特異性針對甲型h3n2流感病毒的納米抗體及其在診斷中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了特異性針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體及編碼該納米抗體的基因序列，同時還公布了該納米抗體在診斷中的應用，以解決現(xiàn)有甲型H3N2流感診斷試劑研發(fā)過程中存在的無法獲得高純度、高親和力、高靈敏度抗體的生產(chǎn)和檢測的問題。通過本發(fā)明所公布的特異性針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體，將該納米抗體在大腸桿菌內(nèi)高效表達，并且對該納米抗體進行改造，使其能夠快速檢測抗原，應用于甲型H3N2流感快速診斷試劑盒的研發(fā)。
【專利說明】特異性針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體及其在診斷中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學或生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及特異性針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體、納米抗體改造技術(shù)及其用于快速診斷試劑盒的研發(fā)。
【背景技術(shù)】
[0002]甲型流感病毒根據(jù)其表面的血凝素(HA)抗原的不同可以分為16個亞型(H1-H16)，根據(jù)神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原的不同可以分為9個亞型(N1-N9)。流感病毒通過表面蛋白抗原性的累積改變(抗原漂移)或不同流感病毒發(fā)生基因重排而產(chǎn)生一種新的流感病毒(抗原轉(zhuǎn)變)來逃避感染宿主的免疫識別，從而在感染群體中傳播、繁衍。甲型H3N2流感是一種因甲型H3N2流感病毒引起的呼吸系統(tǒng)疾病。1968年香港爆發(fā)的H3N2流感至使百萬人失去生命。2013年初，美國東部多個州爆發(fā)H3N2季節(jié)性流感，波士頓市政府于I月9日宣布公共衛(wèi)生緊急狀態(tài)。目前針對人間甲型H3N2流感大流行的防控措施主要采用化學藥物和疫苗，但是化學藥物的過量使用多產(chǎn)生的副作用及疫苗開發(fā)往往滯后于疫情暴發(fā)和疫苗只能對易感人群起預防作用的弊端顯著。而由抗體介導的預防和診斷已顯現(xiàn)良好的效果，其應用前景得到專家的認同。但是常規(guī)抗體仍然存在穩(wěn)定性差，溶解性低及獲得較麻煩等方面的問題。抗體藥物的大分子特性制約了其廣泛使用和療效的發(fā)揮。一般的抗體能被消化系統(tǒng)很快降解，從而阻止了其進入大腦或一些腫瘤的外圍，許多疾病無法用單克隆抗體藥物治療。
[0003]而納米抗體是目前最小的抗體分子，其分子量是普通抗體的1/10，最初由比利時科學家Hamers，R在駱駝血液中發(fā)現(xiàn)，它是工程化抗體產(chǎn)品中備受關(guān)注的一類。它具有分子小、穩(wěn)定性強、可溶性好、免疫原性低、易表達、易改造等獨特優(yōu)勢，并且可根據(jù)應用的需要對其進行方便的個性化設(shè)計，方便偶聯(lián)其他分子，是目前抗體產(chǎn)品開發(fā)的一大熱點。納米抗體已經(jīng)發(fā)展成為有廣泛生物應用價值和臨床應用價值的通用分子，其應用涉及到疾病診斷和治療、基礎(chǔ)醫(yī)學研究、生物學研究等多個領(lǐng)域。利用納米抗體技術(shù)獲得兩株針對甲型H3N2流感病毒不同表位的納米抗體，對其進行改造設(shè)計，用于快速檢測抗原的診斷試劑盒研發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供兩株針對甲型H3N2流感病毒不同表位的納米抗體，同時提供該納米抗體在診斷試劑盒研發(fā)中的應用。
[0005]技術(shù)方案:為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面，提供了一種H3N2納米抗體的VHH鏈，包括框架區(qū)FR和互補決定區(qū)⑶R，所述框架區(qū)FR由四個框架區(qū)組成，分別為分別為FR1、FR2、FR3和FR4，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列:
FRl為SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，F(xiàn)R2為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，F(xiàn)R3為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，F(xiàn)R4為SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，F(xiàn)R2為SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，F(xiàn)R3為SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，F(xiàn)R4為SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列；
所述的互補決定區(qū)⑶R由三個互補決定區(qū)組成，分別⑶R1、⑶R2和⑶R3，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列:
CDRl為SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，⑶R3為SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列。
[0006]優(yōu)選地，所述的特異性針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體，它具有SEQ ID N0.15或16所示的氨基酸序列。
[0007]本發(fā)明第二方面，一種H3N2納米抗體，它是特異性針對甲型H3N2流感病毒表位的納米抗體，包括兩條具有SEQ ID N0.15或16所示氨基酸序列的VHH鏈。
[0008]本發(fā)明第三方面，一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì):權(quán)利要求1或2所述的H3N2納米抗體的VHH鏈，或權(quán)利要求3所述的H3N2納米抗體。
[0009]優(yōu)選地，所述的DNA分子，它具有選自下組的DNA序列:SEQ ID N0.17或18所示
的氨基酸序列。
