Cd44靶向性多肽及其在制備用于篩選早期胃癌的親和探針中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種CD44靶向性多肽及其在制備用于篩選早期胃癌的親和探針中的應用，該多肽包括WHPWSY的氨基酸序列，本發(fā)明所述多肽能夠與胃癌生物標記分子CD44特異性結合，可以作為親和探針并聯(lián)合普通光學內(nèi)窺鏡或共聚焦熒光顯微內(nèi)鏡實現(xiàn)對胃癌的高效篩查，克服了目前常規(guī)光學內(nèi)窺鏡對于面積較大的胃粘膜可疑病變，只能采取隨機多點活檢的方法的不足，能在胃鏡檢查中實現(xiàn)胃癌的早期、實時和定位診斷，臨床應用價值較高。
【專利說明】CD44靶向性多肽及其在制備用于篩選早期胃癌的親和探 針中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及在內(nèi)窺鏡下實現(xiàn)分子影像學胃癌早期診斷用多肽試劑，具體涉及CD44 靶向性多肽及其在制備用于篩選早期胃癌的親和探針中的應用。

【背景技術】
[0002] (1)胃癌早期診斷的困境
[0003] 我國胃癌病人接受:治療時普遍病期偏晚，5年生存率僅有30%左右，而早期胃癌 (Earlygastriccancer，EGC)患者的總生存率高達90%，而10年復發(fā)率則只有2-3%，因 此早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是提高胃癌療效的關鍵。但除了日本和韓國由于全國性的胃癌內(nèi)鏡 篩查發(fā)現(xiàn)了較大比例的早期胃癌，其他國家早期胃癌的檢出率都比較低，即使歐美發(fā)達國 家也只有15-20%。造成這種情況的原因主要有以下兩方面因素：
[0004] 1)早期胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學特性
[0005] 胃癌的發(fā)生是一個多因素參與、多途徑引起、多步驟發(fā)生的復雜過程，是環(huán)境因 素和遺傳因素共同作用于機體產(chǎn)生的結果。目前較為認可的胃癌的發(fā)生模式是1988年 Correa提出的：正常胃黏膜-淺表性胃炎-萎縮性胃炎-小腸型腸上皮化生-輕度不典型 增生（Lowgradedysplasia,LGD)-重度不典型增生（highgradedysplasia,HGD)-胃癌 (腸型）。這是一個連續(xù)的、漫長的病理學過程。
[0006] 2008年，荷蘭的一項包括超過90000名研究對象的全國性隊列研究發(fā)現(xiàn)，在5年的 隨訪中，萎縮性胃炎、輕中度不典型增生、重度不典型增生患者的胃癌發(fā)病率分別以3. 5%、 0. 6%、6%的速度呈階梯式的增加，其中重度不典型增生患者有40. 14%的患病風險率?？?見，對于重度不典型增生患者的胃鏡篩查是發(fā)現(xiàn)早期胃癌的關鍵。
[0007] 2)常規(guī)胃鏡診療技術的缺陷
[0008] 目前，胃鏡檢查仍是胃癌最直接、準確、可靠的診斷方法，但是常規(guī)的胃鏡+活檢 組織病理學的診斷模式存在以下缺點：①早期胃癌診斷率低，漏檢率、誤診率高。首先，胃癌 的癌前病變往往涉及胃粘膜廣泛區(qū)域，常規(guī)的內(nèi)鏡活檢采取分段、隨機多點取樣方法，漏檢 局灶癌變組織的可能性很大，特別是經(jīng)驗缺乏的內(nèi)鏡醫(yī)生則更容易出現(xiàn)"視癌不見";其次， 在顯微鏡下對于不典型性增生和早期胃癌的判定需要大量的病例積累、訓練，在不同的病 理醫(yī)生間或者同一病理醫(yī)生多次診斷同一組胃鏡活檢標本，都存在著一定的差異；②內(nèi)鏡 技術的物理學進展并沒有和腫瘤分子生物學研究進展融合。