 具體而言，可以列舉能夠通過如下方法進(jìn)行鑒定的DNA :使用固定有來源于雜 交的菌落或噬菌斑的DNA、或者具有該序列的PCR產(chǎn)物或寡聚DNA的過濾器或載玻片，在 0· 7 ?I. Omol/L 的氯化鈉存在下在 65°C下進(jìn)行雜交[Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（1989) ;Current Protocols inmolecular Biology, 約翰威立父子出版公司（1987-1997) ;DNA Cloning I: Coretechniques, A Practical Approach(DNA克隆I :核心技術(shù)與實(shí)用方法），第二版，牛津大學(xué)，（1995)]，然后，使用 0. 1?2倍濃度的SSC溶液（1倍濃度的SSC溶液的組成由150mmol/L的氯化鈉、15mmol/L 的檸檬酸鈉構(gòu)成），在65°C的條件下清洗過濾器或載玻片，由此進(jìn)行鑒定。
[0100] 作為能夠雜交的DNA，可以列舉與序列號(hào)69表示的堿基序列具有至少60%以上的 同源性的DNA，優(yōu)選具有80%以上的同源性的DNA，進(jìn)一步優(yōu)選具有95%以上的同源性的 DNA。
[0101] 編碼真核生物的蛋白質(zhì)的基因的堿基序列常常可以觀察到基因的多態(tài)性。本發(fā)明 的編碼BMP9的基因還包括使本發(fā)明中使用的基因由于這樣的多態(tài)性而在堿基序列中產(chǎn)生 小規(guī)模的突變而得到的基因。
[0102] 除特別說明的情況以外，本發(fā)明中的同源性的數(shù)值可以是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的同源性檢索程序計(jì)算出的數(shù)值，對(duì)于堿基序列而言，可以列舉使用BLAST[J. Mol. Biol.，215, 403 (1990)]中默認(rèn)的參數(shù)計(jì)算出的數(shù)值等，對(duì)于氨基酸序列而言，可以列舉使 用 BLAST2 [Nucleic Acids Res. ,25, 3389 (1997) ;Genome Res. ,7,649 (1997) ;http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Education/BLASTinfo/information3. html]中默認(rèn)的參數(shù)計(jì)算出的數(shù) 值等。
[0103] 作為默認(rèn)的參數(shù)，G(起始空位罰分，Cost to open gap)在堿基序列的情況下為 5,在氨基酸序列的情況下為11 ;_E(空位延伸罰分，Cost to extend gap)在堿基序列的 情況下為2,在氨基酸序列的情況下為I ;_q(核苷酸錯(cuò)配罰分，Penalty for nucleotide mismatch)為-3 ;_r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)為 I ;_e(期望 值，expect value)為10 ;_W(字長大小，word size)在堿基序列的情況下為11個(gè)殘基， 在氨基酸序列的情況下為3個(gè)殘基；-y (非空位延伸下降的閾值，Dropoff (X) for blast extensions in bits)在blastn的情況下為20,在blastn以外的程序中為7;-X(空位 比對(duì)的下降閾值，X dropoff value for gapped alignment in bits)為 15 ;Ζ(最終空位 比對(duì)的下降值，final X dropoff value for gapped alignment in bits)在 blastn 的情 況下為為 50,在 blastn 以外的程序中為 25 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/html/ blastcgihelp. html)〇
[0104] 由序列號(hào)66或GenBank登記號(hào)ΝΡ_057288表示的氨基酸序列的部分序列構(gòu)成的 多肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制作，例如，可以通過使編碼序列號(hào)66表示的 氨基酸序列的DNA的一部分缺失并對(duì)導(dǎo)入有包含上述DNA的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)來 制作。
[0105] 另外，基于使用上述方法制作的多肽或DNA，通過與上述同樣的方法，可以得到具 有在序列號(hào)66或GenBank登記號(hào)NP_057288表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或 添加一個(gè)以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽。
[0106] 此夕卜，由序列號(hào)66或GenBank登記號(hào)NP_057288表不的氨基酸序列的部分序列構(gòu) 成的多肽或者具有在序列號(hào)66或GenBank登記號(hào)NP_057288表示的氨基酸序列的部分序 列中缺失、取代或添加一個(gè)以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽也可以通過芴甲氧羰基 (Fmoc)法和叔丁氧羰基（tBoc)法等化學(xué)合成法來制造。
[0107] 本發(fā)明的單克隆抗體（以下，也稱為本發(fā)明的抗體）為識(shí)別并且結(jié)合人BMP9的氨 基酸序列或其空間結(jié)構(gòu)的抗體或其抗體片段，或者具有與人BMP9的氨基酸序列或其空間 結(jié)構(gòu)結(jié)合、抑制BMP9與BMPRII的結(jié)合且不抑制BMP9與ALKl的結(jié)合的性質(zhì)。作為本發(fā)明 的單克隆抗體，可以列舉與人BMP9結(jié)合并且與人BMP9的結(jié)合解離常數(shù)為lXKr 1(lmol/L以 下的單克隆抗體或該抗體片段。
[0108] 作為本發(fā)明的抗體，具體而言，可以列舉與序列號(hào)67表示的人BMP9成熟區(qū)的氨基 酸序列中的至少第84位的Val、第95位的Leu、第97位的Tyr和第98位的His結(jié)合的抗 體、或者與至少第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met和第93位的Pro結(jié)合的抗體。 更優(yōu)選列舉與第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met和第93位的Pro結(jié)合的抗體。
[0109] 作為本發(fā)明中的人BMP9的氨基酸序列，可以列舉例如包含2個(gè)序列號(hào)67表示的 人BMP9成熟區(qū)的氨基酸序列且第73位的半胱氨酸殘基間形成有二硫鍵的氨基酸序列。
[0110] 作為本發(fā)明中的人BMP9的空間結(jié)構(gòu)，只要具有與包含序列號(hào)66、GenBank登記號(hào) NP_057288或序列號(hào)67表示的氨基酸序列的人BMP9在天然狀態(tài)下可以形成的結(jié)構(gòu)同等的 結(jié)構(gòu)，則可以為任意一種結(jié)構(gòu)。人BMP9在天然狀態(tài)下可以形成的空間結(jié)構(gòu)是指人BMP9的 天然型的空間結(jié)構(gòu)。
[0111] 作為本發(fā)明中的BMPRII，可以列舉：包含序列號(hào)70或GenBank登記號(hào)NP_001195 表示的氨基酸序列中相當(dāng)于胞外域的從第27位至第150位的氨基酸序列的多肽。
[0112] 作為本發(fā)明中的ALK1，可以列舉：包含序列號(hào)71或GenBank登記號(hào)AAH42637表 示的氨基酸序列中相當(dāng)于胞外域的從第22位至第118位的氨基酸序列的多肽。
[0113] 本發(fā)明的抗體的結(jié)合解離常數(shù)（Kd值）可以通過由使用Biacore系統(tǒng)（通用電氣 醫(yī)療集團(tuán)制造）測(cè)定的傳感圖利用單周期動(dòng)力學(xué)算法（BIA評(píng)價(jià)軟件第3版，通用電氣醫(yī)療 集團(tuán)制造）進(jìn)行分析來計(jì)算。
[0114] 作為上述抗體，具體而言，可以列舉下述（i)?（ii)的單克隆抗體及其抗體片段。
[0115] (i)包含⑶Rl?3分別含有序列號(hào)54?56表不的氨基酸序列的抗體的重鏈（以 下記作H鏈）且包含⑶Rl?3分別含有序列號(hào)57?59表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈 (以下記作L鏈）的單克隆抗體及其抗體片段
[0116] (ii)包含⑶Rl?3分別含有序列號(hào)60?62表不的氨基酸序列的抗體的H鏈且 包含CDRl?3分別含有序列號(hào)63?65表示的氨基酸序列的抗體的L鏈的單克隆抗體及 其抗體片段
[0117] 另外，作為本發(fā)明的單克隆抗體，更具體而言，可以列舉下述（a)、（b)和（C)的單 克隆抗體及其抗體片段。
[0118] (a)包含含有序列號(hào)48表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)（以下記作VH)且 包含含有序列號(hào)51表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)（以下記作VL)的單克隆抗體 及其抗體片段
[0119] (b)包含含有序列號(hào)49表不的氨基酸序列的抗體的VH且包含含有序列號(hào)52表不 的氨基酸序列的抗體的VL的單克隆抗體及其抗體片段
[0120] (c)包含含有序列號(hào)128表示的氨基酸序列的抗體的VH且包含含有序列號(hào)132表 示的氨基酸序列的抗體的VL的抗體及其抗體片段
[0121] 此外，作為本發(fā)明的單克隆抗體，可以列舉同與上述單克隆抗體所結(jié)合的人BMP9 上存在的表位相同的表位結(jié)合的單克隆抗體及其抗體片段。
[0122] 本發(fā)明的抗體或其抗體片段與人BMP9的氨基酸序列或其空間結(jié)構(gòu)的結(jié)合可以通 過使用固相抗原的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)等針對(duì)人BMP9或表達(dá)人BMP9的組織的公知的 免疫學(xué)檢測(cè)法、能夠考察特定抗原與抗特定抗原的抗體的結(jié)合性的方法等來確認(rèn)。
[0123] 可以列舉例如：使用Biacore系統(tǒng)（通用電氣醫(yī)療集團(tuán)制造）等的表面等離子體 共振法、使用ITC(DKSH公司制造）等的等溫滴定量熱法等方法。
[0124] 抗體對(duì)抗原的結(jié)合解離常數(shù)（Kd值）可以通過利用ELISA、表面等離子體共振法、 等溫滴定量熱法中的任意一種方法進(jìn)行斯卡查德作圖（scatchard plot)、或者依照各裝置 的附帶資料進(jìn)行分析來求出。
[0125] 另外，也可以將公知的免疫學(xué)檢測(cè)方法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice (單克隆抗體的原則與實(shí)踐），第三版，美國學(xué)術(shù)出版社（1996); Antibodies-A Laboratory Manual (抗體實(shí)驗(yàn)指南），冷泉港實(shí)驗(yàn)室（1988);単々口 一 ^抗 體実験^二A 7 > (單克隆抗體實(shí)驗(yàn)指南），講談社寸^工^77々（1987)]等組合 來進(jìn)行確認(rèn)。
[0126] 作為表達(dá)人BMP9的組織，只要表達(dá)該BMP9則可以為任意一種組織，可以列舉例如 血液、肝臟等。
[0127] 作為本發(fā)明的單克隆抗體，可以列舉：由雜交瘤生產(chǎn)的抗體、或者由利用包含抗體 基因的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的基因重組抗體。
[0128] 單克隆抗體為單一克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞所分泌的抗體，其特征在于，僅識(shí)別一個(gè) 表位（也稱為抗原決定簇），并且構(gòu)成單克隆抗體的氨基酸序列（一級(jí)結(jié)構(gòu)）一致。
[0129] 作為表位，可以列舉例如：?jiǎn)慰寺】贵w所識(shí)別并結(jié)合的單一氨基酸序列、由氨基酸 序列構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)、結(jié)合有糖鏈的氨基酸序列以及由結(jié)合有糖鏈的氨基酸序列構(gòu)成的空 間結(jié)構(gòu)等。
[0130] 本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選與人BMP9的氨基酸序列結(jié)合。
[0131] 本發(fā)明的單克隆抗體所結(jié)合的表位優(yōu)選包含在人BMP9的氨基酸序列中。
[0132] 雜交瘤例如可以通過如下方法來制備：制備上述人BMP9作為抗原，利用經(jīng)該抗原 免疫后的動(dòng)物誘導(dǎo)出具有抗原特異性的抗體生產(chǎn)細(xì)胞，進(jìn)而，使該抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤 細(xì)胞融合。通過對(duì)該雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)或者對(duì)動(dòng)物施用該雜交瘤細(xì)胞而使該動(dòng)物產(chǎn)生癌性腹 水并對(duì)該培養(yǎng)液或腹水進(jìn)行分離、純化，可以獲得抗BMP9單克隆抗體。
[0133] 作為進(jìn)行抗原免疫的動(dòng)物，只要能夠制作雜交瘤則均可以使用，優(yōu)選使用小鼠、大 鼠、倉鼠、雞或兔等。另外，由如下制作的雜交瘤生產(chǎn)的抗體等也包括在本發(fā)明的抗體中：從 上述動(dòng)物中獲取具有抗體產(chǎn)生能力的細(xì)胞，在體外對(duì)該細(xì)胞實(shí)施免疫，然后與骨髓瘤細(xì)胞 融合而制作雜交瘤。
[0134] 作為本發(fā)明中的基因重組抗體，包括人嵌合抗體、人⑶R移植抗體、人抗體或抗體 片段等通過基因重組制造的抗體。基因重組抗體中，具有單克隆抗體的特征、抗原性低且血 中半衰期延長的基因重組抗體優(yōu)選作為治療劑。基因重組抗體可以列舉例如使用基因重組 技術(shù)對(duì)上述本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行修飾而得到的抗體。
[0135] 人嵌合抗體是指由人以外的動(dòng)物的抗體的VH和VL與人抗體的重鏈恒定區(qū)（以下 記作CH)和輕鏈恒定區(qū)（以下記作CL)構(gòu)成的抗體。本發(fā)明的人嵌合抗體可以如下制造： 由上述雜交瘤獲取編碼VH和VL的cDNA，將它們分別插入到具有編碼人抗體的CH和CL的 基因的動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體，將上述載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中使 其進(jìn)行表達(dá)。
[0136] 作為人嵌合抗體的CH，只要屬于人免疫球蛋白（以下記作hlg)則均可以使用，優(yōu) 選hlgG類的CH，并且，可以使用屬于hlgG類的hlgGl、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亞類中的 任意一種。另外，作為人嵌合抗體的CL，可以是屬于hlg的任意一種CL，可以使用κ類或 λ類的CL。
[0137] 作為本發(fā)明的人嵌合抗體，具體而言，可以列舉：包含含有序列號(hào)48表不的氨基 酸序列的抗體的VH且包含含有序列號(hào)51表示的氨基酸序列的抗體的VL的嵌合抗體。另 夕卜，可以列舉：包含含有序列號(hào)49表不的氨基酸序列的抗體的VH且包含含有序列號(hào)52表 示的氨基酸序列的抗體的VL的嵌合抗體。
[0138] 人CDR移植抗體有時(shí)也稱為人源化抗體，是指將人以外的動(dòng)物的抗體的VH和VL 的CDR的氨基酸序列移植到人抗體的VH和VL的適當(dāng)位置而得到的抗體。本發(fā)明的人CDR 移植抗體可以如下制造：構(gòu)建編碼可變區(qū)（以下記作V區(qū)）的cDNA，所述可變區(qū)是將由產(chǎn) 生特異性識(shí)別人ΒΜΡ9并與人ΒΜΡ9的氨基酸序列或其空間結(jié)構(gòu)結(jié)合的人以外的動(dòng)物的單克 隆抗體的雜交瘤產(chǎn)生的人以外的動(dòng)物的抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到任意的 人抗體的VH和VL的框架區(qū)（以下記作FR)中而形成的可變區(qū)，將上述cDNA分別插入到具 有編碼人抗體的CH和CL的基因的動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人CDR移植抗體表達(dá)載體， 并將其導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中，由此進(jìn)行表達(dá)，從而制造人CDR移植抗體。
[0139] 作為人⑶R移植抗體的CH，只要屬于hlg則可以是任意一種CH，優(yōu)選使用hlgG類 的CH，并且，可以使用屬于hlgG類的hlgGl、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亞類中的任意一種。 另外，作為人CDR移植抗體的CL，只要屬于hlg則可以是任意一種CL，可以使用κ類或λ 類的CL。
[0140] 作為本發(fā)明的人CDR移植抗體，具體而言，可以列舉：包含CDRl?3分別含有序列 號(hào)54?56表示的氨基酸序列的抗體的VH且包含⑶Rl?3分別含有序列號(hào)57?59表示 的氨基酸序列的抗體的VL的人源化抗體。另外，可以列舉：包含CDRl?3分別含有序列號(hào) 60?62表不的氨基酸序列的抗體的VH且包含⑶Rl?3分別含有序列號(hào)63?65表不的 氨基酸序列的抗體的VL的人源化抗體。
[0141] 作為本發(fā)明的人源化抗體，具體而言，可以列舉包含下述（a)VH和（b)VL中的至少 一者的人源化抗體。
[0142] (a)包含序列號(hào)116的氨基酸序列或者序列號(hào)116的氨基酸序列中的選自第8位 的Gly、第18位的Leu、第49位的Gly、第79位的Asn、第81位的Leu、第94位的Ala、第95 位的Val、第99位的Ala和第100位的Arg中的至少一個(gè)氨基酸殘基被取代成其他氨基酸 殘基的氨基酸序列的抗體的VH
[0143] (b)包含序列號(hào)118的氨基酸序列或者序列號(hào)118的氨基酸序列中的選自第4位 的Met、第40位的Tyr、第81位的Ser、第82位的Leu、第89位的Val和第91位的Tyr中 的至少一個(gè)氨基酸殘基被取代成其他氨基酸殘基的氨基酸序列的抗體的VL
[0144] 此外，作為本發(fā)明的人源化抗體中包含的VH，優(yōu)選下述⑴?（6)。
[0145] (1)包含序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly、第18位的Leu、第49位的 Gly、第79位的Asn、第81位的Leu、第94位的Ala、第95位的Val、第99位的Ala和第100 位的Arg被取代成其他氨基酸殘基的氨基酸序列的VH
[0146] (2)包含序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly、第18位的Leu、第49位的 Gly、第81位的Leu、第94位的Ala、第99位的Ala和第100位的Arg被取代成其他氨基酸 殘基的氨基酸序列的VH
[0147] (3)包含序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly、第18位的Leu、第49位的 Gly、第79位的Asn、第94位的Ala、第99位的Ala和第100位的Arg被取代成其他氨基酸 殘基的氨基酸序列的VH
[0148] (4)包含序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly、第95位的Val、第99位的 Ala和第100位的Arg被取代成其他氨基酸殘基的氨基酸序列的VH
[0149] (5)包含序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly、第18位的Leu、第79位的 Asn和第100位的Arg被取代成其他氨基酸殘基的氨基酸序列的VH
[0150] (6)包含序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly、第99位的Ala和第100位 的Arg被取代成其他氨基酸殘基的氨基酸序列的VH
[0151] 作為上述VH的氨基酸序列，可以列舉例如導(dǎo)入有選自下述修飾中的至少一個(gè)修 飾的氨基酸序列：將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的 Leu取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu 取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第95位的Val取代成lie、將第99位的Ala取 代成Thr或者將第100位的Arg取代成Gly。
[0152] 作為導(dǎo)入有9個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如：將序列號(hào)116 的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu取代成Met、將第49位的Gly 取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第95位的Val取代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列。
[0153] 作為導(dǎo)入有8個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)?（9) 的氨基酸序列。
[0154] (1)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、將第49位的Gly 取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第95位的Val取代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列
[0155] (2)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第49位的Gly 取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第95位的Val取代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列
