專利名稱：脫氧核糖核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的重組脫氧核糖核酸(DNA)，涉及含有這些重組DNA的載體及宿主有機(jī)體，以及涉及含有該重組DNA并且對(duì)有害生物體及植物病害顯示出加強(qiáng)抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
對(duì)許多病毒而言，已經(jīng)證明，當(dāng)將結(jié)構(gòu)基因或非結(jié)構(gòu)基因從這些病毒中分離出來(lái)并且以適當(dāng)?shù)姆绞秸T導(dǎo)這些基因使之在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，它們使所述植物產(chǎn)生增強(qiáng)的對(duì)同源病毒感染的抗性或者使之減毒和/或使癥狀表現(xiàn)速度減慢。利用煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋白的例子首先證實(shí)了這一結(jié)論(EP-A2-0223452;Beachy et al.，1985;and Powell Abel et al.，1986)。TMV屬于煙草花葉病毒(Tobamovirus)屬并且有比較簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，對(duì)其遺傳信息而言，該病毒與許多其他植物病毒一樣，有一條具有正鏈信息的單鏈RNA分子(單鏈正意義RNA基因組)。該遺傳信息包裝于一個(gè)由許多相同亞單位組成的外殼中。在這之后，可以證明類似的方案應(yīng)用于蕃茄斑萎病毒(TSMV)也是成功的，該病毒是一種本質(zhì)上不相同的病毒，并且屬于本雅病毒科的Tospovirus屬(EP-A1-0426195Gielen et al.，1991;De Haan et al.，1992)。Tospovirus屬的分類學(xué)特征是形態(tài)為直徑約100nm的球形顆粒，并且有一個(gè)分為三部分的單鏈RNA基因組，該基因組是一種核蛋白復(fù)合物(殼包核酸)，在其外面包裹一個(gè)脂類外殼。該脂類外殼包含了糖蛋白。
所述由三部分組成的基因組具有二種意義或負(fù)鏈信息(負(fù)或二種意義極性的單鏈RNA分子，De Haan et al.，1990)。對(duì)于這種情況，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的抗性是基于將tospovirus，蕃茄斑萎病毒(＝TSMV)的N結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)移到植物中，并且在該植物中表達(dá)所述基因。所述N基因產(chǎn)物是上面提及的核蛋白復(fù)合物的一種成份。
就TMV外殼蛋白而言可以證明其對(duì)近緣煙草花葉病毒的明顯的交叉抗性(例如，Tumer et al.，1987)，而對(duì)TSMV和N基因的表達(dá)而言至今未知有這樣的交叉抗性(De Haan et al.，1992;Mackenzie和Ellis，1992;Sheng-Zi et al.，1992)。
已經(jīng)找到了新的重組脫氧核糖核酸(DNA)，特征在于其組成成分為或含有下列成份的結(jié)合物或有一種在各種情況下具有同等效果的DNA的成份的結(jié)合物a)一種雙鏈cDNA片段，它來(lái)源于梅痘病毒(PPV)的RNA(“片段A”)，和b)一種雙鏈cDNA片段，它來(lái)源于蕃茄斑萎病毒(TSMV)的S RNA(“片段B”)，為了便于結(jié)合，除了含有可任選存在的其他的DNA片段外，還含有一種在植物細(xì)胞中具活性的啟動(dòng)子。
此外，已發(fā)現(xiàn)了在其基因組中整合了新的重組DNA(并表達(dá)該DNA)的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)有害有機(jī)體和植物病害顯示出增加的抗性。
該轉(zhuǎn)基因植物還，并且尤其，表現(xiàn)出不僅對(duì)同源性的TSW病毒分離物(從其中衍生出片段B)有增加的抗性，而且對(duì)其他的tospovirus種類也有增加的抗性。這一發(fā)現(xiàn)令人驚奇，因?yàn)橛杀绢I(lǐng)域的工藝水平已制備的并且來(lái)源于天然存在的病毒基因的重組脫氧核糖核酸在相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物中沒(méi)有如此廣泛的作用(De Haan et al.，1992;Mackenzie and Ellis，1992)。除此之外，特別令人驚奇的是，可以觀察到對(duì)不屬于Tospovirus屬的病毒的增加的抗性。
在本發(fā)明的重組DNA中，片段B總位于(即以3′方向)片段A之后，兩個(gè)片段相互直接連接或借助于另一個(gè)DNA片段(“片段C”)連接。在植物中有活性的一種啟動(dòng)子置于片段A的上游，這樣本發(fā)明的DNA代表一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。對(duì)于這種情況，片段B后面還跟隨一個(gè)3′非轉(zhuǎn)譯DNA，它直接與片段B連接或借助另一個(gè)DNA片段(“片段D”)相連接。該3′非轉(zhuǎn)譯DNA含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列(TTS)和一個(gè)聚腺苷酸化位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄終止序列”是指一種序列，該序列決定由一種特定的聚合酶從一種作模板的特定的DNA序列進(jìn)行的DNA合成反應(yīng)的結(jié)束。就使用于轉(zhuǎn)基因植物中的“嵌合基因”而言，可以使用，例如，胭脂堿合成酶基因(Zambryski et al.，1983)、章魚(yú)堿合成酶基因(Herrera-Estrella et al.，1983)或CaMV的35S轉(zhuǎn)錄物(花椰菜花葉病毒)(Pietrzak et al.，1986)的TTS。
另外，術(shù)語(yǔ)“聚腺苷酸化位點(diǎn)”或“聚腺苷酸化信號(hào)”優(yōu)選地表示一種由六個(gè)核苷酸(例如AAUAAA)組成的序列，該序列作用于一級(jí)轉(zhuǎn)錄物的精確加工過(guò)程以及在一級(jí)轉(zhuǎn)錄物的3′末端轉(zhuǎn)錄后的“多聚-A序列”的合成。
因此，從這一點(diǎn)可以得出，一個(gè)完全的轉(zhuǎn)錄單位有下列DNA排列(5′)啟動(dòng)子-片段A-任選包括片段C-片段B-任選包括片段D-3′非轉(zhuǎn)譯DNA(3′)以這種方式排列的DNA是本發(fā)明的一部分。下面所述的重組DNA排列同樣是本發(fā)明的一個(gè)組成部分(5′)啟動(dòng)子-任選包括片段C-片段B-任選包括片段D-3′非轉(zhuǎn)譯DNA(3′)，以及片段A-任選包括片段C-片段B-任選包括片段D(3′)，以及(5′)啟動(dòng)子-片段A-任選包括片段C-片段B(3′)片段A是一種來(lái)源于梅痘病毒(PPV)的RNA的雙鏈cDNA，術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”是指該cDNA是一種以互補(bǔ)于病毒RNA的形式存在的DNA。
由SEQ ID NO7復(fù)制出的DNA優(yōu)選地用作為片段A。
片段B是源于S RNA、優(yōu)選的是源于蕃茄斑萎病毒(TSWV)(優(yōu)選其L3分離物)的N結(jié)構(gòu)基因的一種雙鏈cDNA。術(shù)語(yǔ)“源于”是指該cDNA是一種以互補(bǔ)于病毒RNA的形式存在的DNA。由SEQ ID NO11復(fù)制出的DNA優(yōu)選地用作為片段B。
片段A和B可以直接或優(yōu)選地通過(guò)一個(gè)雙鏈DNA片段C而相互連接在一起。可以用合成的DNA片段作為片段C，應(yīng)對(duì)這樣的DNA片段進(jìn)行選擇，選擇出的片段在任何特定的閱讀框架中不含有終止密碼子，并且該片段能連接片段A和B，使它們形成一個(gè)未中斷的開(kāi)放式閱讀框架，該框架起始于片段A，在片段B的末端結(jié)束，并以這種方式編碼一種多肽。
優(yōu)選的片段C含有最多至134個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選的片段C含有2-68個(gè)核苷酸。由SEQ ID NO9復(fù)制出的合成的DNA序列最優(yōu)選地用作為片段C。該片段以特定的優(yōu)選方式將起始于片段A的開(kāi)放式閱讀框架與片段B的框架相連接。
所有在植物中有活性的那些啟動(dòng)子都適合用作為能定位于片段A上游的啟動(dòng)子。在這些啟動(dòng)子中，特別值得提及的是選擇那些受聚合酶Ⅱ控制的啟動(dòng)子，受聚合酶Ⅲ控制的那些啟動(dòng)子也可以使用。特別要提及的還可以選擇來(lái)源于植物病原體病毒的啟動(dòng)子。在這些啟動(dòng)子中，花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子是特別優(yōu)選的。其序列可由SEQ ID NO3復(fù)制產(chǎn)生。優(yōu)選的是將該啟動(dòng)子直接連接到片段A上。
