免疫球蛋白恒定區(qū)Fc受體結(jié)合劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫球蛋白恒定區(qū)Fc受體結(jié)合劑。自免疫學(xué)活性生物模擬物的重組和/或生化創(chuàng)建而衍生IVIG替換化合物。然后，在體外篩選這些替換化合物以評(píng)估每種替換化合物在調(diào)控免疫功能方面的效率。選擇特定的替換化合物以進(jìn)行進(jìn)一步體內(nèi)確認(rèn)和劑量/施用優(yōu)化。最后，使用替換化合物來治療極其多種疾病，包括炎性和自身免疫性疾病。
【專利說明】免疫球蛋白恒定區(qū)Fe受體結(jié)合劑
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年05月30日、中國申請(qǐng)?zhí)枮?00880101542.0、發(fā)明名稱
為“免疫球蛋白恒定區(qū)Fe受體結(jié)合劑”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]一般而言，本發(fā)明涉及免疫學(xué)、炎癥、和腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及包含免疫球蛋白Fe域的生物學(xué)活性生物模擬物分子、包含此類生物模擬物的組合物、和使用此類生物模擬物的方法。
[0003]本發(fā)明還涉及由單核細(xì)胞衍生細(xì)胞介導(dǎo)的病理學(xué)疾患的治療和預(yù)防，且更具體地，涉及IgG Fe片段的穩(wěn)定化功能性部分用于此類治療和預(yù)防的用途。
[0004]發(fā)明背景
[0005]自上世紀(jì)50年代早期以來便已經(jīng)使用來自人血漿的免疫球蛋白產(chǎn)物來治療免疫缺陷病癥，并且新近，更通常用于自身免疫性和炎性疾病。
[0006]最初，通過肌肉內(nèi)注射來施用免疫球蛋白產(chǎn)物。新近，已經(jīng)使用靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)，而且最初顯示有效治療自身免疫性疾病特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP) (ImbachP, Barandun S，d’Apuzzo V 等:High_dose intravenous gammaglobulin for idiopathicthrombocytopenic purpura in childhood.Lancetl981 年 6 月 6 日；I (8232):1228-31)。人IVIG (在本文中稱為“hIVIG”)是自合并的人血漿制造的無菌的、純化的免疫球蛋白G(IgG)產(chǎn)物的配制劑，其通常含有超過95%未修飾的IgG，以及僅少量且可變量的免疫球蛋白 A(IgA)或免疫球蛋白 M(IgM)(參見例如 Rutter A, Luger TA:High_dose intravenousimmunoglobulins:an approach to treat severe immune-mediated and autoimmunediseases of the skin.J Am Acad Dermato12001 年 6 月；44 (6): 1010-24)。目前，hIVIG的單一最常見臨床用途是在ITP治療中。
[0007]雖然hIVIG已經(jīng)是有效的臨床治療方法，但是hIVIG配制劑有數(shù)項(xiàng)缺點(diǎn)，包括不充分無菌性的可能性、雜質(zhì)的存在、可得性的缺乏、和批次間差異。具體地，hIVIG制品在其免疫球蛋白A(IgA)含量方面可以有極大的變化，這可以是令人憂慮的，因?yàn)镮gA能在IgA缺陷的接受者中引起變應(yīng)性和過敏性反應(yīng)。
[0008]鑒于hIVIG的消極方面，需要治療自身免疫性和炎性疾病的改良手段。
[0009]另外，自單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞介導(dǎo)極其多種類型的多種病理學(xué)疾患。供許多(若不是全部)此類疾患中使用的簡單治療劑和/或預(yù)防劑會(huì)是無價(jià)的。
[0010]發(fā)明概述
[0011]IVIG的免疫調(diào)節(jié)特性存在于IgG分子的Fe域中。例如，在ITP的鼠模型中，未修飾的IVIG和單獨(dú)的Fe片段兩者均證明恢復(fù)血小板計(jì)數(shù)的治療功效，而分離的 IVIG Fab 片段不是治療性的(Samuelsson, A.，Towers, T.L.和 Ravetch, J.V.Ant1-1nflammatory Activity of IVIG Mediated Through the Inhibitory FeReceptor.Science291, 484-486 (2001)) ? 此外，F(xiàn)e (而非 IVIG 的 Fab 片段)在兒童和成人特發(fā)性血小板減少性紫癜兩者的治療中也是治療方面有效的(Follea，G.等.1ntravenous pIasmin-treated gammaglobulin therapy in idiopathicthrombocytopenic purpura.Nouv Rev Fr Hematol27，5-10 (1985);Solal-Celigny，P.，Bernard,J., Herrera, A.和 Biovin，P.Treatment of adult autoimmune thrombocytopenicpurpura with high—dose intravenous pIasmin-cleaved gammaglobulins.Scand JHaematol31, 39-44 (1983) ; DebrejM.和 Bonnet，M._C.1nfusion of Gcgamma fragmentsfor treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura.Lancet342，945-49 (1993) ; Burdachj S.E.，Evers, K.和 Geurson，R.Treatment of acute idiopathicthrombocytopenic purpura of childhood with intravenous immunoglobulinG:Comparative efficacy of7S and 5S preparations.J Pediatrl09，770-775(1986))。
[0012]IVIG的治療效果最初經(jīng)由Fe伽馬受體(FcyR)介導(dǎo)，并且其長期致耐受性效應(yīng)(long tolerogenic effect)依賴于樹突細(xì)胞(DC)-巨嗷細(xì)胞對(duì)話(cross-talk) □Fe YRIIIa在起始物階段中發(fā)揮必不可少的作用，而Fe YRIIb是ITP的鼠模型中的效應(yīng)器階段所需要的(Samuelsson, A.，Towers, T.L 和 Ravetch, J.V.Ant1-1nflammatoryActivity of IVIG Mediated Through the Inhibitory Fe Receptor.Science291, 484-486(2001) ;Siragamj V.等.Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activatingFe [gamma] receptors on dendritic cells.Nat Medl2，688 (2006)) ?類似地，人研究證明抗Fcy受體抗體有效治療頑固性ITP(Clarkson，S.等.Treatment of refractoryimmune thrombocytopenic purpura with an ant1-Fc gamma-receptor antibody.NEngl J Med314，1236-1239(1986))。重要的是，長期致耐受性效應(yīng)是通過細(xì)胞-細(xì)胞相互作用而介導(dǎo)的，因?yàn)榻?jīng)IVIG處理的DC的過繼轉(zhuǎn)移有效治療ITP的鼠模型(Siragam，V.等.1ntravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fe[gamma]receptors on dendritic cells.Nat Medl2，688(2006))。
[0013]IVIG的免疫調(diào)控效果需要Fe yR的聚集。Fe Y R的聚集是由IVIG中存在的 IgG 二聚物(占全部 IVIG 的 5-15%)介導(dǎo)的(Bleeker, W.K.等.Vasoactive sideeffects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and theirtreatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydroIase.Blood95, 1856-1861 (2000)) o例如，在ITP的鼠模型中，用具有高含量“二聚物”(完整免疫球蛋白分子的二聚物)的IVIG進(jìn)行的處理增強(qiáng)血小板計(jì)數(shù)，而IVIG “單體”(完整免疫球蛋白分子)不是有效的(Teeling，J.L.等.Therapeutic efficacy of intravenousimmunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies inexperimental immune thrombocytopenia.Blood98, 1095-1099(2001))。此外，盡管事實(shí)是在IVIG的制造中例行使用離子交換樹脂和聚乙二醇分級(jí)以除去IgG聚集物，但是IVIG的臨床功效與患者血清中二聚物的存在相關(guān)聯(lián)(Augener，W.，F(xiàn)riedman, B.和Brittinger，G.Are aggregates of IgG the effective part of high—dose immunoglobulin therapyin adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) ?Blut50，249-252 (1985))。重要的是，二聚物的百分比還與血管活性副作用(其能用乙酰水解酶治療)相關(guān)聯(lián)(Bleeker，W.K.等.Vasoactive side effec ts of intravenous immunoglobulin preparations ina rat model and their tr eatment with recombinant platelet-activating factoracety!hydrolase.Blood95，1856-1861 (2000))。[0014]本發(fā)明涉及生物學(xué)活性生物模擬物分子、包含其的組合物、及使用其的方法。這些生物模擬物具有廣泛的應(yīng)用，用于治療免疫學(xué)和炎性病癥，包括但不限于自身免疫性疾病，而且它們具有作為用于癌癥的生物免疫治療劑的功效。此外，這些生物模擬物中的某些還具有作為試劑的功效，諸如在用于測(cè)試免疫細(xì)胞功能的免疫學(xué)測(cè)定法中和疾病的診斷中使用。此外，本發(fā)明的生物模擬物和組合物具有克服上文所列出的hIVIG局限性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還涉及由單核細(xì)胞衍生細(xì)胞介導(dǎo)的病理學(xué)疾患的治療和預(yù)防，且更具體地，涉及IgG Fe片段的穩(wěn)定化功能性部分用于此類治療和預(yù)防的用途。
[0015]在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的串聯(lián)Stradomer,其包含兩個(gè)或更多個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體，其中每個(gè)所述Stradomer單體包含兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)或更多個(gè)Fe域，且其中所述串聯(lián)Stradomer經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域之第一個(gè)特異性結(jié)合第一 Fe Y受體并經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域之第二個(gè)特異性結(jié)合第二 Fe Y受體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體是經(jīng)由共價(jià)鍵、二硫鍵或化學(xué)交聯(lián)而聯(lián)合的。
[0016]在本發(fā)明的分離的串聯(lián)Stradomer的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分離的串聯(lián)Stradomer由兩個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體構(gòu)成。在一個(gè)同等優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分離的串聯(lián)Stradomer由兩個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體構(gòu)成，其中所述這兩個(gè)Stradomer單體都包含兩個(gè)Fe域單體,且其中所述兩個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)Fe域。在涉及分離的串聯(lián)Stradomer的這些實(shí)施方案的第一個(gè)具體的實(shí)例中,所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgG鉸鏈和IgG CH2域。在第二個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈和IgG CH2域。在第三個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgG鉸鏈、IgGCH2域和IgGCH3域。在第四個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈、IgG CH2域和IgG CH3域。在第五個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第六個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、和IgGlCH2域或IgG3CH2域。在第七個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第八個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第九個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG3鉸鏈、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第十個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。
[0017]又在此第一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域各自是相同免疫球蛋白Fe類的，且所述免疫球蛋白Fe類選自下組:IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4?；蛘撸鰞蓚€(gè)或更多個(gè)Fe域各自是不同免疫球蛋白Fe類的，且所述免疫球蛋白Fe類選自下組:IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4。
[0018]進(jìn)一步在此第一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二 Fe Y受體各自獨(dú)立是Fe Y受體I>Fcy受體I1、Fcy受體III或Fcy受體IV。優(yōu)選地，所述第一和第二 Fe Y受體各自是Fe Y 受體 Ilia。
[0019]在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的串聯(lián)Stradomer，其包含兩個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體，其中所述Stradomer單體之每一個(gè)包含兩個(gè)Fe域單體,其中所述兩個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)Fe域,其中所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈、IgGCH2域和IgG CH3域,且其中所述串聯(lián)Stradomer經(jīng)由所述兩個(gè)Fe域之第一個(gè)特異性結(jié)合第一 Fcy受體并經(jīng)由所述兩個(gè)Fe域之第二個(gè)特異性結(jié)合第二 Fcy受體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體是經(jīng)由共價(jià)鍵、二硫鍵或化學(xué)交聯(lián)而聯(lián)合的。
[0020]在此第二個(gè)實(shí)施方案的第一個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域各自是相同免疫球蛋白Fe類的，且所述免疫球蛋白Fe類選自下組:IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4。在第二個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域各自是不同免疫球蛋白Fe類的，且所述免疫球蛋白Fe類選自下組:IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在第三個(gè)具體的實(shí)例中，至少一個(gè)所述Fe域包含IgG鉸鏈和IgG CH2域。在第四個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈和IgG CH2域。在第五個(gè)具體的實(shí)例中，至少一個(gè)所述Fe域包含IgG鉸鏈、IgG CH2域和IgG CH3域。在第六個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈、IgG CH2域和IgG CH3域。在第七個(gè)具體的實(shí)例中，至少一個(gè)所述Fe域包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第八個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第九個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第十個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG3鉸鏈、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第
十一個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。
[0021] 在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的串聯(lián)Stradomer,其進(jìn)一步包含F(xiàn)ab域，其中所述Stradomer單體之每一個(gè)包含F(xiàn)ab片段重鏈和兩個(gè)Fe域單體,其中所述Fab片段重鏈在所述兩個(gè)Fe域單體氨基端或羧基端的位置中，其中Fab片段輕鏈獨(dú)立與每個(gè)Fab片段重鏈聯(lián)合，且其中所述Fab域具有抗原結(jié)合活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Stradomer單體之每一個(gè)進(jìn)一步包含免疫球蛋白鉸鏈單體,且其中所述免疫球蛋白鉸鏈單體在所述Fab片段重鏈和所述兩個(gè)Fe域單體之間的位置中。