[0156] (3)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第95位的Val取代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列
[0157] (4)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第95位的Val取代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列
[0158] (5)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第94位的Ala取 代成Gly、將第95位的Val取代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列
[0159] (6)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取 代成Val、將第95位的Val取代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列
[0160] (7)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取 代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列
[0161] (8)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取 代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第95位的Val取代成Ile并且將第100位的Arg 取代成Gly的氨基酸序列
[0162] (9)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取 代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第95位的Val取代成Ile并且將第99位的Ala 取代成Thr的氨基酸序列
[0163] 作為導(dǎo)入有7個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述⑴?（8) 的氨基酸序列。
[0164] (1)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0165] (2)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第94位的Ala取 代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0166] (3)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0167] (4)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第49位的Gly 取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0168] (5)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第49位的Gly 取代成Ala將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第95位的Val取 代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0169] (6)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、將第49位的Gly 取代成Ala、將第79位的Asn取代成Ser、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0170] (7)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、將第49位的Gly 取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第95位的Val取 代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0171] (8)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第79位的Asn 取代成Ser、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第95位的Val取 代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0172] 作為導(dǎo)入有6個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)?（7) 的氨基酸序列。
[0173] (1)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、將第49位的Gly 取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取 代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0174] (2)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第49位的Gly 取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取 代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0175] (3)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取 代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0176] (4)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取 代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0177] (5)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第99位的Ala取 代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0178] (6)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0179] (7)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala取 代成Gly并且將第99位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
[0180] 作為導(dǎo)入有5個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)?（6) 的氨基酸序列。
[0181] (1)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu 取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0182] (2)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0183] (3)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、將第81位的Leu 取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0184] (4)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第81位的Leu 取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0185] (5)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、將第49位的Gly 取代成Ala、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0186] (6)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第49位的Gly 取代成Ala、將第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0187] 作為導(dǎo)入有4個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)?（7) 的氨基酸序列。
[0188] (1)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、將第18位的Leu 取代成Met、將第79位的Asn取代成Ser并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0189] (2)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第95位的Val 取代成lie、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0190] (3)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala 取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0191] (4)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第94位的Ala 取代成Gly、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0192] (5)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu 取代成Val、將第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0193] (6)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu 取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0194] (7)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu 取代成Val、將第94位的Ala取代成Gly并且將第99位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
[0195] 作為導(dǎo)入有3個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)?（6) 的氨基酸序列。
[0196] (1)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第99位的Ala 取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0197] (2)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第81位的Leu 取代成Val并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0198] (3)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、將第94位的Ala 取代成Gly并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0199] (4)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val、將第94位的Ala 取代成Gly并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0200] (5)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val、將第99位的Ala 取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0201] (6)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第94位的Ala取代成Gly、將第99位的Ala 取代成Thr并且將第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0202] 作為導(dǎo)入有2個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)? (12)的氨基酸序列。
[0203] (1)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0204] (2)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0205] (3)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0206] (4)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0207] (5)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第94位的Ala取代成Gly并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0208] (6)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第99位的Ala取代成Thr并且將第100位的 Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0209] (7)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg并且將第49位的 Gly取代成Ala的氨基酸序列
[0210] (8)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met并且將第49位的 Gly取代成Ala的氨基酸序列
[0211] (9)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且將第81位的 Leu取代成Val的氨基酸序列
[0212] (10)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且將第94位的 Ala取代成Gly的氨基酸序列
[0213] (11)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且將第99位的 Ala取代成Thr的氨基酸序列
[0214] (12)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且將第100位 的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0215] 作為導(dǎo)入有1個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述⑴?（9) 的氨基酸序列。
[0216] (1)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg的氨基酸序列
[0217] (2)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met的氨基酸序列
[0218] (3)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala的氨基酸序列
[0219] (4)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第79位的Asn取代成Ser的氨基酸序列
[0220] (5)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val的氨基酸序列
[0221] (6)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第94位的Ala取代成Gly的氨基酸序列
[0222] (7)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第95位的Val取代成Ile的氨基酸序列
[0223] (8)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第99位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
[0224] (9)將序列號(hào)116的氨基酸序列中的第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
[0225] 另外，作為本發(fā)明的人源化抗體中含有的VL，優(yōu)選下述（1)?（4)。
[0226] (1)包含序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met、第40位的Tyr、第81位的 Ser、第82位的Leu、第89位的Val和第91位的Tyr被取代成其他氨基酸殘基的氨基酸序 列的抗體的VL
[0227] (2)包含序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met、第81位的Ser、第82位的 Leu和第89位的Val被取代成其他氨基酸殘基的氨基酸序列的抗體的VL
[0228] (3)包含序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr、第81位的Ser和第91位 的Tyr被取代成其他氨基酸殘基的氨基酸序列的抗體的VL
[0229] (4)包含序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr和第91位的Tyr被取代成 其他氨基酸殘基的氨基酸序列的抗體的VL
[0230] 作為上述VL的氨基酸序列，可以列舉例如導(dǎo)入有選自下述修飾中的至少一個(gè)修 飾的氨基酸序列：將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第40位的 Tyr取代成Phe、將第81位的Ser取代成Pro、將第82位的Leu取代成Met、將第89位的 Val取代成Met或者將第91位的Tyr取代成Phe。
[0231] 作為導(dǎo)入有6個(gè)修飾的VL的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如：將序列號(hào)118 的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第40位的Tyr取代成Phe、將第81位的Ser 取代成Pro、將第82位的Leu取代成Met、將第89位的Val取代成Met并且將第91位的 Tyr取代成Phe的氨基酸序列。
[0232] 作為導(dǎo)入有5個(gè)修飾的VL的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述⑴?（6) 的氨基酸序列。
[0233] (1)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、將第81位的Ser 取代成Pro、將第82位的Leu取代成Met、將第89位的Val取代成Met并且將第91位的 Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0234] (2)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第81位的Ser取 代成Pro、將第82位的Leu取代成Met、將第89位的Val取代成Met并且將第91位的Tyr 取代成Phe的氨基酸序列
[0235] (3)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第40位的Tyr取 代成Phe、將第82位的Leu取代成Met、將第89位的Val取代成Met并且將第91位的Tyr 取代成Phe的氨基酸序列
[0236] (4)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第40位的Tyr取 代成Phe、將第81位的Ser取代成Pro、將第89位的Val取代成Met并且將第91位的Tyr 取代成Phe的氨基酸序列
[0237] (5)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第40位的Tyr取 代成Phe、將第81位的Ser取代成Pro、將第82位的Leu取代成Met并且將第91位的Tyr 取代成Phe的氨基酸序列
[0238] (6)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第40位的Tyr取 代成Phe、將第81位的Ser取代成Pro、將第82位的Leu取代成Met并且將第89位的Val 取代成Met的氨基酸序列
[0239] 作為導(dǎo)入有4個(gè)修飾的VL的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)?（6) 的氨基酸序列。
[0240] (1)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第81位的Ser 取代成Pro、將第82位的Leu取代成Met并且將第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
[0241] (2)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro、將第82位的Leu 取代成Met、將第89位的Val取代成Met并且將第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0242] (3)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、將第82位的Leu 取代成Met、將第89位的Val取代成Met并且將第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0243] (4)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、將第81位的Ser 取代成Pro、將第89位的Val取代成Met并且將第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0244] (5)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、將第81位的Ser 取代成Pro、將第82位的Leu取代成Met并且將第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
[0245] (6)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、將第81位的Ser 取代成Pro、將第82位的Leu取代成Met并且將第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