所有能在植物中引起聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的合適區(qū)域都可用作為3′非轉(zhuǎn)譯DNA。該DNA含有一個(gè)聚腺苷酸化位點(diǎn)和一個(gè)TTS信號(hào)并且跟隨片段B，任選插入片段D。優(yōu)先選擇來(lái)源于植物病原體的3′非轉(zhuǎn)譯DNA序列。特別優(yōu)選的是使用其序列SEQ ID NO4中描繪的3′非轉(zhuǎn)譯CaMV 35S DNA。
在各種情況下，可以用含有有相同效果的DNA的相應(yīng)片段代替本發(fā)明重組DNA中的上面描述的片段。在有相同效果的DNA中，其中的一個(gè)或多個(gè)堿基，或者1個(gè)或多個(gè)密碼子可以丟失或由其他堿基或密碼子代替，但是也可僅將該片段改變至基本上保存其效果的程度，即本發(fā)明的片段結(jié)合后導(dǎo)致植物抗有害生物體和植物病害的抗性增強(qiáng)。任何在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與根據(jù)SEQ ID NO1-13的單鏈DNA進(jìn)行雜交并且與其余片段結(jié)合后引起植物的抗性獲得所需增加的DNA都可認(rèn)作為具有相同效果的DNA。優(yōu)選的“有相同效果”的DNA是一種能源生出相同多肽或“其相同效果”的多肽的DNA，如源于SEQ ID NO1、5、7、9和11的DNA序列(也參照SEQ ID2、6、8、10和12的蛋白質(zhì)序列)。在這種情況下，“源生”是指將一種DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，該RNA可轉(zhuǎn)譯為蛋白質(zhì)。有相同效果的多肽是指其總的一級(jí)序列有相同效果的多肽，因此這可以是交換了單個(gè)氨基酸但不以失去所需的抗性增加的方式改變二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。也可以用根據(jù)SEQ ID NO7和11的DNA作為探針以便從用于從本發(fā)明中的梅痘病毒或tospoviruses中分離合適的其他片段。利用這些探針，也可以常規(guī)方式檢測(cè)載體或植物基因組中的片段。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的重組DNA至少含有具有SEQ ID NO7或11的序列的片段A或B之一，或含有一個(gè)具有相同效應(yīng)的相應(yīng)DNA。
根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的重組DNA含有具有SEQ ID NO7和11的序列的片段A和片段B，或含有一種具有相同效果的相應(yīng)DNA。
根據(jù)本發(fā)明，最優(yōu)選的重組DNA有SEQ ID NO1的序列，包括有相同效果的相應(yīng)DNA。具有SEQ ID NO5序列的重組DNA或具有相同效果的一種相應(yīng)DNA最優(yōu)選地作為一個(gè)完全轉(zhuǎn)錄單位。
采用常規(guī)方法，借助于SEQ ID NO1-13的信息可以獲得可用于本發(fā)明的DNA片段，也可以獲得根據(jù)本發(fā)明的DNA。除此之外，從德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物收集處(DSM)的編號(hào)為PL-1080(pPPV-NAT5′-4)和PL-1081(pTSWL3-308)的寄存物可獲得可用于本發(fā)明的梅痘病毒(PPV)基團(tuán)組的cDNA片段以及TSW病毒的S RNA基因組的cDNA片段。從DSM編號(hào)為PL-1029和PL-1033(參見(jiàn)DSM目錄表，植物病毒組，Messeweg 11/12，W-3300 Braunschweig，F(xiàn)ederal Republic of Germany)的寄存物同樣可以獲得CaMV的“Strassburg分離物”和CM1841分離物(ATCC NO.45031)的不同的cDNA。
遵循國(guó)際承認(rèn)的有關(guān)用于專利程序的微生物寄存的布達(dá)佩斯條約的規(guī)章，已將由大腸桿菌攜帶的質(zhì)粒PL-1080和PL-1081寄存于德國(guó)微生物收集處(DSM)，Mascheroder Weg lb，D-3300
Braunschweig，F(xiàn)ederal Republic of Germany
本發(fā)明所述的重組DNA不存在于自然界中。使用前面描述中涉及的信息，尤其是使用SEQ ID NO1-13，借助于常規(guī)分子生物學(xué)方法(Sambrook et al.，1989)，本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員能夠獲得這些DNA。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明重組DNA的新載體，特別是質(zhì)?；蚴删w。例如(如下文中描述)質(zhì)粒pSLTSWVL 3和pXLTSWVL3。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的重組DNA、優(yōu)選地是整合到質(zhì)粒中的重組DNA的新的宿主生物體，尤其是微生物。常規(guī)使用的大腸桿菌和根癌土壤桿菌特別適合于用作為這樣的微生物?？勺鳛閷?shí)例提及的是根癌土壤桿菌XLTSWVL3菌株，這將在下文中進(jìn)行詳細(xì)描述，該菌株含有質(zhì)粒pXLTSWVL3。
使用前面描述中包含的信息，特別是使用SEQ ID NO1-13，借助于常規(guī)分子生物學(xué)方法，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠獲得所述載體及微生物菌株。
將本發(fā)明所述的重組DNA插入植物基因組，結(jié)果導(dǎo)致這些轉(zhuǎn)基因植物呈現(xiàn)出更高的抗有害生物體及植物病害的抗性。
轉(zhuǎn)化植物的增大的抗性對(duì)于農(nóng)業(yè)和林業(yè)、對(duì)于觀賞植物和藥用植物的栽培、以及對(duì)于植物育種都具有重要性。在植物細(xì)胞、例如用于分離藥物學(xué)上可利用的物質(zhì)的植物細(xì)胞的栽培時(shí)，獲得有效的顯示出抗微生物病蟲(chóng)害、尤其是抗真菌和病毒的感染的增大的抗性的植物細(xì)胞也是有利的。
因此，本發(fā)明還涉及制備具有抗有害生物體和植物病害的增大抗性的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物各部分和種子)的方法，該方法特征在于(a)將本發(fā)明的DNA一次性或多次地引導(dǎo)入植物細(xì)胞(包括原生質(zhì)體)的基因組，以及，如果合適，(b)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞(包括原生質(zhì)體)再生出完整的轉(zhuǎn)化植株，并且如果合適，將植株繁殖，并且如果合適，(c)從由該方法產(chǎn)生的母代轉(zhuǎn)基因植株中，或從由親代植株獲得的繁殖子代中分離出所需的植物各部分(包括種子)，以及(d)如果合適，將轉(zhuǎn)基因植物的基因組與其他植物基因組結(jié)合，并且繁殖后代，從而生產(chǎn)更多的植株。
根據(jù)已知的工序和方法，以常規(guī)方式完成上述的方法步驟(a)、(b)和(c)同樣本發(fā)明包括含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明DNA復(fù)制體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物各部分和種子)，以及包括可由上面所述方法制備的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物。
(a)將本發(fā)明的重組DNA用于增加植物抗有害生物體和植物病害的抗性，(b)將本發(fā)明的重組DNA用于生產(chǎn)具有增大的抗有害生物體和植物病害的抗性的植物細(xì)胞、植物、植物各部分和植物繁殖材料，以及
(c)將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物(包括植株各部分及植物種子)用于生產(chǎn)繁殖材料和生產(chǎn)新的植物以及其繁殖材料，上述三點(diǎn)也是本發(fā)明的部分發(fā)明內(nèi)容。
分別含有根據(jù)SEQ ID NO2或6的蛋白質(zhì)，或者如果合適，分別含有截去了氨基末端的根據(jù)SEQ ID NO2或6的蛋白質(zhì)的植物(包括植物細(xì)胞，植物各部分和繁殖材料)也是本發(fā)明的一部分。
