專利名稱：用于免疫避孕的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般來說涉及透明帶蛋白的生產(chǎn)和應(yīng)用，更具體地說涉及編碼透明帶蛋白的新的DNA順序，用于生產(chǎn)這些蛋白的重組材料和方法，以及用于通過使用天然存在的和重組的透明帶蛋白而選擇性地實(shí)現(xiàn)哺乳動物的暫時(shí)性不育或永久性不育的材料和方法。
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)哺乳動物可重復(fù)的暫時(shí)性不育的方法，該方法是在該哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)針對存在于該哺乳動物卵母細(xì)胞透明帶中的蛋白的抗體。本發(fā)明還涉及一些經(jīng)純化和分離的DNA順序，這些順序編碼來自各種不同哺乳動物種屬的、本文稱為“ZPA”、“ZPB”和“ZPC”的透明帶蛋白。本發(fā)明還涉及能夠在主體哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)抗體生成的藥物組合物。
透明帶(ZP)是一種圍繞哺乳動物卵母細(xì)胞的復(fù)合基質(zhì)，由卵巢細(xì)胞所分泌的糖蛋白組成。透明帶糖蛋白行使多種功能。例如，以前稱為ZP2和ZP3的小鼠ZP蛋白，經(jīng)復(fù)合而形成長絲，這些長絲由ZP基質(zhì)中稱為ZP1的蛋白交聯(lián)起來而使基質(zhì)在結(jié)構(gòu)上具有完整性(Wassarman，P.M.，Annu.Rev.Biochem.57∶415-442，1988)。除了在結(jié)構(gòu)上的作用外，還證明了小鼠ZP3是ZP基質(zhì)中的精子受體(Bleil，J.P.和Wassarman，P.M.，Cell20∶873-882,1980)。在精子與ZP3結(jié)合并隨后在ZP表面誘導(dǎo)出精子頂體反應(yīng)后，ZP2起次級精子受體的作用，這對維持精子與卵子的結(jié)合是必需的(Bleil等，Dev.Biol.128∶376-385，1988)。由于它在卵母細(xì)胞的維持及精子-卵母細(xì)胞相互作用中的作用，ZP在邏輯上成為干擾受精過程的避孕藥的設(shè)計(jì)靶標(biāo)。
許多不同的研究小組都進(jìn)行了免疫學(xué)研究工作，試圖干擾ZP的功能，從而降低受免疫動物的可育性(見Dunbar等，《國際生殖免疫學(xué)會議》，T.Wegman和T.Gills編，London:OxfordPress，第505-528頁，1983；Dunbar等《動物受精機(jī)理及控制》，J.Hartman編，AcademicPress，NewYork，第139-166頁，1983)。這些研究表明，用卵巢勻漿液對動物進(jìn)行主動免疫使可育性降低。但是，由于這種勻漿液中組分很多，幾乎不可能鑒定出與可育性下降有關(guān)的抗原。另外，使用這樣一種復(fù)雜的混合物，可能會造成不良的、可能有害的副作用。
不同的研究人員利用包括SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和高壓液相色譜(HPLC)在內(nèi)的色譜法所作的研究，最終鑒定出了不同哺乳動物種屬的許多透明帶蛋白。如下所述，由Timmons和Dunbar(《免疫生殖展望概念和避孕》，第242-260頁，Mathur，S.和Fredericks，C.M.編，NewYork，HemispherePullishingCo.，1988)匯編的數(shù)據(jù)，列舉了已經(jīng)過定性鑒定的一些透明帶蛋白的例子。
從豬體內(nèi)分離出的透明帶蛋白包括PZⅠ，一種由Dunbar等人分離出的40-110kD蛋白(Biol.Reprod.24∶111，1981);PZⅡ(一種70-110kD蛋白)、PZⅢ(一種95-118kD蛋白)、PZⅣ(一種18-25kD蛋白)，均由Dunbar等人分離(Biol.Reprod.32∶619，1985);90K(一種89-119kD蛋白)、65K(一種61-83kD蛋白)、55K(一種47-66kD蛋白)、25K(一種18-26kD蛋白)，均由Hedrick，J.L.和Wardrip，N.J.分離(Biochem.157∶63,1986)；ZP1(一種82-118kD蛋白)、ZP2(一種58-96kD蛋白)、ZP3(PPZA，一種40-74kD蛋白)、ZP4(一種21kD蛋白)，均由Subramanian等人分離(Biol.Reprod.24∶933，1981);87K(ZP1/ZP2，一種77-97kD蛋白)、58K(一種40-70kD蛋白)，均由Yurewicz等人分離(Biol.Reprod.29∶511，1983)；脫糖基化PZⅠ(一種35kD蛋白)、PZⅡ(一種55kD蛋白)、PZⅢ(一種80kD蛋白)，均由Skinner和Dunbar分離(《避孕和促進(jìn)可育性的免疫途徑》，G.P.Talwar編，NewYork:Plenum，第251-268頁，1986)；分子量為45kD的脫糖基化ZP3，由Sacco等人分離(J.Reprod.Fertil.76∶575，1986)。
分離出的兔透明帶蛋白包括分子量分別為68-125kD、80-100.5kD和100-132kD的RZⅠ、RZⅡ和RZⅢ，均由Dunbar等人分離(Biol.Reprod.24∶1111，1986)；分子量分別為100-118kD、83-110kD和80-92kD的ZP1、ZP2和ZP3，均由Sacco等人分離(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167∶318，1981)；分子量分別為65kD和80kD的脫糖基化RZⅠ和RZⅡ，均由Skinner和Dunbar分離(《避孕和促進(jìn)可育性的免疫途徑》，G.P.Talwar編，NewYork∶Plenum，第251-268頁，1986)；脫糖基化RZⅢ，一種由Timmons和Dunbar分離的90kD蛋白(Biol.Reprod.36∶1275，1987)。
已分離出了許多小鼠透明帶蛋白，其中包括分子量分別為200kD、120kD和83kD的ZP1、ZP2和ZP3，均由Bleil和Wassarman分離(Dev.Biol.76∶185，1980)；分子量分別為166-122kD和90-92kD的ZP1和ZP2，由Sacco等人分離(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167∶318，1981)。Bleil等人和Sacco等人所報(bào)道的小鼠ZP1和ZP2分子量的差異，可能是由于使用的是非還原條件下的雙向PAGE，而Sacco使用的則是還原條件下的雙向PAGE。
貓透明帶蛋白CZⅠ和CZⅡ由Maresh和Dunbar分離(J.Exp.Zool.244∶299，1987)，其分子量分別為50-110kD和90-110kD。
Maresh和Dunbar(J.Exp.Zool.244∶299，1987)還分離出了狗透明帶蛋白DZⅠ、DZⅡ和DZⅢ，其分子量分別為50-110kD、70-95kD和90-100kD。
Sacco等人(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167∶318，1981)描述了分子量分別為63-78kD、63-70kD、47-51kD和43-47kD的鼠猴ZP1、ZP2、ZP3、和ZP4。在同一出版物中，Sacco等人描述了分子量分別為80-120kD、73kD和59-65kD的人ZP1、ZP2和ZP3。
迄今為止，很少有哺乳動物透明帶基因或蛋白得到分離和順序測定。沒有一種基因或蛋白曾成功用來生產(chǎn)有效的免疫避孕藥。關(guān)于各種哺乳動物的透明帶中所存在的蛋白數(shù)目和特性(如分子量)，本領(lǐng)域技術(shù)人員沒有達(dá)成一致看法，而且，純化這些高度糖基化的蛋白也有一些困難，這都阻礙了為利用透明帶蛋白生產(chǎn)具有可預(yù)測功能的有效免疫避孕藥所作的嘗試。
許多研究小組已成功地克隆出了編碼各種哺乳動物透明帶蛋白的cDNA或基因。
Ringuette等人(Dev.Biol.，127∶287-295，1988)和Liang等人(Mol.CellBiol.，10∶1507-1515，1990)報(bào)道了分別編碼透明帶蛋白ZP3和ZP2的小鼠DNA的克隆。這些克隆是通過用抗ZP3和抗ZP2抗體篩選小鼠cDNA文庫而得到的。在小鼠ZP3和ZP2之間未發(fā)現(xiàn)有順序同源性。
Ringuette等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83∶4341-4345，1986)報(bào)道了小鼠ZP3部分cDNA克隆的分離，該克隆與小鼠、大鼠、狗、牛和人的完整基因組DNA雜交，但不與豬或兔的基因組DNA雜交，除非雜交在很不嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。由Ringuette(Dev.Biol.127∶287-295，1988)定性鑒定的全長ZP3cDNA，相當(dāng)于一個(gè)具有相對較短的5′和3′非翻譯區(qū)和一個(gè)約1317個(gè)核苷酸的開放讀碼的種系特異性mRNA，該mRNA有一個(gè)200-300個(gè)核苷酸的額外多聚A尾部。Ringuette還發(fā)現(xiàn)，大鼠、兔、狗和牛的卵巢能轉(zhuǎn)錄與小鼠ZP3cDNA雜交的mRNA，而ZP3轉(zhuǎn)錄本具有相似的分子量。Liang等人(Mol.CellBiol.10∶1507-1515，1990)證明，ZP2的核酸順序和推測出的氨基酸順序與ZP3的順序明顯不同，但它的5′和3′非翻譯區(qū)具有同樣的短基序。據(jù)報(bào)道，ZP2mRNA只有一個(gè)2，139個(gè)核苷酸的開放讀碼，編碼相當(dāng)于713個(gè)氨基酸的80，217道爾頓的多肽。
Chamberlin和Dean(Dev.Biol.131∶207-214，1989)及Kinloch，R.A.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85∶6409-6413，1988)報(bào)道了小鼠ZP3基因的克隆。據(jù)報(bào)道，小鼠ZP3基因在8.6kbp的轉(zhuǎn)錄單元中有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。
Kinloch等人(Dev.Biol.142∶414-421，1990)報(bào)道了由倉鼠基因組DNA文庫克隆倉鼠基因組ZP3DNA，所述文庫是用小鼠ZP3DNA作探針篩選出來的。倉鼠ZP3基因有一個(gè)7900個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄單元，據(jù)發(fā)現(xiàn)，該基因含有7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子。倉鼠ZP3蛋白約有81%與小鼠ZP3蛋白同源。倉鼠轉(zhuǎn)錄本含有1266個(gè)核苷酸，比小鼠ZP3mRNA少6個(gè)核苷酸。
Chamberlain和Dean(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87∶6014-6018，1990)報(bào)道了用小鼠ZP3cDNA作探針，由人基因組DNA文庫克隆人ZP3。人ZP3基因由18.3kbp的轉(zhuǎn)錄單元中的8個(gè)外顯子組成。這些外顯子的大小與小鼠ZP3的大小幾乎相同，編碼區(qū)的核苷酸順序有74%同源。人ZP3轉(zhuǎn)錄本與小鼠ZP3mRNA很相似，都具有短的5′和3′非翻譯區(qū)，都只有一個(gè)1272個(gè)核苷酸的開放讀碼，編碼424個(gè)氨基酸的蛋白。
授予Dunbar的美國專利4，996，297報(bào)道了用抗ZP1和抗ZP2抗體作篩選探針，分離三個(gè)編碼兔ZP1和ZP2蛋白的免透明帶克隆。Dunbar專利的圖4中稱為P2和P3的順序，分別代表812和1705個(gè)核苷酸的兔ZPcDNA。
Schwoebel等人(J.Biol.Chem.266∶7214-7219，1991)利用種間交叉親和純化的抗血清分離并鑒定了編碼55kD免透明帶蛋白的全長cDNA(稱為rc55)。該cDNA所編碼的蛋白與Liang所描述的小鼠ZP2蛋白有某種相似性。然而把rc55與小鼠ZP3蛋白比較卻沒有發(fā)現(xiàn)任何同源性。
克隆的ZPDNA及其編碼蛋白的功能活性尚未得到充分鑒定，它們作為免疫避孕藥的潛在用途也尚未得到闡明。
為了開發(fā)用于可育性控制的有用透明帶產(chǎn)品，特別是疫苗形式的產(chǎn)品，迫切需要能夠從感興趣的某種動物中純化、分離和鑒定透明帶蛋白。由于有疫苗生產(chǎn)所需的這些蛋白的純度等因素，以及與這些蛋白的純化有關(guān)的高成本和許多問題，迫切需要確認(rèn)感興趣的特定物種透明帶蛋白的DNA順序和氨基酸順序。有了這些已知的、經(jīng)過分離和鑒定的透明帶蛋白，就可以了解每種透明帶蛋白的功能，就可以根據(jù)特定透明帶蛋白的特定功能特性，對特定的哺乳動物物種設(shè)計(jì)出可育性控制產(chǎn)品。
因此，非常有用而又迫切需要的是，提供經(jīng)過分離純化的、經(jīng)過順序測定和特性鑒定的重組透明帶蛋白，這樣就有可能開發(fā)出具有可重復(fù)的誘導(dǎo)暫時(shí)性和/或永久性不育的特定效果的可育性控制產(chǎn)品。這些產(chǎn)品在用于誘導(dǎo)暫時(shí)性不育時(shí)，將有利地具有長期持續(xù)的效果，從而盡可能減少了為維持不育而必須給予免疫避孕藥的次數(shù)。
本發(fā)明提供用于在雌性哺乳動物(包括人)體內(nèi)誘導(dǎo)可重復(fù)的暫時(shí)性或永久性不育的新方法和材料，該方法是選擇性給予同源和/或異源哺乳動物ZP蛋白或其具有免疫避孕活性的片段，這些片段在下文中稱為ZPA、ZPB和ZPC?！翱芍貜?fù)”的含義是，與先有技術(shù)通過給予ZP蛋白(其形式為這些蛋白的混合物)誘導(dǎo)暫時(shí)性不育的做法不同，本發(fā)明達(dá)到其暫時(shí)性不育效果的方法是給予ZPA和/或ZPB，而其形式能夠使暫時(shí)性不育的持續(xù)時(shí)間可控，并能以可控和/或可預(yù)測的方式維持在開或關(guān)的狀態(tài)。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的方法主要是給予本發(fā)明的高度純化的ZPA和ZPB蛋白或其具有免疫避孕活性的片段，例如重組形式，因而基本不含ZPC。具有免疫避孕活性的片段是指能夠誘導(dǎo)不育的ZP蛋白片段。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)可重復(fù)的暫時(shí)性不育的方法，該方法是給予主體雌性哺乳動物選自哺乳動物ZPA、ZPB及其組合的透明帶蛋白(或其片段)，給予的劑量能有效刺激所述哺乳動物產(chǎn)生識別所述哺乳動物的ZPA或ZPB蛋白的抗體。目前優(yōu)選的是，用于這些方法的哺乳動物ZPA和ZPB得自與主體哺乳動物相同的哺乳動物物種，但也可考慮使用異源物種的蛋白。可以考慮使用哺乳動物ZPA或ZPB蛋白的純化分離物，例如用色譜分離法得到的蛋白。預(yù)計(jì)使用由重組方法得到的蛋白是最優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一方面提供在雌性哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)永久性不育的方法，該方法是以基本不含ZPA和/或ZPB的形式給予主體雌性哺乳動物重組哺乳動物ZPC蛋白(或其片段)，給予的劑量能有效刺激所述雌性哺乳動物產(chǎn)生識別所述哺乳動物的ZPC蛋白的抗體。與誘導(dǎo)暫時(shí)性不育的情況相同，優(yōu)選使用同源物種的ZPC，但不是必須這樣做，蛋白可以得自天然來源，也可以由重組方法產(chǎn)生。本發(fā)明還考慮使用經(jīng)過修飾的ZPC蛋白，包括(但不限于)棕櫚?；牡鞍缀徒?jīng)過脫乙酰殼多糖修飾的蛋白。
對暫時(shí)性不育誘導(dǎo)方法的獸醫(yī)應(yīng)用來說，目前優(yōu)選的ZPA、ZPB和ZPC，蛋白包括豬、兔、狗、貓、牛和獼猴的ZP蛋白。
本發(fā)明的另一方面提供用于在雌性哺乳動物(包括人)體內(nèi)誘導(dǎo)可重復(fù)的暫時(shí)性不育的藥物組合物，該組合物包含有效劑量的選自哺乳動物ZPA和ZPB(基本不含ZPC)的透明帶蛋白(或其片段)，以及一種或更多種可藥用的載體、稀釋劑和佐劑。本發(fā)明還考慮使用經(jīng)過修飾的ZPA和ZPB蛋白(例如棕櫚?；牡鞍谆蚪?jīng)過脫乙酰殼多糖修飾的蛋白)。
本發(fā)明的另一方面提供新的經(jīng)過純化和分離的DNA順序，這些順序編碼豬ZPA、ZPB和ZPC，如在1、3和5號順序中所列的DNA順序所說明的。另外，提供了一些經(jīng)過純化和分離的DNA順序，這些順序編碼兔ZPC，如7號順序中所列的DNA順序所說明；狗ZPA和ZPC，如9號和11號順序中所列的DNA順序所說明；貓ZPA、ZPB和ZPC，如13、15和17號順序中所列的DNA順序所說明；牛ZPA、ZPB和ZPC，如19、21和23號順序中所列的DNA順序所說明；人ZPA和ZPB，如42號和40號順序中所列的DNA順序所說明，并作為人DNA插入片段包含在λ噬菌體克隆A1和A4中(ZPA)，或作為人DNA插入片段包含在λ噬菌體克隆1-1和4-9中(ZPB)。
本發(fā)明的多核苷酸順序可用于用重組法生產(chǎn)ZPA、ZPB和ZPC蛋白，并可作為探針用于用雜交法分離編碼相應(yīng)透明帶蛋白的異源物種多核苷酸。
本發(fā)明還提供新的宿主細(xì)胞，尤其是單細(xì)胞真核和原核細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞已用本發(fā)明的多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方式允許ZP蛋白(或其有免疫意義的片段)在該宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。表達(dá)這些ZP產(chǎn)物的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中時(shí)，特別適用于大規(guī)模生產(chǎn)方法，從而用這些方法從細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離出糖基化或非糖基化形式的所需多肽產(chǎn)物。
因此，本發(fā)明所提供的重組多肽包含ZPA、ZPB和ZPC，以及這些透明帶蛋白的完全等價(jià)物，包括糖基化和非糖基化形式、變異體及其免疫活性片段，這些片段保留了大部分生物活性，即這里所討論的透明帶蛋白的至少一種生物活性，例如在給予哺乳動物后刺激這里所討論的抗體產(chǎn)生的能力。這些免疫活性片段可以定義為含有至少一個(gè)在按本發(fā)明給予哺乳動物后能有效刺激抗體產(chǎn)生的抗原決定基。
本發(fā)明的另一方面提供一種分離編碼其他哺乳動物ZPA、ZPB和ZPC蛋白的核酸順序的方法，該方法是在嚴(yán)格條件下，使異源物種的ZPA、ZPB和/或ZPC探針與得自感興趣哺乳動物物種的cDNA或基因組DNA文庫雜交。
更具體地說，本發(fā)明的一個(gè)方面提供分離編碼人ZPA和ZPB的核酸順序的方法，該方法是在嚴(yán)格條件下，使來自異源物種的編碼ZPA和/或ZPB的順序雜交。
參照附圖來考慮以下對本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施方案所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將很容易理解，附圖中