[0246] 作為導(dǎo)入有3個(gè)修飾的VL的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)?（6) 的氨基酸序列。
[0247] (1)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、將第81位的Ser 取代成Pro并且將第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0248] (2)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、將第82位的Leu 取代成Met并且將第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
[0249] (3)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、將第82位的Leu 取代成Met并且將第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0250] (4)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第82位的Leu取代成Met、將第89位的Val 取代成Met并且將第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0251] (5)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro、將第89位的Val 取代成Met并且將第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0252] (6)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro、將第82位的Leu 取代成Met并且將第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
[0253] 作為導(dǎo)入有2個(gè)修飾的VL的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述（1)? (10)的氨基酸序列。
[0254] (1)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe并且將第81位的 Ser取代成Pro的氨基酸序列
[0255] (2)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe并且將第82位的 Leu取代成Met的氨基酸序列
[0256] (3)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe并且將第89位的 Val取代成Met的氨基酸序列
[0257] (4)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe并且將第91位的 Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0258] (5)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro并且將第82位的 Leu取代成Met的氨基酸序列
[0259] (6)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro并且將第89位的 Val取代成Met的氨基酸序列
[0260] (7)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro并且將第91位的 Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0261] (8)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第82位的Leu取代成Met并且將第89位的 Val取代成Met的氨基酸序列
[0262] (9)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第82位的Leu取代成Met并且將第91位的 Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0263] (10)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第89位的Val取代成Met并且將第91位的 Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0264] 作為導(dǎo)入有1個(gè)修飾的VL的氨基酸序列，具體而言，可以列舉例如下述⑴?（6) 的氨基酸序列。
[0265] (1)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu的氨基酸序列
[0266] (2)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0267] (3)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro的氨基酸序列
[0268] (4)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第82位的Leu取代成Met的氨基酸序列
[0269] (5)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
[0270] (6)將序列號(hào)118的氨基酸序列中的第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
[0271] 另外，作為本發(fā)明的人源化抗體的具體例，可以列舉：抗體的VH包含序列號(hào)116的 氨基酸序列和/或抗體的VL包含序列號(hào)118的氨基酸序列的人源化抗體、抗體的VH包含 序列號(hào)116的氨基酸序列和/或抗體的VL包含圖12所示的任意一個(gè)氨基酸序列的人源化 抗體、或者抗體的VH包含圖11所示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含序列號(hào)118的氨基 酸序列的人源化抗體等。
[0272] 人抗體原本是指天然存在于人體內(nèi)的抗體，但也包括從利用最近的基因工程、細(xì) 胞工程、發(fā)育工程的技術(shù)進(jìn)步而制作的人抗體噬菌體文庫和產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中得 到的抗體等。
[0273] 天然存在于人體內(nèi)的抗體例如可以如下獲得：分離人末梢血淋巴細(xì)胞，使其感染 EB病毒等而永生化，并進(jìn)行克隆，由此可以培養(yǎng)出產(chǎn)生該抗體的淋巴細(xì)胞，并可以從培養(yǎng)上 清中純化出該抗體。
[0274] 人抗體噬菌體文庫是通過將由人B細(xì)胞制備的抗體基因插入到噬菌體基因中而 使Fab、scFv等抗體片段在噬菌體表面進(jìn)行表達(dá)而得到的文庫?？梢砸钥贵w片段對(duì)固定有 抗原的底物的結(jié)合活性為指標(biāo)，從該文庫中回收在表面表達(dá)具有期望的抗原結(jié)合活性的抗 體片段的噬菌體。該抗體片段還可以進(jìn)一步通過基因工程方法轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓛蓷l完整的H鏈和 兩條完整的L鏈構(gòu)成的人抗體分子。
[0275] 產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指細(xì)胞內(nèi)整合有人抗體基因的動(dòng)物。具體而言，例如， 向小鼠 ES細(xì)胞中導(dǎo)入人抗體基因，將該ES細(xì)胞移植到小鼠的早期胚胎中，然后使其發(fā)育， 由此可以制作產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。來自于產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的人抗體可以如 下制作：使用通常的在人以外的動(dòng)物中進(jìn)行的雜交瘤制作方法，獲取產(chǎn)生人抗體的雜交瘤 并進(jìn)行培養(yǎng)，由此，在培養(yǎng)上清中產(chǎn)生并蓄積人抗體。
[0276] 在構(gòu)成上述抗體或抗體片段的氨基酸序列中缺失、添加、取代或插入一個(gè)以上的 氨基酸并且具有與上述抗體或其抗體片段相同的活性的單克隆抗體或其抗體片段也包括 在本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段中。
[0277] 缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸數(shù)為一個(gè)以上，其數(shù)量沒有特別限 定，為利用定點(diǎn)誘變法[Molecular Cloning,第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（1989); Current Protocols inmolecular Biology，約翰威立父子出版公司（1987-1997); Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)； Gene,34,315 (1985) ；Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)]等公知的技術(shù)可以缺失、取代或添加的程度的數(shù)量。例如優(yōu)選為一個(gè)至 數(shù)十個(gè)，更優(yōu)選為1?20個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1?10個(gè)，特別優(yōu)選為1?5個(gè)。
[0278] 在上述抗體的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一個(gè)以上的氨基酸殘基表示 如下含義。即，意味著在同一序列中的任意且一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列中，存在一個(gè)或多個(gè)氨 基酸殘基的缺失、取代、插入和/或添加。另外，既存在同時(shí)發(fā)生缺失、取代、插入或添加的 情況，也存在被取代、插入或添加的氨基酸殘基為天然型和非天然型中的任意一種的情況。
[0279] 作為天然型氨基酸殘基，可以列舉例如：L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、 L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、 L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸或L-半胱 氨酸等。
[0280] 以下，示出可相互取代的氨基酸殘基的優(yōu)選例。同一組中所含的氨基酸殘基可以 相互取代。
[0281] A組：亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨 酸、0-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸
[0282] B組：天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
[0283] C組：天冬酰胺、谷氨酰胺
[0284] D組：賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2, 4-二氨基丁酸、2, 3-二氨基丙酸
[0285] E組：脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸
[0286] F組：絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸
[0287] G組：苯丙氨酸、酪氨酸
[0288] 本發(fā)明中，作為抗體片段，可以列舉：？&1^祕(mì)'）2、？ &13'、單鏈抗體（8(^)、二聚體 化V區(qū)（diabody)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)（dsFv)和包含⑶R的肽等。
[0289] Fab是將IgG用作為蛋白分解酶的木瓜蛋白酶進(jìn)行處理而得到的片段中（在H鏈 的第224位的氨基酸殘基處切斷）、N末端側(cè)約一半的H鏈與整個(gè)L鏈通過二硫鍵結(jié)合而成 的分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。
[0290] 本發(fā)明的Fab可以通過將本發(fā)明的單克隆抗體用木瓜蛋白酶進(jìn)行處理而得到。另 夕卜，也可以將編碼該抗體的Fab的DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體 中并將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此使其進(jìn)行表達(dá)，從而制造 Fab。
[0291] F(ab'）2是將IgG的鉸鏈區(qū)的二硫鍵的下部用作為蛋白分解酶的胃蛋白酶分解而 得到的、兩個(gè)Fab區(qū)在鉸鏈部分結(jié)合而構(gòu)成的、分子量約為10萬的具有抗原結(jié)合活性的片 段。
[0292] 本發(fā)明的F (ab'）2可以通過將本發(fā)明的單克隆抗體用胃蛋白酶進(jìn)行處理而得到。 另外，也可以通過使下述Fab'以硫醚鍵或二硫鍵結(jié)合來制作。
[0293] Fab'是將上述F(ab'）2的鉸鏈區(qū)的二硫鍵切斷而得到的分子量約為5萬的具有 抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明的Fab'可以通過將本發(fā)明的F(ab'） 2用二硫蘇糖醇等 還原劑進(jìn)行處理而得到。另外，也可以將編碼該抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物用 表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中并將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此使其進(jìn)行 表達(dá)，從而制造 Fab'。
[0294] scFv是使用適當(dāng)?shù)碾慕宇^（以下記作P)將一條VH與一條VL連接而形成的 VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。
[0295] 本發(fā)明的scFv可以通過如下方法制造：獲取編碼本發(fā)明的單克隆抗體的VH和VL 的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載 體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)。
[0296] 雙價(jià)抗體為scFv二聚體化而得到的抗體片段，是具有二價(jià)抗原結(jié)合活性的抗體 片段。二價(jià)抗原結(jié)合活性可以相同，也可以使其中之一為不同的抗原結(jié)合活性。
[0297] 本發(fā)明的雙價(jià)抗體可以通過如下方法制造：獲取編碼本發(fā)明的單克隆抗體的VH 和VL的cDNA，以使肽接頭的氨基酸序列的長度為8個(gè)殘基以下的方式構(gòu)建編碼scFv的 DNA，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入 原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)。
[0298] dsFv是指使VH和VL中的各一個(gè)氨基酸殘基取代為半胱氨酸殘基的多肽借助該半 胱氨酸殘基之間的二硫鍵結(jié)合而得到的抗體片段。取代為半胱氨酸殘基的氨基酸殘基可以 根據(jù)已知的方法[Protein Engineering, 7, 697 (1994)]基于抗體的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)來進(jìn)行選 擇。
[0299] 本發(fā)明的dsFv可以通過如下方法制造：獲取編碼本發(fā)明的單克隆抗體的VH和VL 的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載 體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)。
[0300] 包含⑶R的肽包含VH或VL的⑶R中的至少一個(gè)以上的區(qū)域而構(gòu)成。包含多個(gè) CDR的肽可以直接結(jié)合或者借助肽接頭而結(jié)合。
[0301] 本發(fā)明的包含CDR的肽可以通過如下方法制造：構(gòu)建編碼本發(fā)明的單克隆抗體的 VH和VL的⑶R的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，并 將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)。另外，包含CDR的肽也可以通過 Fmoc法或tBoc法等化學(xué)合成法來制造。
[0302] 本發(fā)明的單克隆抗體包括：利用化學(xué)或基因工程方法在本發(fā)明的單克隆抗體或 其抗體片段上結(jié)合放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質(zhì)等而得到的抗體的衍生 物。在使用抗體的衍生物作為檢測(cè)方法、定量方法、檢測(cè)用試劑或定量用試劑的情況下，作 為本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段上結(jié)合的藥劑，可以列舉通常的免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)定方 法中使用的標(biāo)記物。
[0303] 本發(fā)明中的抗體的衍生物可以通過利用化學(xué)方法[抗體工學(xué)入門（抗體工程入 門），地人書館（1994)]在本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段的H鏈或L鏈的N末端側(cè)或 C末端側(cè)、抗體或其抗體片段中的適當(dāng)?shù)娜〈騻?cè)鏈、以及單克隆抗體或其抗體片段中的 糖鏈等上結(jié)合放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質(zhì)等來制造。
[0304] 另外，本發(fā)明中的抗體的衍生物也可以通過基因工程方法來制造，S卩，使編碼本發(fā) 明的單克隆抗體或抗體片段的DNA與編碼要結(jié)合的蛋白質(zhì)的DNA連接后插入表達(dá)載體中， 并將該表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，使其進(jìn)行表達(dá)。
[0305] 作為放射性同位素，可以列舉例如：1311、1251、 9°￥、64&1、991^、'11或21^等。放射性 同位素可以通過氯胺T法等直接與抗體結(jié)合。另外，也可以在抗體上結(jié)合用于螯合放射性 同位素的物質(zhì)。作為螯合劑，可以列舉1-異硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙 酸（MX-DTPA)等。
[0306] 作為低分子藥劑，可以列舉例如：吖啶酯或洛粉堿等發(fā)光物質(zhì)、或者異硫氰酸熒光 素（FITC)或四甲基羅丹明異硫氰酸酯（RITC)等熒光物質(zhì)等。
[0307] 作為使低分子藥劑與抗體結(jié)合的方法，可以列舉例如：通過戊二醛使藥劑與抗體 的氨基之間結(jié)合的方法、或者通過水溶性碳二亞胺使藥劑的氨基與抗體的羧基結(jié)合的方法 等。
[0308] 作為高分子藥劑，可以列舉例如：聚乙二醇（以下記作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚 環(huán)氧乙烷、苯乙烯馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羥丙基甲基丙烯酰胺等。通 過使這些高分子化合物與抗體或抗體片段結(jié)合，可以期待發(fā)揮如下效果：（1)提高對(duì)化學(xué) 性、物理性或生物性的各種因素的穩(wěn)定性；（2)顯著延長血中半衰期；(3)免疫原性消失或 抑制抗體產(chǎn)生；等[A ?^才^ Υ-卜醫(yī)薬品，廣川書店（1993)]。例如，作為使PEG 與抗體結(jié)合的方法，可以列舉與PEG化修飾試劑進(jìn)行反應(yīng)的方法等[才=> '7' Λ欠' 一卜醫(yī)薬品，廣川書店（1993)]。作為PEG化修飾試劑，可以列舉：賴氨酸的ε-氨基的修 飾劑（日本特開昭61-178926號(hào)公報(bào)）、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修飾劑（日本特開昭 56-23587號(hào)公報(bào)）或精氨酸的胍基的修飾劑（日本特開平2-117920號(hào)公報(bào)）等。
[0309] 作為蛋白質(zhì)，可以列舉例如堿性磷酸酶、過氧化物酶或熒光素酶等酶。
[0310] 另外，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段作為有效成分的伴有 ΒΜΡ9相關(guān)的貧血的疾病的治療劑。
[0311] 作為伴有ΒΜΡ9相關(guān)的貧血的疾病，可以列舉：以血液或造血功能本身為原因的原 發(fā)性貧血和以其他疾病為原因而引起的繼發(fā)性貧血。原發(fā)性貧血有缺鐵性貧血、巨幼紅細(xì) 胞性貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血等,繼發(fā)性貧血有腎臟疾病、感染癥（結(jié)核、感染性 心內(nèi)膜炎、肝膿腫等）、膠原病（慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）、癌癥等惡性疾病、 肝臟疾病、內(nèi)分泌疾病等。
[0312] 作為癌癥，可以列舉例如：血癌、乳腺癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺 癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前列腺癌或胰腺癌等，優(yōu)選列舉血癌、食道 癌、胃癌、大腸癌、肝癌或前列腺癌。
[0313] 作為血癌，可以列舉例如：急性骨髓性白血?。╝cute myeloid leukemia, AML)、慢性骨髓性白血?。╟hronic myeloid leukemia, CML)、骨髓增生異常綜合征 (myelodysplastic syndromes，MDS)、多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma)、皮膚 T 細(xì)胞性 淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma，CTCL)、末梢 T 細(xì)胞性淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma，PTCL)、間變性大細(xì)胞性淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL)、急 性淋巴細(xì)胞性白血病（acute lympatic leukemia, ALL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血?。╟hronic lympatic leukemia，CLL)、其他淋巴細(xì)胞性白血病、NK細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、或者以 伯基特淋巴瘤為代表的非霍奇金淋巴瘤等。