[0022]在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及核心Stradomer,其包含與兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元連接的核心模塊,其中所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元之每一個(gè)包含至少一個(gè)Fe域,且其中所述核心Stradomer單元之每一個(gè)獨(dú)立選自下組:
[0023](a) Fe片段，其中所述Fe片段包含兩個(gè)聯(lián)合的Fe片段單體，其中所述Fe片段單體之每一個(gè)包含F(xiàn)e域單體，且其中所述兩個(gè)Fe片段單體的聯(lián)合形成Fe域，
[0024](b)Fc部分片段，其中所述Fe部分片段包含兩個(gè)聯(lián)合的Fe部分片段單體，其中所述Fe部分片段單體之每一個(gè)包含F(xiàn)e域單體，且其中所述兩個(gè)Fe部分片段單體的聯(lián)合形成Fe域，
[0025](c) Fe域，其中所述Fe域包含兩個(gè)聯(lián)合的Fe域單體，且其中所述兩個(gè)Fe域單體的聯(lián)合形成Fe域，
[0026](d)串聯(lián)Stradomer,其中所述串聯(lián)Stradomer包含兩個(gè)或更多個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體,其中所述Stradomer單體之每一個(gè)包含兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體,且其中所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)或更多個(gè)Fe域,和
[0027](e)簇Stradomer,其中所述簇Stradomer包含兩個(gè)或更多個(gè)多聚化的簇Stradomer單元,其中所述簇Stradomer單元之每一個(gè)包含多聚化區(qū)和至少一個(gè)Fe域,其中所述簇Stradomer單元之每一個(gè)包含兩個(gè)聯(lián)合的簇Stradomer單元單體,其中所述簇Stradomer單元單體之每一個(gè)包含多聚化區(qū)單體和至少一個(gè)Fe域單體,其中所述兩個(gè)簇Stradomer單元單體的聯(lián)合形成多聚化區(qū)和至少一個(gè)Fe域,且其中所述兩個(gè)或更多個(gè)簇Stradomer單元的多聚化區(qū)進(jìn)行多聚化以形成所述簇Stradomer,且
[0028]其中所述核心Stradomer經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元之第一個(gè)特異性結(jié)合第一 Fe Y受體并經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元之第二個(gè)特異性結(jié)合第二 Fe Y受體。
[0029]優(yōu)選地，在此第四個(gè)實(shí)施方案中，所述核心模塊選自下組:免疫球蛋白J鏈、清蛋白、脂質(zhì)體、珠、肽和聚乙二醇。
[0030]在涉及核心Stradomer的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元各自獨(dú)立是Fe片段?；蛘?，所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元各自獨(dú)立是串聯(lián)Stradomer0
[0031]在涉及核心Stradomer的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核心Stradomer包含兩個(gè)核心Stradomer單元,其中所述兩個(gè)核心Stradomer單元之每一個(gè)各自獨(dú)立是串聯(lián)Stradomer,其中所述串聯(lián)Stradomer包含兩個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體，其中所述這兩個(gè)Stradomer單體都包含兩個(gè)Fe域單體,且其中所述兩個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)Fe域。在此實(shí)施方案的第一個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元的至少一個(gè)Fe域包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第二個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)或更多個(gè)兩個(gè)核心Stradomer單元的至少一個(gè)Fe域包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、和IgGlCH2域。在第三個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)或更多個(gè)兩個(gè)核心Stradomer單元的Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第四個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)或更多個(gè)兩個(gè)核心Stradomer單元的至少一個(gè)Fe域包含IgG鉸鏈和IgG CH2域。在第五個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)或更多個(gè)兩個(gè)核心Stradomer單元的Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈和IgG CH2域。在第六個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)或更多個(gè)兩個(gè)核心Stradomer單元的Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG3鉸鏈、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第七個(gè)具體的實(shí)例中,所述兩個(gè)或更多個(gè)兩個(gè)核心Stradomer單元的Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。
[0032]在此實(shí)施方案中，所述第一和第二 Fe Y受體各自獨(dú)立是Fe Y受體1、Fe Y受體I1、Fe Y受體III或Fe Y受體IV。優(yōu)選地，所述第一和第二 Fe Y受體各自是Fe Y受體IIIa0
[0033]在第五個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及簇Stradomer，其包含兩個(gè)或更多個(gè)多聚化的簇Stradomer單元,其中所述簇Stradomer單元之每一個(gè)包含多聚化區(qū)和至少一個(gè)Fe域，其中所述簇Stradomer單元之每一個(gè)包含兩個(gè)聯(lián)合的簇Stradomer單元單體，其中所述簇Stradomer單元單體之每一個(gè)包含多聚化區(qū)單體和至少一個(gè)Fe域單體,其中所述兩個(gè)簇Stradomer單元單體的聯(lián)合形成多聚化區(qū)和至少一個(gè)Fe域,其中所述兩個(gè)或更多個(gè)簇Stradomer單元的多聚化區(qū)進(jìn)行多聚化以形成所述簇Stradomer,且其中所述簇Stradomer經(jīng)由第一 Fe域特異性結(jié)合第一 Fe Y受體并經(jīng)由第二 Fe域特異性結(jié)合第二 Fe Y受體。
[0034]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多聚化區(qū)選自下組:IgG2鉸鏈、IgE CH2域、亮氨酸、異亮氨酸拉鏈和鋅指。
[0035] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述簇Stradomer包含2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)多聚化的簇Stradomer單元。[0036]在此第五個(gè)實(shí)施方案的第一個(gè)具體的實(shí)例中，至少一個(gè)所述Fe域包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第二個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第三個(gè)具體的實(shí)例中，至少一個(gè)所述Fe域包含IgG鉸鏈和IgG CH2域。在第四個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈和IgG CH2域。在第五個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG3鉸鏈、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第六個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。在第七個(gè)具體的實(shí)例中，所述Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈、IgG CH2域和IgG CH3域。在第八個(gè)具體的實(shí)例中，至少一個(gè)所述簇Stradomer單元包含兩個(gè)或更多個(gè)Fe域。在第九個(gè)具體的實(shí)例中,所述簇Stradomer單元之每一個(gè)包含兩個(gè)或更多個(gè)Fe域。
[0037]在此實(shí)施方案中，所述第一和第二 Fe Y受體各自獨(dú)立是Fe Y受體1、Fe Y受體
I1、Fe Y受體III或Fe Y受體IV。優(yōu)選地，所述第一和第二 Fe Y受體各自是Fe Y受體IIIa0
[0038]在第六個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種Stradobody,其包含兩個(gè)或更多個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體和Fab域，其中所述Stradomer單體之每一個(gè)包含F(xiàn)ab片段重鏈和兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體，其中所述Fab片段重鏈在所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體的氨基端或羧基端的位置中，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)或更多個(gè)Fe域,其中Fab片段輕鏈獨(dú)立與每個(gè)Stradomer單體的所述Fab片段重鏈聯(lián)合,其中所述Fab域具有抗原結(jié)合活性，且其中所述Stradobody經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域之第一個(gè)特異性結(jié)合第一Fcy受體并經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域之第二個(gè)特異性結(jié)合第二 Fe Y受體。
[0039]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體是經(jīng)由共價(jià)鍵、二硫鍵或化學(xué)交聯(lián)而聯(lián)合的。
[0040]在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Stradobody的所述Stradomer單體之每一個(gè)進(jìn)一步包含免疫球蛋白鉸鏈單體，且其中所述免疫球蛋白鉸鏈單體在所述Fab片段重鏈和所述兩個(gè)Fe域單體之間的位置中。
[0041]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述Stradobody包含兩個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體，其中所述Stradomer單體之每一個(gè)包含F(xiàn)ab片段重鏈和兩個(gè)Fe域單體,且其中所述兩個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)Fe域。在此實(shí)施方案的第一個(gè)具體的實(shí)例中,所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgG鉸鏈、IgG CH2域和IgG CH3域。在第二個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈、IgGCH2域和IgG CH3域。在第三個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgG鉸鏈和IgG CH3域。在第四個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG鉸鏈和IgG CH3域。在第五個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第六個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGl CH3域或IgG3CH3域。在第七個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第八個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgG3鉸鏈、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第九個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域之每一個(gè)獨(dú)立包含IgGl鉸鏈、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。在第十個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、和IgGlCH2域或IgG3CH2域。在第十一個(gè)具體的實(shí)例中，所述兩個(gè)Fe域中至少一個(gè)包含IgGl鉸鏈或IgG3鉸鏈、和IgGlCH2 域。
[0042]在此實(shí)施方案中，所述第一和第二 Fe Y受體各自獨(dú)立是Fe Y受體1、Fe Y受體
I1、Fe Y受體III或Fe Y受體IV。優(yōu)選地，所述第一和第二 Fe Y受體各自是Fe Y受體IIIa0
[0043]在第七個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改變受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括給有所需要的受試者施用包含治療有效量的串聯(lián)Stradomer和載體或稀釋劑的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含治療有效量的串聯(lián)Stradomer的異質(zhì)混合物和載體或稀釋劑。
[0044]在第八個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改變受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括給有所需要的受試者施用包含治療有效量的核心Stradomer和載體或稀釋劑的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含治療有效量的核心Stradomer的異質(zhì)混合物和載體或稀釋劑。
[0045]在第九個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改變受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括給有所需要的受試者施用包含治療有效量的簇Stradomer和載體或稀釋劑的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含治療有效量的簇Stradomer的異質(zhì)混合物和載體或稀釋劑。
[0046]在第十個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改變受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括給有所需要的受試者施用包含治療有效量的Stradobody和載體或稀釋劑的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含治療有效量的Stradobody的異質(zhì)混合物和載體或稀釋劑。
[0047]在第十一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對(duì)抗體篩選對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的特定活性的方法，包括:(a)使所述免疫系統(tǒng)的同質(zhì)細(xì)胞群體與候選抗體接觸，(b)測(cè)量(a)的細(xì)胞群體的活性，(C)使與(a)中相同細(xì)胞類型的同質(zhì)細(xì)胞群體與權(quán)利要求1的串聯(lián)Stradomer接觸，
(d)測(cè)量(C)的細(xì)胞群體的活性，并(e)比較(b)中測(cè)量的活性與(d)中測(cè)量的活性，由此在所述免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上對(duì)抗體篩選特定活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述候選抗體和所述串聯(lián)Stradomer是物種匹配的和同種型匹配的。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，(e)中的所述比較是⑷中測(cè)量的活性對(duì)(b)中測(cè)量的活性的比率。
[0048]在第十二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制單核細(xì)胞衍生細(xì)胞(MDC)的活性的方法。該方法牽涉使所述細(xì)胞與包含具有與其結(jié)合的Fe試劑的基底(substrate)的組合物接觸。所述接觸可以是體外的、體內(nèi)的、或回體(ex vivo)的。所述細(xì)胞可以在動(dòng)物中，例如患有或者有風(fēng)險(xiǎn)形成單核細(xì)胞衍生細(xì)胞介導(dǎo)的疾患(MDCMC)的動(dòng)物。所述細(xì)胞可以是例如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、或破骨細(xì)胞。
[0049]在第十三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療方法，該方法包括給動(dòng)物施用包含具有與其結(jié)合的Fe試劑的基底的組合物，其中所述動(dòng)物患有或者有風(fēng)險(xiǎn)形成單核細(xì)胞衍生細(xì)胞介導(dǎo)的疾患(MDCMC)。
[0050]以下內(nèi)容是對(duì)于這兩種方法(第十二個(gè)和第十三個(gè)實(shí)施方案)而言共同的實(shí)施方案。
[0051]所述動(dòng)物可以是例如人。[0052]所述Fe試劑可以含有或者是人Fe片段(例如人IgGlFc片段、人IgG3Fc片段、人IgG2、或人IgG4Fc片段)的功能性部分(functional portion)。此外,它可以包括或者是IgG分子。所述Fe試劑還可以是或者包括非人Fe片段的功能性部分。
