專利名稱：青年型糖尿病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過胃泌素/胰酶分泌素(CCK)受體配基(特別是胃泌素)和表皮生長因子(EGF)受體配基(特別是轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα))的聯(lián)合協(xié)同刺激作用，影響胰島前體細胞向成熟的胰島素生成細胞的分化，以治療幼年型糖尿病。
胰島由存在于胎兒小管胰內(nèi)皮中的內(nèi)胚層干細胞發(fā)育而成，后者還包含發(fā)育成外分泌胰腺的多潛能干細胞(Teitelman，G.andJ.K.Lee，DevelopmentalBiology，121∶454-466(1987);Pictet，R.andW.J.Rutter，DevelopmentoftheembryonicendocrinePancreas，inEndocrinology，HandbookofPhysiology，ed.R.O.GreepandE.B.Astwood(1972)，AmericanPhysiologicalSociety:WashingtonD.C.，p.25-66)。胰島在胎兒妊娠期間通過非連續(xù)的發(fā)育狀態(tài)發(fā)育，這些非連續(xù)發(fā)育因鮮明的(多次)轉(zhuǎn)變而加強。如由胰島素和胰高血糖素的表達所顯示的，初始期是以這些多潛能干細胞投入胰島細胞譜系為特征的原始分化狀態(tài)。這些原始分化的細胞只表達低水平胰島素特異性基因產(chǎn)物并缺少成熟胰島細胞之細胞分化的定型胰島前體細胞群體(Pictet，R.andW.J.Rutter，文獻同上)。在小鼠體內(nèi)妊娠約16天，原始分化胰腺開始進入以胰島細胞的細胞分化為特征的迅速生長和分化階段，并且胰島細胞特異性基因表達呈數(shù)百倍增加。從組織學(xué)上看，胰島形成(新生)因源于胰管的增殖胰島芽(胰島胚芽生成)而變得明顯。臨出生之前，胰島生長速度變慢，并且胰島新生和胰島胚芽生成變得極不明顯。與此相隨的是，胰島達到一個充分分化的狀態(tài)，同時出現(xiàn)最大水平的胰島素基因表達。因此，與許多器官相似，細胞分化的完成是與降低了的再生潛力相關(guān)聯(lián)的。
因為原始分化之前體的分化發(fā)生在胰的胚胎發(fā)育晚期，所以調(diào)節(jié)胰島分化的因子很可能是在這個階段在胰中被表達的。在胰島發(fā)育期間表達的基因之一編碼胃腸激素肽，即胃泌素。雖然胃泌素在成人體內(nèi)作為調(diào)節(jié)酸分泌的胃激素發(fā)揮作用，但在胎兒體內(nèi)胃泌素表達的主要部位卻是胰島(Brand，S.J.andP.J.Fuller，J.Biol.Chem.，263∶5341-5347(1988))。胃泌素在胰島中的表達是短暫的，它被限制在原始分化的胰島前體形成分化的胰島這一階段。雖然尚不明了胰胃泌素在胰島發(fā)育中的重要性，但一些臨床觀察提示胃泌素在該胰島發(fā)育中具有下述作用。例如，由表達胃泌素的胰島細胞腫瘤和萎縮性胃炎引起的高胃泌素血癥與相似于分化胎幼胰島中所見的胰島胚芽生成相關(guān)(Sacchi，T.B.，etal.，VirchowsArchivB，48∶261-276(1985);和Heitz，P.U.etal.，Diabetes，26∶632-642(1977))。另外，在胎兒胰島胚芽生成的病例中記錄過異常長時間持續(xù)的胰胃泌素(HollandeE.，etal.，Gastroenterology，71∶255-262(1976))。然而，在兩種情況下都沒有確立胰島胚芽生成和胃泌素刺激間的因果關(guān)系。
不應(yīng)把本文引用的參考文獻看作是承認這些參考文獻為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
本發(fā)明提供了以足以影響胰腺胰島前體細胞分化為成熟的胰島素分泌細胞的量給藥提供胃泌素/CCK受體配基(如胃泌素)，和EGF受體配基(如TGFα)的組合物，以治療糖尿病的方法。該組合物可以全身給藥或由補充有于表達載體中之核酸融合構(gòu)建體的細胞在原位表達。該融合構(gòu)建體包含前原胃泌素肽前體編碼順序，且還可包含EGF受體配基的編碼順序。
總地說來，下文報導(dǎo)的研究工作證明，現(xiàn)已用胃泌素/CCK受體配基(如胃泌素)和EGF受體配基(如TGFα)刺激，在動物體內(nèi)的成年人胰臟的小管上皮中重新激活完全胰島細胞新生。這些研究證明并確信為達到預(yù)想的目的，需要兩種類型的生長因子，單用那一種都是不夠的。有關(guān)胰臟中TGFα和胃泌素的轉(zhuǎn)基因過表達，用于闡述胰胃泌素表達在胰島發(fā)育中所起作用的研究工作已有報道，并表明了TGFα和胃泌素在調(diào)節(jié)胰島發(fā)育中各自發(fā)揮作用。
因此，以這種不同因子組合物或提供在胰內(nèi)原位表達這些因子的組合物進行治療給藥，使殘余的多潛能胰管細胞再生分化為成熟的胰島素分泌細胞，現(xiàn)已成為一種治療糖尿病特別是青年型糖尿病的可行臨床選擇。


圖1A照片顯示在免疫過氧化物酶染色后來自TGFα轉(zhuǎn)基因胰的組織轉(zhuǎn)化管中的大量胰島素染色細胞。
圖1B照片顯示對于胰島素來說大多數(shù)小管細胞染色強度較小，而在某些場合下小管細胞確以相鄰胰島一樣的胰島素染色強度染色。