[0314] 作為肝臟疾病，可以列舉例如慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭等，作為內(nèi)分泌疾病，可以 列舉例如甲狀腺功能減退癥、腎上腺皮質(zhì)功能減退癥、垂體功能減退癥、甲狀旁腺功能亢進(jìn) 癥等。
[0315] 本發(fā)明的治療劑含有上述的本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體片段作為有效成分。
[0316] 含有本發(fā)明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物的治療劑可以僅含有作為有 效成分的該抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，但通常優(yōu)選以與藥理學(xué)上可容許的一種 以上的載體一同混合并通過制劑學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】中公知的任意方法制造而成的醫(yī)藥制劑的形 式來提供。
[0317] 施用途徑優(yōu)選使用治療時(shí)最有效的途徑，可以列舉：經(jīng)口施用、或者口腔內(nèi)、氣管 內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)等非經(jīng)口施用，優(yōu)選列舉靜脈內(nèi)施用或皮下施用。
[0318] 作為施用形式，可以列舉例如：噴霧劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、 栓劑、注射劑、軟膏或膠帶劑等。
[0319] 施用量或施用次數(shù)根據(jù)目標(biāo)治療效果、施用方法、治療時(shí)間、年齡和體重等而不 同，通常成人每天為10 μ g/kg?10mg/kg。
[0320] 此外，本發(fā)明涉及含有特異性識(shí)別并結(jié)合BMP9的氨基酸序列或其空間結(jié)構(gòu)的單 克隆抗體或其抗體片段作為有效成分的、BMP9的免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)定方法。
[0321] 作為本發(fā)明中檢測(cè)或測(cè)定BMP9的量的方法，可以列舉任意的公知方法。例如，可 以列舉免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)定方法等。
[0322] 免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)定方法是指使用實(shí)施過標(biāo)記的抗原或抗體來檢測(cè)或測(cè)定抗體 量或抗原量的方法。作為免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)定方法，可以列舉：放射免疫測(cè)定法（RIA)、 酶免疫測(cè)定法（EIA或ELISA)、熒光免疫測(cè)定法（FIA)、發(fā)光免疫測(cè)定法（luminescent immunoassay)、蛋白免疫印跡法或物理化學(xué)方法等。
[0323] 以下，對(duì)本發(fā)明的抗體的制造方法、疾病的治療方法和疾病的診斷方法進(jìn)行具體 說明。
[0324] 1.單克隆抗體的制造方法
[0325] (1)抗原的制備
[0326] 作為抗原的BMP9或表達(dá)BMP9的組織可以通過將包含編碼全長或部分長度的BMP9 的cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞等中而得到。另外，可以從大 量表達(dá)BMP9的人組織中純化得到BMP9。另外，也可以直接使用該組織等作為抗原。此外， 也可以通過Fmoc法或tBoc法等化學(xué)合成方法制備具有BMP9的部分序列的合成肽來作為 抗原使用。
[0327] 本發(fā)明中使用的 BMP9 可以通過使用 Molecular Cloning, A Laboratory Manual， 第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（1989)或 Current Protocols inmolecular Biology,約翰 威立父子出版公司（1987-1997)等中記載的方法等利用例如以下的方法使編碼該BMP9的 DNA在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)來制造。
[0328] 首先，將包含編碼BMP9的部分的全長cDNA插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的啟動(dòng)子的下 游，由此制作重組載體。也可以使用基于全長cDNA而制備的、包含編碼多肽的部分的適當(dāng) 長度的DNA片段來代替上述全長cDNA。接著，將得到的該重組載體導(dǎo)入到適合于該表達(dá)載 體的宿主細(xì)胞中，由此可以得到生產(chǎn)多肽的轉(zhuǎn)化體。
[0329] 作為表達(dá)載體，只要是能夠在所使用的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制或者能夠整合到染色 體中并且在能夠轉(zhuǎn)錄編碼多肽的DNA的位置含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的表達(dá)載體，則均可以使 用。
[0330] 作為宿主細(xì)胞，只要是大腸桿菌等屬于埃希氏菌屬等的微生物、酵母、昆蟲細(xì)胞或 動(dòng)物細(xì)胞等能夠表達(dá)目的基因的宿主細(xì)胞，則均可以使用。
[0331] 在使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細(xì)胞的情況下，重組載體優(yōu)選為在原核生物 中能夠自主復(fù)制的同時(shí)包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、包含編碼BMP9的部分的DNA和轉(zhuǎn)錄 終止序列的載體。另外，該重組載體不一定需要轉(zhuǎn)錄終止序列，但優(yōu)選在緊鄰結(jié)構(gòu)基因的下 游配置轉(zhuǎn)錄終止序列。該重組載體可以進(jìn)一步含有調(diào)控啟動(dòng)子的基因。
[0332] 作為該重組載體，優(yōu)選使用將作為核糖體結(jié)合序列的夏因-達(dá)爾加諾 (Shine-Dalgarno)序列（也稱為SD序列）與起始密碼子的間隔調(diào)節(jié)至適當(dāng)距離（例如6? 18個(gè)喊基）的質(zhì)粒。
[0333] 另外，作為編碼該BMP9的DNA的喊基序列，可以對(duì)喊基進(jìn)行取代以形成最適于在 宿主內(nèi)表達(dá)的密碼子，由此，能夠提高目標(biāo)BMP9的生產(chǎn)率。
[0334] 作為表達(dá)載體，只要是能夠在所使用的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的載體則均可以使 用，可以列舉例如：pBTrp2、pBTacl、pBTac2(以上為羅氏診斷公司制造）、pKK233-2(法瑪 西亞公司制造）、pSE280 (英杰公司制造）、pGEMEX-Ι (普洛麥格公司制造）、pQE-8 (凱杰公 司制造 ）、pKYPIO (日本特開昭 58-110600 號(hào)公報(bào)）、pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984) ], pLSAl [Agricbiol. Chem. , 53, 277 (1989) ], pGELl [Proc. Natl. Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)( 7 卜 7 夕 '7'->公司制造）、 pTrs30[由大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]、pTrs32[由大腸桿菌 JM109/ pTrS32(FERM BP-5408)制備]、pGHA2[由大腸桿菌 IGHA2(FERM BP-400)制備，日本特開昭 60-221091號(hào)公報(bào)]、pGKA2 [由大腸桿菌IGKA2 (FERM BP6798)制備，日本特開昭60-221091 號(hào)公報(bào)]、pTerm2(美國專利第4686191號(hào)說明書、美國專利第4939094號(hào)說明書、美國 專利第 5160735 號(hào)說明書）、pSupex、pUBl 10、pTP5、pC194、pEG400[J. Bacteriol.、172、 2392(1990)]、pGEX(法瑪西亞公司制造）、pET系統(tǒng)（ッパ'フ'iシ公司制造）或pME18SFL3 等。
[0335] 作為啟動(dòng)子，只要是能夠在所使用的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子則均可使用。 可以列舉例如：trp啟動(dòng)子（Ptrp)、lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子等來源于 大腸桿菌或噬菌體等的啟動(dòng)子。另外，也可以使用將兩個(gè)Ptrp串聯(lián)而得到的串聯(lián)啟動(dòng)子、 tac啟動(dòng)子、lac T7啟動(dòng)子或let I啟動(dòng)子等經(jīng)過人為設(shè)計(jì)修飾的啟動(dòng)子等。
[0336] 作為宿主細(xì)胞，可以列舉例如：大腸桿菌XL-lBlue、大腸桿菌XL2_Blue、大腸桿菌 DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、 大腸桿菌No. 49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49或大腸桿菌DH5 α等。
[0337] 作為向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入重組載體的方法，只要是向所使用的宿主細(xì) 胞中導(dǎo)入DNA的方法則均可以使用，可以列舉例如：使用鈣離子的方法[Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 69, 2110 (1972) ；Gene, 17, 107 (1982) ；Molecular&General Genetics, 168, 111(1979)]。
[0338] 在使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主的情況下，作為表達(dá)載體，只要是能夠在動(dòng)物細(xì)胞 中發(fā)揮功能的表達(dá)載體則均可以使用，可以列舉例如：PcDNA I、pcDM8( 73〉公 司制造）、PAGE107[日本特開平 3-22979 號(hào)公報(bào)；Cytotechnology, 3, 133(1990)]、 PAS3-3 (日本特開平 2-227075 號(hào)公報(bào)）、pcDM8 [Nature, 329, 840 (1987) ]、pcDNA 1/ Amp(英杰公司制造）、pcDNA3. I (英杰公司制造）、pREP4(英杰公司制造）、pAGE103[J. Biochemistry, 101，1307 (1987) ]、pAGE210、pME18SFL3 或 pKANTEX93 (國際公開第 97/10354 號(hào)）等。
[0339] 作為啟動(dòng)子，只要是能夠在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子則均可以使用，可以列 舉例如：巨細(xì)胞病毒（CMV)的即刻早期（IE)基因的啟動(dòng)子、SV40的早期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病 毒的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、SRa啟動(dòng)子或者莫洛尼小鼠白血病病毒的 啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等。另外，也可以將人CMV的IE基因的增強(qiáng)子與啟動(dòng)子一同使用。
[0340] 作為宿主細(xì)胞，可以列舉例如：人白血病細(xì)胞那馬瓦（Namalwa)細(xì)胞、猿細(xì)胞COS 細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO 細(xì)胞（Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968) ；Genetics, 55,5 1 3 ( 1968)； Chromosoma,41,129(1973) ；Methods in Cell Science,18,115 (1996) ；Radiation Research, 148, 260 (1997) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) ；Proc. Natl. Acad. Sci.USA,60, 1275 (1968) ；Cell, 6, 121 (1975) ；Molecular CellgeneticsjAppendix I, II (pp. 883-900))、CH0/DG44、CH0-K1 (ATCC 編號(hào)：CCL-61)、DUkXBll (ATCC 編號(hào)： CCL-9096)、Pro-5 (ATCC 編號(hào)：CCL-1781)、CHO-S (Life Technologies, Cat#l 1619)、Pro-3、 大鼠骨髓瘤細(xì)胞YB2/3HL. P2. Gl I. 16Ag. 20 (或者也稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0、小鼠 骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Agl4、敘利亞倉鼠細(xì)胞BHK或HBT5637 (日本特開昭63-000299號(hào)公報(bào)） 等。
[0341] 作為向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入重組載體的方法，只要是向動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法則 均可以使用。可以列舉例如：電穿孔法[Cytotechnology, 3, 133(1990)]、磷酸I丐法（日本特 開平 2-227075 號(hào)公報(bào)）或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等。
[0342] 將如上得到的包含整合有編碼BMP9的DNA的重組載體的來源于微生物或動(dòng)物細(xì) 胞等的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成并蓄積該BMP9,并從該培養(yǎng)物中進(jìn)行 收集，由此可以制造 BMP9。將該轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法可以根據(jù)宿主的培養(yǎng)中 使用的通常的方法來進(jìn)行。
[0343] 在來源于真核生物的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，能夠得到附加有糖或糖鏈的BMP9。在對(duì) 利用使用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以根據(jù)需要向培養(yǎng) 基中添加誘導(dǎo)物。例如，在對(duì)利用使用Iac啟動(dòng)子的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培 養(yǎng)時(shí)，可以向培養(yǎng)基中添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，在對(duì)利用使用trp啟動(dòng)子 的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以向培養(yǎng)基中添加吲哚丙烯酸等。
[0344] 作為用于培養(yǎng)以動(dòng)物細(xì)胞為宿主而得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可以使用 例如通常使用的 RPMI1640 培養(yǎng)基[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]、伊戈?duì)枺‥agle)的 MEM 培養(yǎng)基[Science, 122, 501 (1952)]、 杜爾貝科（Dulbecco)改良的MEM培養(yǎng)基[Virology, 8, 396(1959)]、199 培養(yǎng)基[卩1'0(：.50(3· Exp. Biol. Med.，73, I (1950)]、伊思考夫（Iscove)改良的杜爾貝科培養(yǎng)基（MDM)或者向這 些培養(yǎng)基中添加胎牛血清（FBS)等而得到的培養(yǎng)基等。培養(yǎng)通常在pH6?8、30?40°C、 5% CO2存在下等條件下進(jìn)行1?7天。另外，在培養(yǎng)中，可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加卡 那霉素或青霉素等抗生素。
[0345] 作為編碼BMP9的基因的表達(dá)方法，除了直接表達(dá)以外，還可以使用分泌生產(chǎn)或融 合蛋白表達(dá)等方法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出 版社（1989)]。
[0346] 作為BMP9的生產(chǎn)方法，有在宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的方法、分泌到宿主細(xì)胞外的方法或 者在宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)的方法，可以通過改變所使用的宿主細(xì)胞或所生產(chǎn)的BMP9的結(jié) 構(gòu)來選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?br> [0347] 在宿主細(xì)胞內(nèi)或宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)BMP9的情況下，通過使用鮑爾森等 人的方法[J. Biol. Chem.，264, 17619(1989)]、羅等人的方法[卩1'0(：.恥七1.八。&(1· Sci.，USA, 86, 8227 (1989) ;Genes Develop.，4, 1288 (1990)]、日本特開平 05-336963 號(hào)公 報(bào)或國際公開第94/23021號(hào)等中記載的方法，可以使BMP9主動(dòng)地分泌到宿主細(xì)胞外。
[0348] 另外，還可以利用使用二氫葉酸還原酶基因等的基因擴(kuò)增系統(tǒng)（日本特開平 2-227075號(hào)公報(bào)）來提高BMP9的生產(chǎn)量。所得到的BMP9例如可以如下進(jìn)行分離、純化。 在BMP9在細(xì)胞內(nèi)以溶解狀態(tài)進(jìn)行表達(dá)的情況下，在培養(yǎng)結(jié)束后通過離心分離來回收細(xì)胞， 懸浮于水性緩沖液中，然后，利用超聲波破碎機(jī)、法式壓濾壺、MANT0N-GULIN勻漿器或臥式 砂磨機(jī)等將細(xì)胞破碎，得到無細(xì)胞提取液。
[0349] 通過單獨(dú)使用或組合使用通常的蛋白質(zhì)的分離純化方法、即溶劑提取法、利用 硫酸銨等的鹽析法、脫鹽法、利用有機(jī)溶劑的沉淀法、使用二乙氨基乙基（DEAE)-瓊脂 糖、DIAION HPA-75(三菱化學(xué)公司制造）等樹脂的陰離子交換層析法、使用S-S印harose FF(法瑪西亞公司制造）等樹脂的陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖和苯基瓊脂糖等樹 脂的疏水層析法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、聚焦層析法或者等電點(diǎn)電泳等電 泳法等方法，可以從對(duì)上述無細(xì)胞提取液進(jìn)行離心分離而得到的上清中得到純化制備品。
[0350] 在BMP9在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體而進(jìn)行表達(dá)的情況下，與上述同樣地將細(xì)胞回收后 進(jìn)行破碎，并進(jìn)行離心分離，由此，以沉淀級(jí)分的形式回收該BMP9的包涵體。利用蛋白變性 劑使回收的該BMP9的包涵體可溶化。通過對(duì)該可溶化液進(jìn)行稀釋或透析，使該BMP9恢復(fù) 至正常的空間結(jié)構(gòu)，然后，通過與上述同樣的分離純化方法，可以得到多肽的純化制備品。
[0351] 在BMP9或其糖基化物等衍生物被分泌到細(xì)胞外的情況下，可以在培養(yǎng)上清中回 收該BMP9或其糖基化物等衍生物。將該培養(yǎng)物與上述同樣地利用離心分離等方法進(jìn)行處 理，由此得到可溶性級(jí)分，通過使用與上述同樣的分離純化方法，可以從該可溶性級(jí)分中得 到純化制備品。
[0352] 另外，本發(fā)明中使用的BMP9也可以通過Fmoc法或tBoc法等化學(xué)合成法來制造。 另外，還可以利用 7卜'' A 7卜^ ^7夕公司、珀金埃爾默公司、法瑪西亞公司、7。口亍 4>亍夕7口夕4>7卜卟^>卜公司、〉>七七卟-?'方公司、八一七：7。子歹公司或島 津制作所等制造的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
[0353] (2)動(dòng)物的免疫與融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
[0354] 對(duì)3?20周齡的小鼠、大鼠或倉鼠等動(dòng)物進(jìn)行（1)中得到的抗原的免疫，收集該 動(dòng)物的脾臟、淋巴結(jié)、末梢血中的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。另外，在免疫原性低而無法在上述動(dòng)物中 觀察到充分的抗體效價(jià)的升高的情況下，也可以使用BMP9敲除小鼠作為被免疫動(dòng)物。