圖1是質(zhì)粒載體pZ90的示意圖；圖2是質(zhì)粒載體pZ98的示意圖；圖3是質(zhì)粒載體pZ156的示意圖；圖4是編碼人ZPB的EcoRI片段的排列示意圖。
圖5是質(zhì)粒載體pZ169的示意圖；圖6是質(zhì)粒載體pZ145的示意圖。
本發(fā)明涉及哺乳動物透明帶蛋白，這些蛋白被鑒定為三個(gè)大類ZPA、ZPB和ZPC。之所以這樣分類是因?yàn)椋瑢Ω鞣N哺乳動物卵巢cDNA文庫進(jìn)行反復(fù)篩選后，回收到的克隆編碼具有顯著同源性的三組不同的蛋白，這三組蛋白在這里命名為ZPA、ZPB和ZPC。雖然在不同的動物物種中觀察到編碼ZPA、ZPB或ZPC的DNA順序之間有相似性，但在各物種的ZPA、ZPB和ZPC蛋白之間卻幾乎沒有發(fā)現(xiàn)什么同源性。
編碼透明帶蛋白A、B和C的DNA順序及其推測的各種哺乳動物物種ZP的氨基酸順序，列于1-24號順序中。應(yīng)該理解，特定動物的DNA順序可能會由于等位基因變異現(xiàn)象而稍有變化。預(yù)計(jì)不同動物間確切的DNA順序會有小的差異，由于順序測定方法不夠有效也會造成微小的錯(cuò)誤。這些變異體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
上述透明帶DNA順序是由特異性透明帶抗體或已知的透明帶DNA探針篩選出的卵巢cDNA文庫得到的。將分離出的順序與已公開的蛋白或DNA順序作比較，并在分離出其他克隆時(shí)與其他克隆作比較，并利用這一比較對上述克隆進(jìn)行分類和鑒定。
術(shù)語“透明帶蛋白”的含義包括全長蛋白ZPA、ZPB和ZPC，以及包含在這些蛋白內(nèi)的預(yù)期變異體、免疫活性片段或肽。術(shù)語“透明帶DNA”的含義包括那些編碼透明帶蛋白的核酸順序或其片段。
現(xiàn)已根據(jù)編碼各種哺乳動物ZP的蛋白的DNA中的同源性，確定了三大類哺乳動物透明帶蛋白。ZPA包括以前在文獻(xiàn)中各不相同地稱為ZP1、ZP2和ZP3的肽；ZPB包括以前各不相同地稱為ZP3α和rc55的肽；ZPC包括以前各不相同地稱為ZP3β和ZP3的肽。
特定一類內(nèi)的各種不同透明帶蛋白與每類中一致順序的同源性示于表1。該一致順序是利用Microgenie 順序分析程序(Beckman Instruments，Inc.Spinco Division，Palo Alto，CA)得到的。所排出的順序在一致順序中應(yīng)該是某個(gè)殘基的給定位置肯定是該殘基的最小百分比是50%。相應(yīng)于ZPA、ZPB和ZPC蛋白氨基酸一致順序的DNA順序，分別列在25、26和27號順序中。
表1推測ZP蛋白氨基酸的同源性ZPAZPBZPC狗78.9%--77.3%貓78.4%70.9%77.5%牛77.2%80.4%77.2%豬73.0%77.8%79.0%兔70.1%74.6%71.3%
小鼠61.6%--69.6%人----76.9%倉鼠----70.5%各種透明帶蛋白的推測氨基酸順序，提示ZPA、ZPB和ZPC的近似未糖基化分子量分別為75kD、55kD和45kD。有關(guān)DNA順序同源性和推測氨基酸順序同源性更詳細(xì)的分析，敘述于實(shí)施例13、14和15中。
出人意料地發(fā)現(xiàn)，給予宿主動物特定的一類透明帶蛋白，產(chǎn)生特定的免疫避孕效果；對所給予的適當(dāng)ZP蛋白進(jìn)行選擇，就永久性不育還是暫時(shí)性不育而言能夠誘導(dǎo)出所要求的避孕效果。例如，用透明帶蛋白C給動物接種，可在該動物體內(nèi)誘導(dǎo)出識別內(nèi)源性ZPC的抗體效價(jià)，導(dǎo)致該動物的卵巢喪失卵母細(xì)胞，從而造成永久性不育。相反，用透明帶蛋白A、B或其組合給動物接種，可誘導(dǎo)出不識別ZPC但識別ZPA和ZPB的抗體效價(jià)。這使動物在抗ZPA和/或抗ZPB抗體保持高價(jià)的時(shí)間內(nèi)有重量周期但不育。當(dāng)這些抗體效價(jià)下降時(shí)，不育效果消失，動物重新獲得可育性。
據(jù)觀察，用經(jīng)過分離純化和鑒定的ZPA、ZPB和ZPC蛋白進(jìn)行接種時(shí)，如果觸發(fā)自身免疫反應(yīng)，所產(chǎn)生的自身抗體特異地識別受免疫動物自身的特異透明帶蛋白，則對受免疫動物產(chǎn)生特定的效果。按本發(fā)明誘導(dǎo)出的抗體的這種自我識別作用，可以用血清抗體識別同源物種透明帶蛋白上的至少一種抗原決定基的能力來定義和鑒定。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，用重組ZPA、ZPB或ZPC或其片段來免疫動物。重組蛋白或肽可以屬于同源物種，也可以得自具有共同抗原決定基的異源物種透明帶，前提條件是這些共同的抗原決定基具有誘導(dǎo)所需的自身免疫反應(yīng)的功能。
可以用化學(xué)方法使重組蛋白或肽片段與免疫增強(qiáng)劑如鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)和胞壁酰二肽(MDP)等結(jié)合，也可以把該片段制成融合蛋白，如與外源蛋白氨基酸在氨基末端和/或羧基末端融合。給予本發(fā)明的蛋白或片段后刺激抗體生成的完全常規(guī)的方法是公知的。同樣，涉及給予針對本發(fā)明透明帶蛋白或片段的抗體本身(如抗ZPA抗體、抗ZPB抗體或抗ZPC抗體)的被動免疫技術(shù)，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。詳細(xì)描述見Dean的PCT申請WO90/15624，該申請的公開內(nèi)容全部列入本文作參考。
因此，為誘導(dǎo)狗的永久性不育，可以采用以細(xì)菌融合蛋白形式表達(dá)(或與免疫增強(qiáng)劑結(jié)合)的重組狗ZPC，其中有活性的狗ZPC蛋白得到保留，可參與與抗原呈遞細(xì)胞的相互作用。然后把表達(dá)出的蛋白給予宿主狗，誘導(dǎo)出自身免疫反應(yīng)，該反應(yīng)中生成的抗體識別狗透明帶蛋白C。這種能特異識別狗ZPC蛋白或其聚集體的自身免疫作用，在經(jīng)過接種的狗體內(nèi)誘導(dǎo)出永久性不育，這種不育是由于狗卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的喪失造成的。
另外，也可以給予狗非同源物種的ZPC，例如與狗ZPC交叉反應(yīng)的重組豬ZPC或其肽，以達(dá)到類似的絕育效果。但是，如果誘導(dǎo)出(或者在被動免疫時(shí)給予)能識別宿主自身的固有透明帶的抗體，則不能實(shí)現(xiàn)這種絕育效果。
在本發(fā)明的一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，給予宿主物種自身的A和/或B類透明帶蛋白，或者給予能誘導(dǎo)抗宿主ZPA和/或ZPB蛋白的另一物種的相關(guān)A和/或B蛋白，所產(chǎn)生的不育效果與由ZPC類抗原產(chǎn)生的不育效果不同，用ZPA和ZPB蛋白接種的生理效果是暫時(shí)性的效果?！皶簳r(shí)性不育”在這里定義為，在抗自身透明帶蛋白的抗體在宿主動物的循環(huán)系統(tǒng)中維持在避孕有效濃度(例如在狗體內(nèi)約為1∶250的效價(jià))時(shí)，這種不育就得以維持，而在抗自身透明帶蛋白的抗體下降到避孕有效濃度的下限以下時(shí)，這種不育則消失。抗自身透明帶抗體的下降導(dǎo)致可育性的恢復(fù)，但在卵巢中并沒有重大生理變化的跡象。一般來說，抗體效價(jià)的下降是隨著哺乳動物宿主體內(nèi)的自然過程而發(fā)生的，但降低抗體效價(jià)的其他方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
維持不育所需的抗自身透明帶蛋白A和B的避孕有效抗體效價(jià)，將隨受接種動物的種屬及所給予的重組ZPA或ZPB肽的種類而變化，但很容易確定，例如用以下方法用不同劑量的特異性抗原測試一組所需的動物物種，用已知的ELISA技術(shù)測定誘導(dǎo)出的抗自身抗體的效價(jià)，使該效價(jià)與生殖指標(biāo)(如有生理周期、激素水平等)相關(guān)。一般來說，高于1∶250的抗體效價(jià)是避孕有效的。
根據(jù)氨基酸順序同源性，預(yù)計(jì)特定一類透明帶蛋白中的所有蛋白都含有在哺乳動物物種間有交叉反應(yīng)的功能性抗原決定基。但是，這些有交叉反應(yīng)的功能性抗原決定基沒有得到鑒定的情況下，優(yōu)選的選擇性避孕藥是同源物種的透明帶蛋白或其抗體。
考慮本發(fā)明的下列說明性實(shí)施例將會對本發(fā)明有更完整的理解。這些實(shí)施例中實(shí)施例1闡述編碼豬ZPA、ZPB和ZPC的DNA的分離；實(shí)施例2涉及兔ZPCDNA的分離；實(shí)施例3涉及編碼狗ZPA和ZPC的DNA的分離；實(shí)施例4闡述編碼ZPA、ZPB和ZPC的貓DNA的分離；實(shí)施例5涉及編碼牛ZPA、ZPB和ZPC的DNA的克隆和分離；實(shí)施例6和7敘述了用天然來源的豬透明帶蛋白對狗進(jìn)行免疫避孕處理；實(shí)施例8涉及對實(shí)施例6和7中所測試的動物進(jìn)行的血清化學(xué)研究；實(shí)施例9和10闡述狗ZPC融合蛋白的重組生產(chǎn)及其在狗中的免疫避孕應(yīng)用。實(shí)施例11涉及用本文所述方法分離編碼人ZPA和ZPB的DNA。實(shí)施例12涉及編碼獼猴ZPA、ZPB和ZPC的DNA的分離和順序測定。實(shí)施例13-15分別涉及哺乳動物ZPA、ZPB和ZPC的DNA順序和推測氨基酸順序的比較。實(shí)施例16涉及用HSPZ和經(jīng)過分級分離的HZPC免疫獼猴。實(shí)施例17涉及哺乳動物透明帶蛋白抗原決定基的圖譜測定。實(shí)施例18敘述了用重組ZPC蛋白免疫狗。實(shí)施例19涉及用重組ZP蛋白接種牛和貓。
實(shí)施例1分離編碼豬透明帶蛋白ZPA、ZPB和ZPC的DNA順序取一個(gè)由CloneTech公司(PaloAlto，CA)用工業(yè)方法由分離自14周齡豬的卵巢制備的λgtllcDNA文庫，用得自E.C.Yurewicz并描述于文獻(xiàn)(Keenan等，Biol.Reprod.，44∶150-156，1991)的抗ZP3β抗體對該文庫進(jìn)行篩選。鑒定出8個(gè)候選克隆。
如Yurewicz等人所述(J.Biol.Chem.，262∶564-571，1987)，構(gòu)建一個(gè)簡并DNA寡核苷酸探針(19bp)，以代表N末端豬ZP3β一個(gè)短部分的所有可能順序。該簡并探針的順序列于28號順序中。
用簡并DNA寡核苷酸探針進(jìn)行表達(dá)篩選，分離出8個(gè)候選克隆，對這8個(gè)克隆進(jìn)行Southern分析，結(jié)果8個(gè)候選克隆中有兩個(gè)出現(xiàn)雜交。然后把這兩個(gè)被簡并探針識別出的克隆亞克隆到pBS KS質(zhì)粒(STRATAGENE Cloning Systems，La Jolla，CA)中，以便用測序酶和SEQUENASE 手冊(U.S.Biochemical，Cleveland，OH)所述的程序進(jìn)行順序分析。其中插入片段大小約為1200堿基對的一個(gè)克隆B-8，含有一個(gè)與以前由Ringuette等人(Dev.Biol.，127∶287-295，1988)鑒定的小鼠ZP3N末端順序同源的順序。另一個(gè)克隆B-6的插入片段大小約為1000堿基時(shí)。這兩個(gè)雜交克隆都缺乏與小鼠ZP3基因末端部分的同源性，表明它們都不含有基因的C末端部分。
然后用DNA雜交法篩選14周齡豬卵巢文庫。將約150，000噬斑形成單位鋪在含有大腸桿菌Y1090的瓊脂平板上。于37℃下培養(yǎng)過夜后，制備噬斑的尼龍膜印跡，并用前面通過用28號順序中列出的簡并寡核苷酸探針篩選而分離得到的B6和B8克隆進(jìn)行篩選。
將濾膜置于含有5X鹽水、磷酸鈉、EDTA緩沖劑(SSPE)、5XDenhardt氏試劑、100μg/ml鮭精DNA、30%甲酰胺和0.5%SDS的溶液中，于42℃下預(yù)雜交3小時(shí)。12片濾膜(132mm)使用約50ml預(yù)雜交溶液。預(yù)雜交后，加入10ng新放射標(biāo)記的DNA探針在30%甲酰胺、5xSSPE中的溶液。在95℃下使探針熱變性3-5分鐘，繼續(xù)用DNA探針于42℃下雜交過夜。然后在55℃下用100ml5xSSPE將雜交后的濾膜洗滌兩次，每次洗約1小時(shí)。然后在室溫下用250ml5xSSPE沖洗濾膜，并令其空氣干燥。在-70℃下用增感屏使干燥的濾膜對X光膠片曝光至少8小時(shí)，然后沖洗膠片供目測分析。
在所分離出的其他克隆中，有兩個(gè)含有豬ZP3β基因C末端部分的克隆。將一個(gè)克隆λ5-1亞克隆到質(zhì)粒pBSKS中并測定其順序。這個(gè)稱為pZ57的質(zhì)粒含有1266個(gè)堿基對的ZPDNA插入片段，與已知的小鼠ZP3相比較似乎編碼豬ZP3β的全長氨基酸順序。該克隆的推測氨基酸順序與Yurewicz等人(J.Biol.Chem.，262∶564-571，1987)所報(bào)道的ZP3β已知N末端氨基酸順序的排列，以及相應(yīng)于E.C.Yurewicz所提供的氨基酸255-274的ZP3β內(nèi)部肽順序，證實(shí)了該克隆編碼豬ZP3β的本性。
這個(gè)稱為豬ZPC的克隆的DNA順序列在5號順序中，其推測氨基酸順序列在6號順序中。
用兔透明帶rc55cDNA作探針，對14周齡豬卵巢cDNA文庫進(jìn)行進(jìn)一步的篩選(見Schwoebel等，J.Biol.Chem.，266∶7214-7219，1991)。
分離出一個(gè)約1700堿基對的候選克隆λ2-1，并將其轉(zhuǎn)移到測序質(zhì)粒pBS KS中。用SEQUENASE 手冊(US Biochemical Corporation，Cleveland，Ohio)所述的方法測定豬DNA插入片段的DNA順序和推測氨基酸順序。經(jīng)過測序的克隆含有1620堿基對。通過將推測的氨基酸順序與E.C.Yurewicz所提供的豬ZP3α氨基酸206-222、271-279和328-344的已知蛋白順序的有關(guān)部分進(jìn)行排列，證實(shí)了該克隆含有豬ZP3α基因的全長拷貝。這個(gè)稱為豬ZPB的克隆的DNA順序列在3號順序中。其推測氨基酸順序列在4號順序中。
利用上述步驟，并使用編碼狗ZPA的DNA探針(如下面的實(shí)施例3所述制得，9號順序)。得到約1300堿基對的單個(gè)克隆λ3-5。將該克隆的大小與分離自小鼠(Liang等，Mol.CellBiol.10∶1507-1515，1990)、兔(Dunbar，美國專利4，996，297)和狗(見下面的實(shí)施例3)的ZP2基因作比較，估計(jì)該克隆代表理論豬ZPA基因的N末端60%。
然后用該克隆再次篩選豬卵巢文庫，又得到三個(gè)克隆，兩個(gè)小克隆和一個(gè)大得足以包含全長順序的克隆。測定約2200堿基對的大候選克隆λB的順序，所得數(shù)據(jù)表明，如將該ZPA克隆與小鼠ZP2基因和實(shí)施例3所述的狗ZPA基因一起排列，則發(fā)現(xiàn)該ZPA克隆只缺少全長順序中的約7個(gè)堿基對，包括ATG起始密碼子。這個(gè)稱為豬ZPA的克隆的DNA順序列在1號順序中，其推測氨基酸順序列在2號順序中。
這個(gè)分離出的豬克隆含有與三個(gè)已得到鑒定的豬透明帶蛋白的公開順序相應(yīng)的順序，這三個(gè)蛋白是在授予Dunbar的美國專利4，996，297中公開的ZP1(80kD)、ZP2(62kD)，以及由Hasegawa等人(Abst.NO.382，MeetingSoc.StudyReprod.，1991年7月)公開的ZP4(21kD)。這些結(jié)果表明，一個(gè)單一的克隆編碼了一個(gè)以前曾認(rèn)為是以三個(gè)獨(dú)立蛋白(即ZP1、ZP2和ZP4)存在的透明帶蛋白。這進(jìn)一步表明，只有三個(gè)主要豬透明帶基因編碼本文稱為ZPA、ZPB和ZPC的三個(gè)主要透明帶蛋白。ZPA包括那些以前稱為ZP1、ZP2和ZP4的蛋白。ZPB相應(yīng)于ZP3α，ZPC相應(yīng)于以前鑒定的ZP3β(Yurewicz等，J.Biol.Chem.，262∶564-571，1987)。
實(shí)施例2
編碼兔ZPC蛋白的DNA順序的分離和純化從5周齡兔體內(nèi)摘取卵巢，用Fast TrackTMmRNA分離試劑盒，按Fast TrackTM說明書(version3.1，目錄號K1593-02，Invitrogen，San.Diego，CA)所述的方法來制備cDNA。利用Lambda LibrarianTM試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA)按制造商的說明來制備cDNA，并將cDNA克隆到λgt10中。將約150，000個(gè)噬斑形成單位鋪在含有大腸桿菌Y1090的瓊脂平板上。于37℃下培養(yǎng)過夜后，制備菌落的尼龍膜印跡，并利用實(shí)施例1所述的篩選方法，用豬ZPC DNA探針進(jìn)行篩選。所用的探針為列在5號順序中的豬ZPC順序。
兩個(gè)陽性克隆λR4和λR5與豬ZPCDNA雜交。在瓊脂糖凝膠上估計(jì)這兩個(gè)克隆各自的大小約為1300堿基對。λR4和λR5都如實(shí)施例1所述進(jìn)行順序測定。除λR5在5′端含有4個(gè)額外的核苷酸外，這兩個(gè)順序完全相同。測得的DNA順序與編碼豬ZPC的DNA順序約75%同源。
編碼兔ZPC蛋白的DNA順序列在7號順序中。其推測氨基酸順序列在8號順序中。
兔ZPA和ZPB蛋白以前曾分別由Dunbar的美國專利4，996，297鑒定為P2和P3。