圖2A圖解顯示嵌合胰島素啟動子-胃泌素(INSGAS)轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)。
圖2B圖解顯示得自INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠之胰提取物的放射免疫檢測，顯示胃竇中超過內(nèi)源性鼠基因表達的胃泌素含量的高水平胃泌素免疫反應(yīng)活性。INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠出生后胰臟中具有高表達的胃泌素。
圖3A是用于實施例3所述研究工作中的INSGAS/TGFα小鼠之胰組織的照片。INSGAS/TGFα胰具有小管復(fù)合物增加和間質(zhì)細胞化稍微增加的某些區(qū)域。在所使用的5只動物中，顯示此區(qū)域為最嚴重的組織學(xué)異常。
圖3B是實施例3中對照小鼠的胰組織學(xué)照片。
圖3C是實施例3中TGFα小鼠的胰組織學(xué)照片。實施例3所述研究工作中，TGFα胰腺的該區(qū)域是典型的，并且顯示了間質(zhì)細胞化和紛繁的小管組織轉(zhuǎn)化相合并存在的纖維化，并已由Jhappan等人(文獻同上)描述。
圖4A直方圖顯示基于實施例3所作研究給出的點計數(shù)形態(tài)度量數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)進一步證實了在17周時INSGAS/TGFα小鼠的胰腺比TGFα小鼠的胰腺有較低的導(dǎo)管質(zhì)量。
圖4B直方圖顯示的點計數(shù)形態(tài)度量數(shù)據(jù)表明與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾龋琁NSGAS/TGFα胰腺中胃泌素和TGFα的共表達明顯地增加了胰島質(zhì)量。另外，單獨的TGFα表達不能增加胰島質(zhì)量。這些數(shù)據(jù)是基于實施例3所述研究工作給出的。
本發(fā)明部分基于證明在TGFα誘導(dǎo)的間質(zhì)小管中有大量的胰島素染色細胞這類研究工作。組織變形管細胞中的低水平外分泌和內(nèi)分泌基因表達相似于在胚胎胰發(fā)育的早期階段見到的原始分化的管細胞。胰島的形成(新生)是由這些原始分化的胰島素表達細胞的增殖和分化導(dǎo)致的。從組織學(xué)上看，這一過程表現(xiàn)為由胰管顯現(xiàn)胎芽(胰島胚芽生成)而形成胰島。在MT-42TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠中，在剛出生后期間看不到小管組織變形，而只在4周齡才可看到。這表明TGFα過表達誘導(dǎo)腺管上皮中的胰島素表達，而不是長期維持胎兒胰腺管中的胰島前體。
雖然組織變形管含有大量胰島素陽性細胞，但TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島質(zhì)量并不多于對照組。因此，單單是TGFα過表達不能影響這些原始分化管細胞向充分分化之胰島的轉(zhuǎn)變。這就暗示胰島分化需要有不存在于TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠之成年胰中的其他因子。因為原始分化胰島前體的分化發(fā)化在胚胎發(fā)育晚期，所以調(diào)節(jié)這種轉(zhuǎn)變的因子很可能是這個期間在胰島中表達的。在發(fā)育期胰島中表達的因子有一類是胃腸肽，即胃泌素。臨床觀察也已證實了胃泌素表達與胰島胚芽生成(即胎兒胰管的增殖胰島出芽)的關(guān)聯(lián)(參見Hollande，etal.，Gastroenterology，71∶255-262(1976)andSacchi，T.B.etal.，VirchowsArchiv.B，48∶261-276(1985))。
本文所用的術(shù)語“胃泌素/CCK受體配基”包括那些刺激胃泌素/CCK受體的化合物，這樣當(dāng)同一或相鄰組織中或同一個體中的EGF受體也受到刺激時，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素的胰腺胰島細胞新生。這類胃泌素/CCK受體配基的例子包括各種形式的胃泌素如胃泌素34(大胃泌素)、胃泌素17(小胃泌素)和胃泌素8(極小胃泌素);各種形式的胰酶分泌素如CCK58、CCK33、CCK22、CCK12和CCK8;以及證明與EGF受體配基有協(xié)同作用活性，并具有當(dāng)與EGF受體配基協(xié)同起作用時可誘導(dǎo)成熟胰中的細胞分化形成分泌胰島素的胰島細胞的羧基末端肽Trp-Met-Asp-過的胰組織重新引入哺乳動物體內(nèi)。同樣胃泌素/CCK受體配基最好是胃泌素，EGF受體配基最好是TGFα。
在另一實施方案中，胃泌素/CCK受體配基刺激作用是通過表達經(jīng)轉(zhuǎn)基因引入這些前體細胞中的嵌合胰島素啟動子-胃泌素融合基因構(gòu)建體而達到的。在另一實施方案中，EGF受體配基刺激作用是表達經(jīng)轉(zhuǎn)基因引入哺乳動物體內(nèi)的EGF受體配基基因而產(chǎn)生的。EGF受體配基最好是TGFα，而EGF受體配基基因是TGFα基因。
在另一實施方案中，通過共表達已穩(wěn)定地引入哺乳動物體內(nèi)的(ⅰ)前原胃泌素肽前體基因和(ⅱ)EGF受體配基基因來達到由胃泌素/CCK受體配基的EGF受體配基引起的刺激作用。應(yīng)再次指出的是，EGF受體配基較好是TGFα，而EGF受體配體基因較好是TGFα基因。