[0355] 免疫通過將抗原連同例如完全弗氏佐劑或者氫氧化鋁凝膠和百日咳菌疫苗等適 當(dāng)?shù)淖魟┮煌┯玫絼?dòng)物的皮下、靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)來進(jìn)行。在抗原為部分肽的情況下，與 BSA(牛血清白蛋白）或KLH(鑰孔Ali.血藍(lán)蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等載體蛋白 制成結(jié)合物，將其作為免疫原使用。
[0356] 關(guān)于抗原的施用，在第一次施用之后，每隔1?2周施用2?10次。每次施用后 第3?7天從眼底靜脈叢采血，利用酶免疫測(cè)定法[Antibodies-A Laboratory Manual,冷 泉港實(shí)驗(yàn)室（1988)]等測(cè)定其血清的抗體效價(jià)。將其血清對(duì)免疫所用的抗原顯示出充分的 抗體效價(jià)的動(dòng)物作為融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞的供給源。
[0357] 在抗原的末次施用后第3?7天，從免疫后的動(dòng)物中摘除脾臟等含有抗體產(chǎn)生細(xì) 胞的組織，收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞。在使用脾臟細(xì)胞的情況下，將脾臟細(xì)細(xì)切碎并攪散后，進(jìn)行 離心分離，進(jìn)而除去紅細(xì)胞，得到融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
[0358] (3)骨髓瘤細(xì)胞的制備
[0359] 作為骨髓瘤細(xì)胞，使用由小鼠得到的確立細(xì)胞系，可以使用例如：8-氮 雜鳥嘌呤抗性小鼠（Balb/C來源）骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, I(1978) ]>P3-NSl/lAg41(NS-I) [European J. Immunology, 6, 511 (1976) ]、SP2/0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)]、 P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology, 123, 1548 (1979)]或 P3-X63-Ag8(X63) [Nature, 256, 495 (1975)]等。
[0360] 將該骨髓瘤細(xì)胞在正常培養(yǎng)基[添加有谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素、FBS和 8-氮雜鳥嘌呤的RPMI1640培養(yǎng)基]中傳代，在細(xì)胞融合的3?4天之前傳代到正常培養(yǎng)基 中，以便在融合當(dāng)天確保2 X IO7個(gè)以上的細(xì)胞數(shù)。
[0361] (4)細(xì)胞融合與產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤的制備
[0362] 將（2)中得到的融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞和（3)中得到的骨髓瘤細(xì)胞用最低必需培養(yǎng) 基（MEM)或PBS (磷酸氫二鈉 I. 83g、磷酸二氫鉀0. 21g、氯化鈉7. 65g、蒸餾水1升、pH7. 2) 充分洗滌，以使細(xì)胞數(shù)達(dá)到融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞=5?10:1的方式進(jìn)行混 合，離心分離后，棄去上清。
[0363] 將沉淀的細(xì)胞群充分?jǐn)嚿⒑?，?7°C下邊攪拌邊加入聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、 MEM培養(yǎng)基和二甲亞砜的混合液。進(jìn)而，每隔1?2分鐘加入1?2mL的MEM培養(yǎng)基，重復(fù) 數(shù)次后，加入MEM培養(yǎng)基至總量達(dá)到50mL。離心分離后，除去上清。將沉淀的細(xì)胞群輕輕攪 散后，將融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞輕輕地懸浮于HAT培養(yǎng)基[添加有次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷和 氨基蝶呤的正常培養(yǎng)基]中。將該懸浮液在5% CO2的培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)7?14天。
[0364] 培養(yǎng)后，抽取一部分培養(yǎng)上清，通過后述的結(jié)合分析等雜交瘤的篩選方法篩選與 包含BMP9的抗原反應(yīng)且不與不含BMP9的抗原反應(yīng)的細(xì)胞群。然后，利用有限稀釋法重復(fù) 進(jìn)行兩次克隆[第一次使用HT培養(yǎng)基（從HAT培養(yǎng)基中除去氨基蝶呤的培養(yǎng)基），第二次 使用正常培養(yǎng)基]，篩選穩(wěn)定地觀察到強(qiáng)抗體效價(jià)的細(xì)胞作為產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。
[0365] (5)純化單克隆抗體的制備
[0366] 對(duì)姥鮫烷處理[腹腔內(nèi)施用0· 5mL的2, 6, 10, 14-四甲基十五碳烷（姥鮫烷）并 飼養(yǎng)2周]后的8?10周齡的小鼠或裸鼠腹腔內(nèi)注射⑷中得到的產(chǎn)生單克隆抗體的雜 交瘤。在10?21天雜交瘤產(chǎn)生癌性腹水。從該小鼠中收集腹水，離心分離除去固體成分 后，用40?50%的硫酸銨進(jìn)行鹽析，利用辛酸沉淀法、DEAE-瓊脂糖柱、蛋白A柱或凝膠過 濾柱進(jìn)行純化，收集IgG或IgM級(jí)分，得到純化單克隆抗體。
[0367] 另外，將（4)中得到的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤在添加有10% FBS的RPMI1640培 養(yǎng)基等中進(jìn)行培養(yǎng)，然后，通過離心分離除去上清，懸浮于雜交瘤-SFM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3? 7天。將得到的細(xì)胞懸浮液離心分離，由所得到的上清利用蛋白A柱或蛋白G柱進(jìn)行純化， 收集IgG級(jí)分，由此也可以得到純化單克隆抗體。另外，雜交瘤-SFM培養(yǎng)基中也可以添加 5% 夕' 4 3' GF21。
[0368] 抗體亞類的確定使用亞類分型試劑盒通過酶免疫測(cè)定法來進(jìn)行。蛋白量的定量通 過勞里法或280nm下的吸光度來計(jì)算。
[0369] (6)單克隆抗體的篩選
[0370] 單克隆抗體的篩選通過以下所示的利用酶免疫測(cè)定法的結(jié)合分析、以及利用 Biacore的動(dòng)力學(xué)分析來進(jìn)行。
[0371] (6_a)結(jié)合分析
[0372] 作為抗原，使用將（1)中得到的包含編碼BMP9的cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌、 酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞等中而得到的基因?qū)爰?xì)胞、重組蛋白或者由人組織得到的純 化多肽或部分肽等。在抗原為部分肽的情況下，可以與BSA或KLH等載體蛋白制成結(jié)合物 并使用該結(jié)合物。
[0373] 將抗原分注到96孔板等板中使其固相化，然后，分注血清、雜交瘤的培養(yǎng)上清或 純化單克隆抗體等受試物質(zhì)作為第一抗體，使其發(fā)生反應(yīng)。用PBS或PBS-吐溫等充分洗滌 后，分注由生物素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或放射線化合物等標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體作為第二 抗體，使其發(fā)生反應(yīng)。用PBS-吐溫充分洗滌后，進(jìn)行與第二抗體的標(biāo)記物質(zhì)對(duì)應(yīng)的反應(yīng)，篩 選出對(duì)免疫原發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體。
[0374] 另外，本發(fā)明的單克隆抗體可以通過在上述結(jié)合分析體系中添加受試抗體并使其 發(fā)生反應(yīng)來獲得。即，通過篩選出在加入受試抗體后單克隆抗體的結(jié)合受到抑制的抗體，能 夠獲得與獲得的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性地與BMP9的氨基酸序列或其空間結(jié)構(gòu)結(jié)合的單克隆抗 體。
[0375] 此外，同與本發(fā)明的單克隆抗體所識(shí)別的表位相同的表位結(jié)合的抗體可以通過鑒 定利用上述結(jié)合分析體系獲得的抗體的表位并制作所鑒定的表位的部分合成肽或模擬表 位的空間結(jié)構(gòu)的合成肽等并用其進(jìn)行免疫來獲得。
[0376] (6_b)利用Biacore的動(dòng)力學(xué)分析
[0377] 使用Biacore T100,測(cè)定抗原與受試物之間的結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，利用設(shè)備附帶的分 析軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析。利用胺偶聯(lián)法將抗小鼠IgG抗體固定到傳感芯片CM5上，然后， 使雜交瘤培養(yǎng)上清或純化單克隆抗體等受試物質(zhì)流過而使其以適當(dāng)量進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而，使 濃度已知的多種濃度的抗原流過，測(cè)定結(jié)合、解離。
[0378] 使用設(shè)備附帶的軟件，利用1:1結(jié)合模型對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，得到 各種參數(shù)?；蛘?，利用例如胺偶聯(lián)法將人BMP9固定到傳感芯片上，然后，使?jié)舛纫阎亩喾N 濃度的純化單克隆抗體流過，測(cè)定結(jié)合、解離。使用設(shè)備附帶的軟件，利用二價(jià)結(jié)合模型對(duì) 所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，得到各種參數(shù)。
[0379] 2.基因重組抗體的制作
[0380] 作為基因重組抗體的制作例，以下示出人嵌合抗體和人CDR移植抗體的制作方 法。
[0381] (1)基因重組抗體表達(dá)用載體的構(gòu)建
[0382] 基因重組抗體表達(dá)用載體是整合有編碼人抗體的CH和CL的DNA的動(dòng)物細(xì)胞用表 達(dá)載體，可以通過將編碼人抗體的CH和CL的DNA分別克隆到動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體中來構(gòu) 建。
[0383] 人抗體的恒定區(qū)（以下記作C區(qū)）可以使用任意的人抗體的CH和CL。例如，使用 人抗體的Y 1亞類的CH和K類的CL等。作為編碼人抗體的CH和CL的DNA，使用cDNA， 也可以使用包由外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成的染色體DNA。
[0384] 作為動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體，只要是能夠整合并表達(dá)編碼人抗體的C區(qū)的基因的 載體則均可以使用。可以列舉例如 ：pAGE107[Cytotechnol.，3，133(1990)]、pAGE103[J. Biochem. , 101, 1307(1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223(1984)], pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981) ]、pSGlbd2-4 [Cytotechnol.，4, 173 (1990)]或 pSElUKlSedl-3 [Cytote chnol.，13, 79(1993)]等。
[0385] 作為動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，使用SV40的早期啟動(dòng)子 [J. Biochem.，101，1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的 LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun.，149,960(1987)]或免疫球蛋白H鏈的啟動(dòng)子[Cell, 41，479(1985)]和增強(qiáng)子 [Cell, 33, 717(1983)]等。
[0386] 從基因重組抗體表達(dá)載體的構(gòu)建的容易度、向動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入的容易度、抗體H 鏈與L鏈在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量的平衡均衡等觀點(diǎn)出發(fā)，作為基因重組抗體表達(dá)用載體， 使用抗體H鏈和L鏈存在于同一載體上的類型（串聯(lián)型）的基因重組抗體表達(dá)用載體 [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]，但也可以使用抗體H鏈和L鏈存在于不同載體上的 類型。作為串聯(lián)型基因重組抗體表達(dá)用載體，使用PKANTEX93(國際公開第97/10354號(hào)公 報(bào)）、pEE18[Hybridoma, 17, 559(1998)]等。
[0387] (2)編碼來源于人以外的動(dòng)物的抗體的V區(qū)的cDNA的獲得和氨基酸序列的分析
[0388] 編碼非人抗體的VH和VL的cDNA的獲得和氨基酸序列的分析可以如下進(jìn)行。
[0389] 從產(chǎn)生非人抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取mRNA，并合成cDNA。將合成的cDNA克隆到 噬菌體或質(zhì)粒等載體中，制作cDNA文庫。
[0390] 使用編碼小鼠抗體的C區(qū)部分或V區(qū)部分的DNA作為探針，從上述文庫中分別分 離出具有編碼VH或VL的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒。分別確定重組噬菌體或重組質(zhì) 粒上的作為目標(biāo)的小鼠抗體的VH或VL的全長堿基序列，由堿基序列分別推定VH或VL的 全長氨基酸序列。
[0391] 作為用于制作產(chǎn)生非人抗體的雜交瘤細(xì)胞的人以外的動(dòng)物，使用小鼠、大鼠、倉鼠 或兔等，但只要能夠制作雜交瘤細(xì)胞，則可以使用任意動(dòng)物。
[0392] 由雜交瘤細(xì)胞制備總RNA時(shí)，使用異硫氰酸胍三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol·，154, 3 (1987)]、或者RNA easy試劑盒（凱杰公司制造）等試劑盒等。
[0393] 由總RNA制備mRNA時(shí)，使用固定有寡聚（dT)的纖維素柱法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（1989)]、或者 01ig〇-dT30〈Super>mRNA 純化試劑盒（寶生物公司制造）等試劑盒等。另外，也可以使用Fast Track mRNA分離試 劑盒（英杰公司制造）或QuickPrep mRNA純化試劑盒（法瑪西亞公司制造）等試劑盒從 雜交瘤細(xì)胞中制備mRNA。
[0394] 在合成cDNA和制作cDNA文庫時(shí)，使用公知的方法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（1989) ;Current Protocols in Molecular Biology,附錄1，約翰威立父子出版公司（1987-1997)]、或者用于cDNA合成和 質(zhì)?？寺〉腟uperscript質(zhì)粒系統(tǒng)（英杰公司制造）或ZAP-cDNA合成試劑盒（7卜7夕 ^公司制造）等試劑盒等。
[0395] 制作cDNA文庫時(shí)，作為用于整合以由雜交瘤細(xì)胞提取出的mRNA為模板 而合成的cDNA的載體，只要是能夠整合該cDNA的載體則均可以使用。例如，使 用 ZAP ExPress[Strategies，5, 58(1992)]、pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17,9494(1989)]、λΖΑΡΙΙ( 7 卜 7 夕 y'->公司制造 ）、λ gtlO、Xgtl I [DNA Cloning: A Practical Approach (DNA 克隆實(shí)用方法），1,49 (1985)]、Lambda BlueMicK 夕 口一々公司制造 ）、λΕχ Cell、pT7T3-18U(法瑪西亞公司制造）、？。02[皿01.0611· Biol.，3, 280 (1983)]或 pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)]等。
[0396] 作為用于導(dǎo)入由噬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫的大腸桿菌，只 要是能夠?qū)?、表達(dá)和保持該cDNA文庫的大腸桿菌則均可以使用。例如，使用 XL-IBlue MRF[Strategies，5, 81 (1992)]、C600[Genetics，39, 440(1954)]、Y1088、 Y1090[Science，222, 778 (1983)]、匪522[J. Mol. Biol.，166, I (1983)]、K802[J. Mol. Biol.，16, 118(1966)]或 JM105 [Gene, 38, 275(1985)]等。
[0397] 從cDNA文庫中篩選編碼非人抗體的VH或VL的cDNA克隆時(shí)，使用利用同位素或熒 光標(biāo)記的探針的菌落雜交法或噬菌斑雜交法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（1989)]等。
[0398] 另外，也可以通過如下方法制備編碼VH或VL的cDNA :制備引物，以由mRNA合成的 cDNA或cDNA文庫為模板來進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)法[以下記作PCR法；Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（1989) ;Current Protocolsin Molecular Biology,附錄1，約翰威立父子出版公司（1987-1997)]。
[0399] 將篩選出的cDNA用適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅惹懈詈?，克隆到pBluescript SK(_) ( 7 卜7夕-7'->公司制造）等質(zhì)粒中，利用通常使用的堿基序列分析方法等確定該cDNA 的堿基序列。作為堿基序列分析方法，例如，在進(jìn)行雙脫氧法[Proc. Nat I. Acad. Sc i. USA，74,5463(1977)]等反應(yīng)后，使用ABI PRISM3700(PE生物系統(tǒng)公司制造）或A.L.F.DNA 測(cè)序儀（法瑪西亞公司制造）等堿基序列自動(dòng)分析裝置等。
[0400] 由確定的堿基序列分別推定VH和VL的全長氨基酸序列，并與已知的抗體的VH和 VL的全長氨基酸序列[A. L. F. DNA，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部（1991)]進(jìn)行比較，由此，分別確 認(rèn)所獲得的cDNA是否編碼包含分泌信號(hào)序列的抗體的VH和VL的完整氨基酸序列。
[0401] 關(guān)于包含分泌信號(hào)序列的抗體的VH和VL的完整氨基酸序列，通過與已知的抗體 的VH和VL的全長氨基酸序列[A.L.F.DNA，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部（1991)]進(jìn)行比較，能 夠推定分泌信號(hào)序列的長度和N末端氨基酸序列，進(jìn)而能夠獲知它們所屬的亞類。另外， 關(guān)于VH和VL的各⑶R的氨基酸序列，也可以通過與已知的抗體的VH和VL的氨基酸序列 [A.L.F.DNA，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部（1991)]進(jìn)行比較來找出。
[0402] 另夕卜，使用所得到的VH和VL的完整氨基酸序列，對(duì)例如SWISS-PROT或 PIR-Protein等任意的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST法[J. Mol. Biol.，215, 403 (1990)]等同源性檢索， 能夠確認(rèn)VH和VL的完整氨基酸序列是否是新的氨基酸序列。
[0403] (3)人嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
[0404] 將分別編碼非人抗體的VH或VL的cDNA分別克隆到（1)中得到的基因重組抗體表 達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，由此，能夠構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體。
[0405] 為了將編碼非人抗體的VH或VL的cDNA的3'末端側(cè)與人抗體的CH或CL的5' 末端側(cè)連接，制作以如下方式設(shè)計(jì)的VH和VL的cDNA :連接部分的堿基序列編碼適當(dāng)?shù)陌?基酸，并且成為適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別序列。
[0406] 將所制作的VH和VL的cDNA分別克隆到（1)中得到的人CDR移植抗體表達(dá)用載 體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，以使它們以適當(dāng)?shù)男问竭M(jìn)行表達(dá)，從而構(gòu)建人 嵌合抗體表達(dá)載體。
[0407] 另外，也可以使用在兩端具有適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R(shí)別序列的合成DNA，通過PCR法 對(duì)編碼非人抗體VH或VL的cDNA分別進(jìn)行擴(kuò)增，并將它們克隆到（1)中得到的基因重組抗 體表達(dá)用載體中。
[0408] (4)編碼人⑶R移植抗體的V區(qū)的cDNA的構(gòu)建
[0409] 編碼人⑶R移植抗體的VH或VL的cDNA可以如下構(gòu)建。
[0410] 分別選擇用于移植非人抗體的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗體的VH或VL 的FR的氨基酸序列。作為所選擇的FR的氨基酸序列，只要是人抗體來源的氨基酸序列則 均可以使用。
