專利名稱：1-脫氨基-8-d-精氨酸抗利尿激素的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制造治療尿頻的高純1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素的新方法。該方法包括將MPa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH(SEQ ID NO1)與(R3)-D-Arg(HCl)-Gly-NH2縮合和氧化所產(chǎn)生的肽。
激素類似物1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(1-β-巰基丙酸-8-D-精氨酸)-抗利尿激素或去氨加壓素以下簡稱為“DDAVP”為治療諸如尿崩癥，夜遺尿和尿失禁引起的尿頻的重要抗利尿藥。
在本申請中1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(仍然被稱為九肽衍生物)與天然的垂體神經(jīng)部抗利尿激素不同，它是用1-β-巰基丙酸代替末端的甲硫氨酸并用D-精氨酸代替精氨酸而得到的。同樣，合成的起始原料和中間體稱為n肽衍生物，其中n為在相應(yīng)的肽中的氨基酸和假氨酸殘基的總數(shù)。
佐拉(Zaoral)等的美國專利3,497,491描述了合成DDAVP的均相法，庫切克V和佐拉M在1979，Coll.Czechoslov.Chem Com-mun.441173—1178中描述了固相法。然而，用現(xiàn)在已知的工藝方法僅得到無定形的1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素，因而難以純化。作為治療應(yīng)用，諸如具升壓活性的雜質(zhì)會導(dǎo)致并發(fā)癥。
在已知技術(shù)中收率可能是以犧牲純度來提高的，反之亦然，且產(chǎn)品分子越大，純化就越困難成本也越高。醫(yī)藥領(lǐng)域要求高純的優(yōu)質(zhì)品，因此目前一般強(qiáng)調(diào)純度。然而，目前已知的方法要求過多的純化步驟，不可避免地會使收率減少。提純需化人工，并使產(chǎn)品收率明顯減少，因而提高了成本。
因此，生產(chǎn)DDAVP的合成路線需要有一種工藝使其中合成的最后步驟的收率得到提高。這將減少對中間體和產(chǎn)品的高成本的提純的要求和提供高收率的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。同時(shí)需要有一種DDAVP經(jīng)改進(jìn)的相對不復(fù)雜的生產(chǎn)方法，其中，較少生成具升壓或其它不需要的生理作用的雜質(zhì)，或更易在提純步驟中除去。
本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)率地生產(chǎn)高純度的1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素的新方法。
另一個(gè)目的是提供一種簡單、經(jīng)濟(jì)的方法，通過在最終步驟中避免復(fù)雜、昂貴的提純過程而高產(chǎn)率地生產(chǎn)高純度的DDAVP。
本發(fā)明的一種合成1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)的方法，其特征在于包括下列步驟(a)制備七肽MPa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH(II)(SEQ IDNO1)，或中R1和R2為巰基保護(hù)基，可以相同或者不同；(b)將步驟(a)的七肽與二肽(R3)-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(III)縮合，式中R3為對酸敏感的氨基保護(hù)基；(c)形成九肽；MPa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Ary(HCl)-Gly-NH2(IV)(SEQ ID NO1)以及(d)將步驟(c)的九肽在質(zhì)子性溶劑中用碘氧化。
在步驟(a)中制備七肽的較佳方法為通過三肽MPa(R1)-Tyr-Phe-X(V)(式中X為在Phe的羧基中取代羥基(-OH)的反應(yīng)性基團(tuán))與四肽(R3)-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH(VI)縮合。
巰基保護(hù)基R1和R2可以相同或彼此獨(dú)立，可為乙酰胺基甲基(Acm)，叔丁基，叔丁基亞磺酸基，對甲基芐基，對甲氧基芐基，2-(3-硝基吡啶亞磺?；?，乙基氨基甲酰基，三苯基甲基或9-芴基甲基。
本發(fā)明的較佳的一個(gè)具體實(shí)施方案中，巰基保護(hù)基R1的R2兩者為乙酰胺基甲基。在本發(fā)明的另一較佳的具體實(shí)施方案中，氨基保護(hù)基R3為N-叔丁氧基(BOC)。
更佳的反應(yīng)基X為活化的羧酸酯，諸如，對硝基苯酚或羥基琥珀酰亞胺的酯，或者是非活化的羧酸酯，諸如，甲酯、乙酯或芐酯，或者是疊氮化物，于是，反應(yīng)基X可以是烷氧基，芳氧基或疊氮基，而較佳的烷氧基為琥珀酰亞胺氧基，較佳的芳氧基為對硝基苯氧基。
在上述的方法中，步驟(d)的在低于pH5.0，較佳是在pH2.5—4.3之間用I2進(jìn)行氧化。
本方法在步驟(d)用I2氧化后，即在所有的合成完成之后，不經(jīng)中斷即將反應(yīng)混合物進(jìn)行提純。一條較佳的提純路線為通過離子交換色譜在一種用酸平衡的陽離子交換樹脂上進(jìn)行純化。純化所用的較佳的離子交換樹脂為含磺酸基的。提純可以進(jìn)一步深化例如，采用附加的凝膠色譜步驟。
根據(jù)本發(fā)明，同時(shí)揭示了按照本發(fā)明方法制備的高純度的DDAVP以及將它用于治療尿崩癥、夜遺尿的尿失禁引起的尿頻。
本發(fā)明將通過不起限定作用的具體實(shí)施例，更詳細(xì)地加以說明，其中R1和R2兩者為乙酰胺基甲基，R3為N-叔丁氧基，X為-NHNH2。實(shí)施例1Boc-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH(X)BocCys(Acm)ONp從BocCys(Acm)OH(Novabiochem，Lufelingen，CH)和對硝基苯酚通過與N，N＇二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)在乙酸乙酯中反應(yīng)制得，無需提純而將它與H-Pro-OH在DMF/乙酸乙酯/水中于0℃在pH中性時(shí)加入Et3N反應(yīng)制備Boc-Cys(Acm)-Pro-OH(XII)。收率81％。
純度＞95％(TLC).