[0010]本發(fā)明的第四方面，一種表達載體，它含SEQ ID N0.17或18所不的核苷酸序列。
[0011]本發(fā)明的第五方面，一種宿主細胞，它可以表達針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體。
[0012]H3N2納米抗體外源添加生物素以及偶聯(lián)辣根過氧化物酶，并應用于快速檢測試劑盒的研發(fā)。
[0013]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下:本發(fā)明利用滅活的甲型H3N2流感病毒天然抗原免疫駱駝，獲得高質(zhì)量的免疫納米抗體基因文庫。然后將滅活的甲型H3N2流感病毒分子偶聯(lián)在酶標板上，展示該蛋白的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫納米抗體基因庫(駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫)，從而獲得了 H3N2特異性的納米抗體基因，再將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。最主要的是，我們獲得的兩顆納米抗體能夠針對不同的抗原表位，并且有很好的特異性。對所獲得的納米抗體進行外源改造，建立一種快速檢測方法，為禽流感病毒診斷試劑盒的研發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。
[0014]【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是構(gòu)建的單域抗體文庫的插入率檢測結(jié)果，從左到右凝膠孔的DNA條帶分別是:第一道為DNA分子標記，其余孔道為檢測插入片段的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物帶約為500bp ；經(jīng)檢測，該文庫的插入率達到90%以上。
[0016]圖2是經(jīng)鎳柱純化后，得到的兩種H3N2納米抗體的SDS-PAGE的電泳圖，其表達的蛋白分別對應SEQ ID NO: 17或18所示的核苷酸序列。結(jié)果顯示，H3N2納米抗體經(jīng)過該純化過程，其純度可達到95%以上。
[0017]圖3是H3N2納米抗體外源添加生物素的模式圖。
[0018]圖4是偶聯(lián)生物素的H3N2納米抗體純化圖，該納米抗體對應的是SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列，SDS-PAGE跑膠結(jié)果顯示其純度可達90%以上。
[0019]圖5是由SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列編碼的H3N2納米抗體偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)，作為檢測抗體，用于對H3N2抗原的ELISA檢測圖。
[0020]圖6是兩株H3N2納米抗體用于檢測抗原的反應模式圖。
[0021]圖7是基于鏈霉親和素磁珠的雙抗夾心法對H3N2抗原的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明應用針對H3N2偶聯(lián)在酶標板上，展示蛋白質(zhì)的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形式的抗原篩選免疫納米抗體基因庫(駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫)，而獲得了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
[0023]本發(fā)明的第一方面，提供了一種H3N2納米抗體的VHH鏈，包括框架區(qū)FR和互補決定區(qū)⑶R，所述框架區(qū)FR由四個框架區(qū)組成，分別為分別為FR1、FR2、FR3和FR4，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列:
FRl為SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，F(xiàn)R2為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，F(xiàn)R3為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，F(xiàn)R4為SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，F(xiàn)R2為SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，F(xiàn)R3為SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，F(xiàn)R4為SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列； 所述的互補決定區(qū)⑶R由三個互補決定區(qū)組成，分別⑶R1、⑶R2和⑶R3，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列:
CDRl為SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，⑶R3為SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列。
[0024]優(yōu)選地，所述的特異性針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體，它具有SEQ ID N0.15或16所示的氨基酸序列。
[0025]本發(fā)明第二方面，一種H3N2納米抗體，它是特異性針對甲型H3N2流感病毒表位的納米抗體，包括兩條具有SEQ ID N0.15或16所示氨基酸序列的VHH鏈。
[0026]本發(fā)明第三方面，一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì):權(quán)利要求1或2所述的H3N2納米抗體的VHH鏈，或權(quán)利要求3所述的H3N2納米抗體。
[0027]優(yōu)選地，所述的DNA分子，它具有選自下組的DNA序列:SEQ ID N0.17或18所示
的氨基酸序列。
[0028]本發(fā)明的第四方面，一種表達載體，它含SEQ ID N0.17或18所不的核苷酸序列。
[0029]本發(fā)明的第五方面，一種宿主細胞，它可以表達針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體。