實(shí)施例3編碼狗透明帶蛋白ZPA和ZPC的DNA順序的分離大致按照實(shí)施例1所述的方法，由CloneTech公司(PaloAlto，CA)在λgt11中用工業(yè)方法制備16周齡狗卵巢cDNA表達(dá)文庫。用針對熱溶解狗透明帶產(chǎn)生的抗體篩選狗卵巢cDNA文庫。熱溶解狗透明帶(HSDZ)是大致按照Dunbar等人(Biochem.19∶356-365，1980)所述的方法制備的，但用成套刮刀剪碎卵巢。
用250μgHSDZ和250μgMDP免疫兔。以大約三周的間隔再進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫。用所得的兔血清來篩選狗卵巢cDNA表達(dá)文庫。得到7個(gè)候選克隆。用Southern印跡分析法如下進(jìn)行交叉雜交實(shí)驗(yàn)。首先用約1300堿基對的最大克隆λ26-1作為Southern印跡中所有其他克隆的探針，鑒定出3個(gè)其他克隆。然后用其余克隆中分別約為800和1000堿基對的最大克隆λ20-1和λ7-1作為Southern印跡中的探針。這些探針沒有鑒定出更多的克隆。7個(gè)候選克隆彼此進(jìn)行的這一交叉雜交分析表明，其中有4個(gè)克隆相關(guān)，例如，有4個(gè)克隆與λ26-1雜交，而其余三個(gè)即λ20-1、λ7-1和λ19-3則彼此獨(dú)立。
將4個(gè)相關(guān)克隆中最大的λ26-1亞克隆到pBSKS質(zhì)粒中，以便按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行順序分析。分析出的順序證實(shí)了1278堿基對的長開放讀碼的存在，該開放讀碼編碼約426個(gè)氨基酸的蛋白。把該克隆的推測氨基酸順序與已知透明帶蛋白的順序比較表明，該克隆所編碼的蛋白與下列蛋白相關(guān)如Ringuette等人(Dev.Biol.127∶287-295，1988)所報(bào)道的小鼠ZP3(ZPC)、如Kinloch等人(Dev.Biol.，142∶414-421，1990)所報(bào)道的倉鼠ZP3、如Chamberlin等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87∶6014-6018，1990)所報(bào)道的人ZP3、豬ZPC蛋白(見實(shí)施例1)。這個(gè)稱為狗ZPC的克隆的DNA順序列在11號順序中。其推測氨基酸順序列在12號順序中。
把其余3個(gè)彼此獨(dú)立的候選克隆亞克隆到pBSKS質(zhì)粒中，以便如上所述進(jìn)行順序分析。如上所述，用計(jì)算機(jī)分析法把所測得的800堿基對克隆λ20-1的順序與已知的ZP順序作比較，發(fā)現(xiàn)λ20-1的順序與小鼠ZP2(ZPA)(Liang等，Mol.CellBiol.10∶1507-1515，1990)和豬ZPA(見實(shí)施例1)相關(guān)。
然后用λ20-1的800堿基對片段作雜交探針，再次篩選狗cDNA文庫。又鑒定出兩個(gè)候選克隆，并把約2800堿基對的較大克隆λ7A亞克隆到pBSKS質(zhì)料中以便進(jìn)行順序分析。把該順序與編碼透明帶蛋白的已知順序進(jìn)行比較表明，候選克隆λ7A含有全長ZPA順序，但N末端順序不正確，例如，通過與實(shí)施例1中提到的已知小鼠ZP2和兔ZPA順序一起排列，確定該克隆含有額外的600堿基對。然后把約1000堿基對的第二個(gè)候選克隆λ9-2亞克隆到質(zhì)粒pBSKS中并測定其順序。第二個(gè)克隆的順序表明了正確N末端順序的存在，但是，通過與小鼠ZP2和兔ZPA基因一起排列，確定第二個(gè)克隆的順序只包含全長克隆的大約N末端40%。但是這兩個(gè)cDNA克隆重疊后卻得到全長順序。
把每個(gè)克隆的適當(dāng)片段如下進(jìn)行亞克隆，以產(chǎn)生含有2028堿基對開放讀碼的正確全長透明帶克隆，該開放讀碼編碼約676個(gè)氨基酸的蛋白。用EcoRI消化λ7ADNA，得到兩個(gè)插入片段(2000bp和800bp)。把這兩個(gè)片段分別亞克隆到pBSKS中，分別得到pZ36和pZ37。質(zhì)粒pZ37攜有該順序的C末端部分。從λ載體中移出λ9-2DNA插入片段，并將其亞克隆到pBSKS中，得到pZ38。用HindⅢ消化質(zhì)粒pZ36，以除去λ7A基因片段約1350bp的N末端部分(約850bp的無義DNA和500bp的編碼順序)。這種消化還除去了EcoRI插入片段的一個(gè)末端，留下了一個(gè)單一的EcoRI位點(diǎn)。然后把pZ37EcoRI插入片段移入經(jīng)過修飾的pZ36(pZ36△1)中留下的單一EcoRI位點(diǎn)中，以重新建立存在于λ7A插入片段(1450/2800bp)中的DNA相對結(jié)構(gòu)取向。用HindⅢ把這個(gè)組合質(zhì)粒打開，并插入pZ38的攜有N末端ZPDNA順序的HindⅢ片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pZ39，該質(zhì)粒是攜有全長狗ZPA順序的pBSKS。這個(gè)狗ZPA基因的DNA順序列在9號順序中。其推測氨基酸順序列在10號順序中。
實(shí)施例4編碼貓透明帶蛋白ZPA、ZPB和ZPC的DNA順序的分離從5只約3-4月齡的貓?bào)w內(nèi)分離卵巢。利用Fast TrackTMmRNA，分離試劑盒(Invitrogen, San Diego, CA，目錄號K1593-02)，并采用該試劑盒所提供的程序，從6個(gè)卵巢中分離信使RNA。利用上述程序制備cDNA，并如實(shí)施例2所述克隆到λgt10中。
將約150，000個(gè)噬斑形成單位鋪在含有大腸桿菌Y1090的瓊脂平板上。于37℃下培養(yǎng)過夜后，用尼龍轉(zhuǎn)移膜制備并篩選噬斑印跡。利用編碼豬ZPA、ZPB和ZPC蛋白的DNA探針的等份混合物，并采用實(shí)施例2所述的雜交方法，對噬斑進(jìn)行篩選。共鑒定出81個(gè)陽性克隆。其中有12個(gè)克隆經(jīng)過噬斑純化。分別用豬ZPA、ZPB和ZPCDNA作探針對這些克隆進(jìn)行Southern分析，結(jié)果表明，其中有7個(gè)克隆編碼ZPC蛋白，有1個(gè)克隆編碼ZPA蛋白。有4個(gè)克隆含有不能用EcoRI消化法分離的插入片段。
有5個(gè)ZPC克隆的長度在1200-1350堿基對之間。對一個(gè)約1350堿基對的克隆λC-112進(jìn)行如上所述的順序分析，發(fā)現(xiàn)其推測氨基酸順序與實(shí)施例3獲得的狗ZPC蛋白約70%同源。這個(gè)貓ZPC克隆的DNA順序列在17號順序中。其推測氨基酸順序列在18號順序中。
對單個(gè)貓ZPA克隆λC-116進(jìn)行順序測定，測得其長度約為2215堿基對。推測氨基酸順序與實(shí)施例5中鑒定的狗ZPA蛋白約75%同源。這個(gè)貓ZPA克隆的DNA順序列在13號順序中。其推測氨基酸順序列在14號順序中。
用豬ZPBDNA作探針(3號順序)，再次篩選其余的69個(gè)陽性克隆。得到10個(gè)陽性克隆。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法測定，最大的克隆λC-1含有約1.7千堿基。測定該克隆的順序，發(fā)現(xiàn)基推測氨基酸順序與實(shí)施例1所述的豬ZPB蛋白約80%同源2。這個(gè)貓ZPB克隆的DNA順序列在15號順序中，其推測氨基酸順序列在16號順序中。
實(shí)施例5編碼牛透明帶蛋白ZPA、ZPB和ZPC的DNA順序的分離用實(shí)施例2所述的方法，由五月齡牛卵巢構(gòu)建cDNA文庫。利用編碼ZPA(1號順序)、ZPB(3號順序)和ZPC(5號順序)蛋白(如實(shí)施例2所述)的DNA探針的等比例混合物，采用實(shí)施例2所述的方法，用分別代表各類透明帶蛋白的DNA雜交探針篩選牛卵巢文庫。初步篩選得到三個(gè)候選克隆。分別用在初步篩選中所用的豬ZPA、ZPB和ZPCDNA探針對這些克隆進(jìn)行Southern分析，結(jié)果表明，約650堿基對的一個(gè)克隆λB2編碼ZPA。約1000堿基對的第二個(gè)克隆λB-1編碼ZPB。約1200堿基對的第三個(gè)克隆λ14編碼ZPC。
然后用混合豬ZPDNA探針再次篩選牛卵巢文庫，又得到兩個(gè)克隆。經(jīng)Southern分析鑒定，這兩個(gè)克隆編碼ZPC。
將ZPA、ZPB和最大ZPC克隆的EcoRI插入片段亞克隆，并分析其DNA順序。編碼這些牛ZPA、ZPB和ZPC片段的順序分別列在19、21和23號順序中。其推測氨基酸順序分別列在20、22和24號順序中。
實(shí)施例6用經(jīng)過分級分離的熱溶解豬透明帶對狗進(jìn)行免疫大致按照Dunbar等人(Biochemistry，19∶356-365，1980)所述的方法，但用手動攪肉機(jī)代替所述的Zonamatic，制備熱溶解豬透明帶(HSPZ)。分離后，將透明帶蛋白溶解于0.1M碳酸鈉緩沖液(pH9.6)中，并用6M脲強(qiáng)烈透析。對所得的含約12μgHSPZ的2-3ml溶液，用BIORADRotofor等電聚焦槽如下進(jìn)行等電聚焦。用pI范圍為3-10的1%兩性電解質(zhì)建立等電梯度。將透明帶加到中間范圍槽(pI7.0)中，使其在4℃下聚集約4小時(shí)，或者聚焦到電壓穩(wěn)定。
收集20個(gè)經(jīng)過等電聚焦得到的部分，并用SDSPAGE法和Western印跡分析法分析豬透明帶蛋白。合并含有豬透明帶蛋白、pI范圍約為3.5-5.5的酸性部分。將各部分透析到0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中，并濃縮至約3mg/ml。如下所述用該抗原制備物接種動物。用雙向凝膠電泳法分析這個(gè)抗原制備物，表明存在有ZPA和ZPB蛋白。然而并未證實(shí)該制備物中存在ZPC。
將HSPZ抗原制備物加到50/50水油乳液中，該乳液中加有每劑量含250μgMDP的不完全弗氏佐劑(Sigma，St.Louis，MO)。1ml50/50水油乳液含有0.425ml石蠟油、0.075ml二縮甘露醇單油酸酯、0.5ml含250μg蘇氨酰MDP(SYNTEX公司)的PBS，以及下表3所述量的HSPZ。
采用表2所述的方案，用HSPZ免疫4只10-12周齡的隨機(jī)配種狗。
表2HSPZ(mg)首次免疫0時(shí)0.1第1次增強(qiáng)免疫第4周1.0第2次增強(qiáng)免疫第8周1.25第3次增強(qiáng)免疫第12周0.2第4次增強(qiáng)免疫第16周1.0第5次增強(qiáng)免疫第36周1.0通過ELISA法監(jiān)測這些動物產(chǎn)生的抗血清。17周時(shí)，抗自身(例如抗狗透明帶蛋白)的抗體效價(jià)達(dá)到最高點(diǎn)(用ELISA法測得為8-16K)，然后開始下降。
36周時(shí)，切除1只動物的單側(cè)卵巢，將摘除的卵巢切片并用高碘酸希夫氏染色法(PAS)染色以進(jìn)行組織學(xué)觀察。卵巢似乎是政黨的，因?yàn)樗邪l(fā)育階段中都有卵泡存在。52周時(shí)，觀察到4只受試動物中有2只表現(xiàn)出動情行為。其余的2只受試動物在大約一年半時(shí)表現(xiàn)出動情行為，此時(shí)頭2只受試動物出現(xiàn)第二次動情。所有受試動物都用有交配能力的雄性動物和人工授精法反復(fù)配種，但沒有一只動物受孕。在同一時(shí)間內(nèi)，在如實(shí)施例10所述的未得到自身效價(jià)的各種測試方案中，動物在與相同的雄性動物交配或用人工授精法配種后受孕。
配種期過后兩周后，例如54周時(shí)，將2只早期出現(xiàn)生理周期的動物切除單側(cè)卵巢，并將摘除的卵巢切片以進(jìn)行組織學(xué)觀察。盡管已證實(shí)了功能性不育，但卵巢在這一階段的卵泡活動似乎是正常的。
實(shí)施例7用豬ZPC蛋白進(jìn)行接種從E.Yurewicz處得到純化的豬ZPC蛋白(ZP3β)，該蛋白是如文獻(xiàn)所述制備的(J.Biol.Chem.，262∶564-571，1987)。
將167μg純化的豬ZPC蛋白(βZP3)加到50/50水油乳液中制得疫苗，用于首次免疫時(shí)該乳液含有完全弗氏佐劑(SigmaNo.F5881，St.LouisMO)，用于增強(qiáng)免疫時(shí)則含有如實(shí)施例6所述的含MDP的不完全弗氏佐劑(SigmaNo.F5506，St.Louis，MO)。
采用表3所述的方案，給約10-12周齡的5只隨機(jī)配種狗注射上述ZPC疫苗制備物。
表3ZPC(mg)首次免疫0時(shí)0.167增強(qiáng)免疫第3周0.167增強(qiáng)免疫第6周0.167增強(qiáng)免疫第28周0.167利用Dunbar所述的方法(TwoDimensionalGelElectrophoresisandImmunologicalTechniques，1987)，用ELISA法監(jiān)測每只動物的抗自身透明帶蛋白(例如抗狗透明帶蛋白)抗體效價(jià)。用HSDZ的抗原涂布緩沖液(0.1M碳酸鈉，pH9.6)中的溶液涂有ELISA微量滴定板。用生物素化的兔抗狗IgG作為第二抗體。用ABC試劑(抗生物素蛋白-生物素化過氧化物酶復(fù)合物)和鄰苯二胺二鹽酸鹽及過氧化物底物進(jìn)行目測觀察。只有2只動物產(chǎn)生抗自身抗體，并在第4周時(shí)達(dá)到16K的自身抗體效價(jià)峰值。另3只動物未產(chǎn)生自身抗體效價(jià)，但抗豬透明帶蛋白抗體效價(jià)達(dá)到4K的峰值。在第20周到第36周期間，觀察到所有的狗都表現(xiàn)出動情行為。將動物用可靠的雄性動物反復(fù)配種。只有具有抗自身透明帶蛋白抗體效價(jià)的2只動物保持不育。該實(shí)驗(yàn)中的所有其他動物都受孕。
動情和配種兩周后，將顯示自身抗體效價(jià)的2只不育狗切除單側(cè)卵巢，摘除的卵巢切片后用高碘酸希夫氏染色法染色以進(jìn)行組織學(xué)觀察。組織學(xué)觀察顯示不育狗的卵巢形態(tài)有異常。沒有觀察到有正在進(jìn)行卵泡發(fā)生過程的跡象，而且卵巢喪失了含卵母細(xì)胞的卵泡。此外，沒有觀察到原卵母細(xì)胞。
實(shí)施例8由接種動物產(chǎn)生的抗血清的Western分析為了進(jìn)一步了解實(shí)施例6和7所述的兩項(xiàng)研究中所達(dá)到的免疫反應(yīng)和不同生理效果，用各種抗原以Western分析法分析每個(gè)試驗(yàn)組中產(chǎn)生的抗血清。這些抗原包括天然豬ZPC、熱溶解狗透明帶(HSDZ)、重組狗ZPA和ZPB、重組豬ZPC。用由實(shí)施例6的受試動物(例如用經(jīng)過等電聚焦分離的熱溶解豬透明帶免疫過的動物)得到的抗血清，以及由實(shí)施例7的2只受試動物得到的含有抗自身透明帶蛋白抗體的抗血清，探測Western印跡。
所得數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過食用不含可用PAGE分析檢測到的ZPC的熱溶解豬透明帶免疫的不育但有生理周期的狗所產(chǎn)生的抗血清，不識別重組豬或狗ZPC，但識別天然ZPC、HSDZ和重組狗ZPA。相反，由卵巢中已喪失卵母細(xì)胞的不育狗得到的抗血清則識別重組ZPC蛋白，即多肽骨架。
抗體對抗原的識別作用的一個(gè)關(guān)鍵性差異是，似乎只有從卵巢中已喪失卵母細(xì)胞的狗中得到的抗血清才識別重組狗ZPC抗原。而抗血清強(qiáng)烈識別天然ZPC、HSDZ和重組狗ZPA的不育狗則不識別重組狗ZPC。
假定自身免疫對避孕效果來說是必需的，那么上述數(shù)據(jù)表明，借助抗狗ZPA抗原的自身免疫反應(yīng)，可以在狗體內(nèi)達(dá)到不育而不出現(xiàn)在組織學(xué)上明顯可見的卵巢機(jī)能障礙。相反，得到組織學(xué)驗(yàn)證的將會導(dǎo)致永久性不育的卵巢機(jī)能障礙，即卵母細(xì)胞的喪失，則需要產(chǎn)生特異識別同源泉物種ZPC蛋白的抗體。
實(shí)施例9重組ZP蛋白的表達(dá)Ⅰ.表達(dá)載體的構(gòu)建由質(zhì)粒pUC9(Vierra和Messing，Gene19∶259-268，1982)和pβgal2(Queen，J.Mol.App.Gen.2∶1-10，1983)的片段構(gòu)建圖1所示的質(zhì)粒載體pZ90。利用購自NewEnglandBiolabs的SalⅠ多接頭適配物，將存在于pβgal2中的單個(gè)PvuⅡ限制位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為SalⅠ位點(diǎn)。通過用SalⅠ消化，切下新的SalⅠ位點(diǎn)與已有的SalⅠ位點(diǎn)之間的DNA順序，重新連接后篩選縮小的質(zhì)粒。
將經(jīng)過修飾的pβgal2質(zhì)粒中攜有λ CI阻遏基因、λpR啟動子和lacZ基因(β-半乳糖苷酶)的CalⅠ-NdeI片段，插入pUC9的AccⅠ和NdeⅠ限制位點(diǎn)之間。pUC9質(zhì)粒攜有將質(zhì)粒保持在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)所需的氨芐青霉素抗性(AmpR)基因和col EⅠ復(fù)制起點(diǎn)(ori)。對該組合質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步修飾，將ATG起始密碼子3′端的BamHⅠ位點(diǎn)(ATG GAT CCN)轉(zhuǎn)化為ATG起始密碼子5′端的BglⅡ位點(diǎn)(AGATCTATG)。這是通過用RsaⅠ部分消化質(zhì)粒而實(shí)現(xiàn)的。在若干消化點(diǎn)中有一個(gè)位于BamHⅠ限制位點(diǎn)5′約20bp處。當(dāng)用BamHⅠ消化這個(gè)已經(jīng)過部分消化的質(zhì)粒時(shí)，所產(chǎn)生的某些質(zhì)粒幾乎是全長的。制備一個(gè)合成寡聚體(GTACTAAGGAAGATCTATGGATCC)(29號順序)用于替換已除去的順序(GTACTAAGGAGG-TTGTATGGATCC)(30號順序)。這一替換的凈效果是置換了3bp，從而產(chǎn)生了BglⅡ限制位點(diǎn)。然后通過用BglⅠ和BanⅡ限制消化，切下含約3000堿基對lacZ基因的DNA片段，然后插入含有BamHⅠ位點(diǎn)的合成寡聚體。用BglⅠ和BanⅡ切割該質(zhì)粒，然后用核酸酶S1處理，產(chǎn)生平末端。在經(jīng)過消化的質(zhì)粒的平末端處插入一個(gè)BamHI接頭(NewEnglandBiolabs)。接著，利用合成接頭將λCI阻遏基因和ori順序之間的PvuⅡ限制位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為HindⅢ位點(diǎn)。用PvuⅡ切割PvuⅡ限制位點(diǎn)，并使一個(gè)HindⅢ接頭(NewEnglandBibolabs)與平末端連接。由于剩下的lacZ順序缺少天然順序的并沒有8個(gè)密碼子，所以合成一個(gè)由BglⅡ位點(diǎn)起始并編碼lacZ野生型基因產(chǎn)物(βgal)N末端順序的合成寡聚體，用以替代上述8個(gè)密碼子。