[0053]所述基底可以是或者包括合成聚合物,例如尼龍(nylon)、特氟隆(teflon)、漆絕(dacron)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride)、PEU (聚(酯型氨基甲酸酯))(poly (esterurethane))、PTFE (聚四氟乙烯)(polytetrafluoroethylene)、或 PMMA (甲基丙烯酸甲酯)(methyl methacrylate)。所述基底可以包括或者是金屬或金屬合金,例如不銹鋼、鉬、銥、鈦、鉭、鎳-鈦合金、或鈷-鉻合金。所述基底可以含有或者是動(dòng)物組織或動(dòng)物組織產(chǎn)物，例如組織或器官移植物、骨(例如成骨骨(osteogenic bone))、或軟骨。所述基底可以含有或者是蛋白質(zhì)，例如膠原或角蛋白。所述基底還可以是或者含有多糖，例如瓊脂糖。此外，所述基底可以含有或者是組織基質(zhì)(tissue matrix)，例如無細(xì)胞組織基質(zhì)。所述基底可以含有或者是動(dòng)物細(xì)胞(例如，組織修復(fù)細(xì)胞諸如成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞)。所述基底可以含有或者是鹽，例如硫酸鈣。此外，所述基底可以是或者含有凝膠或乳膏。它還可以含有或者是硅或硅橡膠。它還可以含有或者是天然纖維，例如絲、棉、或羊毛。
[0054]所述基底可以是毛發(fā)移植栓(hair transplant plug)或可移入的醫(yī)學(xué)裝置諸如支架(例如，血管支架諸如冠狀動(dòng)脈支架；氣道支架諸如氣管內(nèi)或鼻支架；胃腸支架諸如膽或胰腺支架；或泌尿器支架諸如輸尿管支架)。它還可以是外科縫線(surgicalsuture)(例如，編織絲(braid silk)、鉻腸線(chromic gut)、尼龍、塑料、或金屬縫線(nylon, plastic, or metal suture)或外科夾(surgical clip)(例如,動(dòng)脈瘤夾(aneurismclip)))。另外，所述基底可以是人工髖、人工髖關(guān)節(jié)、人工膝、人工膝關(guān)節(jié)、人工肩、人工肩關(guān)節(jié)、人工指或趾關(guān)節(jié)、骨板(bone plate)、骨樁(bone dowel)、骨不愈合植入物(bonenon-union implant)、椎間盤植入物、骨粘固劑(bone cement)、或骨粘固劑間隔物(bonecement spacer)。它可以是動(dòng)脈-靜脈分流器、可植入的金屬絲、起搏器、人工心臟、心臟輔助裝置、耳蝸植入物、可植入的除顫器、脊髓刺激器、中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激器、外周神經(jīng)植入物、假牙、或牙冠。此外，所述基底可以是大血管栓塞過濾裝置或籠(large vessel embolicfiltering device or cage)、經(jīng)皮裝置(percutaneous device)、皮膚或粘膜下層貼片(dermal or sub-mucosal patch)、或可植入的藥物投遞裝置。
[0055]所述基底還可以是大血管移植物，其中所述血管是例如頸動(dòng)脈、股動(dòng)脈、或主動(dòng)脈。它還可以是皮下植入物、角膜植入物、眼內(nèi)透鏡(intraocular lens)、或接觸鏡。
[0056]所述基底可以是例如片(sheet)、珠(bead)、網(wǎng)(mesh)、粉末顆粒(powderparticle)、線(thread)、珠(bead)、或纖維(fiber)的形式。所述基底可以含有或者是固體、半固體或凝膠狀物質(zhì)。如此，基底包括在水溶劑中基本上不溶的物質(zhì)，例如脂溶性脂質(zhì)諸如脂質(zhì)體。
[0057]所述MDCMC可以是炎性疾患、自身免疫性疾病、癌癥、骨密度病癥、急性感染、或慢性感染。
[0058]它可以是血液免疫學(xué)過程(hematoimmunological process),例如特發(fā)性血小板減少性紫癜(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura)、同種免疫性/自身免疫性血小板減少(alloimmune/autoimmune thrombocytopenia)、獲得性免疫性血小板減少(Acquired immune thrombocytopenia)、自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥(Autoimmuneneutropenia)、自身免疫性溶血性貧血(Autoimmune hemolytic anemia)、細(xì)小病毒 B19相關(guān)紅細(xì)胞再生障礙(Parvovirus B19_associated red cell aplasia)、獲得性抗因子VIII自身免疫(Acquired antifactor VIII autoimmunity)、獲得性馮.威利布蘭德病(acquired von Willebrand disease)(又叫獲得性血管性血友病)、未知意義的單克隆丙種球蛋白病和多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of UnknownSignificance)、敗血病(Sepsis)、再生障礙性貧血(Aplastic anemia)、純紅細(xì)胞再生障礙(pure red cell aplasia)、戴-布二氏貧血(Diamond-Blackfan anemia)(又叫先天性再生障礙性貧血)、新生兒溶血病(hemolytic disease of the newborn)、免疫介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞減少癥(Immune-mediated neutropenia)、血小板輸注不應(yīng)性(refractorinessto platelet transfusion)、新生兒輸血后紫癒(neonatal post-transfusion purpura)、溶血性尿毒癥綜合征(hemolytic uremic syndrome)、系統(tǒng)性血管炎(systemicVasculitis)、血栓性血小板減少性紫癒(Thrombotic thrombocytopenic purpura)、或埃文斯綜合征(Evan’ s syndrome)。
[0059]或者，所述MDCMC可以是神經(jīng)免疫學(xué)過程(neuroimmunological process)，例如格-巴二氏綜合征(Guillain-Barr6 syndrome)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病(Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradiculoneuropathy)、副蛋白血癥IgM脫髓鞘性多神經(jīng)病(Paraproteinemic IgM demyelinating Polyneuropathy)、朗-伊二氏肌無力綜合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、重癥肌無力(Myasthenia gravis)、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病(Multifocal Motor Neuropathy)、與抗GMl抗體有關(guān)的下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)兀綜合征(Lower Motor Neuron Syndrome associated with ant1-GMlantibodies)、脫髓鞘(Demyelination)、多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis)和視神經(jīng)炎(opticneuritis)、僵人綜合征(Stiff Man Syndrome)、具有抗Yo抗體的副腫瘤性小腦變性(Paraneoplastic cerebellar degeneration with ant1-Yo antibodies)、副月中瘤性腦脊髓炎(paraneoplastic encephalomyelitis)、具有抗 Hu 抗體的感覺神經(jīng)病(sensoryneuropathy with ant1-Hu antibodies)、痛癇(epilepsy)、腦炎(Encephalitis)、脊髓炎(Myelitis)、脊髓病尤其是與人T細(xì)胞親淋巴病毒-1有關(guān)的(Myelopathy especiallyassociated with Human T-cell lymphotropic virus-1)、自身免疫性糖尿病神經(jīng)病變(Autoimmune Diabetic Neuropathy)、或急性特發(fā)性自主神經(jīng)異常神經(jīng)病(AcuteIdiopathic Dysautonomic Neuropathy)。
[0060] 所述MDCMC可以是風(fēng)濕性疾病過程(Rheumatic disease process)，例如川畸氏病(Kawasaki’ s disease)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、費(fèi)耳提氏綜合征(Felty，s syndrome)、ANCA 陽性血管炎(ANCA-positive Vasculitis)、白發(fā)性多肌炎(Spontaneous Polymyositis)、皮肌炎(Dermatomyositis)、抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome)、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus)、幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(Juvenileidiopathic arthritis)、雷諾氏(Raynaud’s)、CREST 綜合征(CREST syndrome)、或葡萄膜炎(Uveitis)ο
[0061]此外，所述MDCMC可以是皮膚免疫學(xué)疾病過程(dermatoimmunological diseaseprocess)，例如表皮壞死松解癥(Epidermal Necrolysis)、壞疽(Gangrene)、肉芽腫(Granuloma)、自身免疫性皮膚起泡疾病(Autoimmune skin blistering disease)包括尋常型天皰瘡(Pemphigus vulgaris)、大皰性類天皰瘡(Bullous Pemphigoid)、和落葉型天皰瘡(Pemphigus foliaceus)、白癜風(fēng)(Vitiligo)、鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal toxic shock syndrome)、硬皮病(Scleroderma)、系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis)包括彌漫性和局限性皮膚系統(tǒng)性硬化癥(diffuse and limitedcutaneous systemic sclerosis)、特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis)、或類固醇依賴性特應(yīng)性皮炎(steroid dependent Atopic dermatitis)。
[0062]此外，所述MDCMC可以是肌肉骨豁免疫學(xué)疾病(musculoskeletal immunologicaldisease)，例如包涵體肌炎(Inclusion Body Myositis)、壞死性筋膜炎(Necrotizingfasciitis)、炎性肌病(Inflammatory Myopathies)、肌炎(Myositis)、抗飾膠蛋白聚糖(BJ抗原)肌病(Ant1-Decorin (BJ antigen)Myopathy)、副腫瘤性壞死肌病(Paraneoplastic Necrotic Myopathy)、X 連鎖的形成空泡的肌病(X-linked VacuolatedMyopathy)、青霉胺誘發(fā)的多肌炎(Penacillamine-1nduced Polymyositis)、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis)、冠狀動(dòng)脈疾病(Coronary Artery Disease)、或心肌病(Cardiomyopathy)。
[0063]所述MDCMC還可以是胃腸免疫學(xué)疾病過程(gastrointestinal immunologicaldisease process)，例如惡性貧血(pernicious anemia)、自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎(autoimmune chronic active hepatitis)、原發(fā)性膽汁性月干硬化(primary biliarycirrhosis)、乳糜?寫(Celiac disease)、皰疫樣皮炎(dermatitis herpetiformis)、隱源性肝硬化(cryptogenic cirrhosis)、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(Reactive arthritis)、克羅恩氏病(Crohn，s disease)、惠普爾氏病(Whipple，s disease)、潰痕性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis)、或硬化性膽管炎(sclerosing cholangitis)。
[0064]所述MDCMC可以是例如移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease)、抗體介導(dǎo)的移植物排斥(Antibody-mediated rejection of the graft)、骨髓移植后排斥(Post-bone marrow transplant rejection)、傳染病后炎癥(Post-1nfectiousdisease inf lammation)、淋巴瘤(Lymphoma)、白血病(Leukemia)、瘤形成(Neoplasia)、哮喘(Asthma)、具有抗β細(xì)胞抗體的I型糖尿病(TypelDiabetes mellitus withant1-beta cell antibodies)、斯耶格倫氏綜合征(Sjogren’ s syndrome)、混合性結(jié)締組織病(Mixed Connective Tissue Disease)、阿狄森氏病(Addison，s disease)、伏格特-小柳-原田三氏綜合征(Vogt-Koyanag1-Harada Syndrome)、膜性增生性腎小球腎炎(Membranoproliferative glomerulonephritis)、古德帕斯丘氏綜合征(Goodpasture’ s syndrome)、格雷夫斯氏病(Graves’ disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、韋格納氏肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)、微多動(dòng)脈炎(micropolyarterit)、丘-施二氏綜合征(Churg-Strauss syndrome)、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(Polyarteritis nodosa)或多系統(tǒng)器官衰竭(Multisystem organ failure) 0
[0065]在所述MDCMC是癌癥的情況中，它可以是纖維肉瘤(f ibrosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、脂肪肉瘤(Iiposarcoma)、軟骨肉瘤(chondrosarcoma)、成骨肉瘤(osteogenic sarcoma)、脊索癌(chordoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、內(nèi)皮肉瘤(endotheliosarco ma)、淋巴管肉瘤(Iymphangiosarcoma)、淋巴管內(nèi)皮肉瘤(Iymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤(synovioma)、間皮瘤(mesothelioma)、尤因氏瘤(Ewing’ s tumor)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、結(jié)腸癌(colon carcinoma)、膜腺癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breast cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cellcarcinoma)、基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma)、腺癌(adenocarcinoma)、汗腺癌(sweatgland carcinoma)、皮月旨腺癌(sebaceous gland carcinoma)、乳頭狀癌(papillarycarcinoma)、乳頭狀腺癌(papillary adenocarcinomas)、囊腺癌(cystadenocarcinoma)、髓樣癌(medullary carcinoma)、支氣管癌(bronchogenic carcinoma)、腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma)、肝瘤(hepatoma)、膽管癌(bile duct carcinoma)、域毛膜癌(choriocarcinoma)、精原細(xì)胞瘤(seminoma)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms’ tumor)、宮頸癌(cervical cancer)、睪丸腫瘤(testicular tumor)、月市癌(lung carcinoma)、小細(xì)胞肺癌(small cell lung carcinoma)、膀胱癌(bladdercarcinoma)、上皮癌(epithelial carcinoma)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)、星形細(xì)胞瘤(astrocytoma)、髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)、顏咽管瘤(craniopharyngioma)、室管膜瘤(ependymoma)、松果體瘤(pinealoma)、成血管細(xì)胞瘤(hemangioblastoma)、聽神經(jīng)瘤(acoustic neuroma)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(oligodendroglioma)、腦脊膜瘤(meningioma)、黑素瘤(melanoma)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma)、白血病(leukemia)、淋巴瘤(lymphoma)、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom’ s macroglobulinemia)、骨髓/脊髓發(fā)育不良疾病(mye lodysp lasti c disease)、重鏈病(heavy chain disease)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumor)、和施旺細(xì)胞瘤(Schwanoma)。
[0066]在所述MDCMC是骨密度病癥的情況中，它可以是骨質(zhì)疏松(osteoporosis)、骨質(zhì)減少(osteopenia)、骨硬化癥(osteopetrosis)、特發(fā)性低促性腺素性性腺功能減退癥(idiopathic hypogonado trop i c hypogonadism)、神經(jīng)性厭食(anorexia nervosa)、不愈合性骨折(non-healing fracture)、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(post-menopausal osteoporosis)、維生素D缺乏或過量(Vitamin D deficiency or excess)、原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁腺功能允進(jìn)(primary or secondary hyperparathyroidism)、甲狀腺疾病(thyroid disease)、或二勝酸鹽毒性(bisphosphonate toxicity) ?
