專利名稱：一種新的免疫診斷方法
豬囊尾蚴即豬肉絳蟲的幼蟲形式，其可感染人腦引起嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，即所說的神經(jīng)囊尾蚴病(NCC)。根據(jù)囊泡在顱內(nèi)的定位，可常見有下列臨床表現(xiàn)。
定位臨床癥狀后遺癥腦實質(zhì)癲癇占位性損傷(SOL)運動或感覺缺陷精神病大腦炎腦膜慢性腦膜炎腦積水腦神經(jīng)癱運動和感覺缺陷腦室SOL腦積水這里描述的所有臨床癥狀可由許多致病因素引起，神經(jīng)囊尾蚴病的常規(guī)鑒別診斷是神經(jīng)系統(tǒng)的結核分支桿菌感染。這種疾病的診斷是基于對頭顱的放射學檢查。顱內(nèi)死亡的鈣化囊泡在X光下顯示為致密的射線不透過性損傷，而活囊泡在計算機控制的斷層掃描圖(CAT-SCAN)上則呈現(xiàn)為低密度或高密度損傷。近年已使用中樞神經(jīng)系統(tǒng)的磁諧振圖象技術觀察活的囊泡。能否通過這些影象鑒定出囊泡，主要取決于囊泡的大小及周圍宿主組織的反應情況。但在流行這種疾病的許多發(fā)展中國家，大多不容易得到這種圖象裝置，而迫切需要建立一種更為簡單的診斷方法。因此，要求有一種能夠?qū)⑸窠?jīng)囊尾蚴病與其他神經(jīng)病鑒別開的免疫診斷試驗法。已有的免疫學試驗大多都是基于檢測抗特定生物體原之抗體的。此外，許多試驗都是作為流行病學調(diào)查的手段而建立的血清診斷試驗，而且已有這些試驗均不適于用作神經(jīng)囊尾蚴病的特異性診斷方法。
試驗的特異性和敏感性主要取決于試驗中使用的抗原。本發(fā)明描述了一種制備能提高免疫診斷之特異性和敏感性的豬囊尾蚴抗原的方法。
可作為囊泡的總勻漿液(1)，或囊泡固體部分即泡壁與頭節(jié)或單純泡壁的勻漿液(2)來制備豬肉絳蟲幼蟲的粗提物。某些情況下，也可用囊泡作為抗原(3)。該勻漿液通常要以15，000-20，000g離心15至30分鐘，以除去細胞碎片和核等。用丙酮提取勻漿液除去大部分脂類，并用于補體結合試驗(4)。這些粗提物和總抗原可用于許多免疫檢測法中，如被動血凝試驗(5、3)、免疫電泳(1)和酶聯(lián)免疫吸收試驗〔(ELISA)(1，6和7)〕。
Kuhn等人(8)描述了使用囊泡的總勻漿液所作的ELISA試驗，并將試驗的敏感性歸因于一組蛋白質(zhì)抗原。這些抗原未經(jīng)純化，也沒有試驗它們的特異性?？倓驖{液除含有可看到的并經(jīng)Western印跡法鑒定為免疫性材料的蛋白質(zhì)外，還含有脂類及碳水化合物。其中沒有證實非蛋白質(zhì)抗原濃度對ELISA之總體敏感性的影響。雖然在ELISA試驗中使用了表現(xiàn)有纖維結合素性質(zhì)的單一抗原(抗原B)，但其敏感性不能令人滿意(9)。
在免疫診斷中，使用寄生蟲的總勻漿液作為抗原有幾個方面的缺點;(ⅰ)它含有幾個能與其他CNS病原體發(fā)生免疫學交叉反應的抗原決定基;(ⅱ)已證明幾種寄生蠕蟲共有交叉反應性抗原(10)。在發(fā)展中國家如印度、墨西哥、巴西、中國、泰國及中非和亞洲國家，人群中寄生蟲感染是很普遍的，許多人體內(nèi)都攜帶抗這種交叉反應性抗原的血清抗體。當這些人感染了能打破血腦屏障的疾病時，血清抗體即可進入腦脊髓液(CSF)中，干擾囊尾蚴病的診斷，導致假陽性結果。