目前內(nèi)鏡檢查方法進展很多， 如放大內(nèi)鏡、染色內(nèi)鏡、超聲內(nèi)鏡、熒光內(nèi)鏡、近紅外線電子內(nèi)鏡、窄譜成像技術、共聚焦激 光顯微內(nèi)鏡等都有在臨床應用，然而這些技術一些是提高成像精度、范圍，另一些雖能對病 灶進行突出顯像，但對于癌組織并無針對性，因此對病變性質(zhì)的判斷依舊依靠操作醫(yī)師的 經(jīng)驗。另一方面腫瘤發(fā)生，往往伴隨一些分子的變化，并且這些分子變化經(jīng)常發(fā)生在瘤形成 的早期，但如何去檢測這些分子變化也是擺在人們面前的一個重要問題。另外，這些方法在 臨床的應用都不久，大都缺乏循證醫(yī)學證據(jù)，沒有被廣泛認可的操作規(guī)范和診斷標準可依， 所以大都應用于臨床研究用，很難普及。③內(nèi)鏡下胃粘膜切除技術的發(fā)展也存在瓶頸。日本 早期胃癌治愈率的提高還得益于其內(nèi)鏡下粘膜切除手術的廣泛開展（EndoscopicMucosal Resection，EMR)，配合染色內(nèi)鏡和窄譜成像技術該手術能安全地切除直徑3cm以內(nèi)的胃粘 膜病變。由于比常規(guī)活檢能獲取更多的組織，EMR不但能提高早期胃癌的確診率，還可以選 擇性的治療小胃癌及微小胃癌。但是對于直徑超過5cm的癌前病變，應用該技術后出血及 胃穿孔的并發(fā)癥明顯高發(fā)，應用受限。如果能在EMR術中實時定位，確認癌變灶，進行選擇 性的病變粘膜切除，縮小粘膜切除的范圍，則有助于該技術的廣泛開展。
[0009] (2)噬菌體肽庫篩選腫瘤標志分子的靶向性多肽結合分子影像學可以診斷早期腫 瘤
[0010] 分子影像學（MolecularImaging)的概念出現(xiàn)于21世紀初期，可以被廣泛定義為 對活體的生物學過程在細胞和分子水平進行的描述和測量，其起源于分子生物學原理與活 體成像兩學科的交叉。與傳統(tǒng)的影像診斷不同，分子影像學展示了機體分子水平的異常而 不是去展示這種分子異常所帶來的最終結果，因此，分子影像學手段能在最早期發(fā)現(xiàn)疾病。 國外曾有研究者使用針對組織蛋白酶（其在肺癌高表達）的光學探針在小鼠模型中檢測出 直徑Imm的腫瘤。
[0011] 噬菌體肽庫技術（PhageDisplay)是一種非常成熟的多肽分子篩選技術，肽庫包 含超過109不同的多肽序列。大量的研究表明，以腫瘤抗原、細胞、離體及活體組織為靶點 進行篩選，能從肽庫獲得與靶分子特異性結合的抗體、配體以及組織、細胞特異性多肽，利 用這些特異性多肽聯(lián)合分子影像學技術，能實現(xiàn)腫瘤特異性的治療和早期定位診斷。該策 略在食管粘膜不典型增生、膀胱癌、結腸癌、前列腺癌和胰腺癌等腫瘤的研究中都取得了很 大進展，但是在上消化道惡性腫瘤的診斷、治療領域報導不多。
[0012] 要實現(xiàn)分子成像，需要以下幾個要素：1)具有合理藥物動力學的高親和力探針； 2)探針能夠穿過生物屏障（如細胞膜、血管等）到達靶點；3)能夠通過化學或者生物手段 將信號放大；4)能夠靈敏、快速、高分辨率的檢測探針的影像學技術。隨著各種影像學技 術的發(fā)展，目前分子影像學的關鍵是選擇合適的靶分子及獲得針對靶分子的特異性親和探 針。
[0013] (3)⑶44是胃癌細胞的重要生物標志物
[0014] ⑶44是一種細胞膜整合糖蛋白，在人類，由位于第11號染色體上的⑶44基因編 碼。作為透明質(zhì)酸（細胞外基質(zhì)的組成部分）的主要細胞受體，CD44與細胞間、細胞與外 基質(zhì)的相互作用有關，參與淋巴細胞歸巢、細胞外基質(zhì)粘附、T淋巴細胞活化、腫瘤擴散等一 系列過程。