[0067]在所述MDCMC是急性感染的情況中，它可以是:真菌病癥，包括念珠菌病(Candidiasis)、念珠菌血癥(Candidemia)、或曲霉病(Aspergillosis);細(xì)菌病癥，包括葡萄球菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、鏈球菌皮膚和口咽疾患，或革蘭氏陰性敗血癥；分支桿菌感染，包括結(jié)核病(tuberculosis);病毒感染，包括單核細(xì)胞增多癥(mononucleosis)、呼吸道合胞體病毒感染、或帶狀皰疹感染；寄生蟲感染包括瘧疾(malaria)、血吸蟲病(schistosomiasis)、或維蟲病(trypanosomiasis)。
[0068]在所述MDCMC是慢性感染的情況中，它可以是甲真菌病(onchyomycosis, onychomycosis);細(xì)菌病癥，包括幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)；分支桿菌感染，包括結(jié)核??；病毒感染，包括埃巴病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、或單純皰疹感染；或寄生蟲感染，包括瘧疾 或血吸蟲病。
[0069]在第十四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，其含有或者是可植入的或可附著的醫(yī)學(xué)裝置和與其結(jié)合的Fe試劑。
[0070]在第十五個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其含有可植入的或可附著的醫(yī)學(xué)裝置和Fe試劑。在這兩個(gè)實(shí)施方案中，所述可植入的或可附著的醫(yī)學(xué)裝置和所述Fe試劑可以是那些在本文中所敘述的之任一種。試劑盒可以進(jìn)一步含有合適的容器。
[0071]本發(fā)明的別的優(yōu)點(diǎn)和特征從以下的詳述、圖和實(shí)施例(它們例示本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案)看會(huì)是顯而易見的。
[0072]上述內(nèi)容已經(jīng)相當(dāng)廣泛地概述了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，以便可以更好地理解本發(fā)明隨后的詳述。下文會(huì)描述本發(fā)明的別的特征和優(yōu)點(diǎn)，它們形成本發(fā)明的權(quán)利要求的主題。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可以容易地利用所公開的概念和具體的實(shí)施方案作為基礎(chǔ)來改良或設(shè)計(jì)用于實(shí)施本發(fā)明相同目的的其它結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)的是，此類等同的構(gòu)建體不背離如所附權(quán)利要求書中所提出的本發(fā)明的精神和范圍。在結(jié)合附圖考慮時(shí)會(huì)更好地從以下描述理解被認(rèn)為是本發(fā)明特征性的新特性(其構(gòu)造和操作方法二者)以及其它的目的和優(yōu)點(diǎn)。然而，要明確理解的是，僅出于例示和描述的目的而提供每幅圖，并且不意圖解釋為本發(fā)明的限制。
[0073]附圖簡述
[0074]圖1A以示意圖形式顯示了一種來自IgGl的天然Fe片段單體結(jié)構(gòu)，其中鉸鏈域連接CH2域連接CH3域；圖1B顯示了自兩個(gè)聯(lián)合的Fe片段單體形成的自聚集的、天然IgGlFc片段。
[0075]圖1C以示意圖形式顯示了一種來自IgG3的天然Fe片段單體結(jié)構(gòu)，其中鉸鏈域連接CH2域連接CH3域；圖1D顯示了自兩個(gè)聯(lián)合的Fe片段單體形成的自聚集的、天然IgG3Fc片段。
[0076]圖2A和圖2B顯示了圖1B中所顯示的天然Fe片段結(jié)構(gòu)的更高階聚集物。Fe片段可以天然多聚化成二聚物的二聚物(即四聚物)或甚至更高階多聚體聚集物。
[0077]圖3A顯示了具有與Fe片段在Fe片段的鉸鏈處連接的天然Fab片段的天然IgGl抗體的示意圖；圖3B顯示了類似的IgG3結(jié)構(gòu)。
[0078]圖4A顯不了一種Stradomer單體，其由兩個(gè)IgGlFc域單體串聯(lián)構(gòu)成；圖4B顯不了一種備選的Stradomer單體結(jié)構(gòu),其具有串聯(lián)連接的IgGlFc_IgG3Fc_IgE Fe。
[0079]圖5A和圖5B顯不了圖4A和圖4B的Stradomer單體由于構(gòu)件Fe域單體的固有能力而自二聚化成串聯(lián)Stradomer。
[0080]圖6A顯示了含有IgGlFc-1gGl (鉸鏈-CH2)的Stradomer單體；圖6B顯示了含有IgGl (鉸鏈-CH2) -1gG3 (鉸鏈-CH2) -1gE (鉸鏈-CH2)衍生序列的 Stradomer。
[0081]圖7A和圖7B顯示了圖6A和圖6B的Stradomer單體由于構(gòu)件Fe域的固有能力而自二聚化成串聯(lián)Stradomer。
[0082]圖7C 顯示了含有 IgE (鉸鏈)-1gGlFc-1gGl (鉸鏈 _CH2) -1gE (CH3)的串聯(lián)Stradomer。圖 7D 顯不了含有 IgG3Fc_IgGlFc 的串聯(lián) Stradomer。
[0083]圖8A顯不了含有Fab及串聯(lián)Stradomer結(jié)構(gòu)的Stradobody構(gòu)建體，其中每個(gè)Stradomer單體含有兩個(gè)IgGlCH2_CH3衍生的Fe域單體；圖8B顯示了如8A中的Stradobody構(gòu)建體，但是其中Stradomer結(jié)構(gòu)含有IgGlFc連接IgG3Fc連接IgE Fe。
[0084]圖9A 顯示了 IgGlFc-1gGl (鉸鏈 _CH2) Stradobody ;圖 9B 顯示了 IgGl (鉸鏈-CH2) -1gG3 (鉸鏈-CH2) -1gE (鉸鏈-CH2) 3-Stradobody。
[0085]圖1OA 顯示了 IgGl (鉸鏈-CH2)-1gG3CH3-1gM CH4Stradomer 單體和 J 鏈蛋白；圖1OB顯示了一種核心Stradomer,其基于圖1OA的Stradomer通過經(jīng)IgM CH4域?qū)鏈的聯(lián)合形成的五聚物。
[0086]圖1OC 顯示了 IgGlFc-1gGlFc-1gM CH4Stradomer 單體和 J 鏈蛋白；圖1OD 顯示了一種核心Stradomer,其基于圖1OC的Stradomer通過經(jīng)IgM CH4域?qū)鏈的聯(lián)合形成的五聚物。
[0087]圖1lA 顯示了 IgGlFc-1gGl (鉸鏈-CH2) Stradomer 單體。圖1lB 展示了圖1lA 中的Stradomer單體如何能自二聚化以形成串聯(lián)Stradomer。圖1lC展示了圖1lA中的相同Stradomer單體如何能使單體Fe域與另一個(gè)Stradomer單體上的相同或相似Fe域單體排列，但是不像自二聚物那樣，由此形成由與自二聚物相同的Stradomer單體構(gòu)成但具有拉鏈效應(yīng)結(jié)構(gòu)的Stradomer。
[0088]圖12A 顯不了 IgG3Fc_IgGlFc Stradomer 單體。圖 12B 顯不了添加第二個(gè) IgG3Fc接著進(jìn)行自二聚化能形成分支結(jié)構(gòu)化IgG3Fc-1gGlFc_IgG3Fc Stradomer。
[0089]圖 13A 顯示了 IgE CH2-1gGlFc_IgGl (鉸鏈-CH2)-1gE CH4Stradomer 單體。圖13B顯示了圖13A單體的自二聚物，并突出顯示了所形成的兩個(gè)Fe Y R結(jié)合位點(diǎn)。
[0090]圖14A顯示了由通過接頭連接的兩個(gè)IgGlFc域構(gòu)成的Stradomer。圖14B顯示了由通過接頭連接的兩個(gè)串聯(lián)Stradomer (具體地,在每種情況中是2 (IgGlFc) Stradomer)構(gòu)成的 Stradomer。
[0091]圖15中的A顯示了人IgGlFc片段的核酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ ID NO: 2)序列。圖15中的B顯示了人IgG2Fc片段的核酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸(SEQ ID NO:4)序列。圖15中的C顯示了人IgG3Fc片段的核酸(SEQ ID NO:5)和氨基酸(SEQ ID NO:6)序列。圖15中的D顯示了人IgG4Fc片段的核酸(SEQ ID NO:7)和氨基酸(SEQ ID NO:8)序列。
[0092] 圖16顯示了包含{IgK信號(hào)序列-1gGlFc片段-1gGlFc片段}的構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO: 17)和氨基酸(SEQ ID NO: 18)序列。IgK信號(hào)的氨基酸序列以粗體顯示。第一個(gè)IgGlFc片段的氨基酸序列標(biāo)有單下劃線。第二個(gè)IgGlFc片段的氨基酸序列標(biāo)有雙下劃線。標(biāo)有星號(hào)的絲氨酸和賴氨酸是那些可以進(jìn)行突變以改變Fe Y受體結(jié)合的氨基酸。
[0093]圖17顯示了包含{限制酶位點(diǎn)-1gK信號(hào)序列-限制酶位點(diǎn)-1gGl (鉸鏈-CH2-CH3)-限制酶位點(diǎn)-表位標(biāo)簽(V5和His)-終止}的構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO: 19)和氨基酸(SEQ ID NO:20)序列。IgK信號(hào)的氨基酸序列以粗體顯示。IgGlFc片段的氨基酸序列標(biāo)有單下劃線。V5標(biāo)簽的氨基酸序列標(biāo)有標(biāo)有虛線的下劃線。His標(biāo)簽的氨基酸序列標(biāo)有下劃線且以粗體顯示。
[0094]圖18顯示了包含{限制酶位點(diǎn)-1gK信號(hào)-限制酶位點(diǎn)-1gGl (鉸鏈-CH2-CH3)-XbaI 位點(diǎn)-1gGl (鉸鏈-CH2-CH3)-終止}的構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO: 21)和氨基酸(SEQ ID NO:22)序列。IgK信號(hào)的氨基酸序列以粗體顯示。第一個(gè)IgGlFc片段的氨基酸序列標(biāo)有單下劃線。第二個(gè)IgGlFc片段的氨基酸序列標(biāo)有雙下劃線。
[0095]圖19顯示了包含{限制酶位點(diǎn)-1gK信號(hào)-限制酶位點(diǎn)-1gGl (鉸鏈-CH2-CH3) -XbaI位點(diǎn)-1gGl (鉸鏈-CH2-CH3)-限制酶位點(diǎn)-表位標(biāo)簽(V5和His)-終止}的構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO:23)和氨基酸(SEQ ID NO:24)序列。IgK信號(hào)的氨基酸序列以粗體顯示。第一個(gè)IgGlFc片段的氨基酸序列標(biāo)有單下劃線。第二個(gè)IgGlFc片段的氨基酸序列標(biāo)有雙下劃線。V5標(biāo)簽的氨基酸序列標(biāo)有虛線的下劃線。His標(biāo)簽的氨基酸序列標(biāo)有下劃線且以粗體顯示。
[0096]圖20中的A顯示了 FcR Y IIIa的N端信號(hào)序列的核酸(SEQ ID NO: 31)和氨基酸(SEQ ID NO:32)序列，其中苯丙氨酸(F)多態(tài)性以粗體顯示且標(biāo)有下劃線?？勺兊暮怂嵋惨源煮w顯示且標(biāo)有下劃線。圖20中的B顯示了 FcRy IIIa的N端信號(hào)序列的核酸(SEQ IDNO:33)和氨基酸(SEQ ID NO:34)序列，其中纈氨酸(V)多態(tài)性以粗體顯示且標(biāo)有下劃線?？勺兊暮怂嵋惨源煮w顯示且標(biāo)有下劃線。兩種構(gòu)建體都含有供純化用的C-端六His標(biāo)簽。