考慮到總勻漿液缺乏特異性，而試圖鑒定并純化種和組織特異性抗原，即得自頭節(jié)和囊泡液的抗原。作為豬肉絳蟲種特異性抗原，已鑒定了表觀分子量為大約26，000和8，000的兩種多肽。這些抗原在免疫印跡試驗中可與得自受豬肉絳蟲感染之病人的血清反應，但不與受其他蠕蟲感染之病人的血清反應(11)。這些抗原的特異性或?qū)ζ渌嚓PCNS疾病的敏感性尚未被證實。已證明使用抗囊泡液總蛋白的單克隆抗體由囊泡液中純化的抗原在免疫診斷中是很特異的，但用于檢測NCC則缺乏敏感性(12)。使用單克隆抗體純化的表觀分子量約為80，000和10，000的頭節(jié)特異性蛋白質(zhì)，在囊尾蚴病的血清學診斷中有100%的敏感性。據(jù)稱這些抗原可用于區(qū)分絳蟲病和囊尾蚴病，但其在鑒別神經(jīng)囊尾蚴病與其他系統(tǒng)性囊尾蚴病中的作用則沒有得到證實(13)。
本發(fā)明人在實驗室中進行的一項研究進一步說明了用總勻漿液作抗原的缺點(14)，現(xiàn)總結如下制備囊泡勻漿并用超聲處理(8×30秒脈沖)。將勻漿溶解于1%SDS中并于100℃下用1%β-巰基乙醇處理，然后在SephacrylS-300柱上進行凝膠過濾，分離成三個部分
部分Ⅰ分子量大于66KD的囊泡抗原部分Ⅱ分子量在25-66KD之間的囊泡抗原部分Ⅲ分子量在14-35KD之間的囊泡抗原

圖1在10%SDS-PAGE上分析得自凝膠過濾的三個峰值部分。泳道1第3個峰;泳道2第2個峰;泳道3第1個峰;泳道4分子量標志(94、67、43、30、20.1和14.1KD)。這三個部分的分子量范圍已在文中給出。
使用囊尾蚴抗原的上述三個部分按下述方法進行ELISA試驗由各種神經(jīng)病人隨機收集150份CSF樣品并對這三個部分進行檢測。以濃度為5μg/ml(100μl/小井)的抗原(在50mM碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中)將96小井微量滴定板(Dynatech)包被過夜。用2%BSA封閉未包被部分并以1/25、1/125和1/625倍稀釋液檢測CSF。使用兔抗人IgG過氧化物酶結合物(Sigma，1∶1000稀釋)顯示結合的人IgG。使用鄰苯二胺作顯色劑(4mg/10ml)，0.3%H2O2作底物。
表1中總結了這150份樣品的試驗結果。
由這些數(shù)據(jù)可得出下列結論雖然試驗對于識別所有神經(jīng)囊尾蚴病例是足夠敏感的，但在結核性腦膜炎的病例中出現(xiàn)了最大假陽性結果。因此，當有這兩種疾病流行時，該試驗是不適用的。
所顯示的結核性腦膜炎CSF與囊泡抗原的反應，是由于分支桿菌與囊泡抗原之間的交叉反應性。
1.結核分支桿菌超聲處理產(chǎn)物可抑制囊尾蚴病陽性CSF與囊泡抗原的結合，但沒有全部消除此反應。
2.這種抑制作用隨著分支桿菌抗原濃度的增加而增加。
3.抗分支桿菌超聲處理產(chǎn)物的兔抗血清可與囊泡抗原反應。
上述觀察表明，粗抗原確實含有與其他CNS病原體發(fā)生交叉反應的抗原決定基。
囊尾蚴是不同于單細胞微生物的多細胞生物體，其不能被巨噬細胞或粒細胞或其他抗原呈現(xiàn)細胞所吞噬和處理。因此，人類免疫系統(tǒng)很少能獲得對該寄生蟲之所有蛋白質(zhì)的敏感性，特別是在免疫學上特殊的部位如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)更是如此。為此，由這些寄生蟲分泌進入宿主體液內(nèi)的抗原(稱為E-S抗原)在免疫學上是很重要的。許多寄生蠕蟲的E-S抗原是通過在組織培養(yǎng)基中維持各發(fā)育階段的蠕蟲并由生長培養(yǎng)基中純化而得到的(15)。也可于體外用血清和組織提取物維持豬囊尾蚴的生長(16)。可以在Dulbecco氏基本培養(yǎng)基(DMEM)和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中短時期保持這些寄生蟲并用C氨基酸激動之，表明它們是具有代謝活性的(17)。但在培養(yǎng)基中只檢測到很少量放射活性標記的蛋白質(zhì)，并且沒有試驗過這些抗原在免疫診斷中的實用性。