[0030]H3N2納米抗體外源添加生物素以及偶聯(lián)辣根過氧化物酶，并應用于快速檢測試劑盒的研發(fā)。
[0031 ] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0032]實施例1:H3N2納米抗體文庫的構(gòu)建:
(I)將0.1mg滅活的甲型H3N2流感天然抗原與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只新疆雙峰駝，每周一次，共免疫7次，刺激B細胞表達抗原特異性的納米抗體；(2)7次免疫結(jié)束后，提取100 mL駱駝外周血淋巴細胞并提取總RNA ; (3)合成cDNA并利用巢式PCR擴增VHH ；
(4)利用限制性內(nèi)切酶PstI及NotI酶切20 Ug PComb3卩遼菌體展示載體(Biovector供應)及10 ug VHH并連接兩個片段；(5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞TGl中，構(gòu)建H3N2納米抗體文庫并測定庫容，庫容大小為1.0X109。與此同時，我們隨機挑取24顆克隆進行菌落PCR檢測，結(jié)果表明所建文庫的插入率在90%以上，圖1顯示菌落PCR結(jié)果。
[0033]實施例2:針對H3N2的納米抗體篩選過程:
(I)將溶解在100 mM NaHC03> pH 8.2中的20 Ug滅活H3N2抗原偶聯(lián)在NUNC酶標板上，4 °C放置過夜；(2)第二天加入100 uL 0.1%酪蛋白，室溫封閉2 h ；(3)2 h后，加入100 uL噬菌體(5X 10ntfu免疫駱駝納米抗體噬菌展示基因庫)，室溫作用I h ;(4)用0.05%PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉非特異的噬菌體；(5)用100 mM TEA (triethylamine)將與H3N2特異性結(jié)合的噬菌體解離下，并感染處于對數(shù)期生長的大腸桿菌TGl細胞，37 °C培養(yǎng)I h，產(chǎn)生并純化噬菌體用于下一輪的篩選，相同篩選過程重復3-4輪，逐步得到富集。
[0034]實施例3:用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)篩選特異性單個陽性克隆:
(I)從上述3-4輪篩選后含有噬菌體的細胞培養(yǎng)皿中，挑選96個單個菌落并接種于含有100微克每毫升的氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基(I升TB培養(yǎng)基中含有2.3克磷酸二氫鉀，12.52克磷酸氫二鉀，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生長至對數(shù)期后，加終濃度I毫摩爾的IPTG，28 °C培養(yǎng)過夜。(2)利用滲透法獲得粗提抗體，并將抗體轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的ELISA板中，在室溫下放置I小時。(3)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入一mouse ant1-HA tag antibody(抗鼠抗HA抗體,購自北京康為世紀生物科技有限公司),在室溫下放置I小時。(4)用PBST洗去未結(jié)合的抗體,加入ant1-mouse alkaline phosphataseconjugate (山羊抗小鼠堿性磷酸酶標記抗體，購自艾美捷科技有限公司)，在室溫下放置I小時。(5)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在405nm波長，讀取吸收值。(6)當樣品孔OD值大于對照孔OD值3倍以上時，判為陽性克隆孔。(7)將陽性克隆孔的菌轉(zhuǎn)搖在含有100微克每毫升的LB液體中以便提取質(zhì)粒并進行測序。
根據(jù)序列比對軟件Vector NTI分析各個克隆株的基因序列，將⑶R1，⑶R2，⑶R3序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，最終共有6株不同的抗體。其抗體的VHH鏈的氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 37、38、39、40、41或42所示。
[0035]實施例4:納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達、純化:
(I)將前面測序分析所獲得不同克隆株的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6中，并將其涂布在LA+glucose即含有氨芐青霉素和葡萄糖的培養(yǎng)平板上，37 1:培養(yǎng)過夜；(2)挑選單個菌落接種在5 mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 °C搖床培養(yǎng)過夜；(3)接種I mL的過夜菌種至330 mL TB培養(yǎng)液中，37 °C搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到OD值達到0.6-0.9時，加入IPTG，28°C搖床培養(yǎng)過夜；(4)離心，收菌；(5)利用滲透法，獲得抗體粗提液；(6)經(jīng)鎳柱離子親和層析可制備純度達90%以上的蛋白。
[0036]實施例5:納米抗體外源添加生物素:
(I)用Afco I和訪II兩種限制性內(nèi)切酶將獲得的兩顆克隆株的質(zhì)粒酶切，將VHH片段亞克隆到PBAD載體上；(2)將構(gòu)建成功的載體與pBiRA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)WK6感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)后將細胞在37°C搖床培養(yǎng)lh，取200ul涂布在LA+glucose的平板培養(yǎng)基上，37 1:培養(yǎng)過夜；(3)挑選單個菌落接種在5 mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 °C搖床培養(yǎng)過夜；(4)接種I mL的過夜菌種至330 mL TB培養(yǎng)液中，37 °C搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到OD值達到0.6-0.9時，加入D-Biotin，使其終濃度為5mM，并加入IPTG，28 1:搖床培養(yǎng)過夜；(5)離心，收菌；(6)利用滲透法，獲得抗體粗提液；(7)經(jīng)Streptavidin Mutein Matrix純化,可制備純度達90%以上的蛋白。
