專利名稱：人血清鐵蛋白體外檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及免疫學(xué)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及以膠體金免疫層析法 快速半定量檢測血清鐵蛋白濃度的體外檢測試劑。
背景技術(shù)：
鐵蛋白(Ferritin)，存在于身體內(nèi)各種細(xì)胞中，尤其以肝臟及網(wǎng)狀內(nèi)皮 系統(tǒng)細(xì)胞濃度最高;其主要功能是將細(xì)胞中過多的游離態(tài)鐵質(zhì)釋放出來，以 供身體使用。因此,鐵蛋白為身體組織中主要貯存鐵質(zhì)的一種蛋白，是維持 鐵質(zhì)平衡中不可缺少的一種重要蛋白。正常的情況下,血清中每lng/ml的 鐵蛋白，約相當(dāng)于身體S 10mg之鐵蛋白貯存量;所以血清中鐵蛋白濃度,可 以直接反映出人體鐵代謝的健康狀況，通過血清鐵蛋白濃度測定人體鐵元 素代謝狀況已逐漸普及，并發(fā)現(xiàn)其除了作為估計體內(nèi)的總貯存量外,血清鐵 蛋白濃度尚可作為輔助指標(biāo)用于肝病、及某些惡性腫瘤的診斷。
臨床應(yīng)用
1. 血清鐵蛋白值直接反映體內(nèi)鐵元素儲藏量，作為貧血的診斷指標(biāo)。
2. 作為某些疾病特別是肝病(如肝癌)的輔助指標(biāo)，提高癌癥診斷的準(zhǔn)確率。
人血清鐵蛋白有參考值為男性15 200ng/ml，女性12 150ng/ml， 兒童7 140 ng/ml。由于檢測方法的不同和地區(qū)差異，參考值略有變化。 一般低于30ng/ml則有缺鐵性貧血的傾向，需要相應(yīng)的鐵補充。大于 300ng/ml應(yīng)考慮是否存在其它疾病。
免疫層析膠體金技術(shù)是新型且較為簡單的診斷技術(shù)，已得到相當(dāng)廣泛 的應(yīng)用，基本原理為利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上 包被相應(yīng)的配對抗原或抗體，檢測時當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原 時，膠體金標(biāo)記顆^^卩樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析， 再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測(T)線，通過檢測線的有無 實現(xiàn)對結(jié)果的判定。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適 合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實用等優(yōu)點
發(fā)明內(nèi)容
本實用新型旨在提供一種用于血清中鐵蛋白濃度的半定量快速檢測試 劑，具有操作簡便、設(shè)備及環(huán)境依賴少、反應(yīng)快速、半定量準(zhǔn)確度高、特
3異性好、適合現(xiàn)場快速檢測和經(jīng)濟(jì)實用等優(yōu)點的人血清鐵蛋白體外檢測試劑。
本實用新型提供一種人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其組件包括上樣墊 (1)、緊密連接于上樣墊一端且含有鐵蛋白血清濃度體外檢測試劑抗體標(biāo)
記的膠體金墊(2)、與膠體金墊另一端緊密相連的硝酸纖維膜(NC膜)(3) 和緊密連接于NC膜另一端的樣本吸收墊(吸水紙)(4) 。 NC膜包被有彼 此分離的檢測線(T line) (5)和質(zhì)控線(C line) (6),T線包被有一 定量的鐵蛋白抗體，C線包被為抗鼠IgG。上樣墊、膠體金墊、NC膜和樣本 吸收墊按照圖示順序(圖l)粘貼到PVC基板(7)上形成試紙條，試紙條亦 可以裝入塑料卡中形成卡式內(nèi)包裝。其特征在于T線為包被在NC膜上的一 定量的鐵蛋白抗體，.膠體金墊含有一定量鐵蛋白抗體標(biāo)記的膠體金顆粒。
所述的人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其特征在于所述上樣墊為無紡布， 樣本吸收墊為吸水濾紙。
所述的人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其特征在于所述鐵蛋白抗體包被 方法為以0. 003M， pH=7. 2磷酸鹽緩沖液(PB)將抗體稀釋至0. 18mg/mL， 用噴膜機(jī)在NC膜確定位置以0. 09ul/mm參數(shù)進(jìn)行T線包被，同時在NC膜 上另一確定位置以鐵蛋白抗體包被C線，后，將NC膜至于干燥間，其環(huán)境 為溫度20-25°C，濕度小于30%。干燥8-IO小時。
