一種鮑鐵蛋白的粗提方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鮑鐵蛋白的粗提方法，包括以下步驟：(1)取除性腺外的鮑組織，加入SB緩沖液，勻漿，得勻漿液；(2)勻漿液置于液氮和水浴中反復(fù)凍融；(3)用SB緩沖液定容至總體積100mL，定容后的溶液混勻后冷凍離心，收集上清液；(4)上清液經(jīng)濾膜過濾，離心，棄上清，加入SB緩沖液重懸得懸液；(5)將懸液加到CsCl密度梯度液面上，離心，棄上清，得紅褐色的鐵蛋白。該方法操作簡(jiǎn)便、快速且樣品損失量少，提取的鐵蛋白純度較高。
【專利說明】一種鮑鐵蛋白的粗提方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明蛋白提取方法，尤其是涉及一種鮑鐵蛋白的粗提方法。

【背景技術(shù)】
[0002]鐵蛋白(ferritin)是動(dòng)植物體內(nèi)普遍存在的、高度保守的一類忙存鐵的胞內(nèi)可溶性蛋白。不同動(dòng)物鐵蛋白的結(jié)構(gòu)相似，均為球型。其外徑約12~14nm，空囊腔徑長(zhǎng)約6nm，外殼(即脫鐵鐵蛋白)由24個(gè)亞基組成，由重鏈和輕鏈兩種亞基按等比例形成。重鏈分子量約為21kDa，輕鏈分子量約為19kDa。完整鐵蛋白的分子量約為480kDa，每個(gè)分子可結(jié)合多達(dá)4500個(gè)鐵原子，在球體中間形成一個(gè)致密的鐵核。鐵蛋白由于其高度的穩(wěn)定性和球型對(duì)稱的分子結(jié)構(gòu)，使其在生物醫(yī)學(xué)及納米材料科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。然而，目前國(guó)內(nèi)外均未見鮑鐵蛋白提取方法的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種從軟體動(dòng)物鮑的組織中提取鐵蛋白的鮑鐵蛋白的粗提方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速且樣品損失量少，提取的鐵蛋白純度較高。
[0004]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下方法:一種鮑鐵蛋白的粗提方法，包括以下步驟:
(1)取除性腺外的鮑組織，加入SB緩沖液，勻漿，得勻漿液；
(2)勻漿液置于液氮和水浴中反復(fù)凍融；
(3)用SB緩沖液定容至總體積10mL,混勻后冷凍離心，收集上清液；
(4)上清液經(jīng)濾膜過濾，離心，棄上清，加入SB緩沖液重懸沉淀物得重懸液；
(5)將重懸液加到CsCl密度梯度液的液面上，離心，棄上清，得紅褐色的鐵蛋白。
[0005]所述步驟(1)中鮑組織與SB緩沖液之間的質(zhì)量體積比為1: 2"!: 50(g/ml)。
[0006]所述步驟(1)中SB 緩沖液的 pH 為 6.0~8.0，含有 0.1-0.3Μ NaCl，2(T100mMTris-HCl, r20mM CaCl2, l~20mM MgCl20
[0007]所述步驟(2)中勻漿液置于液氮和水浴中反復(fù)凍融的次數(shù)為3次。水浴溫度為20^80 0C ο
[0008]所述步驟(3)中冷凍離心是采用高速冷凍離心機(jī)依次以轉(zhuǎn)速100(T5000rpm、6000"8000rpm,9000"10000rpm 和 1100(Tl4000rpm 對(duì)定容后的溶液離心 10~60min。
[0009]所述步驟(4)中濾膜的孔徑為0.22、.45um。
[0010]所述步驟(4)中對(duì)濾膜過濾所得的溶液使用超速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速1500(T40000 rpm離心0.5~3h。
[0011]所述步驟(4)中用于重懸的SB緩沖液的量為0.5~3mL。
[0012]所述步驟(5)中，CsCl密度梯度液采用SB緩沖液配置，從離心管管底到管頂?shù)娜芤嘿|(zhì)量比分別為40~60%、30~40%、20~30%、10~20%。
[0013]所述步驟(5)中使用超速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速15000~40000 rpm離心0.5~3h。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著的效果:
本發(fā)明提供的方法主要以超速離心分離方法為基礎(chǔ)，操作簡(jiǎn)便、快速且樣品損失量少，該方法提取的鐵蛋白純度較高，僅有少量血藍(lán)蛋白干擾(參見圖3)，具有較好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是超速離心后的鐵蛋白沉淀，
左側(cè)為雜色鮑，右側(cè)為皺紋盤鮑。
[0016]圖2是鐵蛋白電鏡照片，
左圖是經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后的鐵蛋白，右圖是未經(jīng)磷鎢酸負(fù)染的鐵蛋白鐵核。
[0017]圖3是鐵蛋白SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，
圖中可見鐵蛋白的兩個(gè)亞基分子量分別約為21kD和19kD ;膠孔處有少量雜蛋白(主要為血藍(lán)蛋白)；1號(hào)樣為皺紋盤鮑，2和3號(hào)樣為雜色鮑。