可利用多種方法將本發(fā)明的重組DNA插入到植物或植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中。DNA的轉(zhuǎn)移可用常規(guī)已知方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，本領(lǐng)域內(nèi)熟練的技術(shù)人員能夠毫不困難地確定在各種情況下應(yīng)使用的合適方法。將要用于轉(zhuǎn)化植物的本發(fā)明所述的DNA必須含有一個(gè)在植物中有活性的合適的啟動(dòng)子以及一個(gè)3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)。根據(jù)SEQ ID NO5的重組DNA特別合適。
根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒適用于作為一種應(yīng)用范圍寬的特別有利的載體，用于將外源DNA轉(zhuǎn)移到雙子葉植物和單子葉植物的基因組。將本發(fā)明的DNA，與DNA調(diào)節(jié)序列一起插入到合適Ti質(zhì)粒的T DNA(例如，Zambryski et al，1983)中，并且通過(guò)感染植物，感染植物各部分或植物組織，例如，葉片、主莖干、下胚軸、子葉、分生組織或由其衍生的組織，例如次級(jí)胚狀體和愈傷組織，或通過(guò)將原生質(zhì)體與根癌土壤桿菌共培養(yǎng)而轉(zhuǎn)移該DNA。
另一種方法是在多陽(yáng)離子或鈣鹽和聚乙二醇存在下將DNA在植物原生質(zhì)體(例如，Hain et al.，1985;Krens et al.，1982;Paszkowski et al.，1984)中培養(yǎng)。
通過(guò)使用電場(chǎng)(electroporation)(例如，F(xiàn)romm et al.，1986)也能夠額外地促進(jìn)DNA的攝取。
采用借助于植物花粉的已知方式，用已攜帶DNA并由物理方法加速的顆粒轟擊過(guò)的花粉也可以將DNA導(dǎo)入(參照EP-A-0270356)。
按已知方法，使用合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(例如Nagy和Maliga 1976)再生出植株。
在本發(fā)明方法(根據(jù)EP-A 116718的方法)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，例如，將本發(fā)明所述的重組DNA以離體形式克隆至一種合適的中間載體大腸桿菌載體，例如pGV700或pGV710(參照EP-A 116718)中或優(yōu)選的是克隆至該載體的含有一種附加的報(bào)道基因(reportergene)例如nptⅡ(Herrera-Estrella et al.1983)或hpt(Vanden Elzen et al.1986)的衍生物中。
采用常規(guī)方法(例如Van Haute et al.1983)將以這種方法構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到例如含有pGV3850或其衍生物(Zambryski et al.1983)的根癌土壤桿菌中。另一種可選方法是，將本發(fā)明所述DNA克隆于一種雙載體例如pCV001或pCV002(例如Koncz and Sohell 1986)中，然后按加上所述轉(zhuǎn)移到一種合適的土壤桿菌菌株(Koncz and Sohell 1986)中。最后將得到的含有可轉(zhuǎn)移到植物中的形式的重組DNA的土壤桿菌菌株用于植物轉(zhuǎn)化。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按常規(guī)方法(例如Hain et al 1985)，通過(guò)基因直接轉(zhuǎn)移，將重組DNA轉(zhuǎn)移到植物原生質(zhì)體中，如果合適，將它與另一種含有植物細(xì)胞報(bào)道基因，例如，卡那霉素抗性(例如Herrera-Estrella et al.1983)或潮霉素抗性(Van den Elzen，1986)基因，優(yōu)選pLGV neo 2103(Hain et al.，1985)、pMON 129(Fraley R.T.et al.，Proc.National Acad.Sci.USA 80，4803(1983))、pAK 1003、pAK 2004(Valten J.et al.，EMBO Journ.Vol.3，2723(1984))或pGSST neo 3(pGSST3)(EP-A-189707)的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)移。在本文中，質(zhì)粒可以環(huán)狀形式存在，但線性形式質(zhì)粒是優(yōu)選的。如果使用含有一種報(bào)道基因的質(zhì)粒，然后檢查卡那霉素抗性原生質(zhì)體中重組DNA的表達(dá)。另一種可選的情況(無(wú)報(bào)道基因)，檢測(cè)得到的愈傷組織中重組DNA的表達(dá)(使用常規(guī)的篩選方法)。
可以根據(jù)已知方法，例如通過(guò)轉(zhuǎn)化葉片(例如Horsoh et al.1985)，通過(guò)將再生植物原生質(zhì)體或細(xì)胞培養(yǎng)物與根癌土壤桿菌(例如Marton et al.1979，Hain et al.1985)共培養(yǎng)，或通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)染法，可制備轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。通過(guò)選擇報(bào)道基因的表達(dá)，例如體外使卡那霉素硫酸鹽磷酸化(Reiss et al.1984;Schreier et al.1985)方法，或者通過(guò)胭脂堿合成酶的表達(dá)(根據(jù)Aerts et al.1983)或通過(guò)采用Northern印跡分析和Western印跡分析檢測(cè)本發(fā)明重組DNA的表達(dá)而檢測(cè)得到的轉(zhuǎn)化植株。也可由已知方法，利用特異的抗體(Adam et al.1987，1991)檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株中的重組DNA基因產(chǎn)物。
根據(jù)常規(guī)方式，利用適合于各種情況的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并再生為完整植株。
含有本發(fā)明的DNA并是本發(fā)明組成部分的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)化植株顯示出相當(dāng)高程度的對(duì)有害生物體及植物病害，尤其是對(duì)線蟲(chóng)、植物病原真菌和病毒的抗性。
關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“植物”是指整個(gè)植株，以及植物各部分如葉、種子、塊莖和插條等等。“植物細(xì)胞”包括原生質(zhì)體、細(xì)胞系、植物愈傷組織等等。“繁殖材料”是指植物、植物各部分，如種子、塊莖和插條，以及可用于繁殖轉(zhuǎn)基因植株和植物細(xì)胞的植物細(xì)胞，并且因此“繁殖材料”同樣也是本發(fā)明的一部分。
事實(shí)上，所有的植物都包含于那些能通過(guò)摻入(轉(zhuǎn)化)本發(fā)明的重組DNA而獲得了增大的抗病蟲(chóng)害的抗性的植物。當(dāng)然，對(duì)于栽培植物，如林業(yè)植物，例如云杉、樅樹(shù)、Douglas樅、松樹(shù)、落葉松、山毛櫸和橡樹(shù)，以及能提供營(yíng)養(yǎng)和原材料的植物，例如谷類(特別是小麥、黑麥、大麥、燕麥、小米、水稻和玉米)、馬鈴薯、豆科植物(如豆子以及，特別是苜蓿和黃豆)、蔬菜(尤其是甘藍(lán)品系以及蕃茄)，水果(尤其是蘋(píng)果、梨、櫻桃、葡萄、柑橘、菠蘿和香蕉)、油棕櫚、茶、可可以及咖啡灌木、煙草、劍麻和棉花，以及對(duì)于藥用植物，如蘿芙木屬和洋地黃，對(duì)于產(chǎn)生抗性有特定的要求。馬鈴薯、蕃茄、豆科植物和Curcubitaceae是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明中提到的根據(jù)本發(fā)明方法獲得的抗病蟲(chóng)害(有害生物體和能引起植物病害的生物體)的增強(qiáng)抗性中所述病蟲(chóng)害是指所有動(dòng)物病蟲(chóng)害，如昆蟲(chóng)、螨類和線蟲(chóng)，和微生物病蟲(chóng)害如植物病原真菌、細(xì)菌和病毒。選擇出來(lái)特別介紹的是損害植物的線蟲(chóng)和微生物蟲(chóng)害，尤其是植物病原真菌及病毒。
有害的昆蟲(chóng)包括，尤其是下列目中的昆蟲(chóng)直翅目、革翅目、等翅目、纓翅目、異翅目、同翅目、鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和雙翅目。