另一方面，本發(fā)明涉及聯(lián)合使用胃泌素/CCK受體配基(特別是胃泌素)，和EGF受體配基(特別是TGFα)刺激哺乳動物的胰臟胰島前體細胞，以使這些細胞分化的方法。在該方面一個優(yōu)選實施方案中，胃泌素刺激作用是經(jīng)表達已穩(wěn)定地引入哺乳動物體內(nèi)的前原胃泌素肽前體基因而實現(xiàn)的該表達在胰島素啟動子控制下進行。EGF受體配基(如TGFα)刺激作用則是通過表達經(jīng)轉(zhuǎn)基因引入哺乳動物體內(nèi)的EGF受體配基基因達到的。上述由胃泌素和TGFα引起的刺激作用，最好是通過共表達已經(jīng)穩(wěn)定地引入哺乳動物體內(nèi)的(ⅰ)前原胃泌素肽前體基因和(ⅱ)EGF受體配基(例如TGFα)基因?qū)崿F(xiàn)的。
本發(fā)明的另一方面是核酸融合構(gòu)建體。該構(gòu)建體包括編碼前原Phe-酰胺的其他胃泌素/CCK受體配基。還包括這些受體配基的活性類似物、片段或其他修飾產(chǎn)物。這類配基還包括增加從組織貯存部位分泌內(nèi)源性胃泌素、胰酶分泌素或相似活性肽的化合物。這些化合物的例子包括抑制胃酸分泌的omeprazole和提高CCK刺激作用的大豆胰蛋白酶抑制劑。
本文所用的術(shù)語“EGF受體配基”包括刺激EGF受體，這樣當(dāng)同一或相鄰組織中或同一個體中的胃泌素CCK受體也受到刺激時，即可誘導(dǎo)生成胰島素的胰腺胰島細胞新生的化合物。這類EGF受體配基的例子包括EGF1-53、EGF1-48、EGF1-52、EGF1-49以及其片段和活性類似物。其他例子包括TGFα受體配基(1-50)，其中有1-48、1-47及其他EGF受體配基如兩性調(diào)節(jié)素(amphiregulin)和痘病病毒生長因子，和證明與胃泌素/CCK受體配基有同樣協(xié)同作用活性的其他EGF受體配基。它們包括上述配基的活性類似物、片段及修飾產(chǎn)物。有關(guān)更詳細背景材料可參見CarpenterandWahl，Chapter4，"PeptideGrowthFactors"(Eds.SpornandRoberts)，SpringerVerlag，1990。
本發(fā)明的一個基本方面是通過給需要進行治療的個體，以足可使胰腺胰島前體細胞分化成熟的分泌胰島素細胞的量，施用包括胃泌素/CCK受體配基和EGF受體配基的組合物以治療糖尿病的方法。分化的細胞是胰導(dǎo)管中殘留的隱性胰島前體細胞。該方法主要是用于治療幼年發(fā)作型糖尿病。一個實施方案包括給個體使用(最好是全身用藥)分化再生量的胃泌素和EGF受體配基，(優(yōu)選TGFα)。
另一個實施方案包括在移出的哺乳動物胰組織的胰腺胰島前體細胞中投入胃泌素/CCK受體配基和EGF受體配基，并將如此刺激胃泌素肽前體的核酸順序和胰島素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)順序，后者位于編碼前原胃泌素肽前體之順序的5’端并用于有效地支持該順序的轉(zhuǎn)錄。胰島素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)順序最好包含至少一個胰島素啟動子。在一優(yōu)選的實施方案中，編碼前體肽前體的核酸順序包括其中含有人胃泌素基因之外顯子2和3，且還可任意含有內(nèi)含子1和2的多核苷酸順序。
本發(fā)明的另一個方面是包括(ⅰ)編碼哺乳動物EGF受體配基(如TGFα)的核酸順序和其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)順序，以及(ⅱ)編碼前原胃泌素肽前體的核酸順序和其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)順序的組合物。EGF受體配基的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)順序較好是強的非組織特異性啟動子，如金屬硫因啟動子。前原胃泌素肽前體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)順序較好是胰島素啟動子。本實施方案的一個優(yōu)選形式是其中編碼前原胃泌素肽前體的核酸順序包括含有人胃泌素基因之內(nèi)含子1和2及外顯子2和3的多核苷酸順序。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含融合基因構(gòu)建體的載體，其中所說的構(gòu)建體包括前胃泌素肽前體編碼順序。該載體可以是質(zhì)粒如pGeml，或者是具有包括胰島素啟動子在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)順序的噬菌體。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含(ⅰ)處于強的非組織特異性啟動子如金屬硫因啟動子控制下的編碼哺乳動物EGF受體配基(如TGFα)的核苷酸順序，和(ⅱ)處于胰島素啟動子控制下的前原胃泌素肽前體編碼順序的載體組合物。就本發(fā)明的這個方面來說，各載體可以是質(zhì)粒如質(zhì)粒pGeml，也可以是噬菌體。