將XII在HCl/HOAC中于室溫下除去保護(hù)基，將由此得到的粗H-Cys(Acm)-Pro-OH·HCl溶解在DMF中，并用Et3N中和，并加入Boc-AsD-ONp(Novabiochem，Lufelingen，CH)于—5℃并保持pH為中性。得到Boc-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH(XIII)以81％的產(chǎn)率分離得XIII?！拨痢矰20＝－77。1°(1g/100ml DMF)。四肽衍生物X由XIII和Boc-Gln-ONp(Novabiochem，Laufeligen，CH)以相應(yīng)于從XII和Boc-Asn-ONp制備XIII的方法來制備。收率78.5％，〔α〕D20＝－89.7°(1g/100ml H2O)。實(shí)施例2Mpa(Acm)-Tyr-Phe-NHNH2(XI)通過H-Tyr-OEt·HCl與Mpa(Acm)-OH(Bachem AG，CH)以及DCC在含有1-羥基苯并三唑(HOBt)的DMF中于0℃并維持pH7(用Et3N)進(jìn)行反應(yīng)，制備Mpa(Acm)-Tyr-OEt(XIV)。收率48％。通過酯XIV與H-Phe-N2H3在DMF/H2O中用α-糜蛋白酶催化進(jìn)行反應(yīng)，制備酰胼XI，收率90％；m.p.240—242℃。實(shí)施例3Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH(VII)(SEQ ID NO1)將Boc-Gln-Asn-Cys(Asm)-Pro-OH(X)(11.7克)溶于56ml三氟乙酸(TFA)中，在室溫保持1小時(shí)后蒸除三氟乙酸。將殘留物溶解在19ml二甲基甲酰胺(DMF)中并冷卻之，用Et3N調(diào)節(jié)至pH7。將Mpa(Acm)-Tyr-Phe-NHNH2(XI；11.0g)溶解在115mlDMF中，將此溶液冷卻至-18℃加入HCl/乙酸乙酯(15.8ml；3.2M)，并將此溶液保持在-15℃，加入亞硝酸異戊酯(3.5ml)，并將此溶液在約-10℃攪拌15分鐘，冷卻至-20℃后將pH用Et3N調(diào)節(jié)至7。
加入除去保持基的四肽在DMF中的溶液，并于-5℃攪拌。在反應(yīng)實(shí)際上完全后(用TLC確定除去保護(hù)基的肽有99.5％)，過濾除去析出的鹽，通過真空蒸發(fā)使體積減少至60ml。加入EtOH(99.5％，21.5ml)并得此溶液加熱至60℃。然后冷卻至環(huán)境溫度，將pH用濃鹽酸調(diào)節(jié)至2.5。將沉淀濾出，用99.5％EtOH洗滌，干燥得到17.6克白色結(jié)晶，收率85％，m.p.188—191℃。實(shí)施例4Boc-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(VIII)將H-Gly-NH2·HCl(2.6g)和1-羥基苯并三唑(HOBt；3.3g)懸浮在34ml DMF中，并將此溶液冷卻至10℃。加入Et3N(2.0ml)，將此混合物攪拌15分鐘。加入Boc-D-精氨酸(HCl)(6.8g)，并將溫度降至0℃。將溶解在4.5mlDMF中的DCC(4.5g)加入，并用Et3N調(diào)節(jié)pH至6.0，轉(zhuǎn)化完全后，過濾除去形成的沉淀，濾液真空蒸發(fā)之。
將殘留物溶解在80ml水中，將此溶液冷卻至0℃，并用1M HCl調(diào)節(jié)pH至3。通過過濾除去HOBt后，該溶液用二氯甲烷萃取。將水相在真空下與丁醇(4X)共沸蒸餾濃縮至20ml的體積，加入BuOH使它的體積成為68ml。此溶液用含1O％NaCl(W/W)和5％丁醇(v/v)的0.1M HCl萃取，然后通過蒸餾將體積減少至一半。
用丁醇重復(fù)共沸蒸餾，并通過過濾除去NaCl后，將此溶液傾入過量八倍(v/v)的醋酸異丙酯中，通過過濾收集沉淀并用醋酸異丙酯洗滌。得到的化合物VIII為白色無定形粉末；產(chǎn)量6.8克(90％)，〔α〕D20＝4.3°。實(shí)施例5Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(IX)，(SEQ ID NO.1)將Boc-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(VIII)(6.8g)溶解在23ml乙酸中，并加入20ml HCl/HOAC(2.2M)，于室溫下攪拌1.5小時(shí)后，在減壓下蒸發(fā)此溶液，將殘留物溶解在30ml DMF中。通過加入二甲苯(31ml)使除去保護(hù)基的二肽以油滴析出。傾潷去上層清液后，殘留物用二甲苯洗滌，并在真空下除去殘存的溶劑。將殘留物溶在110ml DMF中，并將此溶液冷卻至-10℃，通過加入Et3N將pH調(diào)節(jié)至7.5。
將Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH(VII)(SEQ ID NO1)(14g)和2.1g HOBt溶解于65ml DMF中，并將在前一步驟中得到的在DMF中的除去保護(hù)基的二肽H-D-Arg(HCl)-Gly-NH2和計(jì)算量的DCC加入。在90％轉(zhuǎn)化(TLC)后濾除DCU，將濾液體積減少至100ml，加熱至60℃，傾入310mlEtOH/EtOAC(85∶15，v/v)中。