該合成寡聚合體的制備方法是合成4個(gè)分別具有下列順序的寡聚體31號順序(寡聚體1)、32號順序(寡聚體2)、33號順序(寡聚體3)、34號順序(寡聚體4)。寡聚體2和3通過用激酶和ATP處理而在5′端加上磷酸，從而達(dá)到磷酸化。然后使寡聚體1和2分別與寡聚體3和4雜交，雜交方法是在100℃保溫后在200μMNaCl中緩慢冷卻。所得寡聚體的順序列在35號順序中。列在35號順序中的合成寡聚體具有BglⅡ-PvuⅡ末端。對質(zhì)粒進(jìn)行限制消化，并使其與該寡聚體連接，從而使該合成寡聚體轉(zhuǎn)換質(zhì)粒的BglⅡ-PvuⅡ順序。
所得的質(zhì)粒命名為pZ90，并示于圖1。質(zhì)粒pZ90可用于利用熱不穩(wěn)定性λCI阻道基因以熱誘導(dǎo)法表達(dá)重組蛋白。接著，用可化學(xué)誘導(dǎo)的啟動子ptac(Amann等，Gene25∶167-178,1983)替換pZ90的可熱誘導(dǎo)阻基因和啟動子。ptac啟動子受lac阻遏物的控制，后者是lacⅠ基因的產(chǎn)物(Farabaugh，Nature279∶765-769，1978)。利用Innis和Gelfand所述的PCR法(PCRProtocols∶AGuidetoMethodsandApplications，Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J.和White.T.J.編，第1-12頁，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA)，由pMC9(Miller等，TheEMBOJournal33117-3121，1984)得到lacⅠ基因。所用的引物一端與lacⅠ啟動子互補(bǔ)，另一端與lacⅠ基因終止密碼子互補(bǔ)。N末端引端攜有一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)。C末端引物攜有一個(gè)tac啟動子順序，其后是一個(gè)BglⅡ位點(diǎn)。N末端引物具有列在36號順序中的順序。C末端引物具有如37號順序中所列的順序，包括順序?yàn)?′-CACAATGTG-3′的Dra位點(diǎn)。然后，用所得的在兩末端分別具有HindⅢ和BglⅡ限制位點(diǎn)的lacⅠ-ptacDNA片段，替換pZ90的攜有λCI阻遏基因和λpR啟動子的HindⅢ-BglⅡ片段。這一替換產(chǎn)生圖2所示的質(zhì)粒pZ98。
Ⅱ.重組ZPDNA的插入用上述PCR法(Innis和Gelfand)，由實(shí)施例1中制備的質(zhì)粒pZ57制備編碼ZPC的DNA順序。質(zhì)粒pZ57含有由實(shí)施例1所述的λgtll克隆5-1得到的全長豬ZPC順序。在PCR操作過程中，用不含前導(dǎo)順序和疏水性尾部的引物修飾豬ZPC基因。所用的N末端引物具有列在38號順序中的順序。包括順序?yàn)?′-GGATCC-3′的內(nèi)部BamHI限制位點(diǎn)。所用的C末端相物具有如39號順序中所列的順序，包括順序?yàn)?′-GGATCC-3′的SalⅠ限制位點(diǎn)和順序?yàn)?′-CTCGAG-3′的內(nèi)部XhoⅠ限制位點(diǎn)。經(jīng)修飾的ZPC基因含有編碼ZPC氨基酸1-350的第105-1154堿基對。
在經(jīng)修飾的豬ZPC基因的5′端加上一個(gè)BamHI限制位點(diǎn)，在3′端加上一個(gè)XhoⅠ位點(diǎn)、一個(gè)六CAT密碼子順序(CAT)6、一個(gè)終止密碼子、以及一個(gè)SalⅠ限制位點(diǎn)。把這個(gè)經(jīng)修飾的豬的ZPC基因插入到pZ98的BamHI-SalⅠ限制位點(diǎn)中，得到豬ZPC表達(dá)載體，即圖3所示的質(zhì)粒pZ156。(CAT)6順序在重組融合蛋白中產(chǎn)生一個(gè)C末端六組氨酸(His6)氨基酸順序，因此便于用親和色譜法用固定化的金屬來純化融合蛋白。
以如上所述的類似方式，質(zhì)粒pZ156在用BamHI和XhoI消化后可用于接受任何其他重組ZP基因或基因片段，從而表達(dá)出可用金屬離子親和色譜法純化的βgal融合蛋白。
Ⅲ.豬ZPC融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)用Chung等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86∶2172-2175，1989)把表達(dá)載體pZ156(圖3)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10F′株(Invitrogen，SanDiego，CA)中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞系稱為ZI156株。用該細(xì)胞系來表達(dá)重組豬ZPC-βgal融合蛋白。
在含有100μg/ml氨芐青霉素的Luria液體培養(yǎng)基(LB)中，于30℃下培養(yǎng)ZI156的細(xì)菌培養(yǎng)物，直到細(xì)胞密度達(dá)到OD600約為1.5。加入異丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)(每升培養(yǎng)基3ml100mM溶液)，以誘導(dǎo)由tac啟動子的表達(dá)，并將細(xì)胞于30℃下再培養(yǎng)2-3小時(shí)。用離心法收集細(xì)胞，所得細(xì)胞沉淀于-70℃下冷凍。
將冷凍細(xì)胞沉淀懸浮于10mMEDTA中(1g/2-2.5ml)，并在50%功率下超聲處理兩次，每次3分鐘，每次超聲處理之間在冰浴中冷卻。然后將細(xì)胞溶解液于3300×g下離心1小時(shí)，并保留硬沉淀。用硬沉淀重復(fù)該溶解步驟。
為除去殘留的EDTA，通過短暫超聲處理將最終的硬細(xì)胞沉淀分散在少量水中，將該懸浮液離心并棄去上清液。沉淀經(jīng)洗滌后充分再懸浮于緩沖液A中(6M鹽酸胍(GuHCl)、100mM NaH2PO4、10mM TRIS pH8，每克原始細(xì)胞沉淀約0.5ml)。將該懸浮液于10，000×g離心45秒，保留上清液，棄去沉淀。
將保留的上清液加到Ni柱上(在緩沖液A中)，用10倍柱體積的緩沖液A洗柱。接著分別用5倍體積的緩沖液B-D洗柱，緩沖液B-D各自含有8M脲、100mM NaH2PO4和10mM TRIS，但其pH值依次下降，分別為8、6.3、5.9。用兔抗HSDZ和抗HSPZ作探針，用Western印跡分析法進(jìn)行篩選，證明重組pZPC-βgal融合蛋白被pH4.5的緩沖液E洗脫出?？梢杂镁彌_液F(pH2.5)(8MGuHCl、200mM乙酸)進(jìn)行進(jìn)一步的洗脫。
在8M脲中將用上述程序得到的融合蛋白的最終體積調(diào)至0.5ml，并如上所述將其加到0.5ml佐劑中，從而制成給宿主動物注射的最終劑量。每個(gè)劑量給一個(gè)受試動物皮下注射。
實(shí)施例10用重組ZPC-βgal融合蛋白給狗接種從已在約2月齡時(shí)預(yù)先處理過的受試動物中隨機(jī)選擇11只約5-6月齡的混合配種狗。預(yù)先處理時(shí)使用了熱溶解豬透明帶或色譜純化的豬ZP3β與各種作為佐劑的生物聚合物和藥物釋放載體混合。首次注射6周后，即三個(gè)半月齡時(shí)，用ELISA法測得所有受試動物的抗HSPZ抗體效價(jià)都達(dá)到2-16K范圍。但所有受試動物都沒有出現(xiàn)抗自身抗原(如HSDZ)的抗體效價(jià)。
在5-6月齡時(shí)，給5只受試動物注射負(fù)荷劑量的如實(shí)施例9所制備的豬ZPC-βgal融合蛋白。將實(shí)施例9中制得的重組ZPC-βgal融合蛋白在終體積為0.5ml的8M脲中調(diào)至所需的劑量，并與0.5ml佐劑混合。將250μg佐劑N-乙酰-D-葡糖氨基-β(1，4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(GMDP)分散于0.42ml礦物油、0.157mlL-121嵌段聚合物和0.02ml和吐溫80中。每個(gè)劑量給5只受試動物皮下注射。其余的6只動物留作對照。
以2-3周的間隔總共注射4次后，在所有受試動物中都達(dá)到抗自身抗原(如HSDZ)的抗體效價(jià)，用ELISA法測得其峰值在2-8K范圍內(nèi)。
有些對照動物在約9月齡時(shí)開始出現(xiàn)生理周期，到11月齡時(shí)，6只對照動物中有4只已經(jīng)過了第一個(gè)動情期。相反，已接受重組ZPC-βgal融合蛋白的5只受試動物在同一時(shí)間內(nèi)都沒有出現(xiàn)重量周期。但是，雖然這些受試動物的第一個(gè)動情期推遲了幾個(gè)月，但最終還是開始有生理周期。在5只經(jīng)過接種的狗中，有兩只在免疫后的第二個(gè)動情期期間受孕，而第三只狗在免疫后的第三個(gè)動情期期間受孕。然而，其余的兩只受試動物在接種后的三個(gè)動情周期和幾乎兩年內(nèi)都保持不育。
實(shí)施例11編碼人透明帶蛋白ZPA和ZPB的人DNA順序的分離利用購自Stratagene(目錄號946203)的人基因組DNA文庫分離編碼人ZP蛋白的DNA順序。該文庫由克隆到Lambda FixTMⅡ載體(Stratagene)中的人DNA(來自男性白種人的胎盤組織)的9-23kb插入片段。如Stratagene的說明書所述，但用MgCl2代替MgSO4，將約40，000噬斑形成單位鋪在大腸桿菌LE392株(Stratagene，目錄號200266)上。培養(yǎng)過夜后，如實(shí)施例2所述制備噬斑的尼龍膜留下印跡，并用32P標(biāo)記的豬ZPA cDNA(1號順序)和32P標(biāo)記的豬ZPB cDNA(3號順序)進(jìn)行篩選。
證明三個(gè)克隆1-1、2-2和4-9與豬ZPBcDNA(3號順序)雜交?？寺?-1和4-9于1993年1月27日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland)，ATCC保藏號分別為75406和75405。從這些克隆中分離人DNA插入片段，并通過用EcoRI進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶消化和如實(shí)施例1所述的Southern印跡分析法進(jìn)行分析。表4給出了這些克隆的EcoRI消化結(jié)果。
表4人基因組ZPBEcoRI插入片段
Southern印跡分析檢測出4個(gè)EcoRI片段。根據(jù)這些片段與豬ZPBcDNA(3號順序)的雜交來判斷，這些片段攜有ZPB編碼順序。克隆1-1DNA含有發(fā)生這種雜交的2.2kb、2.0kb和1.5kbEcoRI片段。克隆2-2DNA含有2.8kbEcoRI雜交片段?？寺?-9DNA含有與豬ZPBcDNA探針雜交的2.8kb和1.5kbEcoRI片段。所有插入片段都還含有3.2kb非雜交EcoRI片段?？寺?-1和4-9的插入片段都提供0.2kb非雜交片段；克隆1-1還提供0.7kb非雜交片段。
進(jìn)一步的限制分析揭示出圖4所示的片段排列。如實(shí)施例1所述將6個(gè)片段(A-F)亞克隆到pBSKS中以進(jìn)行順序分析。初步的順序分析證實(shí)了圖4所示的片段排列，并表明人ZPB基因的完整編碼順序可能來自克隆1-1和4-9。這一點(diǎn)由這些插入片段的核苷酸順序分析及這些順序與貓ZPB順序(15號順序)和豬ZPB順序(3號順序)的比較得到了證實(shí)。人ZPB的DNA順序和推測氨基酸順序分別列在40號和41號順序中。
還分離出了在實(shí)施例1所述的條件下與豬ZPAcDNA(1號順序)雜交的克隆。鑒定出兩個(gè)陽性克隆A1和A4。這兩個(gè)克隆于1993年1月27日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC保藏號分別為75404和75403。Southern印跡分析表明，這些克隆含有全部或部分人ZPA基因。從這些克隆中分離DNA，并通過BglⅡ、HindⅢ和NotⅠ限制性核酸內(nèi)切酶消化及實(shí)施例1所述的Southern印跡分析法進(jìn)行分析。A1克隆DNA插入片段的大小約為11.6kb，A4克隆DNA插入片段的大小約為13.2kb。如實(shí)施例1所述，將與豬ZPAcDNA(1號順序)雜交的兩個(gè)BglⅡ片段亞克隆到pBSKS中，以進(jìn)行順序分析。順序分析結(jié)果表明，A1和A4共同含有人ZPA基因。與豬ZPAcDNA順序(1號順序)和狗ZPAcDNA(11號順序)所作的比較支持這一結(jié)論。完整DNA順序和推測氨基酸順序分別列在42號和43號順序中。
實(shí)施例12編碼獼猴ZPA、ZPB和ZPC的DNA的分離和順序測定如下所述在λgt10中構(gòu)建獼猴cDNA文庫。簡單地說，從兩只年齡分別為1.5歲和2歲的雌性獼猴體內(nèi)摘取一組卵巢，從三只年齡分別為3歲、4歲和14歲的雌性獼猴體內(nèi)摘取第二組卵巢。利用Fast TrackTMmRNA分離試劑盒，按制造商的說明分離信使RNA。利用Lambda LibrarianTM(Invitrogen，如實(shí)施例2所述)試劑盒，按該試劑盒提供的程序制備cDNA。使用Protoclone (Promega，Madison，WI)λgt10 EcoRI臂及Packagene (Promega)λDNA包裝體系，按制造商的說明將cDNA包裝到λ噬菌體頭部中。這個(gè)步驟一般得到效價(jià)高于1×106噬斑形成單位/ml的文庫。然后如實(shí)施例1所述，用從豬cDNA中分離出的豬ZPA、ZPB和ZPC探針篩選猴cDNA文庫。篩選方法是用Nytran 尼龍濾膜(孔徑為0.2μM)制備兩個(gè)平行的噬斑印跡。使濾膜于42℃下在溶液中預(yù)雜交3小時(shí)，該溶液含有5×SSPE(43.83g/1 NaCl、6.9g/1 NaH2PO4、H2O、1.85g/l EDTA，pH7.4)、5×Denhardt氏試劑(1g/1聚蔗糖[400型]、1g/1聚乙烯吡咯烷酮和1g/1牛血清清蛋白)、100μg/ml經(jīng)過超聲處理的變性硅精巢DNA、30%甲酰胺、0.5%SDS。用[α-32P]-d ATP和Prime-a-Gene (Promega)標(biāo)記體系制備放射標(biāo)記的DNA。預(yù)雜交后，使10ng新放射標(biāo)記的探針在50%甲酰胺和10μg/ml經(jīng)過超聲處理的變性鮭精巢DNA中于95℃下熱變性5分鐘，再加到濾膜上。雜交于42℃下進(jìn)行15-24小時(shí)。然后在55℃下把雜交后的濾膜用100ml 5×SSPE洗滌二次，每次洗滌約1小時(shí)。然后在55℃下將濾膜置于250ml 5×SSPE中漂洗，并令其空氣干燥。干燥后的濾膜用兩塊增感屏(Kodak X-OMATICTM)于70℃下對X光膠片(Kodak XAR5，Eastman Kodak，Rochester NY)曝光至少8小時(shí)。然后沖洗膠片以進(jìn)行目測分析。
用所有的豬探針對兩個(gè)獼猴卵巢cDNA文庫進(jìn)行徹底篩選，共得到12個(gè)候選克隆。Southern雜交表明，這些克隆中只有一個(gè)(λCM4-2)與豬ZPA探針雜交。該克隆含有560bp的插入片段。利用Sequenase Version2試劑盒(U.S.Biochemicals，Cleveland，Ohio)，按制造商的說明進(jìn)行該插入片段的順序測定。順序測定結(jié)果表明，該560bp插入片段與其他哺乳動物ZPA基團(tuán)的3′端同源。順序測定結(jié)果表明，該560bp片段剛好代表全長順序的不足25%bp，并含有492bp的開放讀碼，應(yīng)編碼164個(gè)氨基酸的蛋白。獼猴ZPA cDNA的DNA順序和推測氨基酸順序分別列在44號和45號順序中。
用豬ZPB探針對獼猴卵巢cDNA文庫進(jìn)行徹底篩選，得到含有866bp插入片段的單個(gè)ZPB候選克隆。順序分析結(jié)果表明，該插入片段含有預(yù)期全長順序的C末端50%。猴ZPB插入片段的DNA順序和推測氨基酸順序分別列在46號和47號順序中。用豬ZPCDNA探針篩選猴卵巢cDNA文庫，只得到一些部分ZPC克隆。其中最大的一個(gè)克隆(λCM1-1)含有約1300bp的插入片段，根據(jù)與已知ZPC克隆(特別是人ZPC克隆)所作的比較，該插入片段剛好含有全長順序C末端部分的50%多。該克隆含有672bp的并放讀碼，應(yīng)編碼224個(gè)氨基酸的蛋白。該克隆還在所有三個(gè)讀碼中含有緊靠編碼順序5′端的終止密碼子。獼猴ZPC克隆的DNA順序和推測氨基酸順序分別列在48號和49號順序中。
實(shí)施例13ZPADNA和推測氨基酸順序的比較表5顯示了哺乳動物ZPA的DNA順序和推測氨基酸順序的比較。