[0037]實施例6:納米抗體偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP):
(I)稱取5mg HRP溶于ImL雙蒸水中，加入新鮮配制的0.5mL 0.1M/L的NaIO4,4°C放置15-30min ；(2)加入2.5%乙二醇ImL,室溫放置30_60min ；(3)加入待標記的納米抗體Img,并調(diào)節(jié)pH至9.0,4°C放置過夜；(4)加入硼氫化鈉(5mg/mL) 0.02mL,混勻后置于4V3h ；(5)飽和硫酸銨去除游離HRP，再用IxPBS超濾換液，3000rpm離心30min，去除沉淀物，上清即為酶標抗體。(6) ELISA檢測酶標抗體是否可用。
[0038]實施例7:基于生物素的鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)單域抗體雙抗夾心法檢測抗原:
(I)雙抗夾心法檢測兩株納米抗體是否識別不同表位，本發(fā)明所示的兩株H3N2納米抗
體能夠特異識別H3N2的不同表位；(2)取120ul鏈霉親和素磁珠(每個樣品20ul磁珠)，置于磁力架上，去除保護液，再用IxPBS洗滌5次，加入ImL偶聯(lián)生物素的納米抗體(2ug/mL)室溫反應30min ; (3)順利，磁力架上吸去殘液，用PBST洗滌10次，再用0.1%BSA洗滌2次，加入ImL 0.1%BSA封閉2h ; (4)磁力架上吸去殘液，用PBST洗滌10次，加入不同濃度的抗原:0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL,每種濃度抗原體積均為500 μ L，室溫反應Ih ; (5)用PBST洗滌15次，加入500ul偶聯(lián)HRP的納米抗體(Ing/ μ L)，室溫反應30min ； (6)PBST洗滌25次，雙蒸水洗滌2次，每個樣品加入100 μ L顯色液，反應3-5min，加入50 μ L 2Μ H2SO4終止反應，置于酶標儀測Α450Μ吸光值。
[0039]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出:對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
[0040]本發(fā)明利用滅活的甲型Η3Ν2流感病毒天然抗原免疫駱駝，獲得高質(zhì)量的免疫納米抗體基因文庫。然后將滅活的甲型Η3Ν2流感病毒分子偶聯(lián)在酶標板上，展示該蛋白的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫納米抗體基因庫(駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫)，從而獲得了 Η3Ν2特異性的納米抗體基因，再將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。最主要的是，我們獲得的兩顆納米抗體能夠針對不同的抗原表位，并且有很好的特異性。對所獲得的納米抗體進行外源改造，建立一種快速檢測方法，為禽流感病毒診斷試劑盒的研發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種特異性針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體，包括框架區(qū)FR和互補決定區(qū)CDR，其特征在于，所述框架區(qū)FR由四個框架區(qū)組成，分別為分別為FR1、FR2、FR3和FR4，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列: FRl為SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，F(xiàn)R2為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，F(xiàn)R3為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，F(xiàn)R4為SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列； 或FRl為SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，F(xiàn)R2為SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，F(xiàn)R3為SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，F(xiàn)R4為SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列； 所述的互補決定區(qū)⑶R由三個互補決定區(qū)組成，分別⑶R1、⑶R2和⑶R3，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列: CDRl為SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，⑶R3為SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列； 或CDRl為SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體，其特征在于，它具有SEQ ID N0.15或16所示的氨基酸序列。
3.一種H3N2納米抗體，其特征在于，它是特異性針對甲型H3N2流感病毒表位的納米抗體，包括兩條具有SEQ ID N0.15或16所示氨基酸序列的VHH鏈。
4.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的蛋白質(zhì):權(quán)利要求1或2所述的H3N2納米抗體的VHH鏈，或權(quán)利要求3所述的H3N2納米抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列:SEQIDN0.17或18所示的氨基酸序列。
6.—種表達載體,其特征在于,它含SEQ ID N0.17或18所不的核苷酸序列。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它可以表達針對甲型H3N2流感病毒的納米抗體。
8.權(quán)利要求3所述的H3N2納米抗體，其特征在于，所述H3N2納米抗體外源添加生物素以及偶聯(lián)辣根過氧化物酶。
【文檔編號】C07K16/10GK103936852SQ201410202193
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】萬亞坤, 朱敏, 歐衛(wèi)軍, 王保君, 吳啟運, 沙海, 王蕾 申請人:南通市伊士生物技術(shù)有限責任公司