一種用于修飾脂肪酶的功能化離子液體、制備方法及修飾得到的脂肪酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于修飾脂肪酶的功能化離子液體，該功能化離子液體的結構如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，n為1～7，m為1～2，Y為氯離子、溴離子、四氟硼酸根離子、六氟磷酸根離子或者三氟甲基磺酰亞胺離子。將該功能化離子液體用于對游離脂肪酶進行化學修飾，可以提高游離脂肪酶的穩(wěn)定性、活性及催化選擇性。本發(fā)明還公開了該功能化離子液體的制備方法及修飾得到的脂肪酶。在修飾后的脂肪酶的表面引入具有多重雜環(huán)骨架結構的功能化離子液體，影響了酶活性中心的構型，改善了脂肪酶的催化表現(xiàn)。
【專利說明】一種用于修飾脂肪酶的功能化離子液體、制備方法及修飾 得到的脂肪酶

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于有機合成與生物催化【技術領域】，具體涉及一類具有多重雜環(huán)骨架結構 的功能化離子液體，并用此類功能性離子液共價修飾脂肪酶，制備出高穩(wěn)定性、催化活性及 反應選擇性的脂肪酶。

【背景技術】
[0002] 脂肪酶作為一類重要的生物催化劑，可被用于催化各類有機反應（如酯化、酯交 換、氨解及水解反應）以制備用途廣泛的多種化合物（如醇、酯、酸和胺）?；瘜W修飾通過向 酶蛋白分子中引入外源性分子結構片段來改善酶自身的催化特性，再結合適當?shù)墓潭ɑ?法，在不損失酶活性的前提下，提高酶的穩(wěn)定性及反應選擇性（區(qū)域或空間）。不僅有助于 了解微環(huán)境對酶功能的影響，還能有效拓展酶的應用范圍。
[0003] 離子液體因具備對環(huán)境友好的特性而被稱為"綠色"溶劑，己經(jīng)在有機合成與 生物化學、電化學、分離過程、催化等領域得到廣泛的應用（Room-temperature ionic liquids:solvents for synthesis and catalysis. 2. Chem Rev. 2011，111 (5):3508-76. )〇 同時，離子液體又被稱為"可設計性"溶劑，通過改變陰、陽離子的結構可調節(jié)離子液的物化 特性（如極性、疏水性、黏性、熔點、密度等）以完成其在各領域中的應用任務。設計合成能 夠完成某種特定任務需求（如生物或化學反應、分離等）的離子液體（Task-specific ionic liquid)，即功能化離子液體，亦是當今離子液體研究重要趨勢，這也是本課題組長期以來 的重要研究內(nèi)容之一（設計并合成結構的功能離子液，考察與評價其在合成化學和生物學 等方面的應用）。
[0004] 目前，對多數(shù)生物學研究者而言，離子液體在生物催化領域的應用研究往往就是 將結構相對簡單的傳統(tǒng)型離子液用作催化反應介質或少量添加的反應促進劑（enhancer)， 以期改善酶促反應，如提高產(chǎn)物得率或反應選擇性（Biocatalysis in Ionic Liquids. Chem Rev. 2007, 107(6) :2757-85.)，但該過程存在諸多局限：1)傳統(tǒng)型離子液體作為反應介質， 大用量不經(jīng)濟，且使產(chǎn)物后處理較繁瑣，自身的高黏度削弱了反應效率；2)分子結構中缺 少活性功能基團，對于酶促反應的改善程度有限；3)作為反應促進劑，類型單一，結構缺乏 有針對性的設計及有效制備手段，不利于其對生物催化劑的作用機制的問題研究。盡管通 過功能型離子液體化學修飾的方法可簡便、快速的改善酶的催化行為、改變酶學特性，但該 研究方向屬交叉學科，熟悉酶學研究的生物學家不一定能有效的利用現(xiàn)代有機合成技術手 段實現(xiàn)酶分子修飾劑多樣性的結構需求設想，因此發(fā)展緩慢，而功能化液體的合成與應用 研究為該方向提供了一條有效途徑。
[0005] 2011年，Bastien DoumSche等研究發(fā)現(xiàn)含輕基的離子液體在活化劑作用下可 實現(xiàn)甲酸脫氫酶的化學修飾（Ionic liquid-inspired cationscovalently bound to formate dehydrogenase improve its stability and activityin ionic liquids. ChemCatChem. 2011，3:875-82.)，但這類常規(guī)離子液體不僅修飾作用有限，且酶修飾反應時 間長達24h，對酶活影響較大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種用于修飾脂肪酶的功能化離子液體、制備方法及修飾得到的脂 肪酶，該功能化離子液體用于修飾脂肪酶后，可以提高游離脂肪酶的穩(wěn)定性、活性及催化選 擇性。
[0007] -種用于修飾脂肪酶的功能化離子液體，結構如式（I )所示：
[0008]