有害的螨蟲(chóng)包括(尤其是)下列屬的螨蟲(chóng)跗線螨屬、全爪螨屬以及葉螨屬。
寄生于植物的線蟲(chóng)包括下列屬的線蟲(chóng)草地墊刃線蟲(chóng)屬、Radopholus similis、Ditylenchus dipsaci、Tylenchulus semipenetrans、異皮線蟲(chóng)屬，Globodera spp.、根結(jié)線蟲(chóng)屬、滑刃線蟲(chóng)屬、Longidorus spp.、Xiphinemn spp.、Trichodorus spp.。
微生物病蟲(chóng)害包括(尤其是)植物病原真菌根腫菌綱、卵菌亞綱、壺菌綱、接合菌亞綱、子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌綱。
植物病原細(xì)菌包括(尤其是)假單孢菌科、根瘤菌科、腸桿菌科、棒狀桿菌科和鏈霉菌科。
病毒疾病包括(尤其是)花葉病、矮化的和黃化的病毒病;以及由tospovirus引起的病毒病。
在上面列舉的屬名內(nèi)包括的病毒病、真菌病和細(xì)菌病的某些致病因子舉例如下，而不僅限于這些。
大麥黃矮病毒(BYDV)、馬鈴薯病毒Y(PVY)、黃瓜花葉病毒(CMV)、西瓜花葉病毒(WMV)、桔樹(shù)根枯病病毒(TNV)、煙草花葉病毒(TMV)、煙草壞死病毒(TNV)、 菜壞死黃色葉脈病毒(BNYVV)以及，尤其是，蕃茄斑萎病毒(TSWV)，所有tospoviruses、煙草花葉病毒(TMV)以及其他煙草花葉病毒，以及煙草脆裂病毒和其他tobraviruses。
黃單胞菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如，田野黃單胞菌、稻黃單胞菌;
假單胞菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如丁香假單胞菌、黃瓜角斑病假單胞菌;
歐文氏桿菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如，解淀粉歐文氏桿菌;
腐霉屬內(nèi)各個(gè)種，例如，終極腐霉;
疫霉屬內(nèi)各個(gè)種，例如，蔓延疫霉;
假霜霉屬內(nèi)各個(gè)種，例如，葎草假霜霉或古巴假霜霉;
單軸霉屬內(nèi)各個(gè)種，例如，葡萄生單軸霉;
霜霉屬內(nèi)各個(gè)種，例如豌豆霜霉或蕓苔霜霉;
白粉菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如禾白粉菌;
單絲殼屬內(nèi)各個(gè)種，例如蒼耳單絲殼菌;
柄球菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如蘋(píng)果白粉病柄球菌;
黑心菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如蘋(píng)果黑心菌;
核腔菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如圓核腔菌或麥類核腔菌(分生孢子形式Drechslera，syn長(zhǎng)蠕孢屬);
旋孢霉屬內(nèi)各個(gè)種，例如禾旋孢霉(分生孢子形式Drechslera，syn長(zhǎng)蠕孢屬);
單胞銹菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如疣頂單胞銹菌;
柄銹菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如隱匿柄銹菌屬;
腥黑粉菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如小麥網(wǎng)腥黑粉菌;
黑粉菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如裸黑粉菌或燕麥黑粉菌;
藻膜革菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如佐佐木氏藻膜革菌;
Pyricularia species，例如，Pyricularia oryzae;
鐮孢屬內(nèi)各個(gè)種，例如大刀鐮孢菌;
葡萄孢屬內(nèi)各個(gè)種，例如灰色葡萄孢;
殼針孢屬內(nèi)各個(gè)種，例如穎枯殼針孢;
小球腔菌屬內(nèi)各個(gè)種，例如，Leptosphaeria nodorum;
尾孢屬內(nèi)各個(gè)種，例如Cercospora canescens;
鏈格孢屬內(nèi)各個(gè)種，例如甘藍(lán)鏈格孢;
Pseudocercosporella species，例如，Pseudocercosporella herpotrichoides.
另外，可以列舉灰色長(zhǎng)蠕孢。
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下列實(shí)施例目的在于更清楚地描述本發(fā)明1.構(gòu)建重組DNA并轉(zhuǎn)移至土壤桿菌中正如已經(jīng)解釋過(guò)的，本發(fā)明涉及一種新的重組DNA，尤其是一種重組嵌合基因(SEQ ID NO1)，所述DNA處于一種啟動(dòng)子控制下并含有一個(gè)3′末端序列。作為實(shí)例(Toepfer et al.1987和EP-A2-0223452)本文中使用CaMV35S啟動(dòng)子(5′區(qū))(SEQ ID NO3)以及CaMV35S轉(zhuǎn)錄物的3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)(SEQ ID NO4)。這里使用的整個(gè)實(shí)例顯示于SEQ ID NO5中。本發(fā)明的DNA(嵌合基因)(SEQ ID NO1)由以特定序列連接在一起的幾個(gè)片段組成。它是由來(lái)源于梅痘病毒(PPV)的RNA(Maiss et al.，1989)的一個(gè)152堿基對(duì)的雙鏈cDNA片段組成。該片段對(duì)應(yīng)于病毒RNA序列的1-152位點(diǎn)(SEQ ID NO7)(Maiss et al.，1989)。在該片段中，起始于一個(gè)開(kāi)放式閱讀框架，它通過(guò)一個(gè)合成的cDNA片段(SEQ ID NO9)連接至TSWV N基團(tuán)的L3分離物的S RNA的cDNA片段(Maiss et al.;1991)(SEQ ID NO11)上。通過(guò)這種連接產(chǎn)生一個(gè)開(kāi)放式閱讀框架，它有未中斷的總體長(zhǎng)度為956個(gè)堿基并且在“SEQ ID NO1”的992位點(diǎn)處結(jié)束。借助于一個(gè)合成序列(SEQ ID NO13)將得到的TSWV的3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)的S RNA的cDNA序列(SEQ ID NO11)連接到CaMV的35S轉(zhuǎn)錄物的3′區(qū)(SEQ ID NO4)(Tōpfer et al.;1987)上。
使用熟知的并在Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，1989上詳細(xì)描述的方法完成上述構(gòu)建過(guò)程。
詳細(xì)步驟描述如下。將通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)的質(zhì)粒pCaMVCN(Pharmacia)的長(zhǎng)度為454個(gè)堿基對(duì)的HindⅢ/-BamHⅠ片段克隆到可通過(guò)商業(yè)途徑獲得的質(zhì)粒pT7T3 19U(Pharmacia)并將得到的質(zhì)粒稱為pT7T3 35S。用SalⅠ切割該新的質(zhì)粒并填充其突伸末端，然后用EcoRⅠ切割該DNA。然后將來(lái)自質(zhì)粒pPPV-NAT 5′4(Maiss et al.，1989;Maiss et al.1992)的DraⅠ/EcoRⅠ片段(長(zhǎng)度為572個(gè)堿基對(duì))克隆到剛才制備的質(zhì)粒上。該片段含有PPV的5′末端的一個(gè)cDNA拷貝。將該新的質(zhì)粒稱為p35S 5′.16。
使用與非編碼鏈互補(bǔ)的合成寡核苷酸5′-TGTGTTGAGTTTTTATATTTTCCTCTCCAAATGAAA-3′(SEQ ID NO14)采用體外誘變方法，將CaMV35S啟動(dòng)子序列(5′-…AGAGG-3′)(SEQ ID NO15)的3′-末端粘附到PPV序列的cDNA的量終的5′末端(5′-AAAATAT…-3′)(SEQ ID NO16)。將得到的新質(zhì)粒命名為p35S。從該質(zhì)粒上分離出長(zhǎng)度為568個(gè)堿基對(duì)的HincⅡ片段，并克隆至可由商業(yè)途徑獲得的pT7T3 19U質(zhì)粒，在克隆前已將該質(zhì)粒用SmaⅠ和HincⅡ切割。得到的質(zhì)粒命名為pT7T3 19UPPVL。用EcoRV和SalⅠ切割該質(zhì)粒，分離出長(zhǎng)度為239個(gè)堿基對(duì)的片段。將該片段克隆到pRT101(Tōpfer et al.1987)的EcoRV，XhoⅠ裂解位點(diǎn)。得到的質(zhì)粒稱為pSL。