本發(fā)明是基于由體外保持寄生蟲得到的豬囊尾蚴E-S抗原可能與作為囊泡體內(nèi)代謝過程之一部分而排泄/泌出囊泡的抗原密切相關這一假定而建立的。因此，它們可能為基于檢測病人體液如CSF和血清中抗體而設計的免疫診斷試驗提供特異性和敏感性?？稍诓∪说腃SF中找到這些抗原的同種抗原或降解產(chǎn)物，這就為基于抗原檢測而設計免疫診斷方法提供了基礎。顯然有可能制得抗E-S抗原的多克隆單一特異性抗體或單克隆抗體，然后將其用于這種抗原檢測試驗中，由于其中有些抗原可為宿主提供保護性免疫力，故可將這些抗原制成能預防豬囊尾蚴感染的疫苗。
本發(fā)明描述了一種在無血清細胞培養(yǎng)基中長期保持豬囊尾蚴的方法，以及使用由寄生蟲產(chǎn)生并泌入培養(yǎng)基中的抗原對NCC進行免疫診斷的方法，該方法包括使病人的CSF與E-S抗原相互反應。這里強調(diào)的是，在鑒定NCC中使用該抗原沒有受到其他形式之全身性囊尾蚴病的干擾。這種新的診斷方法也可用于診斷肉豬的豬囊尾蚴感染。
囊泡的來源和維持由屠宰場得到感染囊尾蚴的豬肌肉。用乙醇洗去肌肉表面上的污染物。在不破壞囊泡壁的情況下切下囊泡(如囊泡被破壞則應棄去)并置于每毫升含1000單位青霉素G、40μg慶大霉素和5μg兩性霉素B的鹽水中。用含上述抗生素的鹽水徹底清洗囊泡。然后再用無血清RPMI1640培養(yǎng)基或含Earles鹽或Hank′s鹽的Eagles基本培養(yǎng)基(MEM)洗滌。將囊泡放在每毫升含1000單位青霉素G和40μg慶大霉素的RPMI1640或Eargles MEM中，于37℃下在5%CO2環(huán)境中保溫。
E-S抗原的收集在前24-60小時內(nèi)，至少更換兩次培養(yǎng)基，以確保完全除去宿主成分。一般可在前48小時內(nèi)更換兩次培養(yǎng)基。在囊泡開始外凸之前以一定間隔期收集培養(yǎng)基。實踐中最好每24小時收集一次。通過在倒置顯微鏡下觀察囊壁收縮情況以監(jiān)測囊泡的存活力。第六天后可觀察到囊壁外凸。收集培養(yǎng)基后立即以104，000g離心60分鐘，以除去不溶性碎片及膜污染物。向上清液內(nèi)加入對位甲基磺酰氯(2mM)、對氯苯甲酸汞(0.06%)及使pH保持在7-7.4的90%飽和度硫酸銨。于4℃下沉淀，然后以15，000g4℃離心30分鐘收集沉淀物。將沉淀物溶解于50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中并對同種緩沖液廣泛透析(48小時，更換幾次透析液)。另外可用其他已知方法(如膜過濾法)除去膜碎片。同樣也可用其他方法(如超濾法)分離抗原。溶液的UV光譜表明其在278-280nm有最大吸光率。用Schaffner和Weissmann方法(18)估測蛋白質(zhì)，可知當寄生蟲密度為15囊泡/10ml時，蛋白產(chǎn)生量為25-35μg蛋白質(zhì)/囊泡/24小時。
用考馬斯亮蘭染色、顯示這些蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。
圖2在7.5-15%梯度SDS-PAGE上分析考馬斯蘭染色的E-S蛋白質(zhì)。泳道1高分子量標志(116，97.4，66.45和29KD);泳道2和3硫酸銨沉淀的兩份E-S蛋白質(zhì)制劑;泳道4低分子量標志(94，67，43，30，20.1和14.4KD)。
看到的主要蛋白帶是表觀分子量為大約97000、66000、50000、38000、28000道爾頓和一個表觀分子量范圍為10000-14000道爾頓的未分辨的蛋白質(zhì)混合物。另外還看到許多小帶。