【權利要求】
1. 一種用于修飾脂肪酶的功能化離子液體，其特征在于，結構如式（I )所示：
(I ) 式（I )中，η為1?7; m為1?2 ; Y為氯離子、溴離子、四氟硼酸根離子、六氟磷酸根離子或者三氟甲基磺酰亞胺離子。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用于修飾脂肪酶的功能化離子液體，其特征在于，所述的 功能化離子液體為6, 7-二氫-5H-吡咯[1，2-α]-3-脂肪酸咪唑溴鹽、5, 6, 7, 8-四氫 吡啶[1，2-α ]-3-脂肪酸咪唑溴鹽、6, 7-二氫-5Η-吡咯[1，2-α ]-3-脂肪酸咪唑四氟 硼酸鹽、5, 6, 7, 8-四氫吡啶[1，2- α ] -3-脂肪酸咪唑四氟硼酸鹽、6, 7-二氫-5Η-吡咯 [1，2-α ]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸鹽、5, 6, 7, 8-四氫吡啶[1，2-α ]-3-脂肪酸咪唑六氟磷 酸鹽、6, 7-二氫-5Η-吡咯[1，2-α ]-3-脂肪酸咪唑雙三氟甲基磺酰亞胺或5, 6, 7, 8-四氫 吡啶[1，2-α ]_3_脂肪酸咪唑雙三氟甲基磺酰亞胺。
3. -種如權利要求1或2所述的功能化離子液體的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 向6, 7-二氫-5Η-吡咯[1，2- α ]咪唑或5, 6, 7, 8-四氫吡啶[1，2- α ]咪唑中加入 二氯甲烷，攪拌溶解后滴加鹵代脂肪酸酯進行取代反應，得到取代中間體； (2) 步驟（1)得到的取代中間體用鹽酸調節(jié)pH至1?2,進行水解反應得到水解產(chǎn)物， 得到的水解產(chǎn)物經(jīng)過進一步的離子交換或者直接后處理得到所述的功能化離子液體。
4. 根據(jù)權利要求3所述的功能化離子液體的制備方法，其特征在于，所述的鹵代脂肪 酸酯為2-齒代乙酸酯、3-齒代丙酸酯、4-齒代丁酸酯、5-齒代戊酸酯、6-齒代己酸酯、7-鹵 代庚酸酯或者8-鹵代辛酸酯。
5. 根據(jù)權利要求3所述的功能化離子液體的制備方法，其特征在于，所述的鹵代脂肪 酸酯為氯代脂肪酸酯或溴代脂肪酸酯。
6. 根據(jù)權利要求3所述的功能化離子液體的制備方法，其特征在于，所述的鹵代脂肪 酸酯為鹵代脂肪酸甲酯、鹵代脂肪酸乙酯或鹵代脂肪酸丙酯。
7. 根據(jù)權利要求3所述的功能化離子液體的制備方法，其特征在于，所述6, 7-二 氫-5H-吡咯[1，2-α]咪唑或5, 6, 7, 8-四氫吡啶[1，2-α]咪唑與鹵代脂肪酸酯的摩爾比 為 1:1-3。
8. 根據(jù)權利要求3所述的功能化離子液體的制備方法，其特征在于，步驟（1)的反應溫 度為20-30°C，反應時間為6-12h。
9. 一種使用如權利要求1或2所述的功能化離子液體修飾得到的脂肪酶，其特征在于， 修飾方法如下： 將權利要求1或2所述的離子液體、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與 N-羥基琥珀酰亞胺按1:1-3:1的摩爾比溶于嗎琳乙磺酸中活化l-3h，將活化后的離子液體 與脂肪酶按摩爾比100-1000:1在0-4°C混合反應2-6h ;或者 將權利要求1或2所述的離子液體與N，N-碳酰二咪唑按摩爾比1:1-3溶于二甲基亞 砜中活化l_3h，將活化后的功能化離子液與脂肪酶按摩爾比100-1000:1在0-4°C混合反應 l_6h〇
10.根據(jù)權利要求9所述的功能化離子液體修飾得到的脂肪酶，其特征在于，所述的 脂肪酶為疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶、褶皺假絲酵母脂肪酶、南極假絲酵母脂肪酶、豬胰脂肪 酶、根霉脂肪酶、洋蔥假單胞菌脂肪酶或洋蔥布克氏菌脂肪酶。
【文檔編號】C07D487/04GK104193743SQ201410238797
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權日:2014年5月29日
【發(fā)明者】石玉剛, 劉玉華 申請人:浙江工商大學