從質(zhì)粒pTSWV-L3/308(Maiss et al.;1991)中分離出BamHⅠ/HindⅢ片段。填充其末端，將它插入到pRT101載體(Tōpfer et al.1987)的SmaⅠ切割位點(diǎn)處。將含有正確定向的插入片段的質(zhì)粒稱為pSTSWVL 3。從該質(zhì)粒中分離出長(zhǎng)度為868個(gè)堿基對(duì)的RsaⅠ/-BamHⅠ片段，并克隆到上面介紹的已用SmaⅠ和BamHⅠ切割過(guò)的載體pSL中。由此產(chǎn)生的新質(zhì)粒命名為pSLTSWVL3。利用HindⅢ從后面這個(gè)質(zhì)粒中分離出長(zhǎng)度為1716個(gè)堿基對(duì)并且包含整個(gè)嵌合基因和CaMV(35S)的5′和3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)的一個(gè)片段。將該片段克隆到質(zhì)粒pXL222(Landsmann et al.1988)中，該質(zhì)粒已用HindⅢ切割。得到的質(zhì)粒稱為pXLTSWVL3。將該質(zhì)粒(pXLTSWVL3)轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)染到根癌土壤桿菌菌株LBA4404(Hoekema et al.1983)中。將該新的土壤桿菌菌株稱為XLTSWVL3。
2.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，并檢測(cè)這些植物中的嵌合基因的表達(dá)用土壤桿菌菌株XLTSWVL3轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物各部分。
使用一個(gè)標(biāo)記物和選擇性基因，即在同時(shí)轉(zhuǎn)移的卡那霉素抗性基因，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)它們表達(dá)嵌合基因的能力選出二十一個(gè)單個(gè)的待選植株。這種選擇過(guò)程首先包括在mRNA水平上測(cè)定基因表達(dá)。為了這個(gè)目的，利用逆轉(zhuǎn)錄酶和合成的寡核苷酸5′-GTC AGT GGC TCC AAT CCT GTC TGA AG-3′(SEQ ID NO17)將從轉(zhuǎn)基因植物中分離的整個(gè)RNA轉(zhuǎn)譯為cDNA，并且借助于第二個(gè)合成的寡核苷酸5′-TGT GGA GAA TTC GAG CTC GGA AC-3′(SEQ ID NO18)以及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，Mullis and Faloona，1987)，擴(kuò)增所存在的嵌合基因的mRNA，并鑒別為一個(gè)長(zhǎng)度為328個(gè)堿基對(duì)的片段。
接著使用一個(gè)特異性抗體(ELISA)檢測(cè)已用前面描述的方法和手段檢測(cè)到基因表達(dá)的二十一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生的嵌合基因產(chǎn)物(Adam et al.，1987;1991)。侍選株XL4、XL8、XL11、XL14、XL15和XL19顯示有一個(gè)清晰的可檢測(cè)信號(hào)并且選擇這些株進(jìn)行起始的、增進(jìn)資料的植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
詳細(xì)地說(shuō)，植物的轉(zhuǎn)化按如下所述進(jìn)行。
2.1土壤桿菌轉(zhuǎn)化為了轉(zhuǎn)化煙草用其葉片進(jìn)行試驗(yàn)(Horsch et al.，1985)。為了實(shí)現(xiàn)該目的，在將煙草組織在10mM MgSO4和20ml MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog，1965)中于26℃培養(yǎng)60小時(shí)后將其無(wú)菌發(fā)芽培養(yǎng)物的長(zhǎng)為約2-3cm的葉片用打孔器打成直徑約1cm的葉片，然后將其與經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)的土壤桿菌培養(yǎng)物一起培養(yǎng)。然后在含有1000μg/ml頭孢氨噻的MS培養(yǎng)基中將葉片洗滌3次，然后將這些葉片鋪在含有0.5μg/ml NAA(萘乙酸)、0.2μg/ml BAP(苯甲基氨基嘌呤)以及2%蔗糖(“愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基”)以及合適選擇性試劑(例如硫酸卡那霉素)的MS平板培養(yǎng)基上，在26℃培養(yǎng)。在各種誘導(dǎo)因素條件下培養(yǎng)2周后，將葉片轉(zhuǎn)移到新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。一旦能夠分辨出小的愈傷組織后，將它們轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基相應(yīng)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，但含有0.2μg/ml NAA以及0.5μg/ml BAP。一旦再生芽達(dá)到2-3cm長(zhǎng)，為了誘導(dǎo)根，將其轉(zhuǎn)移到含1%蔗糖但無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上，并在24-26℃(光(1000-3000lux)照12小時(shí)，黑暗12小時(shí))無(wú)菌條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)4-6周后，將發(fā)芽培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)為植株，然后在溫室中合適條件下栽培該植物。
為了轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物，將剪切好的葉片在土壤桿菌懸浮液中培養(yǎng)后，進(jìn)一步在黑暗中培養(yǎng)2天。然后將葉片在含有1.6%葡萄糖、5mg/l NAA、0.1mg/l BAP和500mg/l頭孢氨噻和合適的選擇性試劑的MS平板培養(yǎng)基上，光照16小時(shí)的條件下培養(yǎng)8天。然后將葉片轉(zhuǎn)移到含1.6%葡萄糖、2.0mg/l玉米素核糖核苷，0.02mg/l NAA，0.02mg/l GA3(赤霉素)和500mg/l頭孢氨噻的MS平板培養(yǎng)基上。一旦葉片已培養(yǎng)14天后，將它們轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基平板上。約6-7周后開(kāi)始出現(xiàn)第一批愈傷組織。將已出現(xiàn)的芽轉(zhuǎn)移到放置了含有3%蔗糖和0.5mg/ml羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基的250ml玻璃燒瓶中。約14天后出現(xiàn)了第一批根。然后在溫室里合適條件下栽培植株。
基本上按照上面介紹的方法轉(zhuǎn)化蕃茄。
采用標(biāo)準(zhǔn)方法從得到的植株中分離DNA(Dellaporta et al.，1983)和RNA(Goodall et al.，1990和Chomczynski和Sacchi，1987)。通過(guò)DNA分析(“Southern印跡分析”)可以測(cè)定轉(zhuǎn)移基因的完整性及數(shù)目，以及通過(guò)RNA分析(依據(jù)Vankan和Filipowicz，1988;Goodall and Filipowiez，1989;Steinecke et al.，1992的“RNase Protection”)。測(cè)定轉(zhuǎn)錄的數(shù)量。