E-S蛋白質(zhì)從頭合成的證據(jù)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后，將囊泡移入含40μCi35S-蛋氨酸/囊泡的無蛋氨酸培養(yǎng)基中。于不同時間分別收取囊泡和培養(yǎng)基。將囊泡切割成囊壁和頭節(jié)并勻漿。在12%SDS-PAGE上分析勻漿液并作熒光光譜分析。用丙酮沉淀培養(yǎng)基并在12%SDS-PAGE上分析，然后進行熒光光譜分析?？梢姷?5S-蛋氨酸摻入到囊壁和頭節(jié)蛋白質(zhì)中。
48小時后培養(yǎng)基中出現(xiàn)了幾種蛋白質(zhì)。
圖33份囊泡分別在各含40μCi35S-蛋氨酸的培養(yǎng)基(1ml)中保溫48小時，然后用放射自顯影法檢測35S-蛋氨酸標記的分泌蛋白質(zhì)。收集培養(yǎng)基，超離心并用丙酮沉淀上清液。每泳道代表1份囊泡蛋白質(zhì)。
由圖3可以看出，幾種蛋白質(zhì)都是作為寄生蟲代謝活動的一部分，主動合成并排泄/分泌到培養(yǎng)基中的。
當囊泡于體外被維持在無血清培養(yǎng)基中時，作為代謝更新活動的一部分，某些蛋白質(zhì)抗原即通過排泄或分泌過程出現(xiàn)于培養(yǎng)基中。在頭節(jié)外凸之前收集的抗原代表了幼蟲階段的抗原。權利要求了這些抗原、其制備方法、它們在NCC的診斷及可能預后中的應用，以及它們在生產(chǎn)抗豬囊尾蚴感染之疫苗中的應用。本文描述的診斷方法也可用于診斷肉豬的囊尾蚴病。
其修飾形式可以是聚乙二醇聯(lián)接、或與其他蛋白質(zhì)或雙功能試劑交聯(lián)，或用蛋白酶消化的。本發(fā)明還涉及診斷人NCC的方法，該方法包括使被診斷者的CSF與至少一種以SDS-PAGE法測定表觀分子量約為97，000或66，000或50，000或38，000道爾頓的體外維持之豬囊尾蚴的排泄或分泌抗原或其混合反應。
實施例實施例1和2涉及這些抗原在ELISA系統(tǒng)中，檢測各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病之病人CSF中抗囊尾蚴抗體的應用。實施例3和4涉及進一步用病人CSF進行免疫沉淀，以根據(jù)其分子量鑒定重要抗原。
實施例1按所述方法收集的排泄/分泌蛋白質(zhì)以5μg蛋白/ml(100μl/小井)的濃度，在Dynatech 96小井微量滴定板上室溫包被過夜。使用2%牛血清白蛋白(BSA)(溶于PBS中)封閉平板上余留的蛋白結合位點。在含有0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBST)中以1/25、1/125和1/625倍稀釋CSF，并于37℃下保溫2小時。保溫后各小井用PBST洗3次。加入100μl/小井在PBST中以1∶1000倍稀釋的兔抗人IgG過氧化物酶結合物并于37℃保溫2小時;然后用PBST將小井洗3次。使用鄰苯二胺作著色劑(4mg/10ml)，H2O2作底物。于20分鐘之內(nèi)顯示已結合的上述結合物。加入50μl4N H2SO4終止反應，并用Dynatech MR 700型ELISA計數(shù)儀測定490nm吸光率。在CSF稀釋度為1/100時吸光率大于0.10即認為是陽性。
結果如表2中所示。
表2診斷樣本數(shù)陽性囊尾蚴病尸檢證實21外科證實22臨床可疑76日本腦炎IgG俘獲ELISA陽性300結核性腦膜炎培養(yǎng)物證實+外科證實250結核性腦膜炎(抗原陽性或抗體陽性)712(490nm吸光率＝0.15)從上表可以看出，這種抗原優(yōu)于粗抗原，并可提高免疫反應的特異性。