[0097]圖21顯示了包含{限制酶位點(diǎn)-1gK信號(hào)EcoRV位點(diǎn)_IgG3(鉸鏈-CH2-CH3) -1gGl (鉸鏈-CH2-CH3)-限制酶位點(diǎn)-表位標(biāo)簽(V5和His)-終止}的構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO:25)和氨基酸(SEQ ID NO:26)序列。IgK信號(hào)的氨基酸序列以粗體顯示。IgG3Fc片段的氨基酸序列標(biāo)有單下劃線。IgGlFc片段的氨基酸序列標(biāo)有雙下劃線。V5標(biāo)簽的氨基酸序列標(biāo)有虛線的下劃線。His標(biāo)簽的氨基酸序列標(biāo)有下劃線且以粗體顯示。
[0098]圖22顯示了包含{限制酶位點(diǎn)-1gK信號(hào)-EcoRV位點(diǎn)-1gE (CH2) -1gGl (鉸鏈-CH2-CH3) -1gGl (鉸鏈-CH2) -1gE (CH4)-終止}的構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO: 27)和氨基酸(SEQ ID NO:28)序列。IgK信號(hào)的氨基酸序列以粗體顯示。IgE(CH2)域的氨基酸序列標(biāo)有單下劃線。IgGl (鉸鏈-CH2-CH3)域的氨基酸序列標(biāo)有雙下劃線。IgGl (鉸鏈-CH2)域的氨基酸序列標(biāo)有虛線的下劃線。IgE(CH4)域的氨基酸序列標(biāo)有波形線的下劃線。
[0099]圖23中的A顯示了 Fe片段，并展示了此類Fe片段由兩個(gè)Fe片段單體構(gòu)成，并進(jìn)一步包含F(xiàn)e域(虛線圓圈)和Fe部分域(鉸鏈、CH2和CH3，如標(biāo)示的)。圖23中的B顯示了串聯(lián)Stradomer的組成，其由通過Stradomer單體間連接相連接的兩個(gè)Stradomer單體構(gòu)成。串聯(lián)Stradomer包含至少兩個(gè)Fe域(如虛線圓圈所標(biāo)示的),并且任選地，可以包含域連接區(qū)。圖23中的C顯示了核心Stradomer的組成,其包含核心模塊,各含有至少一個(gè)Fe域的核心Stradomer單元與該核心模塊結(jié)合。核心Stradomer單元可以是Fe片段、串聯(lián)Stradomer或簇Stradomer單元。圖23中的D顯示了簇Stradomer的組成,其包含多聚化的簇Stradomer單元,它們各具有多聚化區(qū)和含有至少一個(gè)Fe域的區(qū)域。簇Stradomer單元可以是Fe片段或串聯(lián)Stradomer。多聚化區(qū)一旦進(jìn)行多聚化便形成簇Stradomer的頭部。簇Stradomer的腿部是由簇Stradomer單元中在空間上比簇Stradomer的多聚化頭部受約束少的Fe域區(qū)域形成的。
[0100]圖24顯示了表3中所列出的Stradomer的氨基酸序列。
[0101]圖25顯示了人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的Fe部分域單體(鉸鏈、CH2和CH3)的氨基酸序列(Kabat, EA, ffu, TT, Perry, HM, Gottesman, KS 和 Foeller, C.1991.Sequences of proteins of immunological interest 第 5 版 US Public HealthServices, NIH, Bethesda)。
[0102]發(fā)明詳述
[0103]用于理性分子設(shè)計(jì)本文中所描述的hIVIG替換化合物的辦法包括免疫學(xué)活性生物模擬物的重組和/或生化創(chuàng)建。在優(yōu)選的方法中，體外篩選這些替換化合物以評(píng)估每種替換化合物在結(jié)合Fe Y受體和調(diào)控免疫功能方面的效率。選擇特定的替換化合物以進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)證實(shí)和劑量/施用優(yōu)化。替換化合物具有用于治療例如自身免疫性疾病、炎性疾病、骨質(zhì)疏松、和癌癥的效用。下文詳細(xì)描述了每個(gè)方面以及具體的例示性實(shí)施方案。
[0104]如本文中所使用的，在與權(quán)利要求書和/或說明書中的術(shù)語“包含”結(jié)合使用時(shí)使用單詞“一個(gè)”或“一種”可以指“一個(gè)/種”，但是它也與“一個(gè)/種或多個(gè)/種”、“至少一個(gè)/種”、和“一個(gè)/種或超過一個(gè)/種”的意義一致。
[0105]如本文中所使用的，術(shù)語“生物模擬物”、“生物模擬物分子”、“生物模擬物化合物”及相關(guān)術(shù)語指模擬另一種化合物(諸如合并的hIVIG、單克隆抗體或抗體的Fe片段)之功能的人造化合物?！吧飳W(xué)活性”生物模擬物指擁有與其天然存在的對(duì)應(yīng)物相同或基本上類似的生物學(xué)活性的化合物?！懊庖邔W(xué)活性”生物模擬物指展現(xiàn)出與天然存在的免疫學(xué)活性分子諸如抗體、細(xì)胞因子、白介素及本領(lǐng)域中已知的其它免疫學(xué)分子相同或基本上類似的免疫學(xué)活性的生物模擬物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物模擬物指Stradomer和Stradobody,如本文中所定義的。[0106]本發(fā)明的免疫學(xué)活性生物模擬物被設(shè)計(jì)成擁有IgG Fe域的一種或多種免疫調(diào)控活性，而且至少具有⑴能夠結(jié)合Fe Y R (包括Fe yR1、Fc yRI1、Fc YRIII和Fe YRIV)的第一 Fe 域，和(ii)能夠結(jié)合 Fe YR (包括 Fe yR1、Fc yRI1、Fc YRIII 和 Fe yRIV)的第二Fe域。
[0107]以下段落定義本發(fā)明的生物模擬物的建筑塊(在結(jié)構(gòu)和功能兩方面)，然后定義生物模擬物自身。然而，首先有幫助的是注意到，如上文所指明的，本發(fā)明的生物模擬物之每一種具有至少兩個(gè)Fe域。在最低限度上，F(xiàn)e域是包含兩條進(jìn)行聯(lián)合以形成功能性Fe Y受體結(jié)合位點(diǎn)的肽鏈或臂(單體)的二聚體多肽(或較大多肽的二聚體區(qū))。因此，一般而言，本文中所討論的各片段和域的功能性形式以二聚體(或多聚體)形式存在。本文中所討論的各片段和域的單體是必須與第二條鏈或臂聯(lián)合以形成功能性二聚體結(jié)構(gòu)的單鏈或臂。
[0108]Fe 片段
[0109]“Fe片段”指如下的本領(lǐng)域術(shù)語，其用于描述常規(guī)地在免疫球蛋白的羧基端找到的蛋白質(zhì)區(qū)或蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)(參見圖3A-3B)。可以經(jīng)由使用木瓜蛋白酶消化來將Fe片段與單克隆抗體的Fab片段分離，所述木瓜蛋白酶消化是不完全且未完成的方法(參見Mihaesco C和 Seligmann M.Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins.Journal of Experimental Medicine,第 127 卷，431-453 (1968) )。Fe 片段連同 Fab 片段(含有抗體結(jié)合域)構(gòu)成全抗體(這里指完整抗體)。Fe片段由抗體重鏈的羧基端部分構(gòu)成。Fe片段中的每條鏈的長度在約220-265個(gè)氨基酸之間，并且這些鏈通常是經(jīng)由二硫鍵相連接的。Fe片段通常含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)折疊或功能性亞域。具體地，F(xiàn)e片段包含F(xiàn)e域，其在本文中定義為能結(jié)合Fe Y受體的最低限度結(jié)構(gòu)(參見例如圖1B和圖1D)。分離的Fe片段由二聚化的兩個(gè)Fe片段單體(例如抗體重鏈的兩個(gè)羧基端部分；本文中進(jìn)一步定義的)構(gòu)成。在兩個(gè)Fe片段單體聯(lián)合時(shí)，所得的Fe片段具有Fe Y受體結(jié)合活性。
[0110]Fe部分片段
[0111]“Fe部分片段”指包含小于抗體整個(gè)Fe片段，但保留足以具有與Fe片段相同活性(包括Fe Y受體結(jié)合活性)的結(jié)構(gòu)的域。因此，F(xiàn)e部分片段可以缺乏部分或整個(gè)鉸鏈區(qū)、部分或整個(gè)CH2域、部分或整個(gè)CH3域、和/或部分或整個(gè)CH4域，這取決于衍生該Fe部分域的抗體的同種型。Fe部分片段的例子包括如下分子，其包含IgG3的上部、核心和下部鉸鏈區(qū)加上CH2 域(Tan, LK, Shopes, RJ, Oi, VT和Morrison, SL, Influence of the hinge regionon complement activation, Clq binding, and segmental flexibility in chimerichuman immunoglobulins, Proc Natl Acad Sci USA.1990January; 87 (I): 162-166)。如此,在此例子中，F(xiàn)e部分片段缺乏IgG3Fc片段中存在的CH3域。Fe部分片段由兩個(gè)Fe部分片段單體構(gòu)成。如本文中進(jìn)一步定義的，在兩個(gè)此類Fe部分片段單體聯(lián)合時(shí)，所得的Fe部分片段具有Fe Y受體結(jié)合活性。
[0112]Fe 域
[0113]如本文中所使用的，“Fe域”描述能結(jié)合Fe Y受體或能被Fe Y受體結(jié)合的最低限度區(qū)域(在較大多肽的語境中)或最小的蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)(在分離的蛋白質(zhì)的語境中)。在Fe片段和Fe部分片段兩者中，F(xiàn)e域指容許所述分子與Fe Y受體結(jié)合的最低限度結(jié)合區(qū)。雖然可以將Fe域限于被Fcy受體結(jié)合的離散多肽，但是也會(huì)清楚的是，F(xiàn)e域可以是部分或整個(gè)Fe片段以及部分或整個(gè)Fe部分片段。在術(shù)語“Fe域”在本發(fā)明中使用時(shí)，它會(huì)被技術(shù)人員承認(rèn)為超過一個(gè)Fe域的意義。Fe域由兩個(gè)Fe域單體構(gòu)成。如本文中進(jìn)一步定義的，在兩個(gè)此類Fe域單體聯(lián)合時(shí)，所得的Fe域具有Fe Y受體結(jié)合活性。如此，F(xiàn)e域指在功能上能結(jié)合Fe Y受體的二聚體結(jié)構(gòu)。
[0114]Fe部分域
[0115]如本文中所使用的，“Fe部分域”描述Fe域的一部分。Fe部分域包括不同免疫球蛋白類和亞類的各重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(例如CH1、CH2、CH3和CH4域)和鉸鏈區(qū)。如此，本發(fā)明的 Fe 部分域包括 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD 和 IgE 的 CHl 域，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD 和 IgE 的 CH2 域，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD 和 IgE 的 CH3 域，IgM 和 IgE 的 CH4 域，和 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE的鉸鏈區(qū)。本發(fā)明的Fe部分域可以進(jìn)一步包含超過一個(gè)這些域和鉸鏈的組合。然而，本發(fā)明的各Fe部分域及其組合缺乏結(jié)合FcyR的能力。因此，F(xiàn)e部分域及其組合包含小于Fe域。可以將Fe部分域連接在一起以形成具有Fe Y受體結(jié)合活性的肽，如此形成Fe域。在本發(fā)明中，F(xiàn)e部分域與Fe域一起作為建筑塊使用以創(chuàng)建本發(fā)明的生物模擬物，如本文中所定義的。每個(gè)Fe部分域由兩個(gè)Fe部分域單體構(gòu)成。在兩個(gè)此類Fe部分域單體聯(lián)合時(shí)，形成Fe部分域。
[0116]如上文所指明的，F(xiàn)e片段、Fe部分片段、Fe域和Fe部分域之每一種是二聚體蛋白質(zhì)或域。如此，這些分子之每一種由進(jìn)行聯(lián)合以形成二聚體蛋白質(zhì)或域的兩個(gè)單體構(gòu)成。雖然上文討論了二聚體形式的特征和活性，但以下討論單體肽。
[0117]Fe片段單體