[0411] 例如，使用蛋白數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank)等數(shù)據(jù)庫中登記的人抗體的FR的氨 基酸序列或人抗體的FR的各亞群的共有氨基酸序列[A. L. F. DNA，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部 (1991)]等。為了抑制抗體的結(jié)合活性的降低，選擇與原抗體的VH或VL的FR的氨基酸序 列具有盡量高的同源性（至少60%以上）的FR的氨基酸序列。
[0412] 接著，向所選擇的人抗體的VH或VL的FR的氨基酸序列中分別移植原抗體的CDR 的氨基酸序列，從而分別設(shè)計(jì)出人CDR移植抗體的VH或VL的氨基酸序列。在考慮抗體基 因的堿基序列中出現(xiàn)的密碼子的使用頻率[A. L.F.DNA，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部（1991)]的 基礎(chǔ)上，將所設(shè)計(jì)的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成DNA序列，從而分別設(shè)計(jì)出編碼人CDR移植抗體的VH 或VL的氨基酸序列的DNA序列。
[0413] 基于所設(shè)計(jì)的DNA序列，合成多條包含約100個(gè)堿基的長度的合成DNA，使用這些 合成DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。這種情況下，從PCR反應(yīng)中的反應(yīng)效率和能夠合成的DNA的長度 考慮，優(yōu)選對(duì)于H鏈、L鏈均設(shè)計(jì)6條合成DNA。
[0414] 另外，通過在位于兩端的合成DNA的5'末端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R(shí)別序列，可 以容易地將編碼人CDR移植抗體的VH或VL的cDNA克隆到（1)中得到的人CDR移植抗體 表達(dá)用載體中。
[0415] 或者，可以通過使用基于所設(shè)計(jì)的DNA序列合成為1條DNA的各H鏈、L鏈全長合 成DNA來實(shí)施。
[0416] PCR反應(yīng)后，將擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆到pBluescript SK(_) ( 7卜7夕公司制 造）等質(zhì)粒中，通過與（2)中記載的方法同樣的方法來確定堿基序列，從而獲得具有編碼期 望的人CDR移植抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的質(zhì)粒。
[0417] (5)人⑶R移植抗體的V區(qū)的氨基酸序列的修飾
[0418] 僅將非人抗體的VH和VL的⑶R移植到人抗體的VH和VL的FR中時(shí)，人⑶R移植 抗體的抗原結(jié)合活性與原來的非人抗體相比降低[BI0/TECHN0L0GY，9, 266 (1991)]。
[0419] 在人CDR移植抗體中，鑒定出人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接與抗原 的結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基、與CDR的氨基酸殘基相互作用的氨基酸殘基以及維持抗體的空 間結(jié)構(gòu)并間接與抗原的結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基，將這些氨基酸殘基取代為原來的非人抗體 的氨基酸殘基，由此能夠使降低的抗原結(jié)合活性升高。
[0420] 為了鑒定與抗原結(jié)合活性相關(guān)的FR的氨基酸殘基，可以通過使用X射線晶體分析 [J. Mol. Biol.，112, 535 (1977)]或計(jì)算機(jī)模擬分析[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)] 等來進(jìn)行抗體的空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和分析。另外，通過針對(duì)各個(gè)抗體制作多種修飾體并反復(fù) 研究它們與抗原結(jié)合活性的相關(guān)性來進(jìn)行各種嘗試，能夠獲得具有所需要的抗原結(jié)合活性 的修飾人CDR移植抗體。
[0421] 人抗體的VH和VL的FR的氨基酸殘基可以通過使用修飾用合成DNA進(jìn)行（4)中 記載的PCR反應(yīng)來進(jìn)行修飾。對(duì)于PCR反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過（2)中記載的方法來確定 堿基序列，從而確認(rèn)已實(shí)施了目標(biāo)修飾。
[0422] (6)人⑶R移植抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
[0423] 將所構(gòu)建的編碼基因重組抗體的VH或VL的cDNA分別克隆到（1)中得到的基因 重組抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，從而可以構(gòu)建人CDR移植 抗體表達(dá)載體。
[0424] 例如，通過向（4)和（5)中得到的構(gòu)建人⑶R移植抗體的VH或VL時(shí)使用的合成 DNA中、位于兩端的合成DNA的5'末端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R(shí)別序列，將所構(gòu)建的VH或 VL的cDNA分別克隆到（1)中得到的人CDR移植抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL 的各基因的上游，以使它們以適當(dāng)?shù)男问竭M(jìn)行表達(dá)。
[0425] (7)基因重組抗體的瞬時(shí)表達(dá)
[0426] 使用（3)和（6)中得到的基因重組抗體表達(dá)載體或者對(duì)上述載體進(jìn)行修飾后的表 達(dá)載體來進(jìn)行基因重組抗體的瞬時(shí)表達(dá)，從而能夠有效地評(píng)價(jià)所制作的多種人CDR移植抗 體的抗原結(jié)合活性。
[0427] 作為用于導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，只要是能夠表達(dá)基因重組抗體的宿主細(xì)胞 則可以使用任何細(xì)胞，例如，使用C0S-7細(xì)胞（ATCC編號(hào)：CRL1651) [Methods in Nucleic Acids Res.，CRC出版社，283(1991)]。向C0S-7細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)載體時(shí)，使用DEAE-右旋 糖酐法[Methods in Nucleic Acids Res. ,CRC 出版社，（1991)]或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等。
[0428] 導(dǎo)入表達(dá)載體后，培養(yǎng)上清中的基因重組抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性使用酶免 疫分析法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美國學(xué)術(shù)出版社 (1996) ;Antibodies_A Laboratory Manual，冷泉港實(shí)驗(yàn)室（1988);単々 口 一 ^抗體実験7 二Λ 7 >，講談社寸4工V^ 7 ^ V夕（1987)]等進(jìn)行測(cè)定。
[0429] (8)穩(wěn)定表達(dá)基因重組抗體的轉(zhuǎn)化株的獲得和基因重組抗體的制備
[0430] 通過將（3)和（6)中得到的基因重組抗體表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，能夠 得到穩(wěn)定表達(dá)基因重組抗體的轉(zhuǎn)化株。
[0431] 向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)載體時(shí)，使用電穿孔法[日本特開平2-257891號(hào)公報(bào)； Cytotechnology, 3, 133(1990)]等。作為用于導(dǎo)入基因重組抗體表達(dá)載體的宿主細(xì)胞,只要 是能夠表達(dá)基因重組抗體的宿主細(xì)胞則可以使用任何細(xì)胞。
[0432] 例如，使用：CH0-K1 (ATCC 編號(hào)：CCL-61)、DUkXBlUATCC 編號(hào)：CCL-9096)、 Pro-5 (ATCC 編號(hào)：CCL-1781)、CHO-S (Life Technologies, Cat#11619)、大鼠骨髓瘤細(xì)胞 YB2/3HL. P2. Gl I. 16Ag. 20 (或者也稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0、小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0-Agl4(ATCC編號(hào)：CRL1581)、小鼠 P3-X63-Ag8653 細(xì)胞（ATCC編號(hào)：CRL1580)、二氫葉 酸還原酶基因缺陷的CHO細(xì)胞[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 4216 (1980)]、獲得了凝集素 抗性的 Lecl3[Somatic cell and Molecular Genetics, 12, 55(1986)]、α 1，6_ 巖藻糖轉(zhuǎn) 移酶基因缺陷的CHO細(xì)胞（國際公開第2005/035586號(hào)、國際公開第02/31140號(hào)）、大鼠 YB2/3HL. Ρ2. GlL 16Ag. 20 細(xì)胞（ATCC 編號(hào)：CRL1662)等。
[0433] 導(dǎo)入表達(dá)載體后，通過在含有G418硫酸鹽等藥劑的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中進(jìn) 行培養(yǎng)來篩選穩(wěn)定表達(dá)基因重組抗體的轉(zhuǎn)化株（日本特開平2-257891號(hào)公報(bào)）。
[0434] 作為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，使用：RPMI 1640培養(yǎng)基（英杰公司制造）、GIT培養(yǎng) 基（日本制藥公司制造）、EX-CELL301培養(yǎng)基（JRH公司制造）、MDM培養(yǎng)基（英杰公司制 造）、雜交瘤-SFM培養(yǎng)基（英杰公司制造）或者在這些培養(yǎng)基中添加有FBS等各種添加物 的培養(yǎng)基等。
[0435] 通過將所得到的轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)上清中表達(dá)并蓄積基因重組 抗體。培養(yǎng)上清中的基因重組抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性可以通過ELISA法等來測(cè)定。 另外，可以利用DHFR擴(kuò)增系統(tǒng)（日本特開平2-257891號(hào)公報(bào)）等使轉(zhuǎn)化株的基因重組抗 體的表達(dá)量升高。
[0436] 基因重組抗體使用蛋白A柱從轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)上清中進(jìn)行純化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美國學(xué)術(shù)出版社（1996) ;Antibodies_A Laboratory Manual,冷泉港實(shí)驗(yàn)室（1988)]。另外，也可以將凝膠過濾、離子交換層析和超 濾等蛋白質(zhì)純化中使用的方法進(jìn)行組合。
[0437] 純化后的基因重組抗體的H鏈、L鏈或整個(gè)抗體分子的分子量可以使用 聚丙烯酰胺凝膠電泳法[Nature, 227, 680 (1970)]或蛋白免疫印跡法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美國學(xué)術(shù)出版社（1996) ;Antibodies_A Laboratory Manual,冷泉港實(shí)驗(yàn)室（1988)]等來測(cè)定。
[0438] 3.純化單克隆抗體或其抗體片段的活性評(píng)價(jià)
[0439] 純化后的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段的活性評(píng)價(jià)可以如下進(jìn)行。
[0440] 與BMP9和BMP9表達(dá)組織的結(jié)合活性使用上述I - (6-a)中記載的結(jié)合分析和 (6-b)中記載的利用Biacore系統(tǒng)等的表面等離子體共振法來測(cè)定。另外，可以使用熒光抗 體法[Cancer Immunol. Immunother.，36, 373 (1993)]來測(cè)定。
[0441] 4.使用本發(fā)明的抗BMP9單克隆抗體或其抗體片段的疾病的治療方法
[0442] 本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段可以用于治療伴有BMP9相關(guān)的貧血的疾病。
[0443] 含有本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段或者它們的衍生物的治療劑可以僅含有 作為有效成分的該抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，但通常優(yōu)選以與藥理學(xué)上容許的 一種以上的載體一同混合并通過制劑學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】中公知的方法制造而成的醫(yī)藥制劑的形 式來提供。
[0444] 作為施用途徑，可以列舉：經(jīng)口施用、或者口腔內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或 靜脈內(nèi)等非經(jīng)口施用。作為施用形式，可以列舉例如：噴霧劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、 糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或膠帶劑等。
[0445] 作為適于經(jīng)口施用的制劑，可以列舉例如：乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑或顆 粒劑等。
[0446] 乳劑或糖漿劑這樣的液體制備物使用如下成分作為添加劑來制造：水、蔗糖、山梨 糖醇或果糖等糖類、聚乙二醇或聚丙二醇等二醇類、芝麻油、橄欖油或大豆油等油類、對(duì)羥 基苯甲酸酯等防腐劑或者草莓香料或薄荷等香料類等。
[0447] 膠囊劑、片劑、散劑或顆粒劑等使用如下成分作為添加劑來制造：乳糖、葡萄糖、蔗 糖或甘露醇等賦形劑、淀粉或海藻酸鈉等崩解劑、硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑、聚乙烯醇、羥 丙基纖維素或明膠等粘結(jié)劑、脂肪酸酯等表面活性劑或者甘油等增塑劑等。
[0448] 作為適于非經(jīng)口施用的制劑，可以列舉例如：注射劑、栓劑或噴霧劑等。
[0449] 注射劑使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液或者這兩者的混合物的載體等來制造。
[0450] 栓劑使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體來制造。
[0451] 噴霧劑使用不刺激接受者的口腔和氣管粘膜、并且使本發(fā)明的單克隆抗體或其抗 體片段以微細(xì)粒子的形式分散從而易于吸收的載體等來制造。作為載體，例如使用乳糖或 甘油等。另外，也可以制成氣溶膠或干粉。
[0452] 此外，上述非經(jīng)口劑中，也可以添加在適于經(jīng)口施用的制劑中作為添加劑所例示 的成分。
[0453] 以下，通過實(shí)施例更具體地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不限定于下述實(shí)施例。只 要沒有特別說明，則所使用的試劑類按照附帶的使用說明書來使用。
[0454] 實(shí)施例
[0455] [實(shí)施例1]
[0456] 小鼠BMP9基因敲除用靶向載體的構(gòu)建
[0457] 1-1)表達(dá)盒載體 pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A 的構(gòu)建
[0458] 作為用于制作敲除（KO)用靶向載體的基本載體的表達(dá)盒載體 pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A是在pBluescript中添加限制性酶切位點(diǎn)后、插入在新霉素抗性 標(biāo)記基因表達(dá)單元的兩端具有LoxP序列的LoxP-Neo和白喉毒素 A鏈基因（DT-A)而得到 的載體，與國際公開第2006/078072號(hào)公報(bào)的實(shí)施例7中記載的載體相同。以下記載該載 體制作的概略。
[0459] 為了在pBluescript II SK(_)(東洋紡公司制造）載體中添加新的限制性酶切位 點(diǎn)，合成了下述寡聚DNA(LinkAl :序列號(hào)l、LinkA2 :序列號(hào)2、LinkBl :序列號(hào)3和LinkB2 : 序列號(hào)4)。
[0460] 將pBluescript II SK(_)用限制性酶Sail和XhoI進(jìn)行處理，用苯酚/氯仿從反 應(yīng)液中提取質(zhì)粒片段，用乙醇沉淀。為了在該質(zhì)粒片段中添加新的限制性酶切位點(diǎn)Nrul、 SgrAI和AscI，插入由LinkAl和LinkA2構(gòu)成的接頭，并導(dǎo)入到大腸桿菌DH5a中。從所得 到的轉(zhuǎn)化體中獲得質(zhì)粒pBlueLA。
[0461] 將pBlueLA用限制性酶NotI和EcoRI進(jìn)行處理，用苯酚/氯仿從反應(yīng)液中提取質(zhì) 粒片段，用乙醇沉淀。為了在該質(zhì)粒片段中添加新的限制性酶切位點(diǎn)PacI、FseI和Sail， 插入由LinkBl和LinkB2構(gòu)成的接頭，并導(dǎo)入到大腸桿菌DH5 α中。從所得到的轉(zhuǎn)化體中 獲得質(zhì)粒pBlueLAB。
[0462] 將國際公開第00/10383號(hào)中記載的質(zhì)粒pLoxP-STneo用XhoI進(jìn)行酶消化，獲得 兩端具有LoxP序列的Neo抗性基因（LoxP-Neo)。使用T4DNA聚合酶使LoxP-Neo的兩末端 成為鈍端，獲得LoxP-Neo-B。
[0463] 將pBlueLAB用EcoRV進(jìn)行酶消化，用苯酚/氯仿從反應(yīng)液中提取質(zhì)粒片段，用乙 醇沉淀。在所得到的質(zhì)粒片段中插入LoxP-Neo-B，并導(dǎo)入到大腸桿菌DH5ci中。從所得到 的轉(zhuǎn)化體中獲得質(zhì)粒pBlueLAB-LoxP-Neo。
[0464] 將pMClDT-A(74フテック才リ工シ夕；レ公司制造）用XhoI和SalI進(jìn)行酶消化 后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒（凱杰公司制造）回收含有DT-A基因的片段。
[0465] 將pBlueLAB-LoxP-Neo用XhoI進(jìn)行酶消化，用苯酚/氯仿從反應(yīng)液中提取質(zhì)粒 片段，用乙醇沉淀。在所得到的質(zhì)粒片段中插入含有DT-A基因的片段，并導(dǎo)入到大腸桿菌 DH5a中。從所得到的轉(zhuǎn)化體中獲得表達(dá)盒載體pBlueLAB-LoxP-Ne〇-DT-A。
[0466] 1-2)小鼠 BMP9基因3'側(cè)基因組區(qū)域片段的獲得
[0467] 根據(jù)從Ensemble基因組瀏覽器（Ensemble Genome Browser)獲得的包含小鼠 BMP9(⑶F2)基因的基因組DNA序列（登記號(hào)：ENSMUSG00000072625)來設(shè)計(jì)引物（序列號(hào) 5,6) 〇
[0468] 以來源于在大腸桿菌人工染色體[Bacterial Artificial Chromosome (BAC)]中包 含C57BL/6J小鼠 BMP9基因的克隆RP23-181N8的DNA作為模板，制備含有各IOpmol的序 列號(hào)5和6的引物以及KOD-plus-(東洋紡公司制造）的反應(yīng)液50 μ L，在94°C下保溫3分 鐘后，以98°C下10秒鐘和68°C下5分鐘作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR。
[0469] 將所得到的PCR擴(kuò)增片段供于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒 (凱杰公司制造）回收2. Ikbp的片段。將回收的PCR擴(kuò)增片段用ClaI和AscI進(jìn)行酶消 化，供于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒來回收酶處理片段（ClaI-AscI 片段）。
[0470] 將pBlueLAB用ClaI和AscI進(jìn)行酶消化，用蝦堿性磷酸酶（SAP)處理后，用苯酚 /氯仿提取該ClaI-AscI片段，用乙醇沉淀。插入上述中回收的ClaI-AscI片段，并導(dǎo)入到 大腸桿菌DH5 α中。
[0471] 從所得到的轉(zhuǎn)化體中篩選出含有未發(fā)生由PCR引起的突變的插入基因的克隆。將 該質(zhì)粒DNA用ClaI和AscI進(jìn)行酶消化，供于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取 試劑盒回收2. Ikbp的含有小鼠 ΒΜΡ9基因的3'側(cè)基因組序列的酶處理片段。
[0472] 1-3)小鼠 ΒΜΡ9基因5'側(cè)基因組區(qū)域片段的獲得
[0473] 根據(jù)從Ensemble基因組瀏覽器獲得的包含小鼠 ΒΜΡ9基因的基因組DNA序列（登 記號(hào)：ENSMUSG00000072625)來設(shè)計(jì)引物（序列號(hào)7、8)。
[0474] 以來源于BAC克隆RP23-181N8的DNA作為模板，制備含有各IOpmol的序列號(hào)7 和8的引物以及KOD-plus-(東洋紡公司制造）的反應(yīng)液50μ L，在94°C下保溫3分鐘后， 以98°C下10秒和68°C下5分鐘作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR。
[0475] 將所得到的PCR擴(kuò)增片段供于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒 (凱杰公司制造）回收5. Ikbp的片段。將回收的PCR擴(kuò)增片段用PacI和FseI進(jìn)行酶消 化，供于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒來回收酶處理片段（PacI-FseI 片段）。
