柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產(chǎn)毒條件的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產(chǎn)毒條件。本發(fā)明保藏號為CCTCC M2014484的柑橘褐斑病菌，用于提取粗毒素，所得柑橘褐斑病菌粗毒素含量高、純度高，產(chǎn)量大，周期短，易于規(guī)?；苽洹４送?，用毒素代替病原菌作為研究對象，可以避免消除生物間的相互干擾和交叉污染等。本發(fā)明建立了一套簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的柑橘褐斑病菌毒素提取方法，為該病菌及其毒素的致病機理研究奠定了良好的基礎(chǔ)。CCTCC M201448420141015
【專利說明】柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產(chǎn)毒條件

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和產(chǎn)毒條 件。

【背景技術(shù)】
[0002] 病原真菌在與寄主植物相互作用的過程中能產(chǎn)生引起寄主生理生化反應(yīng)的代謝 產(chǎn)物，主要包括酶、激素和毒素。其中毒素具有對寄主植物誘發(fā)病害的敏感性誘導(dǎo)因子，是 近幾年研究的熱點。病原真菌產(chǎn)生的毒素根據(jù)其對寄主致病范圍不同可分為寄主選擇性毒 素（HST)和非寄主選擇性毒素（NHST)。目前已知約20種病原真菌產(chǎn)生HST，其中大多數(shù) HST是病原菌的次級代謝產(chǎn)物。1933年Tanaka從梨黑斑病菌-菊池鏈格孢（Alternaria kikuchiana)中首次分離到鏈格孢菌產(chǎn)生的HST-AK毒素（Tanaka)。引起柑橘褐斑病的鏈 格孢菌主要是橘致病型鏈格孢菌，其專化性為害橘及其雜種，產(chǎn)生ACT毒素。Nakatsuka等 于1989年，純化了該病菌產(chǎn)生的毒素并將其命名為ACT毒素 I b和II b。其中I b是主要 成分。ACT毒素由三個部分組成即EDA(9, 10-環(huán)氧基-8-羥基-9-甲基三烯酸）、纈氨酸和 一個聚酮化合物。Kohmoto等研究發(fā)現(xiàn)在理查德培養(yǎng)基中25°C，靜置培養(yǎng)24d產(chǎn)毒量最高， 同時在培養(yǎng)基中加入微量的Zn 2+，能增加產(chǎn)毒量。目前已知的病原菌毒素均為有機類物質(zhì)， 因此可以通過萃取、層析、色譜等方法提取。優(yōu)化病菌產(chǎn)生毒素的條件是研究病原物生物學(xué) 特性的重要方面，對毒素的大量制備與提取等研究工作有重要作用。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有提取柑橘褐斑病菌粗毒素的相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種適合該柑橘褐斑病菌提取粗 毒素的技術(shù)和產(chǎn)毒條件，為研究柑橘褐斑病菌粗毒素的生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明首先公開了一種柑橘褐斑病菌株，其保藏號為：CCTCC M 2014484。
[0006] 本發(fā)明從采自重慶萬州陳家壩紅橘果實中分離篩選到一柑橘褐斑病菌株 CJBHJF-2,該菌株已于2014年10月15日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2014484。在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈灰色至橄欖色或青褐色，分生孢子梗單生或數(shù)根簇生， 直立或頂端微彎曲，有分隔，未見分枝，色澤從基部到頂部深褐色漸變?yōu)闇\褐色，分生孢子 單生或鏈生，倒棍棒形、倒梨形或近橢圓形，淡褐色至褐色，具縱橫隔膜，幼齡孢子多為卵圓 形，顏色淡褐色，〇?1個橫隔，老齡孢子多為棍棒形，顏色深褐色或黑褐色，縱橫隔膜較多。
[0007] 經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternata (Fr.) Keissler]，在柑橘上引起褐斑病，命名為柑橘褐斑病菌CJBHJF-2,中國典 型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2014484。所述柑橘褐斑病菌，生物學(xué)特性穩(wěn)定， 菌株產(chǎn)毒量高。
[0008] 本發(fā)明第二方面公開了從柑橘褐斑病菌中提取粗毒素的方法，具體包括以下步 驟：
[0009] (1)產(chǎn)毒培養(yǎng)：轉(zhuǎn)接柑橘褐斑病菌于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至形成菌落，然后取一定大 小的菌絲塊，于液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，至菌絲開始變黑，得產(chǎn)毒培養(yǎng)液；
[0010] (2)濾液制備：將步驟（1)中所得產(chǎn)毒培養(yǎng)液，過濾除去菌絲，離心棄去沉淀，上清 液即為培養(yǎng)濾液；
[0011] (3)粗毒素提取：采用小分子萃取法，在步驟（2)中所得培養(yǎng)濾液中加入有機溶 齊?，萃取，去除有機溶劑，得濃縮物。然后將濃縮物復(fù)溶于水中，得粗毒素。
[0012] 優(yōu)選的，步驟⑴中，所述柑橘褐斑病菌為CJBHJF-2,其保藏號為：CCTCC Μ2014484。