數(shù)據(jù)以ZPA蛋白和DNA順序的交叉比較來表示。蛋白順序的比較示于該表的右上方，即對角方向的虛線之上。DNA順序的比較示于該表的左下方，即對角方向的虛線之下。ZPADNA順序和推測氨基酸順序在各物種之間高度同源。在哺乳動物綱內(nèi)同一目的各成員間同源性最高。例如，人和獼猴(靈長目)、豬和牛(有蹄目)、貓和狗(食肉目)的順序最為相似。各種哺乳動物物種的ZPA基因之間，以及ZPB(見實(shí)施例14)和ZPC(實(shí)施例15)基因之間的高度同源性，意味著這些物種的ZP層中有高度的結(jié)構(gòu)相似性。但是，翻譯后修飾作用的差異，例如糖基化及其他作用，可能是變異的潛在原因。
所有這些ZPA蛋白所共同具有的一個(gè)蛋白加工位點(diǎn)是靠近蛋白C末端的一個(gè)福林(furin)切割位點(diǎn)(R-X-R/K-R，Hosaka等，J.Biol.Chem.，266∶12127，1991)。事實(shí)上，除少數(shù)幾個(gè)例外，所有ZP蛋白都含有靠近C末端的福林加工位點(diǎn)。這個(gè)福林位點(diǎn)的作用可能是將推定的膜附著順序切下，而這將使加工后的蛋白朝生長著的ZP層的外緣移動。人ZPA基因含有一個(gè)靠近3′端的外顯子，該外顯子存在于獼猴ZPA順序中，但不存在于其他物種的ZPA基因中。這個(gè)額外的外顯子編碼存在于福林加工位點(diǎn)之后的氨基酸順序，這表明，由福林切割產(chǎn)生的C末端片段，對ZP層的功能或卵母細(xì)胞來說可能在某種意義上仍是重要的。
在每個(gè)全長ZPA順序中有20個(gè)保守半胱氨酸殘基和1個(gè)或2個(gè)非保守半胱氨酸殘基。非保守半胱氨酸殘基或者存在于N末端前導(dǎo)順序區(qū)，或者存在于該順序的端部C末端區(qū)，后一區(qū)域中不同的ZPA順序之間有大量的變異。高度的同源性和大量的保守半胱氨酸殘基表明不同ZPA蛋白的三級結(jié)構(gòu)是相似的。
以前曾注意到，ZPA類和ZPB類蛋白之間有一些同源區(qū)(Schwoebel等，J.Biol.Chem.，266∶7214，1991；Lee等，J.Biol.Chem.，268∶12412，1993；Yurewicz等，Biochem.Biophys.Acta1174∶211，1993)。人ZPA基因組結(jié)構(gòu)與人ZPB基因組結(jié)構(gòu)的比較表明，這些同源區(qū)局限于人ZPA基因的外顯子12、13和14及人ZPB基因的外顯子5、6和7。這表明，這種同源性可能是由于祖先基因的部分復(fù)制造成的。ZPB蛋白含有21個(gè)保守半胱氨酸殘基。其中并沒有11個(gè)不與ZPA蛋白中的保守半胱氨酸殘基相對應(yīng)，但后10個(gè)卻完全對應(yīng)。這使同源性擴(kuò)展到約270個(gè)氨基酸，覆蓋了ZPA基因的外顯子11-16和ZPB基因的外顯子4-9，但擴(kuò)展后區(qū)域的總同源性略低(約為43%)。ZPA和ZPB基因的其余部分彼此之間幾乎沒有什么同源性，ZPC基因與ZPA基因也沒有廣泛的同源性。此外，ZPA基因與Genbank和SwissProt數(shù)據(jù)庫中的非ZP核酸和蛋白順序也沒有廣泛的順序相似性。
實(shí)施例14ZPBDNA順序和推測氨基酸順序的比較表6顯示了6個(gè)已知ZPBDNA和蛋白順序的比較(牛和獼猴cDNA片段只與其他全長ZPB順序的相應(yīng)區(qū)域比較)。