過濾收集沉淀并用EtOH/EtOAC(85∶15)洗滌。得到的化合物IX為白色粉末(產(chǎn)量15.5克，84.9％)，m.p.182-185℃(純度94.5％(HPCL)。實(shí)施例61-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素Mpa-Tyr-Phe-GIn-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2(I)(醋酸鹽)(SEQ ID NO2)將10克Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(IX)(SEQ ID NO1)溶解在10立升乙酸/水(1∶9，v/v)中。通過滾柱泵加入溶于80ml乙醇的2克碘將被保護(hù)的九肽衍生物IX于室溫下氧化，進(jìn)料速度通過紫外監(jiān)測器控制，以保持反應(yīng)介質(zhì)中游離碘的量很低。IX的轉(zhuǎn)化率通過高速HPLC監(jiān)控。在IX全部消耗后黃色將持續(xù)。
將含有該產(chǎn)物的反應(yīng)溶液通過裝有1.6立升用含水乙酸平衡的S-Sepharose FF(Pharmacia，瑞典)的短玻璃柱。用0.08M NH4Ac/AcOH緩沖液(24立升，pH4.1；各流份用HPLC監(jiān)測)洗提1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)。將含DDAVP(I)純度＞99％(不計(jì)緩沖液的成分)的流份合并。含有純的標(biāo)題化合物的醋酸鹽的溶液通過反滲透濃縮，并冷凍干燥。得到白色松散粉末。
DDAVP(I)在Sephader G25上(0.1M乙酸)經(jīng)凝膠過濾進(jìn)一步純化。接著用HPLC分析各個(gè)流分，含純產(chǎn)品的流份合并后冷凍干燥。得到純度＞99％的DDAVP(I)的二醋酸鹽產(chǎn)量約5克，為白色松散粉末，收率53％。實(shí)施例7將按照實(shí)施例1—6制備的DDAVP與用已知的均相工藝制備的1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素進(jìn)行比較試驗(yàn)。
按照美國專利3,497,491的均相方法，DDAVP的合成總收率(從β-巰基丙酸起)為5.0％。按照本發(fā)明方法制備的1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)的總收率〔包括Mpa(Acm)-OH的制備〕為7.0％，提高40％。按照本發(fā)明的方法，采用自β-巰基丙酸起始的合成路線〔包括制備Boc-Cys(Acm)-OH〕生產(chǎn)1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)的總收率為10.7％。
更重要的是根據(jù)本發(fā)明在最后三步中得到高的收率即化合物X為38％和化合物VIII為45％。在已知的典型工藝中最后三個(gè)步驟的收率約為8.5％—17％或約10—20％的范圍，在工藝的經(jīng)濟(jì)性方面，在最終幾步損失的產(chǎn)物比初始階段更值錢，因此本發(fā)明的方法降低成本為更有效。
根據(jù)本發(fā)明的方法提供的DDAVP不僅在收率上比已知的均相法高得多，而且在純度上也高得多。
在美國專利3,497,491中缺少最終產(chǎn)品純度的精確信息，它沒有提供最終產(chǎn)品純DDAVP的含量，而僅給出用于確證結(jié)構(gòu)的元素和氨基酸分析的結(jié)果。另外，旋光度原則上可以很精確地測量，但其中所述的值〔α〕D25＝－65±2°并無用處。
然而，在美國專利3,497,491的表中第3欄中關(guān)于升壓反應(yīng)的信息可用于純度的估計(jì)。按照美國專利3,497,491制備的1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)據(jù)說具有可測量的升壓副反應(yīng)。最近的研究表明如果經(jīng)過仔細(xì)純化，1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)實(shí)際上不具有這種升壓活性。然而，按照目前已知的方法進(jìn)一步進(jìn)行這種提純，可能在收率上作出犧牲。
依照已知方法制備的產(chǎn)品中含有的雜質(zhì)導(dǎo)致的升壓副反應(yīng)，包括藥理學(xué)并發(fā)癥如高血壓。因此，“純度”包括二個(gè)方面，首先是在最終產(chǎn)物中活性DDAVP的實(shí)際含量，其次是沒有醫(yī)學(xué)上有害的雜質(zhì)。按照本發(fā)明的方法制備的1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)，實(shí)際上是沒有這類潛在的有害雜質(zhì)的。
在此已詳細(xì)說明了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以變更本工藝中的各個(gè)步驟，所用的試劑和各種反應(yīng)條件，并得到類似的結(jié)果，而這類變更包括在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。