[0013] 優(yōu)選的，步驟（1)中，PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的方式為：28°C，連續(xù)黑暗，培養(yǎng)5?7d。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述液體培養(yǎng)基選自PSK培養(yǎng)基、理查德培養(yǎng)基、改良理查德 培養(yǎng)基、Fries培養(yǎng)基或改良Fries培養(yǎng)基中的任意一種。更優(yōu)選為改良理查德培養(yǎng)基。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（1)中，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為5?30d，更優(yōu)選為8?10d。
[0016] 優(yōu)選的，步驟（1)中，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溫度為10?35°C，更優(yōu)選為28°C。
[0017] 優(yōu)選的，步驟（1)中，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的光照條件為連續(xù)光照、12光照/12h黑 暗或全黑暗，更優(yōu)選為連續(xù)光照。
[0018] 優(yōu)選的，步驟（1)中，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方式為靜置培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)，更優(yōu)選 為振蕩培養(yǎng)，最優(yōu)選為ll〇r/min振蕩培養(yǎng)。
[0019] 優(yōu)選的，步驟（1)中，液體培養(yǎng)基的pH值為3?7,更優(yōu)選為4?5。
[0020] 優(yōu)選的，步驟（3)中，所述有機溶劑選自丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿或四氯化碳中 的任意一種或多種。更優(yōu)選甲醇。
[0021] 優(yōu)選的，步驟（3)中，所述有機溶劑與培養(yǎng)濾液等體積。
[0022] 優(yōu)選的，步驟（3)中，去除有機溶劑時采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法。
[0023] 本發(fā)明第三方面公開了由前述方法提取獲得的柑橘褐斑病菌粗毒素。
[0024] 本發(fā)明第四方面公開了前述柑橘褐斑病菌在提取柑橘褐斑病菌粗毒素中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0026] 本發(fā)明系統(tǒng)比較了時間、溫度、光照、通氣量、pH值和培養(yǎng)基，優(yōu)化了柑橘褐斑病菌 毒素的產(chǎn)生條件。該方法比較了丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳五種萃取劑，甲醇萃 取效果最好。選擇甲醇作萃取劑，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除有機溶劑，方法簡單易行，操作簡便， 成本低。所得柑橘褐斑病菌粗毒素含量高、純度高，產(chǎn)量大，周期短，易于規(guī)模化制備。此外， 用毒素代替病原菌作為研究對象，可以避免消除生物間的相互干擾和交叉污染等。本發(fā)明 建立了一套簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的柑橘褐斑病菌毒素提取方法，為該病菌及其毒素的致病機理 研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0027] 本發(fā)明菌株保藏信息如下：
[0028] 菌株名稱：CJBHJF-2 ;
[0029] 保藏號為：CCTCC M 2014484。
[0030] 保藏日期：2014年10月15日；
[0031] 保減單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保減中心；
[0032] 保藏單位簡稱：CCTCC ;
[0033] 保藏單位地址：武漢市武昌珞珈山街道武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1有機溶劑萃取柑橘褐斑病菌毒素致病性測定
[0035] 圖2不同培養(yǎng)時間對柑橘褐斑病菌產(chǎn)毒的影響
[0036] 圖3不同培養(yǎng)溫度對柑橘褐斑病菌產(chǎn)毒的影響
[0037] 圖4不同培養(yǎng)條件對柑橘褐斑病菌產(chǎn)毒的影響
[0038] 圖5不同pH值對柑橘褐斑病菌產(chǎn)毒的影響
[0039] 圖6不同培養(yǎng)基對柑橘褐斑病菌產(chǎn)毒的影響
[0040] 圖7接種ACT毒素后兩天葉片癥狀

【具體實施方式】
[0041] 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0042] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個"、"一"和"這個"包括復(fù)數(shù)形式。
[0043] 當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0044] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego, 1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0045] 實施例I產(chǎn)毒菌株的篩選
[0046] I. 1.菌株與植物
[0047] 供試菌株：CJBHJF-2、TJCHJ35B、CJBHJL-2、SP-36等29個菌株分離自重慶、西班 牙、廣東、廣西、浙江等地的褐斑病典型發(fā)病葉片、枝條和果實。