數(shù)據(jù)以ZPB蛋白和DNA順序的交叉比較來表示。蛋白順序的比較示于該表的右上方，即對角方向的虛線之上。DNA順序的比較示于該表的左下方，即對角方向的虛線之下。
這些數(shù)據(jù)表明不同哺乳動物物種的各成員間有顯著的ZPB同源性。如同ZPA的情況，這種同源性在哺乳動物綱內(nèi)同一目的成員中最為顯著。例如，人和獼猴順序(靈長目)及豬和牛順序(有蹄目)彼此間的同源性最高。除少數(shù)幾個(gè)例外(后面將指出)，ZPB順序與Genbank或SwissProt數(shù)據(jù)庫中的其他DNA或蛋白順序沒有任何同源性。雜交實(shí)驗(yàn)表明，ZPB轉(zhuǎn)錄本是卵巢特異性的。
ZPB克隆的推測氨基酸順序的比較表明，這一遺傳群體內(nèi)的差異比ZPA和ZPC群體內(nèi)的差異要大。兔ZPB和豬ZPB的比較表明，除了兔ZPB有一個(gè)額外的上游ATG密碼子從而使兔順序增加6個(gè)密碼子外，這些順序基本上是共線的(74%同源)。
與豬和兔順序比較，貓ZPB順序在基因的頭四分之一中有兩個(gè)額外的氨基酸插入片段，總共38個(gè)額外密碼子。兩個(gè)插入片段都剛好出現(xiàn)在半胱氨酸殘基之后。這表明，如果這些半胱氨酸參與形成二硫橋，則這些區(qū)域可能會形成獨(dú)特的抗原決定基。但是，貓基因仍然與豬基因73%同源，與兔基因70%同源。
人基因有一個(gè)與貓順序中的第一個(gè)插入片段同源但不與第二個(gè)插入片段同源的順序。但是，人順序中有一些與這一額外區(qū)域相鄰的拼接點(diǎn)供體和受體一致順序，這些順序如已用過則留下碼內(nèi)編碼順序。所以，代表外顯子2的順序?qū)嶋H上可能是由一個(gè)小內(nèi)含子(84bp)分隔開的兩個(gè)小外顯子(122和103bp)。這將使該區(qū)域內(nèi)的人順序與豬順序相同。貓順序中的頭一個(gè)額外區(qū)域也側(cè)接碼內(nèi)拼接位點(diǎn)供體和受體信號。如果把這個(gè)額外區(qū)域從貓順序中去除，則貓順序與豬順序只有一個(gè)氨基酸不同。然而，制備貓順序所用的cDNA克隆是由似乎已經(jīng)過充分加工的mRNA制得的。貓順序中的第二個(gè)額外區(qū)域不含碼內(nèi)拼接位點(diǎn)受體或供體信號，所以該額外區(qū)域可能不是由于存在未經(jīng)加工的內(nèi)含子而造成的。
與其他ZPB順序比較，獼猴和人順序在C末端有7個(gè)額外密碼子。在獼猴中，這是由兩個(gè)堿基對的缺失造成的。這一缺失造成移碼突變而使其他物種所用的終止密碼子移至碼外。人順序也含有這一缺失，但除此之外還有一個(gè)堿基變化，從而去掉了這個(gè)終止密碼子。
ZPB蛋白中有21個(gè)保守半胱氨酸殘基，其中后10個(gè)出現(xiàn)在與ZPA蛋白具有同源性的區(qū)域中。以前就注意到這種同源性(Schwoebel等，同上；Lee等，同上，1993；Yurewicz等，同上，1993)，但對人ZPA和ZPB基因的基因組結(jié)構(gòu)所作的考察使這種同源性擴(kuò)展到約270個(gè)氨基酸。這種同源性可能是由于祖先基因的部分復(fù)制造成的。除了保守半胱氨酸殘基外，豬ZPB蛋白還在推定的前導(dǎo)順序中含有一個(gè)額外的半胱氨酸殘基，而人順序含有4個(gè)額外的半胱氨酸殘基，其中第一個(gè)位于推定的先導(dǎo)順序中(在與豬不同的位置上)，第二個(gè)位于含有額外插入片段的區(qū)域中，最后兩個(gè)位于由于終止密碼子突變引起的C末端延伸段中。這后兩個(gè)額外半胱氨酸殘基在獼猴順序中是保守的。
所有ZP蛋白都在靠近C末端處含有推定的跨膜區(qū)。但是，剛好出現(xiàn)在所有ZPA和ZPC蛋白中的跨膜區(qū)之前的典型福林蛋白水解加工信號(R-X-R/K-R，Hosaka等，同上，1991)，在人(S-R-R-R)、獼猴(S-R-R-N)和兔(S-R-R-R)ZPB順序中發(fā)生了改變。這一現(xiàn)象的意義尚不清楚，但這可能表明，這些蛋白是受特異于二堿基或三堿基順序的相關(guān)體系加工的，因?yàn)橥贫缒^(qū)的釋放對ZPB蛋白隨ZP層生長而移動來說應(yīng)是必需的。豬ZPA和ZPB(Yurewicz等，同上)蛋白似乎有大量的蛋白水解加工過程，但沒有有關(guān)貓、牛、獼猴或人ZPB蛋白翻譯后修飾的數(shù)據(jù)。這種加工的生理意義尚不清楚，但加工過程的差異可能是各種高度保守的ZP蛋白內(nèi)發(fā)生變異的途徑。
有一個(gè)人是否確實(shí)轉(zhuǎn)錄ZPB基因的問題。由于回收到的人卵巢mRNA的量太小，沒有足夠的RNA用來構(gòu)建cDNA文庫和進(jìn)行Northern分析。但是，既然獼猴轉(zhuǎn)錄ZPB基因，那么有可能高度同源的人ZPB基因也得到轉(zhuǎn)錄。
狗cDNA文庫中明顯缺乏ZPBcDNA是另一個(gè)難題。除狗之外，所篩選出的所有含有任何透明帶基因的文庫都含有所有三個(gè)基因。但是，由六月齡狗的卵巢中分離出的mRNA(文庫是由四月齡狗的卵巢制備的)，包含一個(gè)在Northern印跡上與豬和獼猴ZPBmRNA共遷移的ZPBmRNA。缺乏狗ZPBcDNA的一種可能的解釋是三個(gè)ZP基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)間是間隔開的，并由于用于制備文庫的卵巢很年輕，所以ZPB基因的轉(zhuǎn)錄晚于ZPA和ZPC基因(Andersen和Simpson，1973)。
實(shí)施例15ZPCDNA和推測氨基酸順序的比較表7顯示了所有ZPCcDNA和基因的DNA和推測氨基酸順序的比較。