本發(fā)明的另一個方面涉及能夠表達被穩(wěn)定整合的編碼前原胃泌素之基因的非人哺乳動物或組織(包括細胞)。該方面的另一個實施方案是能夠共表達已被穩(wěn)定地整合到哺乳動物、哺乳動物組織或細胞內(nèi)之(ⅰ)前原胃泌素肽前體基因，及(ⅱ)EGF受體配基(如TGFα)基因的非人哺乳動物。
治療給藥和組合物給藥方式包括(但不限于)透皮、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)和口服等途徑。化合物可通過任何方便途徑給藥，如通過上皮或粘膜下襯(如口腔粘膜、直腸和小腸粘膜等)的吸收進行輸注或批量注射，并可以連同其他生物學(xué)活性劑一起給藥。最好是進行全身給藥。
本發(fā)明還提供醫(yī)藥組合物。這些組合物包括治療有效量的治療劑和醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。載體包括(但不限于)鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇或它們的組合。配方應(yīng)與給藥方式相適應(yīng)。
必要時組合物還可含有小量潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋劑型或粉末型。組合物可與常規(guī)粘結(jié)劑和載體物質(zhì)如甘油三酯配制成栓劑?？诜浞娇砂幤芳壐事洞?、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等標(biāo)準(zhǔn)載體。
各種藥物輸送系統(tǒng)是已知的，并可用于施用本發(fā)明的治療劑，如以脂質(zhì)體、微顆粒、微膠囊等方式進行膠囊包裹。
在一優(yōu)選的實施方案中，組合物是按照適于對人進行靜脈內(nèi)給藥之醫(yī)藥組合物的常規(guī)方法配制的。一般說來。適于靜脈內(nèi)給藥的組合物是在無菌等滲水緩沖液中制成的溶液劑。必要時，組合物還可包含增溶劑和用來減輕注射部位疼痛的局部麻醉劑。通常，各成分可以單位劑量形式分別或混合在一起添加，例如以密封容器如標(biāo)有活性劑量的安瓿或小藥囊內(nèi)的干燥的凍干粉末或無水濃縮制劑形式加入。當(dāng)組合物是以輸注方式給藥時，可以用含有無毒藥品級水或鹽水的輸注瓶進行。當(dāng)組合物是以注射方式給藥時，可提供含注射用無菌水或鹽水的安瓿，以便在給藥前混入各成分。
可作為中性或鹽制劑形式配制本發(fā)明的治療劑。藥理學(xué)上可接受的鹽包括與衍生于鹽酸銨、磷酸銨、醋酸銨、草酸銨、酒石酸銨等的游離氨基形成的鹽，和與衍生于羧酸鈉、羧酸鉀、羧酸銨、羧酸鈣、羧酸鐵、羧酸異丙胺、羧酸三乙胺、羧酸2-乙氨基乙醇、羧酸組氨酸、羧酸普魯卡因等的游離羧基形成的鹽。
在治療具體疾病中有效的本發(fā)明治療劑的量將取決于疾病或癥狀的性質(zhì)，并可用常規(guī)臨床技術(shù)確定之。在配方中使用的精確劑量將也取決于給藥途徑和疾病或紊亂的嚴重程度，并應(yīng)根據(jù)醫(yī)生的判斷和各病人所處環(huán)境來決定。但如果靜脈內(nèi)給藥時，適當(dāng)?shù)膭┝糠秶话愦蠹s為每公斤體重20-500微克活性化合物。鼻內(nèi)給藥時，適當(dāng)?shù)膭┝糠秶话闶谴蠹s每公斤體重0.01Pg至1mg?？捎审w外或動物模型試驗系統(tǒng)得出的劑量-反應(yīng)曲線來外推得出有效劑量。
栓劑一般含有0.5%至10%(重量)的活性成分;口服配方較好含有10%至95%的活性成分。
本發(fā)明還提供包括一個或多個容器的醫(yī)藥包或藥盒，所說的容器內(nèi)裝有一種或多種本發(fā)明醫(yī)藥組合物成分。與這些容器相隨的是一張由控制醫(yī)藥或生物制品的制造、使用或出售的政府機構(gòu)所出具的申明，該申明反映已由藥品生產(chǎn)、使用或出售機構(gòu)批準(zhǔn)可以用于人體。
材料和方法除另有注明者外，下文實施例中所報告的研究工作中使用下列材料和方法。
動物。小鼠，F(xiàn)VB和CD品系，得自TaconicFarms，Inc.，Germantown，NY.Jappan等人(Cell，61∶1137-1146(1990))描述了由金屬硫因啟動子高水平表達TGFα的本發(fā)明使用的TGFα轉(zhuǎn)基因系MT-42小鼠。
INSGAS轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。將包括大鼠胰島素1基因之核苷酸-370至+38的Pvu11-Rsal片段(Cordell，B.G.etal.，Cell，18∶533-543，1979)連接到pGem1(PromegaCorp.，Madison，WI)中。分離含有編碼前原胃泌素肽前體之人胃泌素基因的1.5Kb內(nèi)含子1和2及外顯子2和3的4.4KbBamHI-EcoR1片段，并再克隆到pGem1(Promega)中大鼠胰島素I片段的下游。Wiborg，O.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶1067-1069(1984)和Ito，R.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶4662-4666(1984)中描述了該片段。胰島素啟動子-前原胃泌素INSGAS轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體被切成為4.8KbXba1-EcoR1片段。
轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖和表征。按上述方法制備用于下述微量注射的片段。用瓊脂糖凝膠電泳法分離，并用CsCl梯度純化法純化該片段，然后對注射緩沖液(5mMNaCl，0.1mMEDTA，5mMTris-HClpH7.4)徹底透析。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)微量注射處于單細胞階段的FVB近交小鼠(TaconicFarms，Inc.，文獻同上)的已受孕之卵母細胞(參見Hogan，B.etal.，Manipulatingthemouseembryo:Alaboratorymanual，ColdSpringHarbor，NY，1986)。然后按照Hogan等人所述方法將存活的胚胎植入CD1(CharlesRiverLaboratories，Inc.，Wilmington，MA)“寄母”的輸卵管中。使用分離自個體小鼠尾部的DNA，經(jīng)DNA印跡分析技術(shù)，和經(jīng)隨機引導(dǎo)用32dCTP標(biāo)記的人胃泌素外顯子2探針，鑒定轉(zhuǎn)基因“建立者”小鼠。以相似方法鑒定F1小鼠及其同胞。
使含有衍生于CD-1小鼠系(Jappan，文獻同上)之MT-TGFα轉(zhuǎn)基因的純合MT-42小鼠與雜合INSGAS小鼠雜交。斷奶后，將子代小鼠放在前面描述的酸化50mMZnClz上，以誘導(dǎo)金屬硫因啟動子(Jhappan，文獻同上)。
Northern印跡雜交試驗。為了進行Northern分析，按Cathala等人(DNA，2∶329-335(1983))所述方法從組織中提取總RNA。在1%瓊脂糖變性凝膠上分離20μg總RNA樣品并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。使RNA印跡與32P標(biāo)記的TGFα核蛋白探針(riboprobes)或不與內(nèi)源性小鼠胃泌素mRNA交叉雜交的人胃泌素的外顯子2雜交。
胃泌素的肽放射免疫試驗。提取組織并按Rehfeld，J.F.，Scand.J.Chin.Lab.Invest，30∶361-368(1972)所述使用胃泌素放射免疫試驗中對生物學(xué)活性C末端酰胺化胃泌素特異的抗體2604，以前已描述的放射免疫法，檢測胃泌素免疫反應(yīng)活性。所有試驗中均使用酪氨酸單碘化的人胃泌素17示蹤物，并使用合成的人胃泌素17作為標(biāo)準(zhǔn)品。
TGFα的肽放射免疫試驗。在液氮中冷凍組織，用研缽和研桿研成粉末，并按Todaro，G.J.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77∶5258-5262(1980))所述方法進行酸-乙醇提取。加水恢復(fù)提取物水分，并用考馬斯蘭染料結(jié)合法(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)確定蛋白質(zhì)濃度。在TGFα放射免疫試驗中，以一式兩份試驗胰組織的等分樣品，檢測與125I TGFα競爭，結(jié)合到固相抗大鼠TGFα之C末端的免抗體上的能力(Biotope，Seattle，WA的藥盒)。
組織學(xué)分析。切除胰臟，稱重，使之相似地在暗盒中取向，在Bouin氏溶液中固定并以常規(guī)操作程序包埋在石臘中。
組織制備和免疫組織化學(xué)。剪碎新切下的胰臟，清除脂肪和淋巴結(jié)，在Bouin氏固定液中固定，然后包埋在石臘中進行切片。按標(biāo)準(zhǔn)方法用精木精和曙紅著染常規(guī)切片。對得自成年17周齡MT-TGFα(MT-42)轉(zhuǎn)基因小鼠的胰組織進行胰島素免疫染色，以檢測TGFα過表達對胰島發(fā)育的影響。使用免疫過氧化物酶染色豚鼠抗人胰島素血清(Linco，Eureka，MO)著染TGFα誘導(dǎo)的組織變形小管中的胰島素陽性細胞;用預(yù)免疫豚鼠血清作為對照。使用單克隆免抗胃泌素抗體，按Sternberger的過氧化物酶/抗過氧化物酶法對5μ石臘切片進行免疫組織化學(xué)檢查(參見Sternberger，L.A.，Immunocytochemistry，2nded.1979，NY，Wiley，PP.104-170)。
點計數(shù)形態(tài)量度。使用Weibel，E.R.Lab.Investig.，12∶131-155(1963)中所述的點計數(shù)方法定量胰島、導(dǎo)管或間質(zhì)細胞的相對體積。使用25點目鏡格柵，以400倍放大率，從切片的一個角的隨機點處開始記錄每個其他區(qū)域的點數(shù)。使用載物臺測微尺的標(biāo)志完成不偏而有規(guī)則的區(qū)域選擇。減去血管、脂肪、導(dǎo)管、淋巴結(jié)或小葉間空隙截取的面積即得出總的胰腺面積。各組織塊中最少以108個區(qū)域(使用載物臺測微尺有規(guī)則選擇的)計數(shù)5000個點，相對胰島體積是以胰島組織截取的點數(shù)除以胰組織的點數(shù)得出的。絕對胰島質(zhì)量是相對胰島體積乘以胰組織重量計數(shù)出的(參見Lee，H.C.etal.，Endocrinology，124∶1571-1575，1989)。
統(tǒng)計學(xué)分析。使用針對不成對數(shù)據(jù)的Student試驗來比較平均值間之差，求出有意義差值。