[0048] 生物測定材料：采自網(wǎng)室內(nèi)1年生3?4cm長紅橘葉片。
[0049] 試驗中涉及的培養(yǎng)基配方：
[0050] PDA培養(yǎng)基（PDA Medium):馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，加蒸餾水定容至 IL0
[0051] PSK培養(yǎng)基（PSK Medium):馬鈴薯200g，蔗糖30g，K2HPO4Ig,加蒸餾水定容至1L。
[0052] 理查德培養(yǎng)基（Richard，s Medium):蔗糖 50g，KNO3IOg, KH2P045g，MgS042. 5g， FeCl2O. 02g，加蒸饋水至1L。
[0053] 改良理查德培養(yǎng)基（Improved-Richard Medium):葡萄糖 50g，KNO3IOg, KH2P045g， MgS042. 5g，F(xiàn)eCl2O. 02g，ZnSO4O. 005g，加蒸餾水至 1L。
[0054] Frie' s培養(yǎng)基（Frie' s Medium):鹿糖30g，酒石酸銨5g，酵母浸出液0. 5g， NH4NO3Ig, KH2PO4Ig, MgSO4. 7H20 0· 5g，NaCl 0· lg，CaCl2. H2O 0· lg，加蒸餾水至 1L。
[0055] 改良Frie's培養(yǎng)基（Improved-Fries Medium):鹿糖20g，酒石酸銨5g，酵母浸出 液 lg，NH4NO3Ig, KH2PO4Ig, MgSO4. 7H20 0· 5g，NaCl 0· lg，CaCl2. H2O 0· 13g，加蒸餾水至 1L。
[0056] 查彼克培養(yǎng)基（Czapek-Dox Medium):鹿糖 30g，NaN032g，K2HPO4Ig, KCl 0· 5g， MgSO4. 7H20 0· 5g，F(xiàn)eSO4O. Olg，加蒸餾水至 1L。
[0057] I. 2產(chǎn)毒培養(yǎng)方法
[0058] 轉(zhuǎn)接菌種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5?7d (28°C，連續(xù)黑暗），然后取一定大小的菌絲 塊放于盛有50ml改良Richard's液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C，12h光照/12h黑暗 (12L/12D)，110r/min培養(yǎng)8d，至菌絲開始變黑。
[0059] 1. 3粗毒素的制備及其接種方法
[0060] 粗毒素的制備方法：菌株按上述產(chǎn)毒方法培養(yǎng)后，先用4層紗布過濾，除去菌絲。 濾液經(jīng)15000r/min離心30min，得上清。上清中加入等體積甲醇，300r/min，萃取30min。 然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65°C蒸餾至近干，以去除甲醇，溶液用無菌水定容至5ml離心管中，經(jīng) 0.22 μ m濾膜過濾，得粗毒素。
[0061] 接種方法：采用離體葉片針刺法測定毒力。培養(yǎng)皿中放入無菌濾紙（Thomma 2003),并用無菌水浸濕，葉片放于其中。在距葉片中脈2cm處針刺,滴加50 μ 1粗毒素,保 鮮膜保濕，置于培養(yǎng)箱中一段時間，測量產(chǎn)生的病斑直徑。
[0062] 1. 4產(chǎn)毒菌株
[0063] 從本實驗室保存的29個鏈格孢菌株中篩選出兩個菌株。這兩個菌株用于產(chǎn)毒特 性試驗，同時比較國外和國內(nèi)的這兩個菌株的產(chǎn)毒條件是否有差異。
[0064] 實施例2產(chǎn)毒條件的優(yōu)化
[0065] 2.1萃取劑的選擇
[0066] 高產(chǎn)毒菌株按確定的產(chǎn)毒條件培養(yǎng)后，得到培養(yǎng)濾液。分別取15ml培養(yǎng)濾液加入 等體積的丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳，300r/min萃取30min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)去 除有機溶劑，得到的粗毒素用離體葉片針刺法進(jìn)行生測。
[0067] 2. 2產(chǎn)毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化
[0068] 2. 2. 1按實施例1中方法篩選出的菌株用于產(chǎn)毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化實驗。
[0069] 2. 2. 2時間：按實施例1中1.2方法在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5、10、15、20、25、30d取 樣，制備粗毒素。
[0070] 2. 2. 3溫度：按實施例1中1. 2方法分別于5、10、15、20、25、28、30、35°C條件下，在 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株一定時間，制備粗毒素。
[0071] 2. 2. 4光照條件：按實施例1中1. 2方法分別于連續(xù)光照、12L/12D、全黑暗三種條 件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株一定時間，制備粗毒素。
[0072] 2. 2. 5通氣量：分別于靜置和110r/min振蕩條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株一 定時間，制備粗毒素。
[0073] 2.2.6?!1值：調(diào)節(jié)改良1^1^(1'8培養(yǎng)基的？!1值為2、3、4、5、6、7，培養(yǎng)菌株一定 時間，制備粗毒素。