[0118] 如本文中所使用的，“Fe片段單體”指在與另一個(gè)Fe片段單體聯(lián)合時(shí)構(gòu)成Fe片段的單鏈蛋白質(zhì)。如此，F(xiàn)e片段單體指抗體重鏈之一中構(gòu)成全抗體之Fe片段的羧基端部分(例如，重鏈中包括IgG的鉸鏈區(qū)、CH2域和CH3域的連續(xù)部分)(參見圖1A和圖1C))。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e片段單體在最低限度上包含鉸鏈區(qū)的一條鏈(鉸鏈單體)、CH2域的一條鏈(CH2域單體)和CH3域的一條鏈(CH3域單體)，它們被連續(xù)連接以形成肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e片段單體至少包含鉸鏈區(qū)的一條鏈、CH2域的一條鏈、CH3域的一條鏈、和CH4域的一條鏈(CH4域單體),它們被連續(xù)連接以形成肽。[0119]Fe域單體
[0120]如本文中所使用的，“Fe域單體”描述在與另一個(gè)Fe域單體聯(lián)合時(shí)構(gòu)成能結(jié)合Fe Y受體的Fe域的單鏈蛋白質(zhì)。兩個(gè)Fe域單體的聯(lián)合創(chuàng)建一個(gè)Fe域。單獨(dú)的Fe域單體(僅包含F(xiàn)e域的一側(cè))不能結(jié)合Fe Y受體。
[0121]Fe部分域單體
[0122]如本文中所使用的，“Fe部分域單體”描述在與另一個(gè)Fe部分域單體聯(lián)合時(shí)構(gòu)成Fe部分域的單鏈蛋白質(zhì)。圖25中顯示了 IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的Fe部分域鉸鏈、CH2和CH3單體的氨基酸序列。兩個(gè)Fe部分域單體的聯(lián)合創(chuàng)建一個(gè)Fe部分域。
[0123]Stradomer
[0124]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物模擬物包括Stradomer。Stradomer是能夠結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)Fe Y受體的生物模擬物化合物(參見例如圖13B)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的Stradomer來結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞諸如NK細(xì)胞和未成熟的樹突細(xì)胞及其它單核細(xì)胞衍生細(xì)胞上的Fe Y受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)cy受體是低親和力Fe Y受體。Stradomer可以具有4種不同物理構(gòu)象:串聯(lián)、簇、核心或Fe片段，在以下段落中討論其中每一種。會(huì)明顯的是，在多種Stradomer構(gòu)象的構(gòu)建中使用上文所討論的Fe片段、Fe部分片段、Fe域和Fe部分域。此外，首先生成，然后自我聯(lián)合以形成二聚體結(jié)構(gòu)(其是本發(fā)明的Stradomer)的正是各Fe域單體和Fe部分域單體(也在上文討論的)。
[0125]串聯(lián) Stradomer
[0126]“串聯(lián)Stradomer”指由兩個(gè)在聯(lián)合時(shí)形成兩個(gè)或更多個(gè)Fe域的線性Stradomer單體構(gòu)成的二聚體多肽。Stradomer的Fe域僅在兩條肽鏈(Stradomer單體)聯(lián)合時(shí)才是功能性的(即，在單體狀態(tài)中是非功能性的)。如此，串聯(lián)Stradomer指能夠結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)Fcy受體的生物模擬物化合物。在不同實(shí)施方案中，串聯(lián)Stradomer可以具有2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)或更多個(gè)Fe域，以及Fe部分域。串聯(lián)Stradomer內(nèi)的Fe域(和Fe部分域)可以通過域連接相連,如本文中進(jìn)一步定義的。
[0127]如本文中所使用的，“Stradomer 二聚物”指特定形式的Stradomer,其僅由兩個(gè)Stradomer構(gòu)成。在一個(gè)實(shí)施方案中，Stradomer 二聚物是通過相關(guān)Stradomer單體的自我聚集形成的分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Stradomer 二聚物中的Stradomer單體經(jīng)由Stradomer單體間連接在物理上相連接,如本文中定義的。“多聚體Stradomer”由3個(gè)或更多個(gè)Stradomer構(gòu)成,其通過Stradomer單體的自我聚集,或經(jīng)由Stradomer單體間連接形成，如本文中所定義的。
[0128]Stradomer 單體
[0129]如本文中所使用的，術(shù)語“Stradomer單體”指在至少與第二 Stradomer單體聯(lián)合時(shí)形成包含至少兩個(gè)Fe域的多肽的單一、連續(xù)肽分子(參見例如圖6A-6B，圖12A)。雖然在優(yōu)選的實(shí)施方案中，串聯(lián)Stradomer由兩個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體構(gòu)成(參見例如圖5A、圖5B、圖7A、圖7B、圖7C、圖7D),串聯(lián)Stradomer也可以含有3個(gè)(參見圖11C)或更多個(gè)Stradomer單體?？梢酝ㄟ^Stradomer單體間連接來使Stradomer單體聯(lián)合以形成Stradomer,或者它們可以經(jīng)由自我聚集而形成Stradomer。 [0130]Stradomer單體可以具有如下氨基酸序列，其在與另一個(gè)Stradomer單體聯(lián)合以形成Stradomer時(shí)會(huì)形成I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)或更多個(gè)Fe域。Stradomer單體可以進(jìn)一步具有如下氨基酸序列,其在與另一個(gè)Stradomer單體聯(lián)合以形成Stradomer時(shí)會(huì)形成I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)或更多個(gè)Fe部分域。
[0131]可以僅從Stradomer單體分子的連續(xù)區(qū)域的羧基端至氨基端排列在Stradomer的語境中會(huì)形成Fe域和Fe部分域的Stradomer單體區(qū)域(參見例如圖4A-4B)?；蛘?可以經(jīng)由本文中稱作“域連接”的肽序列來連接Stradomer單體的連續(xù)區(qū)域。構(gòu)成Stradomer單體的特定Fe域單體和Fe部分域單體的排列不是至關(guān)重要的。然而，該排列必須容許兩個(gè)Stradomer單體聯(lián)合后形成兩個(gè)功能性Fe域。
[0132]在本發(fā)明的Stradomer的一個(gè)實(shí)施方案中，生成如下Stradomer單體,其在該肽的N端含有強(qiáng)烈結(jié)合自身的Fe域單體或Fe部分域單體(諸如單個(gè)或兩個(gè)末端IgE CH2域單體或部分IgG3鉸鏈域單體)，以分別創(chuàng)建Fe域或Fe部分域。這些Stradomer單體之每一個(gè)具有Fe域單體和/或部分Fe域單體的必要互補(bǔ)物以在形成Stradomer后結(jié)合兩個(gè)Fe Y受體。源自于此類Stradomer單體聯(lián)合的Stradomer是能夠結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)Fe Y受體的生物模擬物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，N端Fe域或Fe部分域含有額外的糖基化位點(diǎn)，諸如在IgE CH2域上存在的。[0133]作為一個(gè)闡明性的例子，技術(shù)人員會(huì)理解的是，可以如下構(gòu)建本發(fā)明的Stradomer分子，即制備編碼Fe域單體和Fe部分域單體的各種組合(但是是會(huì)形成最少兩個(gè)Fe域單體的組合)的多核苷酸分子?？梢詫⒋祟惗嗪塑账岱肿硬迦氡磉_(dá)載體中，所述表達(dá)載體可以用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌群體。然后可以通過在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌來生成Stradomer單體。然后Stradomer單體可以在Stradomer單體自我聚集后或者在使用Stradomer單體間連接進(jìn)行Stradomer單體聯(lián)合后形成功能性Stradomer。本發(fā)明包括經(jīng)由具有相同氨基酸序列的Stradomer單體、具有基本上類似的氨基酸序列的Stradomer單體、或具有不相似的序列的Stradomer單體的聯(lián)合形成的所有Stradomer。在后一種實(shí)施方案中，構(gòu)成Stradomer的Stradomer單體的氨基酸序列僅需要具有使得能形成兩個(gè)或更多個(gè)功能性Fe Y受體結(jié)合位點(diǎn)的相似性。
[0134]如上文所指明的，F(xiàn)e域可以以其結(jié)合Fe Y受體的能力在功能上限定。因此，基于構(gòu)成Fe域的Fe部分域，具體的Fe域氨基酸序列會(huì)有變化。然而，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH2域。在又一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2域和CH3域。在又一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2域、CH3域和CH4域。在又一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2域和CH4域。
[0135]域連梓
[0136]如上文所指明的，“域連接”指構(gòu)成本發(fā)明串聯(lián)Stradomer或Stradobody之各Stradomer單體之每一個(gè)的Fe域單體和/或Fe部分域單體間的肽連接。域連接可以是I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)氨基酸。域連接不在以其天然序列存在的Fe部分域單體間發(fā)生。即，在使用相連接的Fe域單體之天然連續(xù)部分(諸如IgG的鉸鏈區(qū)、CH2域和CH3域)的情況中，這些Fe部分域單體包含連續(xù)序列，并且這些元件間不需要域連接。比較而言，例如，在以不是天然存在的方式連接兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體或部分Fe域單體以形成各Stradomer單體時(shí)，可以使用域連接。一個(gè)例子會(huì)是兩個(gè)鉸鏈/CH2/CH3肽間的連接,倉Il建包含鉸鏈/CH2/CH3/L/鉸鏈/CH2/CH3的Stradomer的各Stradomer單體，其中“L”指域連接(參見例如圖4A，在那里所述域連接(未顯示)在IgGlCH3域和IgGl鉸鏈間發(fā)生)。在所描述的各種情況中，域連接可以是重鏈的天然存在部分的域連接，其連接抗體Fe域單體中的鉸鏈和CH域?；蛘?域連接可以是任何其它如下氨基酸序列,其提供各Stradomer單體的Fe域單體和部分Fe域單體間所需要的間隔和柔性，而且容許各Stradomer單體彼此配對(duì)以形成本發(fā)明的Stradomer。
[0137]技術(shù)人員會(huì)理解的是，域連接的身份并不特別重要，只要其容許兩個(gè)或更多個(gè)各Stradomer單體形成本發(fā)明的生物模擬物化合物，并且所得的化合物具有交聯(lián)超過一個(gè)FcyR的能力。預(yù)想的是，每種免疫學(xué)活性生物模擬物化合物會(huì)優(yōu)選在串聯(lián)Stradomer或Stradobody的每個(gè)Stradomer單體中含有至少一個(gè)域連接,其會(huì)發(fā)揮將免疫學(xué)活性生物模擬物的Fe域維持在受限的空間區(qū)域內(nèi)的功能，而且其會(huì)促進(jìn)Fe Y R活化活性，例如通過經(jīng)由與免疫學(xué)活性生物模擬物內(nèi)的Fe域的共結(jié)合聚集Fe Y R來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，域連接會(huì)容許與IgG分子鉸鏈域提供的構(gòu)象可變性相同或更大程度的構(gòu)象可變性。所有上文的連接是本文中公知的。