實施例1檢測TGF轉(zhuǎn)基因胰中的胰島素產(chǎn)生免疫過氧化物酶染色顯示TGFα轉(zhuǎn)基因胰的組織變形導(dǎo)管中有大量的胰島素染色細胞(圖1A)，而非轉(zhuǎn)基因?qū)Ч軆?nèi)則實際上沒有胰島素染色細胞(少于6.1%)。當(dāng)以400倍放大倍數(shù)觀察每只動物至少記錄600個小管細胞時，在TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠的組織變型小管中則可以6.0+/-0.9%的頻率(n＝5)看到胰島素陽性細胞。偶有小管細胞以相鄰胰島胰島素染色同樣強度著染，但是大多數(shù)還是具有較小的著染強度(圖1B)。小管細胞的低水平胰島素染色與報導(dǎo)的發(fā)育胰之導(dǎo)管中原始分化細胞的著染水平相似(Pictet，R.andW.J.Rutter，DevelopmentoftheembryonicendocrinePancreas，inEndocrinology，HandbookofPhysiology，ed.R.0.GreepandE.B.Astwood，1972，AmericanPhysiologicalSociety:Washington，DC，PP.25-66;andAlpert，S.，etal.，Cell，53∶295-308，1988)。
然而，盡管組織變形導(dǎo)管中胰島素陽性細胞的數(shù)目增加了，但并沒增加TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島質(zhì)量。用點計數(shù)形態(tài)量度法定量，TGFα轉(zhuǎn)基因胰臟中胰島質(zhì)量為2.14mg+/-0.84(均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝5)，此與非轉(zhuǎn)基因的交配仔的1.93mg+/-0.46(n＝6)差不多。
對這些發(fā)現(xiàn)的一種解釋是，TGFα過表達引起原始分化之前體增殖，但不能單獨影響這些原始分化細胞向充分分化之胰島的轉(zhuǎn)變，分化要受到成年胰中所沒有的其他因子的調(diào)節(jié)。
實施例2INSGAS轉(zhuǎn)基因得到的胰胃泌素表達為了檢驗胃泌素在調(diào)節(jié)胰島分化中的可能作用，培育可表達嵌合胰島素啟動子-胃泌素(INSGAS)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，所說的嵌合體中胰島素啟動子指導(dǎo)胃泌素轉(zhuǎn)基因的胰特異性表達(圖2A)。與胃泌素基因不同的是，胰島素基因表達沒有在出生后停止。因此，INSGAS轉(zhuǎn)基因?qū)е铝顺赡暌戎械某志眯晕该谒乇磉_。
INSGAS轉(zhuǎn)基因包括5’側(cè)翼DNA的370bp，和大鼠胰島素I基因的第一個非編碼外顯子(Cordell，B.etal.，Cell，18∶533-543，1979)。將其連接到含有人胃泌素基因(編碼前原胃泌素肽前體)之1.5Kb內(nèi)含子1和外顯子2及3的BamHI-EcoRI片段上(Wiborg，O.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶1067-1069，1984;Ito，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶4662-4666，1984)。分離4.8KbINSGAS片段并微量注射到純系FVB單細胞小鼠胚胎(Hogan，B.etal.，Manipulatingthemouseembryo:Alaboratorymanual，1986，NY，ColdSpringHarbor)。
使用對胃泌素的生物活性酰胺化C末端特異的抗血清2604(Rehfeld，J.etal.，Scand.J.Clin.Lab.Invest.，30∶361-368，1972)，以放射免疫法檢測轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠之胰和胃提取物中的胃泌素免疫反應(yīng)活性。
基于胃泌素單克隆抗體對胰組織的免疫染色來觀察由INSGAS轉(zhuǎn)基團導(dǎo)致的β細胞特異性胃泌素表達。
將分離自8周齡INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠之不同組織的RNA的Northern印跡與人胃泌素外顯子2探針進行雜交。只在胰中而不是任何其他組織中見有高水平的胃泌素轉(zhuǎn)基因mRNA。該探針是對人胃泌素基因特異性的;在INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠的竇RNA中未見有雜交現(xiàn)象，且非轉(zhuǎn)基因FVB小鼠表達了高水平的小鼠胃泌素mRNA。對INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠之胰提取物的放射免疫檢測顯示，高水平的胃泌素免疫反應(yīng)活性超過了胃竇中由內(nèi)源性小鼠基因表達的胃泌素含量(圖2B)。在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈蟮囊忍崛∥镏形礈y得胃泌素免疫反應(yīng)活性。胃泌素放射免疫檢測法是對羧酰胺化前體特異的，此表明胃泌素肽前體在轉(zhuǎn)譯后被有效地加工成生物活性肽。用胃泌素單克隆抗體完成的免疫組織化學(xué)分析顯示胰β胰島細胞特異地表達胃泌素(圖2C)。