2.2原生質(zhì)體分離和PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將無(wú)菌培養(yǎng)的4-8周齡的煙草SR1葉切下，用蒸餾水清洗，并置于0.05%SDS溶液中，以防細(xì)菌污染。用無(wú)菌水洗滌二次，從而除去SDS，然后將葉在K3培養(yǎng)基(500mg/l頭孢氨噻、1mg/l NAA、0.2mg/l激動(dòng)素)中平衡10分鐘。將中央主脈除去后，將葉子切為大小1-2cm2的葉片。為了分離葉肉原生質(zhì)體，將葉片加至裝有30毫升含有纖維素酶和mazerozyme的酶溶液(1.5%纖維素酶，0.5% mazerozyme溶于K3培養(yǎng)基中)的1升無(wú)菌燒瓶中，并將其置于微真空中保持10分鐘。接著在27℃黑暗培養(yǎng)16小時(shí)后，以75rpm振動(dòng)混合物30分鐘。然后將該原生質(zhì)體懸液通過(guò)孔徑寬度為250和100μm的鋼篩過(guò)篩，將濾液平均分配于12ml離心管內(nèi)，并在Hettich Universal 2S離心機(jī)內(nèi)以650rpm離心5分鐘。用一個(gè)100μm玻璃毛細(xì)管將較低相與沉淀一起吸出，用10ml K3培養(yǎng)基洗滌原生質(zhì)體，在重復(fù)離心(如上所述)后再一次吸出培養(yǎng)基。隨后，在W5培養(yǎng)基(154mM NaCl、125mM CaCl2×H2O、5mM葡萄糖、5mM KCl，pH5.6)中培養(yǎng)原生質(zhì)體，在Fuchs-Rosenthal計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)，然后將其留在W5培養(yǎng)基中維持30分鐘。通過(guò)在650rpm離心5分鐘而分離開(kāi)原生質(zhì)體，將沉淀重懸于MaMg溶液(450mM甘露醇，15mM MgCl2，0.1%MES，pH5.6)中，將懸浮液濃度調(diào)至1-3×106個(gè)原生質(zhì)體/ml。然后可以直接轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體或?qū)⑵湓诒渲匈A存4小時(shí)。
為了進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將原生質(zhì)體在水浴中，45℃熱休克5分鐘，其間偶爾轉(zhuǎn)動(dòng)一下，然后立即將其置于冰/水中保持45秒而冷卻至室溫。隨后，將0.35ml體積的原生質(zhì)體懸液等分到10ml離心管中并然后向每個(gè)管中加入50μl的DNA溶液。10分鐘后再向離心管中滴加0.35ml的PEG溶液(100mM Ca(NO3)2×4H2O、400mM甘露醇、40%PEG 4000，pH7-9)，再維持20分鐘，在此期將所有樣品轉(zhuǎn)動(dòng)5分鐘，然后將轉(zhuǎn)染樣品轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。在滴加入4ml的K3培養(yǎng)基后，在27℃黑暗中將原生質(zhì)體培養(yǎng)6-48小時(shí)。保溫后將原生質(zhì)體加到已裝滿用于洗滌的海水的12ml離心管中，然后以650rpm離心3分鐘。將上清液移走至剩下1ml，然后將原生質(zhì)體重新懸浮并轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中。在13000rpm(Biofuge)離心1分鐘并小心地移走上清液后，將原生質(zhì)體溶解于恰當(dāng)?shù)奶崛【彌_液中。
成功地將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入到由上述方法制備的原生質(zhì)體中。
3.本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物增加抗性的實(shí)施例3.1.抗植物病原真菌的抗性增加將例2(上述)中列出的轉(zhuǎn)基因煙草植物XL4、XL8、XL11、XL14、XL15和XL19進(jìn)行自花授粉，選擇XL4的子代進(jìn)行下面試驗(yàn)。用植物病原真菌灰色葡萄孢作為檢測(cè)病原體。
(a)試驗(yàn)描述在溫室，23℃和70-80%相對(duì)大氣濕度條件下使煙草植物生長(zhǎng)，直至試驗(yàn)開(kāi)始。根據(jù)需要，供給其水及肥料。為了接種，將病原菌的孢子懸浮液噴在6-8周齡的植物的葉片上直至濕透葉子。隨后，將植物在有利于病原菌的條件，即20℃和100%相對(duì)大氣濕度的條件下保溫。4天后，根據(jù)感染葉片面積以百分?jǐn)?shù)計(jì)確定葉片的健康狀況。分清葉片生長(zhǎng)期(葉1期＝最老葉，葉6期＝最嫩葉)。
(b)測(cè)試結(jié)果
<p>3.2抗病毒抗性的增加將列于例2(上文)中的轉(zhuǎn)基因煙草植株XL4、XL8、XL11、XL14、XL15和XL19自花授粉，選擇XL4和XL8的純合子代(XL4.24和XL8.28)進(jìn)行下面的試驗(yàn)。
以各種tospovirus，以及其他科的病毒作為試驗(yàn)用病原體。
(a)試驗(yàn)描述將煙草植株在溫室中23℃和70-80%相對(duì)大氣濕度條件下生長(zhǎng)，直至試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)使用。按照需要供應(yīng)水和肥料。
從已經(jīng)用TSWV分離物L(fēng)3(DSM NOPVO182)感染3周的煙草植株(Nicotiana rustica L.)上采集顯示有明顯病毒癥狀的初次感染葉片的3克葉材料;然后將葉放在研缽中在30ml標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(0.1M Na-K磷酸鹽緩沖液，pH7.0，含有0.2%聚乙烯吡咯烷酮MW10000和0.2%(W/V)Na2SO4)中均勻化。使用時(shí)將該葉材料處理成二種形式，即未稀釋的原材料及用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液稀釋的1∶25稀釋液，然后在各種情況下通過(guò)機(jī)械磨擦葉片的辦法以每片葉為0.1ml上述葉材料的量施給約8-10周齡的試驗(yàn)植株的3片葉的每片葉上。這些試驗(yàn)植株曾經(jīng)用研磨料(金鋼砂，600目)磨擦過(guò)，并且一旦已進(jìn)行接種即將它們用自來(lái)水漂洗。
在接種后從第5天開(kāi)始，在14天的時(shí)期內(nèi)，按照等級(jí)評(píng)價(jià)方案，肉眼觀察評(píng)估植株上產(chǎn)生的癥狀。在感染葉片上和通過(guò)內(nèi)吸作用在非感染葉片上出現(xiàn)了感染癥狀。
等級(jí)0＝無(wú)癥狀等級(jí)1＝輕微癥狀，在葉片上有菌環(huán)狀點(diǎn)(壞死)等級(jí)2＝嚴(yán)重癥狀，脈紋顯黃色，花葉，頂梢枯死的癥狀。
利用等級(jí)數(shù)值引出平均等級(jí)數(shù)值，然后將該級(jí)別與對(duì)照植株的等級(jí)數(shù)值相比較。
為了進(jìn)一步對(duì)植株的抗性進(jìn)行定量，使用一種三抗體夾心(TAS)ELISA方法測(cè)定TSWV抗原的量。為了該目的，用每井孔0.1ml的多克隆抗血清(DSM NO.，AS-0105，2μg/ml)包被Greiner微滴平板(655001型)。將初次感染和繼發(fā)性感染的試驗(yàn)植株的葉進(jìn)行擠壓，使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA緩沖液將其擠壓出的汁液制成1∶30和1∶500兩種稀釋液。然后對(duì)于各種情況，將各種樣品(0.1ml)上樣到該平板的3個(gè)井孔中，然后將平板在4℃保溫過(guò)夜。在平板已用PBS-吐溫洗滌三次后，向每個(gè)孔中加入1∶1000稀釋的兩種單克隆抗體4F2和2B6(Adam et al.，1991)的0.1ml溶液，將平板置于37℃時(shí)保溫3小時(shí)。在用PBS吐溫將平板洗滌三次后，向每個(gè)孔中加入以1∶1000稀釋的兔抗-小鼠IgG結(jié)合物(DAK Diagnostica GmbH，NO.D314)的0.1ml溶液，并將平板在37℃時(shí)保溫3小時(shí)。用PBS吐溫將該平板洗滌三次后，加入底物對(duì)-硝基苯基磷酸鹽(1mg/ml)，并且在30分鐘及1小時(shí)后，用光度計(jì)檢測(cè)450nm處消光值。利用該消光值確定平均消光值，然后將該平均值與對(duì)照測(cè)量值進(jìn)行比較。結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因植物沒(méi)有癥狀而對(duì)照植物顯示有嚴(yán)重癥狀。除此以外，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中TSWV抗原的量(根據(jù)單克隆抗體(Mab 2B6)反應(yīng)而檢測(cè))明顯地低于對(duì)照植株的量。
(b)試驗(yàn)結(jié)果
用其他各種tospovirus分離物轉(zhuǎn)染的XL4.24轉(zhuǎn)基因植株的生物試驗(yàn)(a)試驗(yàn)描述栽培轉(zhuǎn)基因植株XL4的純合子代(XL4.24)直至它們長(zhǎng)成4葉期。
隨機(jī)地將植株收集成組，每組20株，并用機(jī)械磨損方法將從感染了各種tospoviruses的煙草植株得到的勻漿接種到植株上。使用下列病毒分離物進(jìn)行接種TSWV-花生＝SA05(DSM NO.PV-0205);INSV(DSM NO.PV-0280);INSV(DSM NO.PV-0281)。用作為分離接種物的植株已先接種了10-14天。并且根據(jù)電子顯微鏡觀察結(jié)果，這些植株未受其他病毒污染。為了制備接種物，使用標(biāo)準(zhǔn)DSM接種緩沖液(DSM植物病毒目錄)，勻漿化方法是用研缽和研棒以及以1∶30(g/ml)比例完成的。用無(wú)菌玻璃抹刀將接種物抹在已用金鋼砂(600目)擦過(guò)的試驗(yàn)植株葉上。每個(gè)試驗(yàn)植株的兩片最老的次級(jí)葉片被接種。接種后，將感染葉片用自來(lái)水漂洗。然后在上面介紹的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)這些植株，并且每天觀察評(píng)估癥狀。作為對(duì)照，非轉(zhuǎn)化的煙草以同樣方式進(jìn)行生長(zhǎng)并且同樣接種各種病毒分離物。