[0015] 研究發(fā)現(xiàn)⑶44s在所有的正常胃組織中都有表達，然而在胃癌組織中⑶44v的表 達明顯高于正常胃組織和胃癌前病變組織，并且，在轉(zhuǎn)移的胃癌組織中可以發(fā)現(xiàn)尤其高的 ⑶44v表達。Fan.X等研究人員發(fā)現(xiàn)HP陽性的胃上皮細胞⑶44的表達陽性，并推測HP感 染可能通過誘導⑶44的表達而促進了胃癌的進展。Heider等曾對42例胃癌患者標本進行 免疫組織化學染色分析，發(fā)現(xiàn)在腸型胃癌中表達的CD44有v5及v6編碼的成分，而彌漫型 則僅含有v5,通過RT-PCR檢測組織中⑶44RNA的表達亦發(fā)現(xiàn)同樣的模式。Takaishi等鑒 定出三個CD44(+)胃癌細胞系，能夠在無血清培養(yǎng)基中形成球形克隆并具有在裸鼠胃及皮 膚中成瘤的能力，對⑶44的敲低則明顯抑制這種作用。這些細胞能夠自我更新、分化及形 成CD44(_)細胞的能力，并且對化療藥及放射引起的細胞死亡具有更大的抵抗力，這表明 ⑶44(+)胃癌細胞具有腫瘤干細胞特性，而且⑶44是胃癌細胞的重要生物標志物。
[0016] 申請者在斯坦福大學做博士后研究期間，以人類食管癌細胞株（SEg-I)為靶 細胞，從PHD7肽庫篩選出了一個7肽，該多肽能特異性識別Seg-I細胞，并能發(fā)現(xiàn)人類 Barrett食管標本中的癌變細胞（ShaoyingLu，Gastroenterology，2008;LuS,Cancer Biomark· 2008;LiM,Progressinbiomedicaloptics. 2009·)。該研究同時獲得了斯坦福 大學和密西根大學進行人體試驗的許可，進一步的臨床研究表明在熒光內(nèi)鏡觀察下該多肽 能夠特異性識別Barrett食管病變中的早期癌變組織，指導熒光內(nèi)窺鏡下的靶向性粘膜活 檢。該多肽目前已經(jīng)被斯坦福大學專利化（US61/128210)，并與奧林巴斯（Olympus)公司醫(yī) 學研究部門聯(lián)合進行新一代內(nèi)窺鏡的研發(fā)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明的目的在于提供一種CD44靶向性多肽及其在制備用于篩選早期胃癌的親 和探針中的應用。
[0018] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：
[0019] 一種CD44靶向性多肽，該多肽包括如SEQ.ID.NO. 1所示的氨基酸序列。
[0020] 所述多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示。
[0021] 上述CD44靶向性多肽在制備用于篩選早期胃癌的親和探針中的應用。
[0022] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0023] 本發(fā)明所述多肽能夠與胃癌生物標記分子CD44特異性結合，可以作為親和探針 并聯(lián)合熒光內(nèi)窺鏡或激光共聚焦顯微內(nèi)鏡實現(xiàn)對胃癌的高效篩查，克服了目前常規(guī)光學內(nèi) 窺鏡對于面積較大的胃粘膜可疑病變，只能采取隨機（盲目）多點活檢的方法的不足，能在 胃鏡檢查中實現(xiàn)胃癌的早期、實時和定位診斷，臨床應用價值較高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為ELISA實驗驗證展示序列WHPWSYLWTQQA的噬菌體對⑶44蛋白親和的結果； 圖1中：⑶44/BSA表示序列對⑶44親和力和對牛血清蛋白親和力的比值。