數(shù)據(jù)以ZPC蛋白和DNA順序的交叉比較來表示。蛋白順序的比較示于該表的右上方，即對角方向的虛線之上。DNA順序的比較示于該表的左下方，即對角方向的虛線之下。
ZPC蛋白和DNA順序顯示了比ZPA和ZPBDNA和蛋白程度更高的同源性。如同ZPA和ZPB的情況，在哺乳動物綱內(nèi)同一目的各成員中同源性最為顯著，例如人和獼猴順序(靈長目)、貓和狗順序(食肉目)、豬和牛順序(有蹄目)、小鼠和倉鼠順序(嚙齒目)。根據(jù)Northern印跡分析，ZPC轉(zhuǎn)錄本是卵巢特異性的，與GenBank和SwissProt數(shù)據(jù)庫中的順序所作的比較沒有發(fā)現(xiàn)顯著的非ZP同源性。已知ZPC基因的推測氨基酸順序的比較發(fā)現(xiàn)了三個(gè)含有大量非一致順序的區(qū)域。這些區(qū)域是推定的前導(dǎo)順序和成熟蛋白的頭20-25個(gè)氨基酸；含有被鑒定為小鼠精子結(jié)合區(qū)的肽的區(qū)域(Millar等，Science216∶935-938，1989)；可能在福林加工位點(diǎn)從成熟蛋白上除去的蛋白C末端區(qū)(見下文)。
被鑒定為推定的精子結(jié)合位點(diǎn)的抗原決定基(Millar等，同上，1989)，恰好出現(xiàn)在福林蛋白水解切割位點(diǎn)之前(Hosaka等，1991)。福林位點(diǎn)在所有ZPC順序中都是高度保守的。但應(yīng)該注意，狗ZPC順序含有第二個(gè)福林位點(diǎn)，位于距頭一個(gè)福林位點(diǎn)上游19個(gè)氨基酸處。還是如同ZPA和ZPB的情況，ZPC蛋白被福林切割將除去推定的膜附著順序(Klein等，1985)，從而使加工后的ZPC蛋白朝正在增大的卵母細(xì)胞的外層移動。所以，這個(gè)精子結(jié)合位點(diǎn)可能代表了成熟蛋白的C末端。然而，在ZPC蛋白相應(yīng)于該抗原決定基的區(qū)域中，卻幾乎沒有什么同源性(甚至在倉鼠和小鼠之間也是如此)。這可能表明該區(qū)域?qū)呀Y(jié)合的種屬特異性有貢獻(xiàn)。
在ZPC蛋白的C末端觀察到的變異出現(xiàn)在推定的跨膜區(qū)。這一變異可能表明，該氨基酸順序不如該區(qū)域內(nèi)氨基酸的總疏水性重要，類似于在前導(dǎo)順序中觀察到的缺乏同源性。但是，也可能這種變異表明該區(qū)域的某種種屬特異性功能。
每個(gè)ZPC順序含有14個(gè)保守半胱氨酸殘基，但每個(gè)順序還有只與一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)其他順序共有的一個(gè)或二個(gè)額外半胱氨酸殘基。這些額外半胱氨酸殘基靠近存在最大順序變異的蛋白N末端或C末端。然而，大量的保守半胱氨酸殘基可能表明，所有這些蛋白的中心核的總結(jié)構(gòu)都是非常保守的。
實(shí)施例16用HSPZ免疫獼猴用HSPZ免疫性成熟獼猴，以測試HSPZ誘導(dǎo)不育的能力。如實(shí)施例6所述制備HSPZ。將HSPZ與下列GMDP/油佐劑混合50μgGMDP(N-乙酰-D-葡糖氨基-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-D-異谷氨酰胺)(CC.Biotech，Poway，CA)；42.1ml礦物油、15.8%PluronicVC-121(嵌段聚多元醇，BASF-Wyandotte，Parsippany，NJ)。用配制在GMDP/油佐劑中的HSPZ給動物總共進(jìn)行4次皮下注射，每次注射1mgHSPZ，先以首次劑量開始，4周后給予一個(gè)增強(qiáng)劑量，然后以5周的間隔給予兩個(gè)增強(qiáng)劑量，然后在6周后給予一個(gè)最終劑量。這一劑量方案使獼猴因具有對抗如上所述制備的獼猴熱溶解透明帶的抗體效價(jià)而不排卵。抗獼猴HSPZ抗體效價(jià)峰值為1∶8000-1∶16，000。
如實(shí)施例6所述，用等電聚焦法制備基本為天然豬ZPA和ZPB的HSPZ分組分離制備物，并用該制備物來接種獼猴，接種時(shí)用配制在GMDP/油中的1mg分級分離HSPZ按下列計(jì)劃進(jìn)行皮下注射，給予首次劑量約6周后給予一個(gè)增強(qiáng)劑量，然后在這個(gè)增強(qiáng)劑量11周后給予一個(gè)最終增強(qiáng)劑量。經(jīng)過免疫的猴達(dá)到1∶4，000-1∶8，000的抗猴熱溶解透明帶抗體效價(jià)峰值，同時(shí)保持正常的排卵周期。但盡管保持正常的排卵周期，這些猴仍然不育，直到其抗猴熱溶解透明帶抗體效價(jià)下降到1∶500以下之后，動物才在配種后受孕。
用重組桿狀病毒產(chǎn)生的狗ZPC和豬ZPC(如實(shí)施例18所述制備)免疫獼猴，盡管誘導(dǎo)出抗猴熱溶解透明帶抗體的產(chǎn)生，但并沒有誘導(dǎo)出不育。對此一種可能的解釋是在桿狀病毒體系中產(chǎn)生的ZP蛋白的糖基化方式可能妨礙了對負(fù)責(zé)誘導(dǎo)不育的抗原決定基的識別。
上述由細(xì)菌產(chǎn)生的豬ZPA、ZPB和ZPC在給予獼猴后，盡管產(chǎn)生了針對所呈遞抗原的抗體效價(jià)，但沒有誘導(dǎo)出可檢測的抗獼猴熱溶解透明帶抗體效價(jià)。
實(shí)施例17哺乳動物透明帶蛋白抗原決定基的圖譜測定利用購自Chiron Mimotopes U.S.公司(Emeryville，CA)目錄號PT-02-20000A)的Pin TechnologyTM抗原決定基掃描試劑盒，進(jìn)行透明帶蛋白抗原決定基的圖譜測定。采用試劑盒手冊中所述的步驟，但在ELISA檢測步驟中有些修改(見下述)。
簡單地說，按制造商的說明將PinTechnology軟件安裝在聯(lián)合商用機(jī)器486/33型計(jì)算機(jī)中。將蛋白順序輸入計(jì)算機(jī)程序，選擇所需的肽長度和肽間重疊程序，打印出一份規(guī)程，該規(guī)程包括每日需要的活化的受護(hù)氨基酸衍生物及它們在偶聯(lián)盤的各孔中的位置。使用前，先把針(pins)用二甲基甲酰胺(DMF)洗一次，再用甲醇洗三次，每次洗滌持續(xù)二分鐘。將針封(pinblock)空氣干燥，將針置于20%哌啶在DMF中的混合物中于室溫下攪拌30分鐘使其脫保持。將針再如上所述進(jìn)行洗滌，所不同的是每次洗5分鐘，然后使針封空氣干燥。制備所需的氨基酸衍生物溶液，并按本次循環(huán)的程序?qū)⑷芤悍盅b到合成盤的各孔中。將干燥的模擬型針再在DMF浴中進(jìn)行一次5分鐘的洗滌，然后放在合成盤中的適當(dāng)孔中。然后把該組件密封在塑料袋內(nèi)，于30℃下保溫約22小時(shí)。第二天，從偶聯(lián)盤上取下針封進(jìn)行與上述相同的洗滌、脫保護(hù)和偶聯(lián)步驟循環(huán)，但使用適于下一次循環(huán)的氨基酸衍生物及其在盤中的位置。重復(fù)上述的洗滌、脫保護(hù)和偶聯(lián)循環(huán)，直到完成各肽順序。
各肽的末端氨基酸偶聯(lián)后，如上所述將針封洗滌、空氣干燥、脫保護(hù)、洗滌和空氣干燥。然后把針浸入分裝在聚丙烯偶聯(lián)盤的各小孔中的，含有5份DMF、2份乙酸酐和1份三乙胺(按體積計(jì))的混合物中，并在30℃下保溫90分鐘，使肽的末端氨基乙?；?。取下針封，如上所述進(jìn)行另一個(gè)洗滌順序，并空氣干燥。
將針封置于含95份三氟乙酸、2.5份茴香醚和2.5份乙二硫醇(體積)的混合物中，于室溫下攪拌4小時(shí)，進(jìn)行肽的側(cè)鏈脫保護(hù)反應(yīng)。然后把針封空氣干燥約10分鐘，在含有等份甲醇和去離子水(體積)和0.1%鹽酸的水浴中超聲處理15分鐘，最后空氣干燥。
在進(jìn)行ELISA檢測前，對針進(jìn)行一個(gè)破碎步驟。該步驟包括在由一種混合物組成的水浴中進(jìn)行超聲處理。該混合物含有39份磷酸二氫鈉、25份十二烷基硫酸鈉、0.1份2-巰基乙醇、2500份去離子水，并用50%氫氧化鈉溶液調(diào)至PH7.2。超聲處理在55-60℃下進(jìn)行約45分鐘。然后把針封依次浸入三個(gè)60℃去離子水浴中，并小心攪拌進(jìn)行洗滌，每個(gè)水浴中洗滌3分鐘。最后，把針封浸入輕度沸騰的甲醇中約4分鐘，然后空氣干燥。
抗血清的制備用本領(lǐng)域公知并由E.Harlow和D.Lane(Antibodies，ALaboratoryManual，第5章，ColdSpringHarborLaboratory，1988該文獻(xiàn)并入本文作參考)描述的方法，用適當(dāng)?shù)耐该鲙У鞍酌庖哌m當(dāng)?shù)膭游?，從而制得針對透明帶蛋白的抗血清。用?jīng)過修改的Harlow(同上，第314頁)所述的方法制備生物素化的抗血清。簡單地說，在含有1-3mg/ml選定抗體IgG部分的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH7.2)中，以10mg/ml的濃度加入含25-250μg生物素酰氨基已酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma，目錄號B2643)的二甲亞砜溶液。將該混合物充分混合，然后在室溫下保溫4小時(shí)。以相當(dāng)于每250微克生物素酯20微升的量加入1M氯化銨溶液，所得混合物在室溫下保溫10分鐘。然后用Centricon-30(TM)微量濃縮器(AmiconDivision，W.R.Grace&Co.，Inc.，BeverlyMA)對PBS充分透濾，除去未反應(yīng)的生物素酯。對適當(dāng)?shù)奶烊坏鞍走M(jìn)行ELISA滴定，測定所得結(jié)合物的稀釋倍數(shù)。
ELISA檢測采用經(jīng)過修改的抗原決定基掃描試劑盒手冊中所述的方法。破碎后，將模擬針(mimotopepins)與“超級混合液”(每升PBS10g卵清蛋白、10g牛血清清蛋白、1ml吐溫20去污劑)一起在室溫下保溫1小時(shí)，使模擬針封閉。然后在室溫下與適當(dāng)稀釋的生物素化抗血清一起保溫2小時(shí)。在室溫下用含0.5%吐溫20(PBST)的PBS將針攪拌洗滌4次，每次10分鐘。
然后使針在室溫下與第二抗體一起保溫1小時(shí)。第二抗體是用PBST以1∶2500稀釋過的辣根過氧化物酶-抗生物素蛋白鏈菌素結(jié)合物(ZymedLaboratories，Inc.，SouthSanFrancisco，CA)。將針再如上所述進(jìn)行洗滌。
如下制備底物緩沖液把200ml1.0M磷酸氫二鈉溶液與160ml1.0M檸檬酸溶液混合，用1640ml去離子水稀釋該混合物，并用檸檬酸或氫氧化鈉溶液調(diào)至如pH4.0。如下制備底物溶液把10mg2，2′-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽溶解于20ml底物緩沖液中，并加入6μl30%過氧化氫。利用微量滴定板使模擬針在室溫下與上述溶液一起保溫。微量滴定板中每孔裝150μl溶液。當(dāng)顯色看來適于用ELISA滴定板測定儀測定時(shí)，除去針封并在450nm波長下測定滴定板。然后用上述步驟破碎針封。
將數(shù)據(jù)輸入Pin TechnologyTM計(jì)算機(jī)程序中，由該程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和評定，并打印出鑒定結(jié)合能力最強(qiáng)的抗原決定基的結(jié)果。簡單地說，假定25%光密度讀數(shù)最低的小孔代表每個(gè)實(shí)驗(yàn)的背景。計(jì)算這些讀數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差?？寡鍖﹄牡娘@著識別歸因于相應(yīng)于這些針?biāo)鶎?yīng)的各小孔的光吸收讀數(shù)高于背景平均值與該平均值的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的總和。
檢查人ZPA抗原決定基與如上所述制備的小鼠抗人ZP抗血清的反應(yīng)性。以43號順序中所示的1號氨基酸開始合成長度為15個(gè)氨基酸的肽。合成一系列接續(xù)的肽，每個(gè)肽有7個(gè)氨基酸與該系列中的前一個(gè)肽重疊。證明下列肽與小鼠抗人ZP抗血清結(jié)合1-15，9-23，25-39，33-47，65-79，81-95，89-103，97-111，105-119，113-127，121-135，129-143，145-159，153-167，161-175，193-207，209-223，217-231，225-239，241-255，249-263，273-287，281-295，289-303，305-319，313-327，321-335，329-343，337-351，345-359，385-399，393-407，401-415，409-423，417-431，425-439，441-455，449-463，457-471，481-495，489-503，497-511，505-519，513-527，521-535，537-551，545-559，561-575，569-583，577-591，585-599，601-615，609-623，617-631，625-639，633-647，641-655，665-679，697-711，705-719，713-727，721-735，729-743.
類似地，用小鼠抗人ZP抗血清進(jìn)行人ZP抗原決定基的圖譜測定。在這些實(shí)驗(yàn)中，以如41號順序中所示的1號氨基酸開始合成一些15個(gè)氨基酸的肽。該實(shí)驗(yàn)中各接續(xù)肽之間的重疊為9個(gè)氨基酸。證明下列肽與小鼠抗人ZP抗血清結(jié)合7-21，25-39，31-45，49-63，67-81，73-87，79-93，91-105，103-117，121-135，193-207，205-219，211-225，217-231，223-237，229-243，253-267，259-273，265-279，283-297，289-303，295-309，301-315，307-321，313-327，319-333，343-357，349-363，355-369，367-381，373-387，379-393，385-399，403-417，409-423，415-429，421-435，433-447，439-453，445-459，451-465，481-495，487-501，499-513，505-519，511-525，523-537，529-543，547-561.
用小鼠抗人ZP抗血清進(jìn)行人ZPC抗原決定基的圖譜測定。在這些實(shí)驗(yàn)中，以Chamberlin等人(Proc.Nat′lAcad.Sci.USA87∶6014-6018，1990，該文獻(xiàn)列入本文作參考)所列出的1號的氨基酸開始，合成一些15個(gè)氨基酸的肽。各接續(xù)肽之間的重疊為10個(gè)氨基酸。證明下列肽與小鼠抗人ZP抗血清結(jié)合21-35，51-65，116-130，146-160，151-165，181-195，241-255，251-265，271-285，296-310，321-335，401-415，411-425.
用兔抗狗ZP抗血清進(jìn)行狗ZPC抗原決定基的圖譜測定。在這些實(shí)驗(yàn)中，以10號順序中所示的1號氨基酸開始合成一些15個(gè)氨基酸的肽。接續(xù)肽之間的重疊為5個(gè)氨基酸。證明下列肽與兔抗狗ZP抗血清結(jié)合51-65，61-75，81-95，131-145，181-195，301-315.
用兔抗貓ZP抗血清進(jìn)行貓ZPC抗原決定基的圖譜測定。在這些實(shí)驗(yàn)中，以18號順序中所列的1號氨基酸開始，合成一些15個(gè)氨基酸的肽。各接續(xù)肽之間的重疊為5個(gè)氨基酸。證明下列肽與兔抗貓ZP結(jié)合36-50，46-60，56-70，76-90，96-110，106-120，116-130，126-140，136-150，146-160，156-170，186-200，196-210，246-260，266-280，276-290，286-300，296-310，316-330，326-340，336-350，346-360，376-390，396-410，406-420.
用兔抗牛ZP抗血清進(jìn)行牛ZPC抗原決定基的圖譜測定。在這些實(shí)驗(yàn)中，以24號順序中所列的1號氨基酸開始，合成一些相互重疊的15個(gè)氨基酸的肽。各肽之間的重疊為10個(gè)氨基酸。證明下列肽與兔抗牛ZP抗血清反應(yīng)1-15，31-45，51-65，56-70，61-75，76-90，106-120，111-125，116-130，121-135，131-145，136-150，141-155，146-160，151-165，161-175，181-195，186-200，191-205，196-210，201-215，206-220，216-230，226-240，241-255，246-260，261-275，266-280，271-285，276-290，291-305，296-310，301-315，316-330，321-335，326-340，331-345，336-350，341-355，356-370，361-375，376-390，381-395，386-400，396-410，401-415，406-420.
實(shí)施例18用重組ZPC蛋白免疫狗用各種重組狗ZPC制備物免疫狗。如下構(gòu)建質(zhì)粒pZ169細(xì)菌表達(dá)載體(圖5)。用限制酶PvuI和BamHI消化母體載體pZ98(實(shí)施例9所述)，并凝膠純化大片段。在該載體中連入一個(gè)通過使以下寡核苷酸退火而產(chǎn)生的片段5′CGCCCTTCCCAGCAACTGCACCATCACCACCATGGG3′
(50號順序)；5′GATCCCCATGGTGGTGGTGATGGTGCAGTTGCTGGGAAGGGCGAT3′(51號順序)。
這些寡核苷酸產(chǎn)生一個(gè)帶有PvuI和BamHI末端的片段，并編碼六肽順序His6。用限制酶BamHI和EcoRI消化這個(gè)中間載體，并凝膠純化大片段。在該載體中連入一個(gè)通過使下列寡核苷酸退火而產(chǎn)生的片段5′GATCCCTCGAGCCACCATCACCACCATCATG3′(52號順序)；5′AATTCATGATGGTGGTGATGGTGGCTCGAGG3′(53號順序)。
這些寡核苷酸產(chǎn)生一個(gè)帶有BamHI和EcoRI末端和一個(gè)恰好位于BamHI位點(diǎn)上游的XhoI位點(diǎn)，并編碼六肽順序His6。這個(gè)新載體稱為pZ88，在兩個(gè)His6順序之間含有獨(dú)特的BamHI和XhoI克隆位點(diǎn)。為構(gòu)建pZ169，用限制酶BamHI和XhoI消化pZ88載體，并凝膠純化大片段。在該載體中連入一個(gè)通過用下列寡核苷酸進(jìn)行狗ZPCcDNA的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))而產(chǎn)生的片段5′CCCGGATCCGCAGACCATCTGGCCAACTGAG3′(54號順序)；5′GCGCTCGAGGGCATATGGCTGCCAGTGTG3′(55號順序)。
該P(yáng)CR產(chǎn)生一個(gè)含有狗ZPC順序的23-207位氨基酸的片段，該片段帶有BamHI和XhoI末端。這個(gè)新載體稱為pZ169(圖5)，它所產(chǎn)生的蛋白含有大腸桿菌β-半乳糖苷酶順序的1-56位氨基酸、His6、狗ZPC順序的23-207位氨酸、His6、大腸桿菌β-半乳糖苷酶順序的1006-1023位氨基酸。該蛋白稱為N末端狗ZPC。在圖5中，pTAC指上述tac啟動子；AmpR指氨芐青霉素抗性標(biāo)記，ori是大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)順序，pLacI是驅(qū)動lacI基因表達(dá)的lacI啟動子。
如實(shí)施例9所述制備和純化重組狗ZPC。如下構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體pZ145。用限制酶NheI和BamHI消化母體載體pBlueBac2(購自InvitrogenCorporation，SanDiego，CA)，并凝膠純化大片段。在該載體中連入一個(gè)用下列寡核苷酸進(jìn)行豬ZPCcDNA的PCR而產(chǎn)生的片段5′CGCGCTAGCAGATCTATGGCGCCGAGCTGGAGGTTC3′(56號順序)；5′CGCGGATCCTATTAATGGTGGTGATGGTGGTGACTAGTGGACCCTTCCA3′(57號順序)。
該P(yáng)CR產(chǎn)生一個(gè)帶有NheI和BamHI末端的片段，該片段含有豬ZPC順序的27-350位氨基酸，其后是SpeI位點(diǎn)和六肽His6。這個(gè)新載體稱為pZ147。為構(gòu)建pZ145載體，用NheI和SpeI消化pZ147，并凝膠純化大片段(這除去了豬ZPC順序)。在該載體中連入一個(gè)通過用下列寡核苷酸進(jìn)行狗ZPCcDNA的PCR而產(chǎn)生的片段5′CCCGCTAGCAGATCTATGGGGCTGAGCTATGGAATTTTC3′(58號順序)；5′CGCACTAGTTGACCCCTCTATACCATGATCACTA3′(59號順序)。
該P(yáng)CR產(chǎn)生一個(gè)帶有NheI和SpeI末端的片段，該片段含有狗順序的1-379位氨基酸。篩選由這一連接反應(yīng)得到的含有正確取向的插入NheI/SpeI片段的轉(zhuǎn)化體(因?yàn)镹heI和SpeI粘性末端是相同的)。這個(gè)新載體稱為pZ145(圖6)，它所產(chǎn)生的蛋白Z含有DZPC順序的1-379位氨基酸，其后是His6。該蛋白稱為桿狀病毒-狗ZPC。在圖6中，pP代表?xiàng)U狀病毒多角體素(polyhedrin)啟動子，AmpR代表氨芐青霉素抗性標(biāo)記，lacZ代表β-半乳糖苷酶基因，pE是驅(qū)動lacZ表達(dá)的組成啟動子，ori是大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。
用以下方法制備由重組桿狀病毒衍生的狗ZPC利用購自Invitrogen公司(San Diego，CA)的MAXBACTM試劑盒中所述的本領(lǐng)域公知方法，用pZ145和苜蓿銀紋夜蚊多被膜核型多角體病毒(AcMNPV)共轉(zhuǎn)染昆蟲SF9細(xì)胞。由共轉(zhuǎn)染的SF9細(xì)胞如下制備在SF9細(xì)胞中產(chǎn)生的重組狗ZPC。收集共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并離心沉降，按實(shí)施例9所述的從細(xì)胞沉淀中進(jìn)行純化的方法純化重組狗ZPC。也可從培養(yǎng)基中分離重組狗ZPC，并如實(shí)施例9所述在Ni柱上進(jìn)行純化。
能夠在各種調(diào)控順序的控制下表達(dá)透明帶編碼寡核苷酸順序的其他表達(dá)載體，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并易于用本領(lǐng)域公知的方法來構(gòu)建。
還可以用本領(lǐng)域公知的各種方法對重組透明帶蛋白進(jìn)行修飾，以提高其潛在抗原性。例如，如下制備經(jīng)棕櫚?；揎椀闹亟M狗ZPC。將約1mg如上所述用質(zhì)粒PZ169制備的重組ZPC調(diào)至終濃度為8M脲(總體積為0.2-0.3ml)。然后把棕櫚酸酐加到三乙胺中，使終濃度達(dá)到每ml三乙胺20mg棕櫚酸酐，從而制得棕櫚酰化溶液(Pl2O/TEA)。
將約10μl Pl2O/TEA溶液加到1mg重組狗ZPC在8M脲中的溶液中(如上所述)。將該混合物在室溫下放置至少2小時(shí)，而后該制備物便可與GMDP/油佐劑混合。
脫乙酰殼多糖修飾是另一種適于實(shí)施本發(fā)明的狗ZPC修飾作用。簡單地說，將1.5ml無菌礦物油加到1.5ml如上所述用質(zhì)粒pZ169制備的重組狗ZPC溶液中(共3mgZPC，2mg/ml在8M脲中的溶液)，并與5滴ArlacelA(二縮甘露醇單油酸酯，Sigma，St.Louis，MO)混合。然后加入0.75ml脫乙酰殼多糖(2%w/v在0.5M乙酸鈉pH5.0中的溶液)，并將該混合物超聲處理10-20秒，接著加入0.045ml50%NaOH，并再進(jìn)行一次10-20秒的超聲處理。最后加入10μl10mg/mlGMDP/8M脲。
取3只狗作為一組，用如上所述制備的、通過加入脫乙酰殼多糖修飾的N末端狗ZPC免疫5次，每次皮下注射1mg的劑量，間隔為一個(gè)月。經(jīng)用上述方法測定，經(jīng)免疫的狗產(chǎn)生1∶8000-1∶16000的抗熱溶解狗透明帶抗體效價(jià)(自身效價(jià))。顯示自身效價(jià)的狗在動情周期中不排卵，且動情周期延長(4-6周，而正常狗的動情周期為10-14天)。在這3只經(jīng)免疫的狗中，有兩只已出現(xiàn)第一個(gè)動情周期，其中有1只在首次免疫6個(gè)月后出現(xiàn)動情周期，經(jīng)配種后發(fā)現(xiàn)該狗不育，第2只出現(xiàn)動情周期且在首次免疫9個(gè)月后保持不育。第3只狗則在免疫9個(gè)多月后仍未出現(xiàn)動情周期。
取4只狗作為另一組，以1個(gè)月的間隔免疫3次，每次皮下給予1mg劑量的配制在GMDP/油佐劑中的棕櫚酰化狗ZPC(如上所述制備)。這些動物達(dá)到1∶4000-1∶8000的自身效價(jià)(抗熱溶解狗透明帶)。免疫幾乎7個(gè)月后，4只狗中有兩只出現(xiàn)動情周期但保持不育。其余的兩只狗則尚未出現(xiàn)動情周期。
另一組狗以1個(gè)月的間隔免疫3次，每次皮下注射1mg配制在GMDP/油佐劑中的、用pZ166(一種類似于pZ169但含有編碼狗ZPC蛋白23-379位氨基酸的DNA順序的質(zhì)粒)制備的重組狗ZPC。這些動物沒有產(chǎn)生自身效價(jià)，因而在配種后受孕。用桿狀病毒體系產(chǎn)生的狗ZPC片段免疫的狗沒有誘導(dǎo)出不育。
實(shí)施例19用重組透明帶蛋白給牛和貓接種進(jìn)行初步研究以評定重組透明帶蛋白在牛和貓?bào)w內(nèi)誘導(dǎo)不育的能力。
給牛注射3次或更多次劑量(配制在GMDP(250μg)油佐劑中)的各種用重組方法得到的狗和豬來源的ZPC蛋白，包括用圖5所示的質(zhì)粒pZ169產(chǎn)生的狗ZPC，每次注射1mg蛋白。以未修飾的及棕櫚?；兔撘阴ざ嗵切揎椥问浇o予重組蛋白。這些ZP蛋白制備物在所接種的牛體內(nèi)都沒有誘導(dǎo)出自身效價(jià)或不育。正在用不同的重組透明帶蛋白制備物和不同的劑量方案進(jìn)行進(jìn)一步的研究，試圖在牛體內(nèi)誘導(dǎo)出自身效價(jià)和不育。
類似地，用下列重組透明帶蛋白接種貓重組貓ZPA、ZPB和ZPC的混合物；用如上所述并如圖3所示的pZ156產(chǎn)生的豬ZPC；用上述的圖5所示的質(zhì)粒pZ169產(chǎn)生的狗ZPC。用這些ZP蛋白制備物接種的貓產(chǎn)生抗疫苗蛋白的抗體，但未產(chǎn)生自身效價(jià)，因此是可育的。為了刺激自身效價(jià)的產(chǎn)生并誘導(dǎo)不育，正在進(jìn)行研究以確定對重組透明帶蛋白進(jìn)行修飾的效果。
還正在進(jìn)行研究以選擇其他用重組方法得到的透明帶蛋白片段作為可能的免疫避孕藥進(jìn)行測試。
預(yù)計(jì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會對以上實(shí)施例所說明的各種發(fā)明實(shí)施方式作出很多修改。因此，這些說明性的實(shí)施例并不是要限制所附的權(quán)利要求書中所提出的發(fā)明范圍。
順序表(1)概況(ⅰ)申請人HarrisPh.D.，JeffreyD.
Hsu，KuangT.
Podolski，JosephS.
(ⅱ)發(fā)明名稱用于免疫避孕的材料和方法(ⅲ)順序數(shù)(ⅳ)通信地址(A)收信人Marshall，O'Toole，Gerstein，Murray&Borun(B)街道6300SearsTower，233SouthWackerDrive(C)城市芝加哥(D)州伊利諾斯(E)國家美國(F)郵政編碼60606-6402(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(ⅵ)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)枺?B)申請日(C)分類(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/012，990(B)申請日1993年1月29日
(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?7/1973，341(B)申請日1992年11月9日(ⅶ)代理人資料(A)姓名Clough，DavidW.
(B)登記號36，107(C)案卷號31745(ⅸ)電訊資料(A)電話312/474-6653(B)傳真312/474-0448(C)電傳25-3856(2)1號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度2214堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體豬(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞sig-peptide(B)位置12..119(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置120..2153(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置12..2153(xi)順序描述1號順序