順序錄(i)一般信息(ii)順序數(shù)2SEQ ID NO1的信息(i)順序特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)形狀線狀(ii)分子類型肽(iii)順序說明SEQ ID NO1Tyr-Phe-Gln-AsnSEQ ID NO2的信息(i)順序特征
(A)長度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)形狀線狀(ii)分子類型肽(iii)順序描述SEQ ID NO2Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro
權(quán)利要求
1.合成1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素的方法，其特征在于包括以下步驟(a)制備七肽Mpa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH(SEQ ID NO1)式中R1和R2為巰基保護(hù)基，(b)將步驟(a)的七肽與二肽(R3)-D-Arg(HCl)-Gly-NH2縮合，式中R3為對酸敏感的氨基的保護(hù)基；(c)形成九肽Mpa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-(HCl)-Gly-NH2(SEQ ID NO1)以及(d)將步驟(c)的九肽在質(zhì)子性溶劑中用碘氧化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的巰基保護(hù)基R1和R2可以相同或彼此獨(dú)立，可選自包括乙酰胺基甲基，叔丁基，叔丁基亞磺酰基，對甲基芐基，對甲氧基芐基，2-(3-硝基吡啶亞磺酰基)，乙基氨基甲?；?，三苯基甲基和9-芴基甲基的一組基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的巰基保護(hù)基R1和R2兩者都是乙酰胺基甲基。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的氨基保護(hù)基R3為N-叔丁氧基。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的制備七肽的步驟包括將三肽Mpa(R1)-Tyr-Phe-X(式中X為在Phe的-COOH中取代羥基的反應(yīng)性基團(tuán))與四肽R3-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH發(fā)生縮合。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的反應(yīng)性基團(tuán)X選自包括烷氧基、芳氧基和疊氮基的一組基團(tuán)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的烷氧基為琥珀酰亞胺基氧基。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的芳氧基為對硝基苯氧基。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的用碘氧化的步驟(d)在pH低于5.0時(shí)進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述的用碘氧化的步驟(d)在pHl.5—4.3之間進(jìn)行。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于自步驟(d)所得的含有所述的已被氧化的九肽的反應(yīng)混合物用經(jīng)酸平衡的陽離子交換樹脂的離子交換色譜法純化。
12.按照權(quán)利要求1的方法制備1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(DDAVP)。
13.治療尿頻的方法，其特征在于包括給予治療劑量的按照權(quán)利要求12制備的1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(DDAVP)。
14.按照權(quán)利要求1的方法制備的含有如下結(jié)構(gòu)的化合物Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2(SEQ IDNO2)。
15.一種尿頻的治療系統(tǒng)，其特征在于包括使用權(quán)利要求14的化合物的一種合適的給藥系統(tǒng)。
16.治療尿頻的方法，其特征在于包括給予治療劑量的權(quán)利要求14的化合物。
全文摘要
一種制備1-脫氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(DDAVP)的方法，包括將Mpa(R
文檔編號C07K1/107GK1125952SQ9419259
公開日1996年7月3日 申請日期1994年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月29日
發(fā)明者B·A·K·拉松, T·B·梅爾白蘭特, E·M·B·莫爾斯塔姆, J·A·I·羅斯徹斯特, J·A·舍爾德貝克 申請人:凡林有限公司