[0025] 圖2為細胞免疫熒光實驗結果。
[0026] 圖3為基序WHPWSY與⑶44透明質(zhì)酸結合域的分子對接方式預測（3D模式）；圖3 中：Cl?C3分別為結合位點Cavityl?Cavity3,共有序列在Cl?C3中為球棍模型的較 小分子。
[0027] 圖4為在熒光內(nèi)窺鏡下聯(lián)合使用多肽探針實現(xiàn)胃食管連接處早期胃癌（賁門
[0028] 癌）的定位診斷和靶向性活檢結果。

【具體實施方式】
[0029] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細說明。
[0030] ( -）利用噬菌體展示肽庫技術，以人源性⑶44(該分子在胃癌組織表達明顯高于 胃正常組織及癌前病變）純化蛋白為靶點篩選出⑶44特異性12肽WHPWSYLWTQQA(TrpHis ProTrpSerTyrLeuTrpThrGlnGlnAla)〇
[0031] 該12肽在酶聯(lián)免疫實驗（參見圖I)、細胞免疫熒光實驗（參見圖2)中均表現(xiàn)出 對CD44良好的特異性和親和力，由于在篩選出的針對CD44的另一條特異性多肽序列中也 發(fā)現(xiàn)六肽基序WHPWSY，故猜測該12肽可能是通過六肽基序WHPWSY與⑶44結合，因此，對兩 者利用軟件（MolegroVirtualDocker、
[0032] LigPlus)進行了分子對接，結果顯示兩者在構型及能量上均有良好的結合特性 (參見圖3以及表1)。
[0033] 由圖1可以看出，展示多肽WHPWSYLWTQQA的噬菌體對⑶44特異性結合，而對牛血 清蛋白（BSA)無明顯結合，未展示序列的空噬菌體（WT)并未表現(xiàn)對CD44的特異性結合。 根據(jù)⑶44/BSA可以得出該序列（WHPWSYLWTQQA)對⑶44的親和力是對無關蛋白親和力的 6倍多，具有較高的特異性。
[0034] 由圖2可以看出，插入序列WHPWSYLWTQQA的噬菌體克隆對GV146-⑶44質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293細胞特異性結合（參見圖2A);對轉(zhuǎn)染GV146空質(zhì)粒HEK293細胞則幾乎不結合（參 見圖2C);無關對照噬菌體克隆對GV146-CD44轉(zhuǎn)染HEK293細胞（參見圖2E)和GV146空 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細胞（參見圖2G)均僅有微弱結合；圖2B(與圖2A對應）、圖2D(與圖 2C對應）、圖2F(與圖2E對應）、圖2H(與圖2G對應）為DAPI染細胞核。
[0035] 表1基序WHPWSY與⑶44透明質(zhì)酸結合域在3個可能結合位點的分子對接數(shù)據(jù)
[0036]

【權利要求】
1. 一種⑶44靶向性多肽，其特征在于：該多肽包括如SEQ. ID. NO. 1所示的氨基酸序 列。
2. 根據(jù)權利要求1所述一種CD44靶向性多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如 SEQ. ID. NO. 2 所示。
3. -種如權利要求1或2所述CD44靶向性多肽在制備用于篩選早期胃癌的親和探針 中的應用。
【文檔編號】C07K7/08GK104327161SQ201410497787
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權日:2014年9月25日
【發(fā)明者】祿韶英, 賈環(huán), 王燕, 張丹, 李偉明, 關昊 申請人:西安交通大學