所述的人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其特征在于所述的鐵蛋白抗體標(biāo) 記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30—50nm 的膠體金顆粒溶膠，制備完成后取100ml膠體金液于燒杯內(nèi)，用0.2MK2C03 調(diào)至pH7.5，按100ml膠體金溶液加入0. 5mg鐵蛋白抗體，室溫攪拌2小 時，加入1%體積20% (m/V)牛血清白蛋白(BSA)， 0. 5%體積20% (m/V)聚 乙二醇(PEG) 20000封閉20min， 12000rpm離心30分鐘，棄上清，用膠體金 工作液復(fù)溶至76. 5ml，按lml溶液鋪22(^2的比例均勻地鋪在無紡布上，再 置于干燥間，其環(huán)境為溫度20-25。C，濕度小于30%。干燥2-4小時，制 成膠體金墊
所述的人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其特征在于所述的試紙的裝配方 法為在干燥室內(nèi)，溫度20-25°C，濕度小于30%，取PVC板，將己包被的 NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠 體金墊lmm)粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的2mm; 在NC膜C線一側(cè)搭接樣本吸收墊，搭NC膜Iran;最后用裁剪機(jī)將貼好塑料
4板切成3mm或4mm寬的試紙條，切好的試紙條可以裝入塑料卡內(nèi)，形成檢 測卡或盒內(nèi)，形成檢測卡或盒。
所述的人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其特征在于檢測方法為將被檢 血清、血漿或全血平衡至溫室，將試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入 24ul血清或血漿，或40ul全血，并加入16ul樣本稀釋液，樣品溶解膠體 金并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在25-30分鐘內(nèi)C、 T線的反應(yīng) 情況，比對比色卡，'并判定檢測結(jié)果。
本實用新型的有益效果是提供一種利用膠體金免疫層析技術(shù)實現(xiàn)半 定量監(jiān)測人血清鐵蛋白體外檢測試劑，具有操作簡便、設(shè)備及環(huán)境依賴少、 反應(yīng)快速、半定量準(zhǔn)確度高、特異性好、適合現(xiàn)場快速檢測和經(jīng)濟(jì)實用等 優(yōu)點。


圖l:人血清鐵蛋白體外檢測試劑試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
1:上樣墊 2:膠體金墊
3: NC膜 4:樣本吸收墊
5:檢測線(T線) 6:質(zhì)控線(C線)
7: PVC板 .
具體實施方式
實施例制備人血清鐵蛋白體外檢測試劑 1.主要材料
1.1 鼠源鐵蛋白抗體芬蘭MedixMAB公司產(chǎn)品，用于膠體金標(biāo)記；
配對鼠源鐵蛋白抗體芬蘭MedixMAB公司產(chǎn)品，用于NC膜包被； 氯金酸(HAuCl4)，檸檬酸三鈉，牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇(PEG) 20000， 美國sigma公司產(chǎn)品。NC膜美國Millipore公司產(chǎn)品，型號為HF135。其 它常用試劑，分析純
1. 2臨床經(jīng)ELISA測定鐵蛋白濃度的定值血清50份 2方法
2.1鼠抗鐵蛋白膠體金標(biāo)記，以氯金酸一檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40mn 的膠體金溶液，制備完成后取三份等體積膠體金，分別用0.2MK2C03將溶液 調(diào)到pH7.5、 pH8.0和pH9.0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按 每100ml溶液加入0. 3mg、 0. 5mg、 1. Omg鐵蛋白抗體緩慢滴加到膠體金溶 液中，繼續(xù)攪拌0. 5小時，再滴加入到終濃度為0. 1%的PEG2000和0. 2%的
5BSA進(jìn)行封閉30min，標(biāo)記結(jié)束后以12000 r/m離心，棄上清，沉淀按原體 積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液(Tris緩沖液，pH7. 3，含一定量的酪蛋白 和表面活性劑)中。然后將標(biāo)記膠體金溶液按lml溶液鋪22cm2的比例加樣 于無紡布上，在溫度20-25°C ，相對濕度在<30%的干燥間干燥2-4小時， 制成膠體金墊。