實施例2該實施例描述了對排泄一分泌抗原之診斷價值的雙盲研究，其中試驗的設計排除了研究者的主觀偏見。
由確定診斷的各種神經(jīng)病病人得到37份CSF樣品，并由研究人員以外的觀察者給出1-37的序號。將樣品分為3組。由兩不同的實驗室各出兩個人(共4個人)按實施例1所述獨立地進行ELISA試驗。四個試驗者均將結果列成表并交給無關觀察者。最后四個人的結果都相同(見表3)。
表3診斷樣本數(shù)陽性神經(jīng)性囊尾蚴病33脊髓麻醉(正常對照)80手術后腦膜炎(培養(yǎng)證實)50日本腦炎70膿性腦膜炎(肺炎球菌性)30隱球菌腦膜炎(培養(yǎng)證實)10結核性腦膜炎(培養(yǎng)證實)20胸段脊髓受壓20顱脊椎接合異常10椎間盤脫出10運動神經(jīng)元疾病10共濟失調(diào)性神經(jīng)病10偏癱10假延髓性麻痺10上述結果表明，排泄-分泌的抗原可為用于檢測病人CSF中抗體的診斷試驗提供100%的敏感性和100%的特異性。
實施例3使用Iodogen方法，用125I標記按本發(fā)明方法得到的排泄-分泌抗原。將標記的蛋白質(zhì)與得自神經(jīng)囊尾蚴病、結核性腦膜炎及各種其他神經(jīng)病病人的CSF一起保溫。用兔抗人IgG、載體人IgG結合免疫復合物并向其中加入2.5%聚乙二醇。在7.5-15%梯度SDS-PAGE上分析沉淀物，并進行放射自顯影。
圖4125I標記的排泄-分泌蛋白質(zhì)與病人CSF之免疫沉淀物的放射自顯影。1∶3倍稀釋的CSF(30μl)與E-S蛋白(3×10cpm)保溫并按已述方法沉淀免疫復合物。泳道1對照，無CSF;泳道2、3和4CSF得自神經(jīng)囊尾蚴病病人;泳道5CSF得自結核性腦膜炎病人;泳道6、7和8CSF得自其他神經(jīng)病病人。
結果可見，表觀分子量約為97、66、50和38KD的蛋白質(zhì)被結合到免疫沉淀物中。
實施例4通過在含有35S-蛋氨酸的無蛋氨酸培養(yǎng)基中維持囊泡從而用35S-蛋氨酸標記蛋白質(zhì)，然后按實施例2所述用CSF抗體進行免疫沉淀。圖5中顯示了免疫沉淀物之SDS-PAGE帶的熒光圖譜。
35S標記的E-S蛋白質(zhì)與各種神經(jīng)病病人CSF之免疫沉淀物的放射自顯影。泳道9和5NCC病人的CSF免疫沉淀物。
同實施例3一樣，本實驗中也沉淀出96、66和50KD的蛋白質(zhì)。
表觀分子量為97000道爾頓之抗原的特性Ⅰ，部分核酸順序從豬囊尾蚴的總polyA+RNA構建λgt11cDNA文庫(19)。使用抗由羅化裂體吸蟲(Schistosomamansoni)純化之副肌漿球蛋白的超免疫兔血清，鑒定并分離一個大約為2.5Kb的cDNA克隆。
測定雙股DNA順序如下
1.TCTCAAGCAGXACGTCACACTGACAGTACATATGTACACTGACTCTGCTTCACATATTATATTAGTTACTAGCAAGCACACACACGTCGAC2.TGAGTACGTCXTGTAGTCTGTCGTATGTGTGTAGTTCTGTCGTXGATCACTAACTTAATATTAGAGTCAGXAGGTCAGTGTCATGTCATGTCATGTATⅡ.部分氨基酸順序電泳分離E-S抗原，由考馬斯蘭染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠上電洗脫出表觀分子量約為97，000的抗原(21)。溶劑沉淀電洗脫的蛋白質(zhì)，除去SDS。然后用TPCK處理的胰蛋白酶消化該蛋白質(zhì)。在用溶劑A(溶于水中的0.1%TFA)平衡過的RP300(C8)柱(0.46×25cm)上分離胰蛋白酶解肽。用線性梯度溶劑B(含有0.085%TFA的70%乙腈;由0至65%)在40分鐘內(nèi)洗脫肽。于真空下將含肽部分蒸發(fā)至干，并進行肽的順序分析。