[0018]圖4是實(shí)施例1中雜色鮑的疑似鐵蛋白目標(biāo)條帶的重鏈的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
[0019]圖5是實(shí)施例1中雜色鮑的疑似鐵蛋白目標(biāo)條帶的輕鏈的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
[0020]圖6是實(shí)施例3中皺紋盤鮑的疑似鐵蛋白目標(biāo)條帶的重鏈的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
[0021]圖7是實(shí)施例3中皺紋盤鮑的疑似鐵蛋白目標(biāo)條帶的輕鏈的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
鮑鐵蛋白的提取
(I)取1g雜色鮑組織(除性腺外的各組織);加50mL SB緩沖液，勻衆(zhòng)，得勻漿液。其中，SB 緩沖液的 pH 為 7.5，每 50ml 中含有 0.2M NaCl, 50mM Tris-HCl, 5mM CaCl2, 5mM MgCl20
[0023](2)勻漿液置于液氮和45°C水浴中反復(fù)凍融3次。
[0024](3)用SB緩沖液定容至總體積10mL,顛倒混勻；然后使用普通高速冷凍離心機(jī)依次以轉(zhuǎn)速 5000rpm、8000rpm、lOOOOrpm、12000rpm 離心 30min,收集上清。
[0025](4)用0.22um濾膜過濾上清液，使用超速離心機(jī)對(duì)過濾所得的溶液以30000rpm離心lh，棄上清，加入ImL SB緩沖液充分重懸沉淀物得重懸液。
[0026](5)采用SB緩沖液配置CsCl密度梯度液，從離心管管底到管頂?shù)娜芤嘿|(zhì)量比依次為45%、35%、25%、15% ;將重懸液加到配置好的CsCl密度梯度液的液面上，使用超速離心機(jī)以30000rpm離心8h,獲得管底最下層的紅褐色沉淀(圖1)。
[0027]鮑鐵蛋白的驗(yàn)證
對(duì)溶解后的紅色沉淀進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察，由圖2所示的結(jié)果可見，所得的紅褐色沉淀具有典型鐵蛋白環(huán)形結(jié)構(gòu)(直徑約10nm)，進(jìn)而對(duì)該蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)(圖3)，并對(duì)兩條疑似鐵蛋白目標(biāo)條帶在http://www.matrixscience.com/進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,鑒定結(jié)果參見圖4和圖5， 所得蛋白的重鏈和輕鏈分別與雜色鮑鐵蛋白的重鏈和輕鏈序列一致，可以確定為鐵蛋白。
[0028]實(shí)施例2 鮑鐵蛋白的提取
(I)取1g雜色鮑組織(除性腺外的各組織);加5mL SB緩沖液，勻漿，得勻漿液。其中，SB 緩沖液的 pH 為 6，每 20ml 中含有 0.1M NaCl, 20mM Tris-HCl, ImM CaCl2, 20mM MgCl30
[0029](2)勻漿液置于液氮和45°C水浴中反復(fù)凍融3次。
[0030](3)用SB定容至總體積10mL,顛倒混勻；然后使用普通高速冷凍離心機(jī)依次以轉(zhuǎn)速 15000rpm、6000rpm、9000rpm、IlOOOrpm 離心 60min,收集上清。
[0031](4)用0.22um濾膜過濾上清液，使用超速離心機(jī)對(duì)過濾所得溶液以40000rpm離心lh，棄上清，加入ImL SB緩沖液充分重懸沉淀物得重懸液。
[0032](5)采用SB緩沖液配置CsCl密度梯度液，從離心管管底到管頂?shù)娜芤嘿|(zhì)量比依次為45%、35%、25%、15% ;將重懸液加到配置好的CsCl密度梯度液的液面上，使用超速離心機(jī)以40000rpm離心8h，獲得管底最下層的紅褐色沉淀，即鮑鐵蛋白。
[0033]實(shí)施例3 鮑鐵蛋白的提取
(I)取1g皺紋盤鮑組織(除性腺外的各組織);加50mL SB緩沖液，勻漿，得勻漿液。其中，SB緩沖液的pH為 7.5，每50ml 中含有0.2M NaCl, 50mM Tris-HCl, 5mM CaCl2, 5mM MgCl20
[0034](2)勻漿液置于液氮和45°C水浴中反復(fù)凍融3次。
[0035](3)用SB緩沖液定容至總體積10mL,顛倒混勻；然后使用普通高速冷凍離心機(jī)依次以轉(zhuǎn)速 5000rpm、8 000rpm、lOOOOrpm、12000rpm 離心 30min,收集上清。
[0036](4)用0.22um濾膜過濾上清液，使用超速離心機(jī)對(duì)過濾所得溶液以35000rpm離心Ih,棄上清,每管加入ImL SB緩沖液充分重懸沉淀物得懸液。
[0037](5)采用SB緩沖液配置CsCl密度梯度液，從離心管管底到管頂?shù)娜芤嘿|(zhì)量比依次為45%、35%、25%、15% ;將重懸液加到配置好的CsCl密度梯度液的液面上，使用超速離心機(jī)以35000rpm離心8h,獲得管底最下層的紅褐色沉淀(圖1)。
[0038]鮑鐵蛋白的驗(yàn)證