[0074] 2. 2. 7 培養(yǎng)基：PSK、Richard' s、改良 Richard' s、Fries、改良 Fries、Czapek 六種 培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，一定時間后制備粗毒素。
[0075] 各處理得到的粗毒素在用于生物測定前均可保存于4°C。離體葉片針刺法進(jìn)行 生物測定。以無菌水和經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾的培養(yǎng)基分別作為清水對照（CKO)和負(fù)對照 (CKl)。
[0076] 2. 3數(shù)據(jù)分析
[0077] 每個條件處理3個重復(fù)，離體葉片接種粗毒素兩天后拍照，應(yīng)用IMGEJ軟件計算 病斑直徑。實驗結(jié)果采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù) 的方差分析和多重比較。
[0078] 2. 4 結(jié)果
[0079] 2. 4. 1產(chǎn)毒菌株
[0080] 從本實驗室保存的29個鏈格孢菌株中篩選出兩個菌株：西班牙菌株SP-36和萬州 菌株CJBHJF-2。這兩個菌株用于產(chǎn)毒特性試驗。
[0081] 2. 4. 2萃取劑的選擇
[0082] 結(jié)果表明：不同的萃取劑分層特征不同（見表1)，萃取效果也不同（見圖1)。ACT 毒素是小分子物質(zhì)，主要存在于水相中。四氯化碳、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮這五種萃取 劑的極性分別是I. 60、3. 40、4. 30、5. 10、5. 40。由圖1可以看出，用極性強、與水互溶的甲醇 和丙酮萃取，均產(chǎn)生少量白色絮狀沉淀物。經(jīng)離心除去沉淀后的溶液基本為澄清狀態(tài)，把有 機溶劑和水的混合相經(jīng)減壓蒸發(fā)去除有機溶劑，分別將得到的濃縮物和離心獲得的沉淀物 復(fù)溶于水中進(jìn)行生物活性測定。甲醇有機相減壓蒸發(fā)后得到的濃縮物所產(chǎn)生的病斑直徑較 大，而絮狀沉淀引起的病斑較小，說明甲醇的有機相中含有大量的毒素，而且柑橘褐斑病菌 在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的毒素成分是小分子物質(zhì)，甲醇萃取效果最好。由此可知，毒素的極性 較大，在5. 10?5. 40之間。
[0083] 表1有機溶劑萃取柑橘褐斑病菌毒素有機相和水相的外觀性狀
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 一種柑橘褐斑病菌株，其保藏號為：CCTCC M 2014484。
2. -種從柑橘褐斑病菌株中提取粗毒素的方法，具體包括以下步驟： (1) 產(chǎn)毒培養(yǎng)：轉(zhuǎn)接柑橘褐斑病菌株于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至形成菌落，然后取一定大小 的菌絲塊，于液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，至菌絲開始變黑，得產(chǎn)毒培養(yǎng)液； (2) 濾液制備：將步驟（1)中所得產(chǎn)毒培養(yǎng)液，過濾除去菌絲，離心棄去沉淀，上清液即 為培養(yǎng)濾液； (3) 粗毒素提取：采用小分子萃取法，在步驟（2)中所得培養(yǎng)濾液中加入有機溶劑，萃 取，去除有機溶劑，得濃縮物。然后將濃縮物復(fù)溶于水中，得柑橘褐斑病菌粗毒素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，所述柑橘褐斑病菌株為 CJBHJF-2,其保藏號為：CCTCC M 2014484。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基選自PSK培養(yǎng)基、理查德 培養(yǎng)基、改良理查德培養(yǎng)基、Fries培養(yǎng)基或改良Fries培養(yǎng)基中的任意一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間 為5?30d ;于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溫度為10?35°C ;于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的光照條件為 連續(xù)光照、12光照/12h黑暗或全黑暗。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方式 為靜置培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟⑴中，液體培養(yǎng)基的pH值為3? 7。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，所述有機溶劑選自丙酮、甲 醇、乙酸乙酯、氯仿或四氯化碳中的任意一種或多種。
9. 一種由權(quán)利要求2-8任一項權(quán)利要求所述的方法制備獲得的柑橘褐斑病菌粗毒素。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑橘褐斑病菌株在提取柑橘褐斑病菌粗毒素中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/37GK104388319SQ201410578773
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】唐科志, 王玲杰, 李中安, 周常勇 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所