[0138]Stradomer單體間連接
[0139]本發(fā)明的生物模擬物化合物中找到的區(qū)別的連接是“ Stradomer單體間連接”，其在構(gòu)成本發(fā)明Stradomer和Stradobody的兩個(gè)或更多個(gè)各Stradomer單體間發(fā)生。域連接是用來將構(gòu)成生物模擬物化合物之各Stradomer單體的Fe域單體和部分Fe域單體彼此連接的短氨基酸序列，而Stradomer單體間連接用來連接構(gòu)成生物模擬物化合物的兩個(gè)或更多個(gè)各Stradomer單體。Stradomer單體間連接可以是能夠穩(wěn)定聯(lián)合各Stradomer單體的任何連接。在一些實(shí)施方案中，Stradomer單體間連接可以是Stradomer單體間的共價(jià)連接?；蛘?，Stradomer單體之間的Stradomer單體間連接可以是通過直接化學(xué)交聯(lián)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Stradomer單體結(jié)構(gòu)利用Fe域單體之間的天然自我聚集特性來創(chuàng)建自我聚集的Stradomer。在此類實(shí)施方案中，二硫鍵在各Stradomer單體間形成以形成Stradomer (參見例如圖5A,在那里Stradomer單體間連接(未顯示)用來連接Stradomer的兩個(gè)Stradomer單體個(gè)體)。二硫鍵在構(gòu)成生物模擬物分子的Fe域單體的半胱氨酸殘基之間形成，其使用存在于天然Fe域單體序列中的半胱氨酸殘基或通過定點(diǎn)誘變而摻入Fe域單體中的半胱氨酸殘基來實(shí)現(xiàn)。還可以使用此類天然自我聚集特性來形成Stradomer多聚體中各Stradomer單體之間的Stradomer單體間連接。備選的實(shí)施方案包括Stradomer單體間連接，在那里二硫鍵在經(jīng)由定點(diǎn)誘變而摻入構(gòu)成各Stradomer單體的氨基酸序列中的半胱氨酸殘基之間形成。
[0140]如上文所討論的,在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，形成Stradomer的Stradomer單體間連接是源自于Stradomer單體自我聚集的連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成Stradomer的兩個(gè)Stradomer單體是相同的肽，使得構(gòu)成Stradomer的兩個(gè)各Stradomer單體序列相同。然而，技術(shù)人員會(huì)理解，其它實(shí)施方案包括其中各個(gè)Stradomer單體在氨基酸序列上彼此不同的 Stradomer。
[0141] 兩個(gè)Stradomer單體能通過例如平行排列以使得配對(duì)在Stradomer單體中的相同F(xiàn)e部分域單體之間發(fā)生來形成Stradomer (參見例如圖5A-5B)。然而,本發(fā)明還包括配對(duì)在不相同的Fe部分域單體間發(fā)生的實(shí)施方案,和配對(duì)在Stradomer單體中相同的Fe部分域單體間發(fā)生但兩個(gè)Stradomer單體的排列有偏移的實(shí)施方案(參見圖11C)。
[0142]為了控制Stradomer單體的生成和自二聚化，可以使用“加帽區(qū)”。例如，Stradomer單體序列可以包含以下Fe部分域:IgE CH2/IgGl鉸鏈/IgGlCH2/IgGlCH3/IgGl鉸鏈/IgGlCH2/IgE CH4 (參見圖13A)，在那里IgE域充當(dāng)帽以阻止“拉鏈效應(yīng)”。拉鏈效應(yīng)能在Stradomer單體(參見圖11A)能自二聚化(參見圖11B)或者能不像自二聚物那樣但像平行交替的單體那樣排列自身(參見圖11C)時(shí)發(fā)生。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)理解的是，可以單獨(dú)或組合使用多種Fe部分域，諸如任何免疫球蛋白的鉸鏈或IgM或IgE的CH4域以在想要時(shí)指導(dǎo)Stradomer自二聚化和阻止拉鏈效應(yīng)。其它非串聯(lián)結(jié)構(gòu)可以含有分支分子(參見圖12B)，即兩個(gè)或更多個(gè)由接頭(諸如簡單的共價(jià)鍵、肽接頭、或非肽接頭)連接的平行排列的Stradomer (參見圖14A和圖14B)。
[0143]核心 Stradomer
[0144]“核心Stradomer”由與兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元結(jié)合的核心模塊構(gòu)成，其中每個(gè)核心Stradomer單元包含至少一個(gè)Fe域，由此創(chuàng)建能夠結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)Fe Y受體的生物模擬物化合物。Fe片段、Fe部分片段、串聯(lián)Stradomer或簇Stradomer單元可以各自獨(dú)立充當(dāng)核心Stradomer中的一個(gè)或兩個(gè)(若它們包含兩個(gè)Fe域的話)核心Stradomer單元，因?yàn)檫@些分子之每一種含有至少一個(gè)Fe域。如此,核心Stradomer可以包含與至少一個(gè)串聯(lián)Stradomer結(jié)合的核心模塊。
[0145]如本文中所使用的，核心Stradomer的核心模塊是可以與核心Stradomer單元連接或共價(jià)結(jié)合的任何物理結(jié)構(gòu)?？梢猿洚?dāng)核心模塊的優(yōu)選多肽包括匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白、牛血清清蛋白和卵清蛋白。可以通過許多化學(xué)品使用公知的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)此類核心模塊和核心Stradomer單兀(例如Fe片段、Fe部分片段、Fe域、串聯(lián)Stradomer和族Stradomer單元)之間的化學(xué)交聯(lián)。通常適合于在交聯(lián)中使用的例示性化學(xué)品包括戊二醛、碳二亞胺、琥珀酰亞胺酯(例如MBS、SMCC)、聯(lián)苯胺、高碘酸酯、異硫氰酸酯；ΡΕ0(聚乙烯)/PEG(聚乙二醇)間隔物諸如雙(NHS)PEO5、DFDNB (I，5-二氟-2，4-二硝基苯)；和胺反應(yīng)性同雙功能交聯(lián)劑，包括醛活化的右旋糖酐、辛二酸雙(磺基琥珀酰亞氨基)酯、雙[2-(琥珀酰亞氨基氧羰氧)乙基]砜、二亞氨基己二酸二甲酯二鹽酸鹽(Dimethyl adipimidate.2HC1)、二亞氨基庚二酸二甲酯二鹽酸鹽(Dimethyl pimelimidate.2HC1)、二亞氨基辛二酸二甲酯二鹽酸鹽(Dimethyl Suberimidate.2HC1)、戍二酸二琥拍酰亞氨基酯、二硫代雙(琥拍酰亞氨基)丙酸酯、辛二酸二琥珀酰亞氨基酯、酒石酸二琥珀酰亞氨基酯、3，3’ - 二硫代雙亞氨基丙酸二甲酯二鹽酸鹽、3，3’-二硫代雙(磺基琥珀酰亞氨基丙酸酯)、乙二醇雙[琥珀酰亞氨基琥珀酸酯]、乙二醇雙[磺基琥珀酰亞氨基琥珀酸酯]、β_[三(羥甲基)膦基]丙酸和氨基三乙酸三琥珀酰亞氨基酯。基于進(jìn)行組合以形成免疫學(xué)活性生物模擬物的含有Fe域的多肽的序列和選定的具體核心模塊，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)能夠選擇合適的交聯(lián)化學(xué)品和條件° 參見例如 Wong, Shan S.Chemistry of protein conjugation and cross-linking.Boca Raton:CRC Press, cl991(ISBN0849358868)。
[0146] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用連接(J)鏈多肽作為核心模塊。在使用J鏈作為核心模塊時(shí)，可以使用半胱氨酸橋來連接各核心Stradomer單元以形成核心Stradomer (參見圖10A-10D)。在核心Stradomer的一個(gè)實(shí)施方案中，含有末端IgM CH4域的串聯(lián)Stradomer (充當(dāng)核心Stradomer單元)與J鏈聯(lián)合以形成核心Stradomer。包含IgM CH4域?qū)е掳薋e部分域及J鏈的Stradomer自我聚集以形成能夠結(jié)合多個(gè)Fe Y受體的生物模擬物。另一種例示性的核心Stradomer是包含F(xiàn)e域(充當(dāng)核心Stradomer單元)的核心Stradomer，其中所述Fe域具有結(jié)構(gòu)IgG3鉸鏈/IgG3CH2/IgG3CH3/IgM CH4。此分子的構(gòu)件Fe域不能單獨(dú)結(jié)合超過一個(gè)Fe Y受體,但是整個(gè)結(jié)構(gòu)在構(gòu)件Fe域與J鏈聯(lián)合時(shí)能結(jié)合5個(gè)Fe Y受體。
[0147]在另一個(gè)實(shí)施方案中，核心模塊可以是非多肽實(shí)體。多種合適的組分可以在物理上與核心Stradomer單元聯(lián)合以生成免疫學(xué)活性生物模擬物?？梢允褂脽o毒珠、超分支聚合物(hyperbranched polymer)和樹狀聚物(dendrimer)、納米顆粒、和被FDA歸為“通常認(rèn)為安全”(Generally Regarded As Safe)的各種化合物(例如丙二醇、山梨糖醇、脂質(zhì)體和娃酸鈣)。參見例如 Nanoparticulates as Drug Carriers, VladimirP.Torchilin(編)，Imperial College Press(2006 年 9 月)ISBN:1860946305/ISBN-13:9781860946301。
[0148]本發(fā)明優(yōu)選的核心模塊包括珠、清蛋白、脂質(zhì)體、肽和聚乙二醇。
[0149]簾 Stradomer
[0150]“簇Stradomer”指具有有中心模塊“頭部”和兩個(gè)或更多個(gè)“腿部”的章魚樣形式的生物模擬物，其中每個(gè)腿部包含一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合至少一個(gè)Fe Y受體的Fe域，如此創(chuàng)建能夠結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)Fe Y受體的生物模擬物。每個(gè)簇Stradomer由超過一個(gè)二聚體蛋白質(zhì)(每個(gè)稱作“簇Stradomer單元”)構(gòu)成。每個(gè)簇Stradomer單元由多聚化的區(qū)域和包含至少一個(gè)功能性Fe域的“腿部”區(qū)域構(gòu)成。多聚化區(qū)一旦與另一個(gè)簇Stradomer單元的多聚化區(qū)進(jìn)行多聚化便創(chuàng)建簇Stradomer“頭部”。腿部區(qū)域能夠結(jié)合與每個(gè)腿部區(qū)域中存在有的Fe域一樣多的Fe Y受體。如此,簇Stradomer是能夠結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)Fe Y受體的生物模擬物化合物。
[0151]多聚化區(qū)可以是引起二聚體蛋白質(zhì)進(jìn)一步多聚化的肽序列，或者多聚化區(qū)可以是增強(qiáng)二聚體蛋白質(zhì)的多聚化的糖基化。肽多聚化區(qū)的例子包括IgG2鉸鏈、IgE CH2域、異亮氨酸拉鏈、和鋅指。糖基化對(duì)肽多聚化的影響在本領(lǐng)域中有充分的記載(例如Roleof Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand FactorProtein.Harvey R.Gralnick, SybiI B.Williams 和 Margaret E.Rick.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,第 80卷，第 9 期，[Part1:Biological Sciences] (1983 年 5 月 I 日)，第 2771 頁-第 2774頁;Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated byits glycosylation.Kimie Asanuma, Fumio Arisaka 和 Haruko Ogawa.1nternationalCongress Series Volumel223, 2001 年 12 月，第 97 頁-第 101 頁)。