在接種以后一周和三周時(shí)由兩個(gè)觀察者觀察實(shí)驗(yàn)并將結(jié)果最后按等級(jí)劃分。當(dāng)評(píng)估值有差異時(shí)，取較不利的數(shù)值。結(jié)果概括于表1中。在成功地進(jìn)行感染后，TSMV花生(SA-05)分離物在感染葉片上引起局部壞死并且產(chǎn)物嚴(yán)重的全株癥狀，包括葉片畸形和新形成的、通過(guò)內(nèi)吸作用感染的葉片的壞死，而兩種INSV分離物僅使接種葉片形成局部壞死，而不出現(xiàn)向新形成的葉片的內(nèi)吸擴(kuò)散現(xiàn)象。對(duì)于TSWV-花生來(lái)說(shuō)，當(dāng)進(jìn)行等級(jí)評(píng)估時(shí)，將通過(guò)內(nèi)吸作用感染的試驗(yàn)植株和那些僅顯示局部初級(jí)癥狀的植株都當(dāng)作是進(jìn)行了成功感染。因?yàn)榻?jīng)驗(yàn)告訴我們?cè)诤笠环N情況中全株癥狀的出現(xiàn)是延遲的且隨時(shí)間推移將會(huì)出現(xiàn)這種全株癥狀。對(duì)于兩種INSV分離物來(lái)說(shuō)，僅僅當(dāng)出現(xiàn)局部初級(jí)癥狀時(shí)即作為成功感染的證據(jù)。
表1檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草XL4系(XL4.24)對(duì)TSWV-花生和其他各種INSV分離物的抗性;

使用不屬于本雅病毒分離物XL 4.24轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生物檢測(cè)(a)試驗(yàn)描述種植轉(zhuǎn)基因植株XL4的純合子代(XL4.24)，直到它們生長(zhǎng)到四葉期。
隨機(jī)收集植株將它們按20株為一組進(jìn)行分組，并且采用機(jī)械方法將來(lái)自感染了各種病毒的煙草植株的勻漿物接種到植株上。使用下列的病毒分離物進(jìn)行接種TMV(DSM No.PV-0055)和煙草脆裂病毒(DSM No.PV-0043)。用于分離接種物的植株已先接種了10-14天，并且基于電子顯微鏡觀察結(jié)果，沒(méi)有被其他病毒污染。為了制備接種物，使用標(biāo)準(zhǔn)DSM接種緩沖液(DSM植物病毒目錄)，并用研缽和研棒，按1∶30(g/ml)的比例將接種物勻漿化。使用無(wú)菌玻璃抹刀將接種物抹在試驗(yàn)植株葉上，該葉片已用金剛砂(600目)摩擦。對(duì)各個(gè)試驗(yàn)植株的兩個(gè)最老的次級(jí)葉片接種。接種之后，將感染的葉片用自來(lái)水漂洗。隨后在上面介紹的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)植株并且每天觀察評(píng)估癥狀。作為對(duì)照，非轉(zhuǎn)化的煙草植株按同樣方法生長(zhǎng)并且用各種分離物進(jìn)行接種。
接種后在一周和三周時(shí)由兩名觀察者觀察實(shí)驗(yàn)并將結(jié)果最后按等級(jí)劃分;假如評(píng)估數(shù)不相同，取較不利的數(shù)值。用兩類病毒感染時(shí)在對(duì)照植物的初次感染的葉上產(chǎn)生局部壞死，該對(duì)照植物用TRV感染時(shí)還產(chǎn)生嚴(yán)重的全株癥狀。對(duì)于TMV來(lái)說(shuō)，在轉(zhuǎn)基因XL4.24植株中觀察到的局部損傷明顯降低。對(duì)于煙草脆裂病毒，對(duì)照植株中有14%僅在初次感染的葉上產(chǎn)生壞死，而86%還顯示有全株癥狀。與之相反，28%的轉(zhuǎn)基因植株完全沒(méi)有感染，而36%僅有初級(jí)壞死，并且僅36%的植株還有全株癥狀。
⒊3 對(duì)植物病原線蟲(chóng)的抗性的提高(a)試驗(yàn)描述在溫室中23℃和70-80%相對(duì)大氣溫度的條件下生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因煙草植株(XL4)直到試驗(yàn)開(kāi)始。在移植幼苗后，在土壤中栽培植株，以便確保一個(gè)發(fā)育特別完好的根系統(tǒng)。根據(jù)需要供給水和肥料。用吸管吸取存活的剛孵化的Meloidogyne incognita(LⅡ)的幼蟲(chóng)以每100ml土壤體積約300個(gè)幼蟲(chóng)的比例均勻地播在土壤表面而對(duì)約15cm高的植株進(jìn)行接種。在接種后4周通過(guò)測(cè)定每個(gè)根系統(tǒng)上蟲(chóng)癭數(shù)而進(jìn)行等級(jí)評(píng)定。
與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株顯示出抗線蟲(chóng)的增大的抗性。
在本說(shuō)明書(shū)中，除另有說(shuō)明，%數(shù)值是指重量百分?jǐn)?shù)，并除另有說(shuō)明，稀釋度是指體積的份數(shù)(例如1∶25)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名Bayer AG(B)街道Bayerwerk(C)城市Leverkusen(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵編5090(G)電話號(hào)碼0214/30 61285(H)傳真0214/30 3482
(Ⅰ)電傳85 101-265 by d(ⅱ)申請(qǐng)名稱脫氧核糖核酸(ⅲ)序列數(shù)18(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)工具類型floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release＃1.0，Version ＃ 1.25(EPA)(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1040個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)長(zhǎng)度36..989(xi)序列描述SEQ ID NO1

(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度318個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度439個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3 (2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度226個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4
(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1722個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)長(zhǎng)度475..1428(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5

(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度318個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6
(2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度152個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股
(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)長(zhǎng)度36..152(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7 (2)SEQ ID NO8的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8
(2)SEQ ID NO9的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)長(zhǎng)度1..36(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9AGA ATT CGA GCT CGG TAC CCA CCC GAT CCT CTA GAG TC 38.