由表觀分子量97，000之抗原得到的少數(shù)胰蛋白酶解肽的氨基酸順序如表4所示。
表4氨基酸順序肽……VKLDSAKT14ATQTEVWRT19VYSTSTKT16YAFL-ASVT-SRT21SLLDFRSTRT1權利要求
1.豬囊尾蚴的排泄/分泌(E-S)抗原在神經(jīng)囊尾蚴病的免疫診斷中的應用。
2.根據(jù)權利要求1的應用，其中使用了表觀分子量約為97，000、66，000、50，000和38，000的抗原。
3.根據(jù)權利要求1的應用，其中使用了表觀分子量約為66，000和38，000的抗原。
4.根據(jù)權利要求1、2和3中任一項的應用，其中設計免疫檢測法以檢測病人體液如CSF和血清中的抗體。
5.根據(jù)權利要求1、2和3中任一項的應用，其中設計免疫檢測法以檢測病人體液如CSF和血清中的抗原。
6.體外維持豬囊尾蚴，以制備權利要求2和3中限定之抗原的方法。
7.由豬囊尾蚴排泄/分泌的抗原，其具有以SDS-PAGE估計的約為97，000或66，000或50，000或38，000道爾頓的表觀分子量。
8.根據(jù)權利要求7的抗原，特征在于它是一種用SDS-PAGE法估測表觀分子量約為97，000或50，000的糖蛋白。
9.根據(jù)權利要求7的抗原，其中表觀分子量約為38，000的蛋白質(zhì)包含的部分氨基酸順序為纈氨酸-谷氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-胱氨酸-蘇氨酸(VEYTCT)。
10.一種可由豬囊尾蚴分泌或排泄而得到的抗原，其具有以SDS-PAGE法估測約為97，000或66，000或50，000或38，000的表觀分子量。
11.一種可由豬囊尾蚴分泌或排泄而得到的抗原，其具有以SDS-PAGE法估測約為97，000、50，000的表觀分子量。
12.一種可由豬囊尾蚴分泌或排泄而得到的抗原，其包含部分氨基酸順序為纈氨酸-谷氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-胱氨酸-蘇氨酸(VEYTCT)。
13.根據(jù)權利要求7、8、9、10、11和12之任一項的抗原在制備抗豬囊尾蚴感染之疫苗中的應用。
14.得到權利要求7、8、和9中限定之抗原的方法，其包括下列步驟a.在含有抗生素的無血清細胞生長培養(yǎng)基中體外維持由感染的豬肌肉分離的完整、未被損傷的囊尾蚴。b.在通過更換培養(yǎng)基以維持的前24-60小時內(nèi)除去所有抗原。c.然后以一定間隔期收集培養(yǎng)基，直到囊泡外凸為止，d.除去膜碎片，并e.分離抗原。
15.診斷活動的人NCC的方法，其包括使待診斷者的CSF與至少一種由體外培養(yǎng)的豬囊尾蚴排泄或分泌的，以SDS-PAGE法測定表觀分子量約為97，000或66，000或50，000或38，000道爾頓的抗原或所說抗原的混合物相互反應。
全文摘要
公開了一種通過體外維持豬囊尾蚴以得到抗原的方法。這些抗原可用于檢驗神經(jīng)囊尾蚴病病例的酶聯(lián)免疫吸附試驗中。
文檔編號C07K14/435GK1045184SQ90101000
公開日1990年9月5日 申請日期1990年1月24日 優(yōu)先權日1989年1月24日
發(fā)明者B·V·拉維·庫馬, V·蘇里雅納拉雅納, V·拉維, A·錢德拉穆希 申請人:阿斯特拉公司