對(duì)溶解后的紅色沉淀進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察，可見如圖2所示的典型鐵蛋白環(huán)形結(jié)構(gòu)(直徑約10nm)，進(jìn)而對(duì)該蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)(圖3)，并對(duì)兩條疑似鐵蛋白目標(biāo)條帶在http://www.matrixscience.com/進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,鑒定結(jié)果參見圖6和圖7,所得蛋白的重鏈和輕鏈分別與雜色鮑鐵蛋白的重鏈和輕鏈序列一致，可以確定為鐵蛋白。
[0039]實(shí)施例4 鮑鐵蛋白的提取
(I)取1g皺紋盤鮑組織(除性腺外的各組織)；加50mL SB緩沖液，勻漿，得勻漿液。其中，SB 緩沖液的 pH 為 7.5，每 30ml 中含有(λ 3M NaCl, 80mM Tris-HCl, 1mM CaCl2, 1mMMgCl2。
[0040](2)勻漿液置于液氮和45°C水浴中反復(fù)凍融3次。
[0041 ] (3)用SB緩沖液定容至總體積10mL,顛倒混勻；然后使用普通高速冷凍離心機(jī)依次以轉(zhuǎn)速 4000rpm、7000rpm、9500rpm、14000rpm 離心 1min,收集上清。
[0042](4)用0.45um濾膜過濾上清液，使用超速離心機(jī)對(duì)過濾所得溶液38000rpm離心lh，棄上清，加入ImL SB緩沖液充分重懸沉淀物得重懸液。
[0043](5)采用SB緩沖液配置CsCl密度梯度液，從離心管底到管頂?shù)娜芤嘿|(zhì)量比依次為45%、35%、25%、15% ;將重懸液加到配置好的CsCl密度梯度液的液面上，使用超速離心機(jī)38000rpm離心8h,獲得管底最下層的紅褐色沉淀(圖1)。
[0044]本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，本發(fā)明還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，均落在本發(fā)明權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取除性腺外的鮑組織，加入SB緩沖液，勻漿，得勻漿液； (2)勻漿液置于液氮和水浴中反復(fù)凍融； (3)用SB緩沖液定容至總體積10mL,混勻后冷凍離心，收集上清液； (4)上清液經(jīng)濾膜過濾，離心，棄上清，加入SB緩沖液重懸沉淀物得重懸液； (5)將重懸液加到離心管中的CsCl密度梯度液的液面上，離心，棄上清，得紅褐色的鐵蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述步驟(1)中鮑組織與SB緩沖液之間的質(zhì)量體積比為1: 2~1: 50。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述中SB緩沖液的pH 為 6.0~8.0，含有 0.1~θ.3Μ NaCl, 2(T100mM Tris-HCl, 1~20mM CaCl2,1~20mM MgCl20
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述步驟(2)中勻漿液置于液氮和水浴中反復(fù)凍融的次數(shù)為3次，水浴溫度為2(T80°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述步驟(3)中冷凍離心是采用高速冷凍離心機(jī)依次以轉(zhuǎn)速1000~5000rpm、6000~8000rpm、900~10000rpm和11000~14000rpm對(duì)定容后的溶液離心10~60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述步驟(4)中濾膜孔徑為 0.22~0.45um。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述步驟(4)中對(duì)濾膜過濾所得的上清液使用超速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速1500(T40000rpm離心0.5~3h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述步驟(4)中用于重懸的SB緩沖液的量為0.5~3mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述步驟(5)中，CsCl密度梯度液采用SB緩沖液配置，從離心管管底到管頂?shù)娜芤嘿|(zhì)量比分別為40-60%、30-40%、20~30%、10~20%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的鮑鐵蛋白的粗提方法，其特征在于，所述步驟(5)中使用超速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速15000~40000rpm離心0.5~3h。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK104130321SQ201410326242
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】姜敬哲, 何健, 王江勇, 谷露 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所