2. 2鼠抗鐵蛋白的包被，用pH=7. 3 ， 0. 003M PB將鼠抗鐵蛋白分別稀釋成 0. lmg/ml、0. 2mg/ml、0. 5mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜固定位是按0. 09ul/mra 進(jìn)行劃線包被，同時在NC膜另一固定位置包被配對抗鐵蛋白抗體，用于產(chǎn) 品的質(zhì)控，包被完成后將NC膜在在溫度25t，相對濕度在<30%的干燥間 干燥8小時。
2. 3鐵蛋白快速檢測試紙的組裝，在干燥室內(nèi)(溫度20-25°C，相對濕度 <30%)取PVC基板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在 NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊lmm粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭 接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的2mm);在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭樣本 吸收墊的2mm);然后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成3mm或4ram寬的試紙條。 切好的試紙條可以再裝入塑料卡或盒內(nèi)，形成檢測卡或盒。
2. 4檢測方法將被檢血清、血漿或全血平衡至溫室，將試紙條或試劑卡 平放，在上樣墊上加入24ul血清或血漿，或40ul全血，并加入16ul樣本 稀釋液，樣品溶解膠體金并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在10mins、 15mins、 20mins、 25mins， 30mins， C、 T線的反應(yīng)情況,比對比色卡，并 判定檢測結(jié)果。
2. 5試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標(biāo)記、包被的試劑進(jìn)行組合配對， 制備小樣，利用質(zhì)控血清對試劑進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)最佳組合。 3結(jié)果
3. l試紙參數(shù)確定，根據(jù)小樣的檢測結(jié)果，確定了空白金最佳標(biāo)記pH值為 7.5;鐵蛋白的最佳標(biāo)記量為0.5mg/100ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作 液為100mMTris-Cl緩沖液，pH7. 3，含0. 5%酪蛋白,2%蔗糖，0. 2%吐溫-20; 最佳鐵蛋白包被濃度為0.2 mg/ml。檢測結(jié)果的最佳判定時間為25分鐘。 3. 2臨床血清檢測，以ELISA試劑為對照，50份ELISA定值血清中，本試 劑肉眼定值和ELISA試劑相比無顯著性差異。
權(quán)利要求1、一種人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其特征在于由PVC板(7)上粘貼上樣墊(1)，膠體金墊另一端連接包被有彼此分離的檢測線T線和質(zhì)控線C線的的硝酸纖維素(NC)膜，T線包被有鐵蛋白抗體，C線包被為抗鼠免疫球蛋白G(IgG)，NC膜(3)另一端連接樣本吸收墊(4)形成試紙條構(gòu)成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其特征在于所 述鐵蛋白抗體來源于小鼠腹水，經(jīng)蛋白純化獲得；其標(biāo)記及包被濃度可隨 檢測靈敏度及檢測濃度范圍而變化設(shè)定。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其特征在于所 述上樣墊(1)為無紡布，樣本吸收墊(4)為吸水濾紙。
專利摘要本實用新型涉及免疫學(xué)診斷用實用領(lǐng)域，特別涉及一種人血清鐵蛋白體外檢測試劑，其由塑料支撐板(PVC板)上粘貼上樣墊，上樣墊一端連接含有鐵蛋白抗體標(biāo)記的膠體金墊，膠體金墊另一端連接包被有彼此分離的檢測線T線和質(zhì)控線C線的的硝酸纖維素(NC)膜，T線包被有鐵蛋白抗體，C線包被為抗鼠免疫球蛋白G(IgG)，NC膜另一端連接樣本吸收墊形成試紙條構(gòu)成。試紙條亦可以裝入塑料卡中形成卡式內(nèi)包裝。此診斷試劑用于人血清鐵蛋白的檢測，具有操作簡便、設(shè)備及環(huán)境依賴少、反應(yīng)快速、半定量、準(zhǔn)確度高、特異性好、適合現(xiàn)場快速檢測和經(jīng)濟(jì)實用等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/532GK201348633SQ20082014179
公開日2009年11月18日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者洲 李, 楊發(fā)青, 王之嬰 申請人:天津中新科炬生物制藥有限公司