[0476] 將pBlueLAB用PacI和FseI進(jìn)行酶消化，進(jìn)行SAP處理后，用苯酚/氯仿提取該 PacI-FseI片段，用乙醇沉淀。插入上述中回收的PacI-FseI片段，并導(dǎo)入到大腸桿菌DH5 α 中。
[0477] 從所得到的轉(zhuǎn)化體中篩選出含有未發(fā)生由PCR引起的突變的插入基因的克隆。將 該質(zhì)粒DNA用PacI和FseI進(jìn)行酶消化，供于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取 試劑盒回收5. Ikbp的含有小鼠 ΒΜΡ9基因的5'側(cè)基因組序列的酶處理片段。
[0478] 1-4)小鼠 ΒΜΡ9基因3'側(cè)基因組區(qū)域片段向表達(dá)盒載體中的插入
[0479] 將實(shí)施例1-1中得到的pBlueLAB-Lox-Neo-DT-A用ClaI和AscI進(jìn)行酶消化，供 于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒回收DNA片段。在回收的約7. 6kbp 的DNA片段中插入實(shí)施例1-2中得到的酶處理片段后，導(dǎo)入到大腸桿菌DH5ci中。從所得 到的轉(zhuǎn)化體中篩選出插入有DNA片段的克隆。確認(rèn)連接部分的堿基序列沒有問題。
[0480] 1-5)小鼠 BMP9基因5'側(cè)基因組區(qū)域片段向具有小鼠 BMP9基因3'側(cè)基因組區(qū)域 片段的表達(dá)盒載體中的插入
[0481] 將實(shí)施例1-4中得到的質(zhì)粒用PacI和FseI進(jìn)行酶消化，供于瓊脂糖凝膠電泳后， 使用QIAquick凝膠提取試劑盒回收DNA片段。在回收的9. 7kbp的DNA片段中插入實(shí)施例 1-3中制作的酶處理片段后，導(dǎo)入到大腸桿菌DH5ci中。
[0482] 從所得到的轉(zhuǎn)化體中篩選出插入有DNA片段的克隆。確認(rèn)連接部分的堿基序列沒 有問題，獲得了小鼠 BMP9基因敲除用靶向載體pBluemBmp9-Lox-Ne〇-DT-A-3' K0-5' KO(圖 1)。
[0483] [實(shí)施例2]
[0484] 小鼠 BMP9基因靶向載體的制備
[0485] 將 60 μ g 的實(shí)施例 1-5 中得到的 pBluemBmp9-Lox-Ne〇-DT-A-3' K0-5' KO 在以使 終濃度為lmmol/L的方式添加有亞精胺（西格瑪公司制造）并將pH調(diào)節(jié)為7. O的限制性 酶用H緩沖液（羅氏診斷公司制造）中用NotI進(jìn)行酶消化。
[0486] 從反應(yīng)液中用苯酚/氯仿提取載體片段，用乙醇沉淀。加入pH為7. 05的HBS溶 液[每 1 升中含有 HEPES 5g、NaCl 8g、KCl 0· 37g、Na2HP04 · 2H20 (λ 125g、右旋糖（D-葡萄 糖）Ig的溶液]，以使DNA濃度為0. 5 μ g/μ L，在室溫下保存1小時(shí)，由此，制備電穿孔用小 鼠 BMP9 基因靶向用載體 pBluemBmp9-Lox-Ne〇-DT-A-3' K0-5' K〇-Notl。
[0487] [實(shí)施例3]
[0488] 基因組DNA印跡分析用探針的制備
[0489] 3-1)用于確認(rèn)小鼠 BMP9基因的5'側(cè)基因組的探針的制作
[0490] 為了獲得含有小鼠 BMP9基因的5'側(cè)基因組區(qū)域約500bp的探針，基于BAC克隆 RP23-181N8的堿基序列信息，設(shè)計(jì)了引物（序列號(hào)9、10)。
[0491] 以來源于BAC克隆RP23-181N8的DNA為模板，制備含有各IOpmol的序列號(hào)9和 10的引物以及TaKaRa Z Taq(寶酒造公司制造）的反應(yīng)液50yL，在94°C下保溫2分鐘后， 以94°C下30秒鐘、60°C下20秒鐘和72°C下1分鐘作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR。 將所得到的PCR擴(kuò)增片段供于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒（凱杰公 司制造）回收約500bp的5'側(cè)基因組DNA印跡用探針（5' KO-探針）。
[0492] 3-2)用于確認(rèn)小鼠 BMP9基因的3'側(cè)基因組的探針的制作
[0493] 為了獲得含有小鼠 BMP9基因的3'側(cè)基因組區(qū)域約500bp的探針，基于BAC克隆 RP23-181N8的堿基序列信息，設(shè)計(jì)了引物（序列號(hào)11、12)。
[0494] 以來源于BAC克隆RP23-181N8的DNA為模板，制備含有各IOpmol的序列號(hào)11和 12的引物以及TaKaRa Z Taq(寶酒造公司制造）的反應(yīng)液50yL，在94°C下保溫2分鐘后， 以94°C下30秒鐘、60°C下20秒鐘和72°C下1分鐘作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR。 將所得到的PCR擴(kuò)增片段供于瓊脂糖凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒（凱杰公 司制造）回收約500bp的3'側(cè)基因組DNA印跡用探針（3' KO-探針）。
[0495] [實(shí)施例4]
[0496] 小鼠 BMP9K0 ES細(xì)胞株的獲得
[0497] 為了獲得利用同源重組得到的小鼠 BMP9基因 KO ES細(xì)胞，根據(jù)已建立的方法（相 澤慎一著，才二二7 A; U-文' 8 (生物手冊(cè)叢書8)，基因靶向，羊土社，1995)，將實(shí) 施例 2 中制備的 pBluemBmp9-Lox-Ne〇-DT-A-3' K0-5' KO-NotI 導(dǎo)入小鼠 ES 細(xì)胞 TT2(Yagi 等，Analytical Biochem. ,214:70,1993)中。以下記載詳細(xì)的方法。
[0498] 使用利用絲裂霉素 C(西格瑪公司制造）處理后的G418抗性原代培養(yǎng)細(xì)胞（英杰 公司制造）作為營養(yǎng)細(xì)胞，在37°C、5% CO2的條件下進(jìn)行TT2細(xì)胞的培養(yǎng)增殖。對(duì)TT2細(xì) 胞進(jìn)行胰蛋白酶處理，以使其達(dá)到3 X IO7個(gè)/mL的方式懸浮于實(shí)施例2記載的HBS溶液中。 將 0· 5mL 的細(xì)胞懸浮液與 10μ g 的 pBluemBmp9-Lox-Ne〇-DT-A-3' K0-5' KO-NotI 混合，力口 入到基因脈沖池（電極距離：0.4cm，伯樂公司制造）中，進(jìn)行電穿孔（容量：960 μ F，電壓： 240V，室溫）。
[0499] 將電穿孔后的細(xì)胞懸浮于ES培養(yǎng)基[每1升中含有胎牛血清（FBS) 180mL、D_葡萄 糖3. 5g、杜爾貝科改良的伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基粉末（英杰公司制造）10g、非必需氨基酸溶液（100 倍濃縮液；英杰公司制造）IOmU碳酸氫鈉 I. 9g的溶液]IOmL中，將其接種到一個(gè)預(yù)先接種 有上述營養(yǎng)細(xì)胞的IOOmm組織培養(yǎng)用塑料皿（7 7 3 ^公司制造）中。24小時(shí)后，將培 養(yǎng)基更換為含有200 μ g/mL的新霉素（西格瑪公司制造）的ES培養(yǎng)基。挑取7天后產(chǎn)生 的菌落，分別接種到24孔板中。
[0500] 在使其增殖至達(dá)到鋪滿狀態(tài)后，將三分之一的細(xì)胞接種到12孔明膠包被板中，培 養(yǎng)2天，由此，利用Puregene DNA分離試劑盒（Gentra System公司制造）由IO6?IO7個(gè) 細(xì)胞制備基因組DNA。將這些新霉素抗性TT2細(xì)胞基因組DNA用EcoRI進(jìn)行酶消化，并供于 瓊脂糖凝膠電泳。接著，使用實(shí)施例3-2中得到的3'KO-探針來進(jìn)行DNA印跡。在野生型 TT2細(xì)胞中，檢測(cè)到一個(gè)條帶（約15. 5kbp)，在同源重組體中，檢測(cè)到兩個(gè)條帶（約11. 5kbp 和約 15. 5kbp)。
[0501] 進(jìn)而，將確認(rèn)到同源重組的克隆的基因組DNA用NcoI進(jìn)行酶消化，并供于瓊脂糖 凝膠電泳。接著，使用實(shí)施例3-1中得到的5' KO-探針來進(jìn)行DNA印記。在野生型TT2細(xì) 胞中，檢測(cè)到一個(gè)條帶（約13. 4kbp)，在同源重組體中，檢測(cè)到兩個(gè)條帶（約8. 5kbp和約 13. 4kbp)。
[0502] 根據(jù)上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了 7株預(yù)測(cè)到敲除了小鼠 BMP9基因的同源重組體。接著，根 據(jù)已有的報(bào)道（相澤慎一著，八·^才^二Λ 7 i U -文' 8 (生物手冊(cè)叢書8)，基因靶向，羊 土社，1995)進(jìn)行了同源重組體的核型分析，結(jié)果確認(rèn)，所發(fā)現(xiàn)的7株中的5株為具有正常核 型的小鼠 BMP9基因 KO ES細(xì)胞。
[0503] [實(shí)施例5]
[0504] BMP9K0雜合子小鼠的制作
[0505] 實(shí)施例4中獲得的ES細(xì)胞是來源于毛色為深褐色的CBAXC57BL/6F1小鼠 （Yagi 等，Analytical Biochemistry, 214:70-76, 1993)的 TT2 細(xì)胞。因此，為了簡(jiǎn)便地區(qū)別具有 來源于ES細(xì)胞的基因的嵌合小鼠與不具有來源于ES細(xì)胞的基因的宿主小鼠，選擇毛色為 白色的ICR小鼠作為宿主小鼠。
[0506] 首先，將實(shí)施例4中能夠確認(rèn)到具有正常核型的小鼠BMP9基因KO ES細(xì)胞中的4 株分別以每個(gè)胚胎8?10個(gè)注射到通過ICR品系的雌雄小鼠的交配得到的8細(xì)胞期胚胎 中。然后，使用ES培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，由此使注射胚胎發(fā)育至囊胚，然后，將發(fā)育至囊胚的注 射胚胎移植到假孕處理后2. 5天的代孕ICR小鼠（日本7公司）的子宮中，每側(cè)的子 宮分別移植約10個(gè)。
[0507] 總計(jì)移植了 260個(gè)發(fā)育至囊胚的注射胚胎，結(jié)果出生了 102只后代嵌合小鼠。出 生的102只中，毛色包含深褐色的小鼠、即觀察到ES細(xì)胞的貢獻(xiàn)的嵌合小鼠為89只。上述 89只中，毛色全部為深褐色而不含白色部分的小鼠、即來源于ES細(xì)胞的嵌合率高的嵌合小 鼠為40只。
[0508] 接著，使這些嵌合率高的雄性嵌合小鼠與C57BL/6的雌性交配，結(jié)果，出生了毛色 為深褐色的后代小鼠，由此確認(rèn)ES細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)移到生殖細(xì)胞系中。
[0509] BMP9基因靶向的雜合子小鼠的篩選通過以來源于尾部活檢的DNA為模板的PCR分 析來進(jìn)行。為此，制作對(duì)實(shí)施例1中制作的小鼠 BMP9基因敲除用載體pBluemBmp9-L〇X-Ne o-DT-A-3 ' K0-5 ' KO內(nèi)的新霉素抗性基因區(qū)域具有特異性的引物mBMP9_FW5915 (序列號(hào)13) 和 mBMP9_RV17165 (序列號(hào) 14)。
[0510] 從出生后經(jīng)過3周以上的小鼠獲得尾巴（勝木元也著，発生工學(xué)実験7 = 7 7 > (發(fā)育工程實(shí)驗(yàn)指南），講談社寸4工V4 7 4 V夕，1987)，使用Puregene DNA分離試 劑盒提取基因組DNA。以該基因組DNA作為模板，制備含有各IOpmol的序列號(hào)13和14的 引物以及EX Taq(寶酒造公司制造）的反應(yīng)液50 μ L，以95°C下30秒鐘、60°C下1分鐘和 72°C下2分鐘作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR。
[0511] 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果是，存在多個(gè)檢測(cè)到約I. 3kbp的擴(kuò)增產(chǎn)物的個(gè)體。該 結(jié)果表明，得到了內(nèi)源性BMP9基因發(fā)生了同源重組且插入有新霉素抗性基因的多只雜合 子小鼠[BMP9K0 (+/-)]。
[0512] [實(shí)施例6]
[0513] BMP9K0純合子小鼠的制作
[0514] 使實(shí)施例5中制作的BMP9K0(+/_)的雌雄個(gè)體交配，得到后代小鼠。與實(shí)施例 5同樣，使用Puregene DNA分離試劑盒，從小鼠的尾巴提取基因組DNA。以該基因組DNA 作為模板，與實(shí)施例5同樣地進(jìn)行PCR。進(jìn)而，進(jìn)行瓊脂糖電泳，由此選出BMP9K0雜合子 [BMP9K0 (+/-)]和純合子[BMP9K0 (-/-)]。
[0515] 以選出的個(gè)體的基因組DNA作為模板，制備含有各IOpmol的序列號(hào)15和16的引 物以及EX Taq(寶酒造公司制造）的反應(yīng)液50 μ L，以95°C下30秒鐘、60°C下30秒鐘和 72°C下1分鐘作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明，存在 檢測(cè)到約200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的個(gè)體和未檢測(cè)到約200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的個(gè)體。
[0516] 在具有野生型等位基因的BMP9K0 (+/_)中檢測(cè)到約200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，但在 BMP9K0(-/_)中未檢測(cè)到約200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，該結(jié)果表明，得到了 BMP9K0(-/_)。為 了獲得抗BMP9單克隆抗體，使用所得到的雌雄純合子[BMP9K0(-/-)]中的10只雌性小鼠。
[0517] [實(shí)施例7]
[0518] 抗人BMP9單克隆抗體的制作
[0519] 7-1)免疫原的制備
[0520] 作為免疫原使用的人BMP9重組蛋白根據(jù)國際公開第2010/126169號(hào)的實(shí)施例12 記載的方法來制備。
[0521] 7-2)動(dòng)物的免疫和抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
[0522] 使用RIBI佐劑（Corixa公司制造）或Titer Max Gold(Titermax公司制造）作 為佐劑，對(duì)實(shí)施例6中得到的BMP9K0(-/_)小鼠進(jìn)行實(shí)施例7-1中制備的人BMP9重組蛋白 的免疫。具體而言，根據(jù)RIBI佐劑的附帶資料制備人BMP9重組蛋白的懸浮液，然后，以每 只施用25 μ g的人BMP9重組蛋白的方式將該懸浮液施用到KO小鼠的腹腔內(nèi)。
[0523] 在使用Titer Max Gold時(shí)，也同樣根據(jù)附帶的資料制備人BMP9重組蛋白的懸浮 液，然后，以每只施用25 μ g的人BMP9重組蛋白的方式將該懸浮液施用到KO小鼠的皮下。 包括最終加強(qiáng)在內(nèi)，免疫均共計(jì)進(jìn)行3次。在最終施用3天后摘除脾臟。
[0524] 將摘除的脾臟在PBS (phosphate-buffered saline,磷酸鹽緩沖液）中細(xì)細(xì)切碎 后，通過離心分離（1500rpm、3分鐘）回收脾細(xì)胞。所得到的脾細(xì)胞級(jí)分含有紅細(xì)胞，因此， 添加 RED血細(xì)胞裂解緩沖液（西格瑪公司制造），在冰上進(jìn)行處理，由此除去紅細(xì)胞。將所 得到的脾細(xì)胞用DMEM (杜爾貝科改良的伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基，英杰公司制造）培養(yǎng)基洗滌2次后， 供于細(xì)胞融合。
[0525] 7-3)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的制備
[0526] 將小鼠骨髓瘤細(xì)胞株（3?2/0,4了0：:0^1581)在添加有10%胎牛血清的01^]\1中 進(jìn)行培養(yǎng)，作為細(xì)胞融合的親本株使用。
[0527] 7-4)雜交瘤的制作
[0528] 將實(shí)施例7-2中得到的小鼠脾細(xì)胞與實(shí)施例7-3中得到的骨髓瘤細(xì)胞以達(dá)到5:1 的方式進(jìn)行混合，并離心分離（1500rpm、3分鐘）。對(duì)于所得到的沉淀級(jí)分（細(xì)胞群），在輕 輕搖動(dòng)的同時(shí)緩慢加入ImL聚乙二醇-1500(羅氏診斷公司制造）。接著，在輕輕搖動(dòng)的同 時(shí)，在該細(xì)胞液中加入5mL DMEM培養(yǎng)基，再添加 IOmL DMEM培養(yǎng)基。接著，將上述含有該細(xì) 胞液的試管在37°C下孵育5分鐘，并離心分離（1500rpm、3分鐘）。
[0529] 將所得到的沉淀級(jí)分（細(xì)胞群）使用完全培養(yǎng)基（含有FCS lOV/v%、β -巰基乙 醇50 μ mol/L、胰島素50 μ g/mL和IL-610ng/mL的DMEM培養(yǎng)基]進(jìn)行懸浮，使得脾細(xì)胞數(shù) 達(dá)到IX IO6個(gè)/mL，然后，在96孔板中接種各100 μ L。
[0530] 在1. 5小時(shí)后，將含有制造商推薦的終濃度的2倍的HAT培養(yǎng)基添加劑（西格瑪 公司制造，Catffl0262-10VL)的完全培養(yǎng)基以各100μ L加入到各孔中，在37°C、5% CO2的 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。使用含有制造商推薦的終濃度的HAT培養(yǎng)基添加劑的完全培養(yǎng)基以每周 3次的頻率進(jìn)行培養(yǎng)基更換，直至孔內(nèi)的細(xì)胞達(dá)到適于篩選的細(xì)胞數(shù)。
[0531] 7-5) ALK1/BMP9 夾心 ELISA 的構(gòu)建
[0532] 使用抗人BMP9小鼠單克隆抗體（安迪生物科技公司制造，克隆號(hào)360107,以下 記為R&D抗體）和作為人BMP9的I型受體已知的人ALKl胞外域人IgGlFc段融合蛋白質(zhì) (hsALKl-Fc)，以下述方式構(gòu)建ALK1/BMP9夾心ELISA。
[0533] 首先，在 96 孔的 ELISA 用板（F96MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE， Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以100 μ L/孔分注通過將根據(jù)國際公開第 2010/126169號(hào)的實(shí)施例1記載的方法制備的hsALKl-Fc用50mmol/L NaHCO3緩沖液（Wako 公司制造，Cat#191-01305)制備成0. 05yg/mL而得到的溶液，在4°C下靜置過夜而使其吸 附。
[0534] 除去固相化液后，以250 μ L/孔加入SuperBlock(Thermo SCIENTIFIC公司制造， Cat#37535)，在室溫下靜置1小時(shí)來進(jìn)行封閉，用含有0. 1 %的吐溫-20的PBS (PBS-T)洗滌 3次。
[0535] 接著，將人成熟二聚體BMP9重組蛋白（安迪生物科技公司制造，Cat#3209_BP)用 SuperBlock與PBS-T以1:9的比例混合而成的10% SuperBlock的PBS-T溶液制備成Ing/ mL的濃度，將所得物以100 μ L/孔進(jìn)行分注，在室溫下靜置1小時(shí)，用PBS-T洗滌4次。
[0536] 接著，將使用SureLINK顯色生物素標(biāo)記試劑盒（KPL公司制造）進(jìn)行了生物素 標(biāo)記的R&D抗體用10% SuperBlock的PBS-T溶液制備成30ng/mL，然后以100 μ L/孔進(jìn) 行分注，在室溫下靜置1小時(shí)。將該板用PBS-T洗滌4次后，以100 μ L/孔分注用10% SuperBlock 的 PBS-T 溶液稀釋 500 倍的鏈霉親和素-聚 HRP80 (Stereospecific Detection Technologies公司制造，Cat#SP80D50)，在室溫下靜置30分鐘?1小時(shí)。
[0537] 將該板用PBS-T洗滌4次，以100 μ L/孔添加 TMB顯色液（TMB+底物-色原體， Dako公司制造，Cat#S1599)，使其顯色，在得到適當(dāng)?shù)娘@色時(shí)，以100 μ L/孔添加 IN硫酸溶 液（Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用ARVO (珀金埃爾默公司制造）測(cè)定450nm的吸光 度。
[0538] 7-6)使用ALK1/BMP9夾心ELISA的抗人BMP9抗體產(chǎn)生雜交瘤的篩選
[0539] 實(shí)施例7-5中構(gòu)建的夾心ELISA中，在添加人成熟二聚體BMP9重組蛋白時(shí)，以 100 μ L/孔分注以含有濃度為Ing/mL的人成熟二聚體BMP9重組蛋白和濃度為50 %的實(shí)施 例7-4中制作的雜交瘤的培養(yǎng)上清的方式制備的10% SuperBlock的PBS-T溶液。
[0540] 作為陰性對(duì)照，使用雜交瘤用培養(yǎng)基。以添加有雜交瘤用培養(yǎng)基的孔作為基準(zhǔn)，將 顯色得到抑制的孔判斷為陽性，挑選出產(chǎn)生抑制hsALKl-Fc與人成熟二聚體BMP9重組蛋白 的相互作用或者抑制人成熟二聚體BMP9重組蛋白與R&D抗體的相互作用的抗體的雜交瘤 株。
[0541] 對(duì)于挑選出的雜交瘤，利用含有HT (西格瑪公司制造，Cat#H0137_10VL)的完全培 養(yǎng)基進(jìn)行有限稀釋，接種到96孔板中，進(jìn)行克隆化。對(duì)來源于在第1次被判斷為陽性的孔 的雜交瘤總計(jì)進(jìn)行3次克隆化。通過以上的操作，分離出產(chǎn)生6D10-1-1抗體、10D5-2-3抗 體和3B7-3-3抗體的雜交瘤株。
[0542] 7-7)雜交瘤在eRDF培養(yǎng)基中的馴化
[0543] 為了獲得大量抗體，將雜交瘤的培養(yǎng)基從完全培養(yǎng)基分階段地置換為eRDF培養(yǎng) 基[含有Ultra-Low IgG FBS(GIBC0公司制造）lv/v%、轉(zhuǎn)鐵蛋白5yg/mL、胰島素5yg/ mL、乙醇胺10 μ mol/L和亞硒酸鈉25nmol/L的e-RDF培養(yǎng)基（極東制藥制造）]，進(jìn)行雜交 瘤細(xì)胞在eRDF培養(yǎng)基中的馴化。
[0544] 7-8)由雜交瘤大量獲得抗體