雖然INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠在新生后胰中具有胃泌素的高表達(圖2B)，但INSGAS轉(zhuǎn)基因小鼠有與對照組動物完全相同的胰組織學(xué)特征。5-6周齡INSGAS小鼠(1.78+/-0.21mg，n＝11)和相同周齡的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈?1.74+/-0.19mg，n＝11)，用點計數(shù)形態(tài)度量法定量的胰島質(zhì)量是相同的(Weibel，E.R.，LabInvestig.，12∶131-55，1963)。因此，單單是出生后胰中的胃泌素繼續(xù)表達并不能刺激胰島細胞生長。
實施例3TGFα和TGFα/INSGAS胰的組織學(xué)檢查胃泌素刺激胰島生長可能需要有其他生長因子的刺激，以產(chǎn)生反應(yīng)性細胞群體。因此，在具有組織變形導(dǎo)管的TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)研究胃泌素刺激作用的效果，其中組織變形導(dǎo)管含有相似于原始分化之胰島前體的胰島素表達細胞。為了估計胃泌素和TGFα間的相互作用，繁殖三組有相等FVB/CD1品系遺傳背景的小鼠非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M、單一TGFα轉(zhuǎn)基因組和雙重INSGAS/TGFα轉(zhuǎn)基因組。于3周齡時將所有三組小鼠置于50mM ZnCl2上。于17周齡殺死動物并切除胰腺進行組織學(xué)評估。TGFα和INSGAS/TGFα小鼠的胰腺具有相似的大體形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，與柔軟松散的對照組胰腺相反，這些胰組織富于彈性、組織堅實而且致密。用Northerm印跡分析法(數(shù)據(jù)未示出)和放射免疫檢測法測知TGFα和INSGAS/TGFα組小鼠的TGFα表達是等同的。TGFα和INSGAS/TGFα小鼠中，胰TGFα免疫活性肽水平分別為12.2+/-1和18.9+/-8ng/mg蛋白質(zhì)(均值±SD)。
制作出所研究的三組小鼠(AINSGAS/TGFα;BFVB/CD1對照組;CTGFα)胰腺的蘇木精染色石臘切片的光照顯微鏡照片。INSGAS/TGFα胰腺有某些區(qū)域增加了小管復(fù)合物并稍微增加了間質(zhì)細胞化;5只動物中所示的區(qū)域(圖3A)具最為嚴重的形態(tài)學(xué)異常;大多數(shù)胰腺則不能與對照組分辨開(圖3B)。相反，TGFα胰腺區(qū)域(圖3C)呈現(xiàn)一般狀況，并顯示出結(jié)合有Jhappan等人(文獻同上)所述之鮮明的小管組織轉(zhuǎn)化相結(jié)合的間質(zhì)細胞化和纖維變性(文獻同上)。
胰胃泌素與TGFα相互協(xié)同作用以增加胰島質(zhì)量，并抑制由TGFα過表達所誘導(dǎo)的小管組織轉(zhuǎn)化。使純合MT-TGFα(MT-42)小鼠(TGFα)與雜合INSGAS小鼠交配，得到雜合TGFα單一轉(zhuǎn)基因或含有INSGAS與TGFα兩種轉(zhuǎn)基因(INSGAS/TGFα)之雙重轉(zhuǎn)基因的子代。因為INSGAS是FVB品系的，而TGFα是CD1品系的，所以對于所有三組小鼠來說，TGFα純合小鼠和CD1對照小鼠(CON)兩者與FVB交配即產(chǎn)生出FVB/CD1品系背景。從3周齡到17周齡殺死動物時，用50mMZnClz處理小鼠。切除胰臟，稱重，相似地定向在暗盒內(nèi)，在Bouin溶液中固定并在石臘中包埋之。使用來自每只動物的一個隨機切片，以點數(shù)形態(tài)度量法(Weibel，E.R.，LabInvestig，12∶131-155，1963)定量小管和胰島的相對體積。在放大170倍時，以50點格柵截取，來計數(shù)組織上至少2000個點;在沒有重迭的條件下復(fù)蓋整個切片。將相對體積乘以動物的胰腺重量，計算出小管和胰島的質(zhì)量。為使不同的平均體重標(biāo)準(zhǔn)化，以μg/g體重為單位來表示質(zhì)量。結(jié)果為每組5-6只動物的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差。＊P＜0.05(Student不配對數(shù)據(jù))。
由INSGAS轉(zhuǎn)基因表達胃泌素降低了TGFα過表達引起的小管組織變形。在17周時，INSGAS/TGFα小鼠的胰組織學(xué)改變相似于對照胰(圖3B)，而多于TGFα小鼠的胰組織改變(圖3C)。
這一點可通過用點計數(shù)形態(tài)度量法定量TGFα和INSGAS/TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠和FVB1/CD1對照組的胰小管質(zhì)量得以證實(圖4A)。與對照組相比，INSGAS/TGFα胰腺中胃泌素和TGFα的共表達也顯著地增加了胰島質(zhì)量(圖4B)，而單獨TGFα或胃泌素轉(zhuǎn)基因的表達則沒有增加胰島質(zhì)量。三組小鼠間的血葡萄糖濃度沒有顯著差異。
本發(fā)明不受本文所述特定實施方案的限制。