[0152] 熟練技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可的是,簇Stradomer單元自身可以包含串聯(lián)Stradomer (含有兩個(gè)或更多個(gè)Fe域)及多聚化區(qū)。如此，簇Stradomer的“腿部”可以由本文中所討論的任何類型的串聯(lián)Stradomer和/或一個(gè)或多個(gè)IgGlFc片段和/或IgG3Fc片段和/或單一Fe域構(gòu)成。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可的是，可以修飾此類生物模擬物中的IgGlFc片段和IgG3Fc片段之每一個(gè)以包含來自任何免疫球蛋白的部分Fe片段。構(gòu)成簇Stradomer單元(如上文所指明的，其以兩個(gè)肽的二聚體聯(lián)合形式存在)的單體是“簇Stradomer單元單體”。已經(jīng)制備的例示性簇Stradomer是:IgE CH2/IgGl鉸鏈/IgGlCH2/IgGlCH3,其簇Stradomer單元在多聚化前不會(huì)結(jié)合超過一個(gè)低親和力Fcy受體。
[0153]本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可的是,在使用串聯(lián)Stradomer作為簇Stradomer的“腿部”時(shí)，每個(gè)“腿部”會(huì)能夠結(jié)合超過一個(gè)Fe Y受體(因?yàn)橹辽賰蓚€(gè)Fe域存在于串聯(lián)Stradomer中),如此創(chuàng)建能夠結(jié)合超過一個(gè)Fe Y受體的生物模擬物?？梢栽诎炔康膫€(gè)體簇Stradomer單元單體的末端放置Fe部分域、其它免疫球蛋白序列、和非免疫球蛋白序列以創(chuàng)建簇Stradomer，其中每個(gè)腿部具有優(yōu)選的空間接近性以增加它們結(jié)合一個(gè)或超過一個(gè)Fe Y受體的可用性。
[0154]多聚化區(qū)可以是引起肽進(jìn)行二聚化或多聚化的肽序列，并且包括IgG2鉸鏈、IgE CH2域、異亮氨酸拉鏈和鋅指。如本領(lǐng)域中知曉的是，人IgG2的鉸鏈區(qū)能形成共價(jià)二聚物(Yoo, E.M.等.J.1mmunol.170, 3134-3138(2003) ; Salfeld NatureBiotech.25，1369-1372(2007))。IgG2的二聚物形成是潛在地經(jīng)由IgG2鉸鏈結(jié)構(gòu)通過C-C鍵介導(dǎo)的(Yoo等2003)，提示單獨(dú)的鉸鏈結(jié)構(gòu)能介導(dǎo)二聚物形成。如此，具有IgG2鉸鏈(如此充當(dāng)簇Stradomer單元)的串聯(lián)Stradomer會(huì)形成可以包含兩個(gè)串聯(lián)Stradomer或者甚至三個(gè)串聯(lián)Stradomer的族Stradomer。
[0155]人IgG2鉸鏈單體的氨基酸序列如下:ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:36)。鉸鏈的核心結(jié)構(gòu)是鉸鏈單體的C-X-X-C部分。如此,本發(fā)明的Stradomer單體可以包含IgG2鉸鏈單體的完整的12個(gè)氨基酸的序列，或4個(gè)氨基酸的核心，以及Fe域單體。雖然核心結(jié)構(gòu)的X-X可以是任何氨基酸，但是在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，X-X序列是V-E或P-P。熟練技術(shù)人員會(huì)理解的是，在核心四氨基酸結(jié)構(gòu)外，IgG2鉸鏈單體可以由鉸鏈序列的任何部分構(gòu)成，包括所有IgG2鉸鏈序列和一些或所有IgG2CH2和CH3域單體序列?？赡艿腎gG2鉸鏈-1gGlFc域串聯(lián)Stradomer構(gòu)建體的具體例子如下:
[0156]表1
[0157]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的串聯(lián)Stradomer,其包含兩個(gè)或更多個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體,其中每個(gè)所述Stradomer單體包含兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)或更多個(gè)Fe域,且其中所述串聯(lián)Stradomer經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域之第一個(gè)特異性結(jié)合第一 Fe Y受體并經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域之第二個(gè)特異性結(jié)合第二 Fe Y受體。
2.—種核心Stradomer,其包含與兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元連接的核心模塊，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元之每一個(gè)包含至少一個(gè)Fe域,且其中所述核心Stradomer單元之每一個(gè)獨(dú)立選自下組: (a)Fe片段，其中所述Fe片段包含兩個(gè)聯(lián)合的Fe片段單體，其中所述Fe片段單體之每一個(gè)包含F(xiàn)e域單體，且其中所述兩個(gè)Fe片段單體的聯(lián)合形成Fe域， (b)Fc部分片段，其中所述Fe部分片段包含兩個(gè)聯(lián)合的Fe部分片段單體，其中所述Fe部分片段單體之每一個(gè)包含F(xiàn)e域單體，且其中所述兩個(gè)Fe部分片段單體的聯(lián)合形成Fe域， (c)Fc域,其中所述Fe域包含兩個(gè)聯(lián)合的Fe域單體,且其中所述兩個(gè)Fe域單體的聯(lián)合形成Fe域， (d)串聯(lián)Stradomer,其中所述串聯(lián)Stradomer包含兩個(gè)或更多個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體，其中所述Stradomer單體之每一個(gè)包含兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體,且其中所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)或更多個(gè)Fe域,和 (e)簇Stradomer,其中所述簇Stradomer包含兩個(gè)或更多個(gè)多聚化的簇Stradomer單元，其中所述簇Stradomer單元之每一個(gè)包含多聚化區(qū)和至少一個(gè)Fe域,其中所述簇Stradomer單兀之每一個(gè)包含兩個(gè)聯(lián)合的族Stradomer單兀單體，其中所述族Stradomer單元單體之每一個(gè)包含多聚化區(qū)單體和至少一個(gè)Fe域單體,其中所述兩個(gè)簇Stradomer單元單體的聯(lián)合形成多聚化區(qū)和至少一個(gè)Fe域,且其中所述兩個(gè)或更多個(gè)簇Stradomer單元的多聚化區(qū)進(jìn)行多聚化以形成所述簇Stradomer，且 其中所述核心Stradomer經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元之第一個(gè)特異性結(jié)合第一 Fe Y受體并經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)核心Stradomer單元之第二個(gè)特異性結(jié)合第二 Fe Y受體。
3.一種簇Stradomer,其包含兩個(gè)或更多個(gè)多聚化的簇Stradomer單元,其中所述簇Stradomer單元之每一個(gè)包含多聚化區(qū)和至少一個(gè)Fe域,其中所述簇Stradomer單元之每一個(gè)包含兩個(gè)聯(lián)合的簇Stradomer單元單體,其中所述簇Stradomer單元單體之每一個(gè)包含多聚化區(qū)單體和至少一個(gè)Fe域單體,其中所述兩個(gè)簇Stradomer單元單體的聯(lián)合形成多聚化區(qū)和至少一個(gè)Fe域,其中所述兩個(gè)或更多個(gè)簇Stradomer單元的多聚化區(qū)進(jìn)行多聚化以形成所述簇Stradomer,且其中所述簇Stradomer經(jīng)由第一 Fe域特異性結(jié)合第一 Fe Y受體并經(jīng)由第二 Fe域特異性結(jié)合第二 Fe Y受體。
4.一種Stradobody,其包含兩個(gè)或更多個(gè)聯(lián)合的Stradomer單體和Fab域，其中所述Stradomer單體之每一個(gè)包含F(xiàn)ab片段重鏈和兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體,其中所述Fab片段重鏈在所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域單體的氨基端或羧基端的位置中，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)Stradomer單體的聯(lián)合形成兩個(gè)或更多個(gè)Fe域,其中Fab片段輕鏈獨(dú)立與每個(gè)Stradomer單體的所述Fab片段重鏈聯(lián)合,其中所述Fab域具有抗原結(jié)合活性,且其中所述Stradobody經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域之第一個(gè)特異性結(jié)合第一 Fe Y受體并經(jīng)由所述兩個(gè)或更多個(gè)Fe域之第二個(gè)特異性結(jié)合第二 Fe Y受體。
5.一種改變受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括給有所需要的受試者施用包含治療有效量的權(quán)利要求1的串聯(lián)Stradomer、權(quán)利要求2的核心Stradomer、權(quán)利要求3的簇Stradomer或權(quán)利要求4的Stradobody和載體或稀釋劑的藥物組合物。
6.一種對(duì)抗體篩選對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的特定活性的方法，包括: (a)使所述免疫系統(tǒng)的同質(zhì)細(xì)胞群體與候選抗體接觸， (b)測(cè)量(a)的細(xì)胞群體的活性， (C)使與(a)中相同細(xì)胞類型的同質(zhì)細(xì)胞群體與權(quán)利要求1的串聯(lián)Stradomer接觸， (d)測(cè)量(C)的細(xì)胞群體的活性，并 (e)比較(b)中測(cè)量的活性與(d)中測(cè)量的活性，由此在所述免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上對(duì)抗體篩選特定活性。
7.一種抑制單核細(xì)胞衍生細(xì)胞(MDC)的活性的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與包含具有與其結(jié)合的Fe試劑的基底的組合物接觸。
8.一種治療方法，該方法包括給動(dòng)物施用包含具有與其結(jié)合的Fe試劑的基底的組合物，其中所述動(dòng)物患有或者有風(fēng)險(xiǎn)形成單核細(xì)胞衍生細(xì)胞介導(dǎo)的疾患(MDCMC)。
9.一種組合物，其包含可植入的或可附著的醫(yī)學(xué)裝置和與其結(jié)合的Fe試劑。
10.一種試劑盒，其包含可植入的或可附著的醫(yī)學(xué)裝置和Fe試劑。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK103897063SQ201410106484
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2007年6月1日
【發(fā)明者】斯科特.E.斯特羅姆, 丹.H.舒爾策, 戴維.S.布洛克 申請(qǐng)人:馬里蘭大學(xué)巴爾的摩分校, 格利克尼克股份有限公司