[0545] 將實(shí)施例7-8中馴化后的雜交瘤以1?2X IO5個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度接種到100 個(gè)轉(zhuǎn)瓶（850cm2, BD寸^> 7公司制造）中。作為培養(yǎng)基，使用eRDF培養(yǎng)基。在利用轉(zhuǎn) 瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)使接種后的轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)的同時(shí)，在37°C下培養(yǎng)6?8天，然后，回收含有細(xì)胞的 培養(yǎng)基。對(duì)回收的培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，將所得到的培養(yǎng)上清用〇. 22 μ m的過濾器進(jìn)行過 濾。
[0546] 使用填充有Proteing Sepharose 4Fast Flow (通用電氣醫(yī)療集團(tuán)制造）的開放 柱從使用過濾器過濾后的培養(yǎng)上清中純化出抗人BMP9抗體。將所得到的抗體使用0. 22 μ m 的過濾器進(jìn)行滅菌，然后供于體內(nèi)試驗(yàn)。
[0547] [實(shí)施例8]
[0548] 利用使用固相抗原的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)對(duì)獲得抗體的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)
[0549] 為了確認(rèn)獲得的抗體對(duì)人BMP9的特異性，進(jìn)行了用于比較獲得的抗體與人BMP9 的結(jié)合性和獲得的抗體與作為人BMP9的同源性最高的分子的人BMPlO的結(jié)合性的實(shí)驗(yàn)。首 先，在 96 孔的 ELISA 用板（F96MAXIS0RP NUNC-IMMUNO PLATE，Thermo Fisher Scientific 公司制造，Cat#442404)中，以50 μ L/孔分注通過將人成熟二聚體BMP9重組蛋白（安迪生 物科技公司制造，Cat#3209-BP)或人成熟二聚體BMPlO重組蛋白（安迪生物科技公司制造， Cat#2926-BP)用 50mmol/L NaHCO3 緩沖液（Wako 公司制造，Cat#191-01305)制備成 IOOng/ mL而得到的溶液，在4°C下靜置過夜而使其吸附。
[0550] 除去固相化液后，以200 μ L/孔加入Super Block (Thermo SCIENTIFIC公司制造， Cat#37535)，在室溫下靜置1小時(shí)來進(jìn)行封閉，用TBST (含有吐溫20的Tris緩沖液；SANTA CRUZ公司制造，SC-24953)洗滌3次。
[0551] 接著，將使用生物素標(biāo)記試劑盒_NH2( 2 7 才公司制造，Cat#LK03)進(jìn)行 了生物素標(biāo)記的6D10-1-1抗體、10D5-2-3抗體、3B7-3-3抗體、R&D抗體或抗BMPlO抗體 (安迪生物科技公司制造，Cat#MAB2926)用SuperBlock與TBST以1:9的比例混合而成的 10% Super Block的TBST溶液制備成100ng/mL后，作為一次抗體以50 μ L/孔進(jìn)行分注， 在室溫下靜置1小時(shí)。
[0552] 將該板用TBST洗滌3次后，以100 μ L/孔分注用10% Super Block的TBST溶液 稀釋 500 倍的鏈霉親和素-聚 HRP80 (Stereospecific Detection Technologies 公司制造， Cat#SP80D50)，在室溫下靜置1小時(shí)。
[0553] 將該板用TBST洗滌5次，以50 μ L/孔添加 TMB底物液（TMB+底物-色原體，Dako公 司制造，Cat#S1599)，使其顯色，在得到適當(dāng)?shù)娘@色時(shí)，以50 μ L/孔添加 IN硫酸溶液（Wako 公司制造，Cat#192-04755)，使用酶標(biāo)儀（Spectra Max,分子儀器公司制造）測(cè)定樣品波長 450nm、參比波長570nm下的吸光度（450nm-570nm)。
[0554] 將結(jié)果記載于圖2中。如圖2所示，6D10-1-1抗體、10D5-2-3抗體和3B7-3-3 抗體與R&D抗體同樣地顯示出：與人BMP9強(qiáng)結(jié)合，并且不與人BMP10結(jié)合。該結(jié)果表明， 6D10-1-1抗體、10D5-2-3抗體和3B7-3-3抗體為與人BMP9特異性結(jié)合的抗體。
[0555] [實(shí)施例9]
[0556] 獲得抗體對(duì)人BMP9重組蛋白的結(jié)合性的評(píng)價(jià)
[0557] 為了測(cè)定獲得的抗人BMP9抗體對(duì)人BMP9的結(jié)合活性，進(jìn)行了下述實(shí)驗(yàn)。
[0558] 首先，在 96 孔的 ELISA 用板（F96MAXISORP NUNC-IMMUN0 PLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以50 μ L/孔分注將人成熟二聚體BMP9重組蛋白（安 迪生物科技公司制造，Cat#3209-BP)用50mmol/L NaHCO3緩沖液制備成100ng/mL而得到的 溶液，在4°C下靜置過夜而使其吸附。
[0559] 除去固相化液后，以200 μ L/孔加入Super Block (Thermo SCIENTIFIC公司制造， Cat#37535)，在室溫下靜置1小時(shí)來進(jìn)行封閉，用TBST洗滌3次。接著，將生物素標(biāo)記的 6D10-1-1 抗體、10D5-2-3 抗體、3B7-3-3 抗體或 R&D 抗體用 10% Super Block 的 TBST 溶 液分別制備成 1叩/1111^、51^/1]11^、20叩/1]11^、10〇1^/1]11^、30〇1^/1]11^將所得物以5(^17/孔進(jìn)行分 注，在室溫下靜置1小時(shí)。
[0560] 將該板用TBST洗滌3次后，以100 μ L/孔分注用10% Super Block的TBST溶液 稀釋500倍的鏈霉親和素-聚HRP80,在室溫下靜置1小時(shí)。
[0561] 將該板用TBST洗滌5次，以50 μ L/孔添加 TMB底物液（TMB+底物-色原體，Dako公 司制造，Cat#S1599)，使其顯色，在得到適當(dāng)?shù)娘@色時(shí)，以50 μ L/孔添加 IN硫酸溶液（Wako 公司制造，Cat#192-04755)，使用酶標(biāo)儀（Spectra Max,分子儀器公司制造）測(cè)定樣品波長 450nm、參比波長570nm下的吸光度（450nm-570nm)。
[0562] 將結(jié)果記載于圖3中。如圖3所示，6D10-1-1抗體、10D5-2-3抗體和3B7-3-3抗 體與R&D抗體同樣地，隨著抗體濃度增高而與人BMP9結(jié)合。此外，明確了 ：6D10-1-1抗體 和10D5-2-3抗體對(duì)人BMP9的結(jié)合活性比R&D抗體高。
[0563] [實(shí)施例 10]
[0564] 獲得抗體對(duì)人BMP9與R&D抗體的結(jié)合的作用
[0565] 根據(jù)實(shí)施例7中使用的體系的特征，認(rèn)為獲得抗體為抑制hsALKl-Fc與人成熟二 聚體BMP9重組蛋白的相互作用、或者人成熟二聚體BMP9重組蛋白與R&D抗體的相互作用 中的任意一種相互作用的抗體。因此，首先，構(gòu)建了人BMP9與R&D抗體的結(jié)合分析體系。
[0566] 在 96 孑L 的 ELISA 用板（F96MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以lOOyL/孔分注將實(shí)施例7-1中制備的人BMP9重 組蛋白用50mmol/L NaHCO3緩沖液制備成100ng/mL而得到的溶液，在室溫下靜置1小時(shí)而 使其吸附。除去固相化液后，以250 μ L/孔加入Super Block,在室溫下靜置1小時(shí)來進(jìn)行 封閉，用TBST洗滌3次。
[0567] 接著，以100 μ L/孔分注含有用10% Super Block的PBS-T溶液分別制備成100? 3000ng/mL的獲得抗體和50ng/mL的生物素標(biāo)記的R&D抗體的溶液，在室溫下靜置1小 時(shí)。將該板用PBS-T洗滌4次后，以100 μ L/孔分注用10% Super Block的PBS-T溶液稀 釋 500 倍的鏈霉親和素-聚 HRP80 (Stereospecific Detection Technologies 公司制造， Cat#SP80D50)，在室溫下靜置30分鐘?1小時(shí)。
[0568] 將該板用PBS-T洗滌4次，以100 μ L/孔添加 TMB顯色液（TMB+底物-色原體， Dako公司制造，Cat#S1599)，使其顯色，在得到適當(dāng)?shù)娘@色時(shí)，以100 μ L/孔添加 IN硫酸溶 液（Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用ARVO (珀金埃爾默公司制造）測(cè)定450nm的吸光 度。將結(jié)果記載于圖4中。
[0569] 如圖4所示，人BMP9與生物素標(biāo)記的R&D抗體的結(jié)合在添加未標(biāo)記的R&D抗體時(shí) 受到抑制，在添加10D5-2-3抗體或6D10-1-1抗體時(shí)也受到抑制。另一方面，在3B7-3-3抗 體的情況下，未觀察到抑制。
[0570] 該結(jié)果暗示了 ： 10D5-2-3抗體和6D10-1-1抗體對(duì)人BMP9的識(shí)別部位（表位）與 R&D抗體的識(shí)別部位相同或者在其附近，3B7-3-3抗體對(duì)人BMP9的識(shí)別部位（表位）與R&D 抗體的識(shí)別部位不同。
[0571] 另外，與R&D抗體相比，從更低的濃度開始觀察到抑制活性，由此明確，10D5-2-3 抗體和6D10-1-1抗體對(duì)人BMP9的結(jié)合活性（親和性）比R&D抗體高。
[0572] [實(shí)施例 11]
[0573] 獲得抗體對(duì)人BMP9與人ALKl的結(jié)合的作用
[0574] 接著，構(gòu)建了人BMP9與人ALKl的結(jié)合分析體系。
[0575] 在 96 孑L 的 ELISA 用板（F96MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以100 μ L/孔分注通過將實(shí)施例7-1中制備的人 BMP9重組蛋白用50mmol/L NaHCO3緩沖液稀釋成100ng/mL而得到的溶液，在室溫下靜置1 小時(shí)而使其吸附。
[0576] 將固相化液除去后，以250 μ L/孔加入Super Block,在室溫下靜置1小時(shí)來進(jìn)行 封閉，用PBS-T洗滌3次。接著，以100 μ L/孔分注含有用10% Super Block的PBS-T分別 制備成100ng/mL、1000ng/mL或10000ng/mL的獲得抗體或R&D抗體、和100ng/mL的進(jìn)行了 生物素標(biāo)記的hsALKl-Fc蛋白質(zhì)的溶液，在室溫下靜置1小時(shí)。
[0577] 將該板用PBS-T洗滌4次后，以100 μ L/孔分注用10% Super Block的PBS-T稀 釋 500 倍而得到的鏈霉親和素-聚 HRP80 (Stereospecific Detection Technologies 公司 制造，Cat#SP80D50)，在室溫下靜置30分鐘?1小時(shí)。
[0578] 將該板用PBS-T洗滌4次，以100 μ L/孔添加 TMB顯色液 (TMB+Substrate_Chromogen、Dako公司制造，Cat#S 1599)，使其顯色，在得到適當(dāng)?shù)娘@色時(shí) 以100 μ L/孔添加 IN硫酸溶液（Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用ARVO (八一々 > 工 > ^ 一公司制造）測(cè)定450nm的吸光度。
[0579] 濃度為 100ng/mL、1000ng/mL 或 10000ng/mL 的 3B7-3-3 抗體將人 BMP9 與人 ALKl 的結(jié)合分別抑制為10. 3%、29. 與此相對(duì)，即使添加最高用量的濃度為IOOOOng/ mL的6D10-1-1抗體、10D5-2-3抗體和R&D抗體，也沒有抑制人BMP9與人ALKl的結(jié)合。
[0580] 由以上的結(jié)果明確，3B7-3-3抗體為抑制人BMP9與人ALKl的結(jié)合的抗BMP9抗體， 與此相對(duì)，6D10-1-1抗體、10D5-2-3抗體和R&D抗體為不抑制人BMP9與人ALKl的結(jié)合的 抗BMI^抗體。
[0581] [實(shí)施例 I2]
[0582] 獲得抗體對(duì)人BMP9與人BMPRII的結(jié)合的作用
[0583] 已知BMP9的受體由BMPI型受體和BMPII型受體構(gòu)成，BMP9與這兩種類型的受體 結(jié)合。由實(shí)施例11明確，10D5-2-3抗體、6D10-1-1抗體和R&D抗體不抑制人BMP9與人ALKl 的結(jié)合，暗示這些抗體不抑制BMP9與BMPI型受體的結(jié)合。
[0584] 接著，為了研究這些抗體是否抑制BMP9與BMPII型受體的結(jié)合，構(gòu)建人BMP9與作 為人BMP9II型受體之一而已知的人BMPRII的結(jié)合分析體系。
[0585] 在 96 孔的 ELISA 用板（F96MAXISORP NUNC-IMMUN0 PLATE、Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以100 μ L/孔分注通過將實(shí)施例7-1中制備的人 BMP9重組蛋白用3 μ g/mL而得到的溶液,在室溫下靜置1小時(shí)而使其吸附。將固相化液除 去后，以260 μ L/孔加入Super Block,在室溫下靜置1小時(shí)來進(jìn)行封閉，用TBST洗滌4次。
[0586] 接著，以100 μ L/孔分注含有用10% Super Block的TBST制備成1000ng/mL的獲 得抗體、R&D抗體或陰性對(duì)照小鼠 IgGl單克隆抗體（DAK0公司制造，X0931)和制備成3 μ g/ mL的BMPRII-Fc (人BMPRII的胞外域與人IgGlFc區(qū)域的融合重組蛋白、安迪生物科技公司 制造）的10% Super Block的TBST溶液，在室溫下靜置1小時(shí)。
[0587] 將該板用TBST洗滌4次后，以100 μ L/孔分注用10 % SuperBlock的TBST稀釋 20000倍而得到的山羊抗人IgG HRP (Thermo Scientific公司制造），在室溫下靜置30分 鐘?1小時(shí)。
[0588] 將該板用TBST洗滌4次，以100 μ L/孔添加 TMB顯色液（TMB+底物-色原體， Dako公司制造，Cat#S1599)，使其顯色，在得到適當(dāng)?shù)娘@色時(shí)以100 μ L/孔添加 IN硫酸溶 液（Wako 公司制造，Cat#192_04755)，使用 Multiskan Ascent (Thermo Labsystems 公司制 造）測(cè)定450nm的吸光度。將結(jié)果示于圖5。
[0589] 如圖5所示，人BMP9與人BMPRII的結(jié)合被6D10-1-1抗體、10D5-2-3抗體和R&D 抗體抑制，由此明確，這些抗體為抑制BMP9與BMPRII受體的結(jié)合的抗人BMP9抗體。
[0590] [實(shí)施例 13]
[0591] 獲得抗體對(duì)人BMP9重組蛋白的結(jié)合活性（biacore分析）
[0592] 使用BIAcore 2000 (通用電氣醫(yī)療集團(tuán)制造）對(duì)獲得抗體對(duì)人BMP9重組蛋白的 結(jié)合活性（親和性）進(jìn)行研究。使用小鼠抗體捕獲試劑盒（通用電氣醫(yī)療集團(tuán)制造），將抗 小鼠 IgG抗體固定到傳感芯片CM5上，然后，使抗人BMP9抗體以使RU值為700-1100的方 式進(jìn)行結(jié)合。
[0593] 然后，將實(shí)施例7-1中制備的人BMP9重組蛋白用HBS-EP溶液（通用電氣醫(yī) 療集團(tuán)制造）制備成 〇· 152nmol/L、0. 457nmol/L、I. 37nmol/L、4. lnmol/L、12. 3nmol/L、 36. 89nmol/L、110. 67nmol/L、322nmol/L的濃度，將所得物作為分析物進(jìn)行添加，測(cè)定結(jié)合 強(qiáng)度。
[0594] 基于所得到的值，利用單周期動(dòng)力學(xué)計(jì)算法（BIA評(píng)價(jià)軟件第三版，通用電氣醫(yī)療 集團(tuán)制造）算出結(jié)合解離常數(shù)（Kd值）。將結(jié)果示于表1中。
[0595] [表 1]
[0596]

【權(quán)利要求】
1. 一種單克隆抗體或該抗體片段，其為選自下述（a)?（e)中的一種抗體、或者與該抗 體競(jìng)爭(zhēng)地與人BMP9結(jié)合且與人BMP9的結(jié)合解離常數(shù)為lXKr1(lm〇l/L以下， (a) 包含互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining region，以下記作 CDR) 1 ?3 分 別含有序列號(hào)54?56表不的氨基酸序列的抗體的重鏈且包含CDR1?3分別含有序列號(hào) 57?59表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈的抗體， (b) 包含⑶R1?3分別含有序列號(hào)60?62表示的氨基酸序列的抗體的重鏈且包含 CDR1?3分別含有序列號(hào)63?65表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈的抗體， (c) 包含含有序列號(hào)48表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)且包含含有序列號(hào)51 表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體， (d) 包含含有序列號(hào)49表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)且包含含有序列號(hào)52 表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體， (e) 包含含有序列號(hào)128表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)且包含含有序列號(hào) 132表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體。
2. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或該抗體片段，其為與選自所述（a)?（e)中的一 種抗體所結(jié)合的表位結(jié)合的單克隆抗體。
3. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或該抗體片段，其為基因重組抗體。
4. 如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體或該抗體片段，其為選自人嵌合抗體、人源化抗體 和人抗體中的基因重組抗體。
5. 選自下述（a)?（c)中的一種單克隆抗體或該抗體片段， (a) 包含⑶R1?3分別含有序列號(hào)54?56表示的氨基酸序列的抗體的重鏈且包含 CDR1?3分別含有序列號(hào)57?59表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈的單克隆抗體及該抗體 片段， (b) 包含⑶R1?3分別含有序列號(hào)60?62表示的氨基酸序列的抗體的重鏈且包含 CDR1?3分別含有序列號(hào)63?65表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈的單克隆抗體及該抗體 片段， (c) 包含含有序列號(hào)128表示的氨基酸序列的抗體的重鏈可變區(qū)且包含含有序列號(hào) 132表示的氨基酸序列的抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體及抗體片段。
6. 如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體及該抗體片段，其與序列號(hào)67表不的 人BMP9成熟區(qū)的氨基酸序列中的至少第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met和第 93位的Pro結(jié)合。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的抗體片段，其為選自Fab、Fab'、F(ab'）2、單鏈抗 體（scFv)、二聚體化V區(qū)（雙價(jià)抗體）、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)（dsFv)和包含CDR的肽中的抗 體片段。
8. -種DNA，其編碼權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段。
9. 一種重組載體，其含有權(quán)利要求8所述的DNA。
10. -種轉(zhuǎn)化株，其通過將權(quán)利要求9所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中而獲得。
11. 權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段的制造方法，其特征在 于，將權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成并蓄積權(quán)利要求 1?7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，并從培養(yǎng)物中收集該抗體或該抗體片段。
12. -種伴有BMP9相關(guān)的貧血的疾病的治療劑，其含有與人BMP9結(jié)合并且抑制人 BMP9與人BMPRII的結(jié)合的單克隆抗體或該抗體片段作為有效成分。
13. -種人BMP9的免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)定方法，其使用權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的單 克隆抗體或該抗體片段。
14. 一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段 和藥理學(xué)上容許的載體。
15. -種人BMP9相關(guān)的貧血的治療方法，其包括施用權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的 單克隆抗體或該抗體片段。
16. -種BMP9相關(guān)的貧血的治療方法，其包括施用與人BMP9結(jié)合并且抑制人BMP9與 人BMPRII的結(jié)合的單克隆抗體或該抗體片段。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK104411720SQ201380035350
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月2日
【發(fā)明者】清水清, 山崎雄司, 久保田麗夫, 木村要 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社