根據(jù)前面的描述和附圖要作的改動是顯而易見的，并將落入權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本文所列的各種出版物，其中公開的內(nèi)容均全文作為本文的參考文獻。
權(quán)利要求
1.治療需要進行這種治療之糖尿病的方法，包括給該個體施用足可使胰腺胰島前體細胞分化為成熟之分泌胰島素細胞的量的，提供胃泌素/CCK受體配基和EGF受體配基的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中如此分化的細胞是胰導(dǎo)管中的胰島前體細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其為治療青年發(fā)作糖尿病的方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中胃泌素/CCK受體配基是胃泌素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中EGF受體配基是TGFα。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法包括在已移出之哺乳動物胰組織的胰島前體細胞中投入胃泌素/CCK受體配基和EGF受體配基，并將如此刺激過的胰組織重新引入哺乳動物體內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中胃泌素/CCK受體配基刺激作用是通過表達已穩(wěn)定地引入個體內(nèi)的胃泌素/CCK受體配基基因而實現(xiàn)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所說的表達是前原胃泌素肽前體基因的表達。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中EGF受體配基刺激作用是通過表達已穩(wěn)定地引入個體內(nèi)的EGF受體配基基因而實現(xiàn)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中胃泌素/CCK受體配基和EGF受體配基的刺激作用是通過共表達已穩(wěn)定地引入胰細胞內(nèi)的(ⅰ)前原胃泌素肽前體基因和(ⅱ)EGF受體配基基因，從而使它們能夠刺激這些胰細胞而實現(xiàn)的。
11.使哺乳動物胰的胰島前體細胞分化為成熟的分泌胰島素細胞的方法，該方法包括聯(lián)合使用胃泌素/CCK受體配基和EGF受體配基刺激這些細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中胃泌素/CCK受體配基刺激作用是通過表達已穩(wěn)定地引入這些前體細胞內(nèi)的前原胃泌素肽前體基因而實現(xiàn)的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的表達是處于胰島素表達調(diào)節(jié)順序控制之下的。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中EGF受體配基刺激作用是通過表達已穩(wěn)定地引入這些前體細胞內(nèi)的EGF受體配基基因而實現(xiàn)的。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中胃泌素/CCK受體配基和EGF受體配基的刺激作用是通過共表達已穩(wěn)定地引入哺乳動物體內(nèi)的(ⅰ)前原胃泌素肽前體基因和(ⅱ)EGF受體配基基因而實現(xiàn)的。
16.包括哺乳動物胰島素啟動子5’到編碼哺乳動物胃泌素CCK受體配基之核酸順序的核酸構(gòu)建體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的構(gòu)建體，其中編碼前原胃泌素肽前體的核酸順序包括含有人胃泌素基因之外顯子2和3的多核苷酸順序。
18.包含(ⅰ)哺乳動物EGF受體配基基因和(ⅱ)哺乳動物胃泌素/CCK受體配基基因的組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中哺乳動物胃泌素/CCK受體配基基因包括在胰島素啟動子控制下的前原胃泌素肽前體編碼順序。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中編碼前原胃泌素肽前體的核酸順序包括含有人胃泌素基因之外顯子2和3的多核苷酸順序。
21.能夠表達權(quán)利要求16的穩(wěn)定地引入之構(gòu)建體的非人哺乳動物。
22.能夠表達權(quán)利要求18的穩(wěn)定地引入之組合物的非人哺乳動物。
全文摘要
通過施用足可影響胰島前體細胞分化為成熟之分泌胰島素細胞的量，提供胃泌素/CCK受體配基(如胃泌素)，和EGF受體配基(如TGFα)的組合物來治療糖尿病的方法。該組合物可以全身給藥，或者由已經(jīng)轉(zhuǎn)基因補充了胃泌素/CCK受體配基基因(如前原胃泌素肽前體基因)和EGF受體配基基因(如TGFα基因)之一或兩者的細胞在原位被表達而提供之。
文檔編號C07K14/595GK1098942SQ93112658
公開日1995年2月22日 申請日期1993年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月14日
發(fā)明者R·V·納迪, S·J·布蘭德 申請人:研究三角藥品有限公司, 馬薛諸塞綜合醫(yī)院