Arg Ile Arg Ala Arg Tyr Pro Pro Asp Pro Leu Glu1 5 10(2)SEQ ID NO10的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10Arg Ile Arg Ala Arg Tyr Pro Pro Asp Pro Leu Glu1 5 10
(2)SEQ ID NO11的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度850個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)長(zhǎng)度2..799(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11
(2)SEQ ID NO12的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度266個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12
(2)SEQ ID NO13的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股
(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13GGGGATCCTC TAGAGTC 17(2)SEQ ID NO14的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14TGTGTTGAGT TTTTATATTT TCCTCTCCAA AIGAAA 36.
(2)SEQ ID NO15的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15AGAGG 5
(2)SEQ ID NO16的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16AAAATAT 7(2)SEQ ID NO17的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17GTCAGTGGCT CCAATCCTGT CTGAAG 26.
(2)SEQ ID NO18的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18TGTCGAGAAT TCGAGCTCGG TAC 23.
權(quán)利要求
1.重組脫氧核糖核酸(DNA)，其特征在于它們是由下列組分結(jié)合而成，或含有這些組分(a)來(lái)源于梅痘病毒(PPV)的RNA的雙鏈cDNA片段(“片段A”)，以及(b)來(lái)源于蕃茄斑萎病毒(TSWV)的N結(jié)構(gòu)基因的SRNA的雙鏈cDNA片段(“片段B”)，為了結(jié)合的需要，除了含有可任選存在的其他DNA片段外，還可含有在植物細(xì)胞中有活性的一個(gè)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能調(diào)節(jié)重組DNA片段的轉(zhuǎn)錄。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中片段B定位于片段A之后(即在3′方向)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中片段A是一種具有列于SEQ ID NO7中的序列的DNA，或是一種有相同效果的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中片段B是一種具有列于SEQ ID NO11中的序列的DNA，或是一種具有相同效果的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它含有列于SEQ ID NO7和SEQ ID NO11中的DNA片段的結(jié)合物或者含有相同效果的DNA結(jié)合物，或是由這樣一種結(jié)合物構(gòu)成的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它含有一種在植物體中有活性的啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它含有一種具有CaMV 35S啟動(dòng)子序列的DNA或具有相同效果的一種DNA作為啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中片段A和B通過(guò)一個(gè)有最多至134個(gè)堿基對(duì)的合成cDNA片段(“片段C”)相連接，其中后一片段將起始于片段A的開(kāi)放式閱讀框架連接到片段B上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中A和B cDNA片段通過(guò)有根據(jù)SEQ ID NO9的序列的合成DNA片段或通過(guò)有相同效果的一個(gè)DNA相連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中在片段B之后，它含有一個(gè)具有1-30個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA片段(“片段D”)或具有相同效果的一個(gè)DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中在片段B之后，它含有一個(gè)根據(jù)SEQ ID NO13的雙鏈DNA片段，或有相同效果的一個(gè)DNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它含有一個(gè)3′非轉(zhuǎn)譯DNA，該DNA或者直接接在片段B之后或者通過(guò)一個(gè)雙鏈DNA片段(片段D)連接到片段B上。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它含有一個(gè)3′非轉(zhuǎn)譯DNA，該DNA或者直接連接在片段B之后或者通過(guò)一個(gè)雙鏈DNA片段(片段D)，即具有根據(jù)SEQ ID NO4的序列的3′非轉(zhuǎn)譯DNA而連接到片段B上。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它是由具有列于SEQ ID NO1中的序列的DNA組成，或由具有相同效果的DNA組成，或含有該序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它是由具有列于SEQ ID NO5的序列的DNA組成，或由具有相同效果的DNA組成，或含有該序列。
16.病毒或原核DNA，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
17.植物的DNA，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
18.含有權(quán)利要求1所述的DNA的載體。
19.含有權(quán)利要求1所述DNA的宿主生物體。
20.權(quán)利要求1所述重組DNA的應(yīng)用，用于生產(chǎn)具有增大的抗有害生物體或植物病害的抗性的植物、植物各部分和植物細(xì)胞(包括繁殖材料)。
21.制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物的方法，其特征在于使用常規(guī)方法將權(quán)利要求1所述的重組DNA插入到植物細(xì)胞或植物的基因組中。植物細(xì)胞可任意再生得到植物，植物可任意地進(jìn)行繁殖，以及可任意生產(chǎn)更多的植物，轉(zhuǎn)基因植物的基因組與后續(xù)植物的基因組相結(jié)合，并且繁殖子代。
22.含有權(quán)利要求1所述重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物體和其各部分，以及繁殖材料。
23.含有根據(jù)SEQ ID NO2或6的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物體和其各部分，以及繁殖材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的重組脫氧核糖核酸(DNA)、含有該重組DNA的載體和宿主生物體、含有該重組DNA并且具有增大的抗有害生物體和植物病害的抗性的轉(zhuǎn)基因植物，其中該重組DNA的特征在于它們是由下列各成分或含有在各種情況下都具有相同功效的一個(gè)DNA的成分結(jié)合而成，或者含有所述組分(a)來(lái)源于梅痘病毒(PPV)的RNA的一個(gè)雙鏈cDNA片段(“片段A”)，以及(b)來(lái)源于蕃茄斑萎病毒(TSWV)的S RNA的一個(gè)雙鏈cDNA片段(“片段B”)，為了結(jié)合的需要，除了含有可任選存在的其它DNA片段外，還可含有在植物細(xì)胞中有活性的一個(gè)啟動(dòng)子。
文檔編號(hào)C07K14/08GK1098744SQ9410615
公開(kāi)日1995年2月15日 申請(qǐng)日期1994年5月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月28日
發(fā)明者P·H·施賴埃爾, K·施滕策爾, G·阿當(dāng), E·邁斯 申請(qǐng)人:拜爾公司