(2)2號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度713個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述2號順序

(2)3號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度1699堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體豬(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞sig-peptide(B)位置38..445
(xi)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置446..1648(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置38..1648(xi)順序描述3號順序

(2)4號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度536個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述4號順序

(2)5號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度1326堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體豬(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Sig-peptide(B)位置25..105(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置106..1290(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置25..1290(xi)順序描述5號順序

(2)6號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度421個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述6號順序

(2)7號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度1338堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體兔(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置17..1261(xi)順序描述7號順序

(2)8號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度415個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述8號順序

(2)9號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度2381個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體家犬(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置206..2353(xi)順序描述9號順序


(2)10號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度715個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)順序描述10號順序

(2)11號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度1325堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體家犬(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置13..1293(xi)順序描述11號順序

(2)12號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度426個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述12號順序

(2)13號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度2236堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體家貓(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置28.2175(xi)順序描述13號順序


(2)14號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度716個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述14號順序

(2)15號順序資料(ⅰ)順序特性
(A)長度1840堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體家貓(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置57..1766(xi)順序描述15號順序

(2)16號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度570個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述16號順序
(2)17號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度1319堿基對
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體家貓(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置26..1297(xi)順序描述17號順序

(2)18號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度424個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述18號順序
(2)19號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度643堿基對
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體牛(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置16..582(xi)順序描述19號順序
(2)20號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度188個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述20號順序
(2)21號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度1029堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體牛(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS
(B)位置2..976(xi)順序描述21號順序

(2)22號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度324個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述22號順序
(2)23號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度1457堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物體牛(D)發(fā)育階段幼年(E)倍型二倍體(F)組織類型卵巢(G)細(xì)胞類型卵母細(xì)胞(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置149..1411(xi)順序描述23號順序

(2)24號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度421個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述24號順序

(2)25號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度125堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述25號順序 (2)26號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度111堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述26號順序 (2)27號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度96堿基對(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述27號順序 (2)28號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述28號順序ATGGARAGRTGYCAMGARG19(2)29號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述29號順序GATCTAAGGAAGATCTATGGATCC24(2)30號順序資料
(ⅰ)順序特性(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述30號順序:
GATCTAAGGAGGTTGTATGGATCC24(2)31號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度55堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述31號順序GATCTATGACCATGATTACGGATTCGCGTAGCCGTCGTCCTGCAGCGTCGCGACT55(2)32號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度57堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述32號順序
(2)33號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度54堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述33號順序 (2)34號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度52堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述34號順序CTGGCCAAAGGGGGATGTGGCTGCTAATCGATTAAGTTGGGTAACGCCCGGG52(2)35號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度120堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述35號順序 (2)36號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ix)順序描述36號順序GCGAAGCTTCCGACACCATCGAACGGCGC29(2)37號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述37號順序GCGCACAATGTGCCTAATGAGTGAGCTAAC30(2)38號順序資料
(ⅰ)順序特性(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述38號順序CGCGGATCCGGACGAAGGCCAGCGCTTG28(2)39號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度58堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)順序描述39號順序 (2)40號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度1701堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..1698(xi)順序描述40號順序

(2)41號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度566個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述41號順序

(2)42號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度2266堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..2235(xi)順序描述42號順序


(2)43號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度745個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述43號順序

(2)44號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度560堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置15..506(xi)順序描述44號順序
(2)45號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度164個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述45號順序
(2)46號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度866堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置12..821(xi)順序描述46號順序

(2)47號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度270個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述47號順序
(2)48號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度722堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置15..683(xi)順序描述48號順序
(2)49號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度223個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述49號順序
(2)50號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述50號順序CGCCCTTCCCAGCAACTGCACCATCACCACCATGGG36(2)51號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度45堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述51號順序GATCCCCATGGTGGTGGTGATGGTGCAGTTGCTGGGAAGGGCGAT45
(2)52號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述52號順序GATCCCTCGAGCCACCATCACCACCATCATG31(2)53號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述53號順序AATTCATGATGGTGGTGATGGTGGCTCGAGG31(2)54號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述54號順序CCCGGATCCGCAGACCATCTGGCCAACTGAG31(2)55號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述55號順序GCGCTCGAGGGCATATGGCTGCCAGTGTG29(2)56號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述56號順序CGCGCTAGCAGATCTATGGCGCCGAGCTGGAGGTTC36(2)57號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度49堿基對(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述57號順序CGCGGATCCTATTAATGGTGGTGATGGTGGTGACTAGTGGACCCTTCCA49(2)58號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度39堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述58號順序CCCGCTAGCAGATCTATGGGGCTGAGCTATGGAATTTTC39(2)59號順序資料(ⅰ)順序特性(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(xi)順序描述59號順序CGCACTAGTTGACCCCTCTATACCATGATCACTA3權(quán)利要求
1.一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)可重復(fù)的暫時(shí)性不育的方法，該方法包括給予主體哺乳動物透明帶蛋白或其片段，所述蛋白選自哺乳動物ZPA、哺乳動物ZPB及其組合，給予的劑量能有效刺激所述哺乳動物產(chǎn)生識別所述哺乳動物的ZPA或ZPB蛋白的抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物ZPA和ZPB得自與主體哺乳動物相同的哺乳動物物種。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物ZPA和ZPB得自與主體哺乳動物不同的哺乳動物物種。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物ZPA或ZPB蛋白選自豬、狗、貓、牛、獼猴和人的ZPA和ZPB。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物ZPA和哺乳動物ZPB基本上不含ZPC。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述透明帶蛋白基本上只是ZPA。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述透明帶蛋白基本上只是ZPB。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物ZPA和ZPB為重組ZPA和ZPB。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體的效價(jià)至少為1∶250。
10.一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)永久性不育的方法，該方法包括給予主體哺乳動物重組哺乳動物ZPC蛋白或其片段，給予的劑量能有效刺激所述哺乳動物產(chǎn)生識別所述哺乳動物的ZPC蛋白的抗體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述哺乳動物ZPC得自與主體哺乳動物相同的哺乳動物物種。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述哺乳動物ZPC得自與主體哺乳動物不同的哺乳動物物種。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述哺乳動物ZPC蛋白選自豬、兔、狗、貓、獼猴和牛的ZPC。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述ZPC蛋白基本上不含ZPA和ZPB。
15.一種藥物組合物，該組合物包含有效避孕劑量的重組ZPC蛋白或其免疫避孕活性片段。
16.一種藥物組合物，該組合物包含有效避孕劑量的透明帶蛋白和可藥用的載體、稀釋劑和佐劑，所述透明帶蛋白選自哺乳動物ZPA和ZPB及其片段。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所述哺乳動物ZPA和ZPB得自與主體哺乳動物相同的哺乳動物物種。
18.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所述哺乳動物ZPA和ZPB選自豬、貓、狗、牛、獼猴和人的ZPA和ZPB。
19.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所述哺乳動物ZPA和ZPB基本上不含ZPC。
20.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所述哺乳動物ZPA和ZPB為重組ZPA和ZPB。
21.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼豬ZPA、ZPB或其免疫避孕活性片段，所述DNA順序基本上如1、3和5號順序所示。
22.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼免ZPC或其免疫避孕活性片段，所述DNA順序基本上如7號順序所示。
23.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼狗ZPA或ZPC或其免疫避孕活性片段，所述DNA順序基本上如9和11號順序所示。
24.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼貓ZPA、ZPB或ZPC、或其免疫避孕活性片段，所述DNA順序基本上如13、15和17號順序所示。
25.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼牛ZPA、ZPB或ZPC、或其免疫避孕活性片段，所述DNA順序基本上如19、21和23號順序所示。
26.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼人ZPA或其免疫避孕活性片段，所述DNA順序包含存在于λ噬菌體克隆A1(ATCC75404)和A4(ATCC75403)中的人DNA插入片段中的DNA。
27.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼人ZPA或其免疫避孕活性片段，所述順序基本上如42號順序所示。
28.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼人ZPB或其免疫避孕活性片段，所述DNA順序包含存在于λ噬菌體克隆1-1(ATCC75406)和4-9(ATCC75405)中的DNA插入片段中的人DNA。
29.一種經(jīng)過分離純化的DNA順序，所述DNA順序編碼人ZPB或其免疫避孕活性片段，所述順序基本上如40號順序所示。
30.一種載體，該載體含有權(quán)利要求21的DNA順序。
31.一種載體，該載體含有權(quán)利要求22的DNA順序。
32.一種載體，該載體含有權(quán)利要求23的DNA順序。
33.一種載體，該載體含有權(quán)利要求24的DNA順序。
34.一種載體，該載體含有權(quán)利要求25的DNA順序。
35.一種載體，該載體含有權(quán)利要求26的DNA順序。
36.一種載體，該載體含有權(quán)利要求27的DNA順序。
37.一種載體，該載體含有權(quán)利要求28的DNA順序。
38.一種載體，該載體含有權(quán)利要求的29DNA順序。
39.一種真核或原核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞已用權(quán)利要求30、31、32、32、33、34、35、35、36、37或38的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
40.權(quán)利要求21、22、23、24、25、26、27、28或29的DNA順序在原核或真核宿主細(xì)胞中的多肽表達(dá)產(chǎn)物。
41.一種制備重組哺乳動物透明帶蛋白或其片段的方法，所述方法包括在合適的營養(yǎng)條件下培養(yǎng)用權(quán)利要求30、31、32、33、34、35、36或37的DNA載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，并分離所述載體中的DNA順序的所需多肽表達(dá)產(chǎn)物。
42.一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)可重復(fù)的暫時(shí)性不育的方法，該方法包括給予主體哺乳動物避孕有效劑量的針對透明帶蛋白的抗體，所述抗體選自抗ZPA抗體和抗ZPB抗體。
43.一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)永久性不育的方法，該方法包括給予主體哺乳動物避孕有效劑量的針對ZPC的抗體。
全文摘要
一種在宿主動物體內(nèi)特異性地誘導(dǎo)暫時(shí)性不育或永久性不育的方法，該方法是用特異性的透明帶蛋白或其免疫避孕活性片段進(jìn)行選擇性接種。公開了編碼特異透明帶蛋白的新透明帶DNA順序。
文檔編號C07K16/00GK1110177SQ94103010
公開日1995年10月18日 申請日期1994年3月14日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月9日
發(fā)明者J·D·哈里斯, 許光燦, J·S·波多爾斯基 申請人:佐納根有限公司