專利名稱：分離百日咳桿菌保護(hù)性組分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離百日咳桿菌保護(hù)性組分的方法。通過(guò)適當(dāng)混合由本發(fā)明方法分離的保護(hù)性組分，可以制備百日咳組分疫苗。
疫苗被廣泛地用于防止傳染病。百日咳，一種因感染百日咳桿菌而引起的傳染性呼吸疾病，由于窒息性(apneic)咳嗽同時(shí)偶爾伴有痙攣可能嚴(yán)重地影響患者，特別是嬰兒。為了治療這種疾病，實(shí)踐中均是使用滅活后的百日咳桿菌全培養(yǎng)細(xì)胞(滅活的疫苗)。但是，已經(jīng)報(bào)告了在接種位點(diǎn)的定位反應(yīng)和副反應(yīng)，如發(fā)燒，從而社會(huì)上急需解決此問(wèn)題。為了解決該問(wèn)題， 已經(jīng)進(jìn)行了許多使用從百日咳桿菌中分離的保護(hù)性組分作為疫苗的嘗試。例如，通過(guò)從百日咳桿菌中提取保護(hù)性蛋白質(zhì)，如百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)，除去內(nèi)毒素(ET)而制備無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗(ACP疫苗)，但由于下述缺陷而并不完全令人滿意。
用相應(yīng)的方法分離了百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)，(所有均是已經(jīng)在實(shí)踐應(yīng)用中有效的百日咳桿菌保護(hù)性組分)。
用人結(jié)合珠蛋白作為配體的親和層析可分離百日咳毒素(PT)[Biochimica et Biophysica Acta，Vol.580，p.175(1979)]。但是由于人結(jié)合珠蛋白是從人血中收集的，因此可能受到肝炎病毒的污染；使用動(dòng)物血清時(shí)有相同的問(wèn)題。另一種方法是使用變性的血漿銅藍(lán)蛋白作為配體的親和層析(日本未審查專利No.62135/1987)。盡管該方法沒(méi)有病毒污染的問(wèn)題，但產(chǎn)生了其他一些問(wèn)題，包括血漿銅藍(lán)蛋白和硫氰酸鈉的高毒性和強(qiáng)身體滯留以及有蛋白質(zhì)變性作用的其他洗脫劑的污染疫苗。
就百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(PHA)來(lái)說(shuō)，可利用的是使用羥基磷灰石的純化方法[Infection and Immunity，Vol.41，p.313(1983)and EP-A-231083，EP-A-427462，EP-A462534；日本未審查專利Nos.234031/1987，169893/1992，368337/1993]。但是該方法要花長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行柱操作而且由于羥基磷灰石的高成本而不經(jīng)濟(jì)。
就pertactin(PRN，69K-OMP)來(lái)說(shuō)，使用小鼠血清作為配體進(jìn)行親和層析[Infection and Immunity，Vol.56，p.3189(1988)]，但也有上述缺陷。
就百日咳菌絲(FIM)來(lái)說(shuō)，通過(guò)用硫酸銨和氯化鎂鹽析來(lái)純化百日咳桿菌細(xì)胞提取物[Infection and immunity，Vol.48，p442(1985)]，但由于產(chǎn)率低該方法在疫苗生成效率方面是很差的。
有一種通過(guò)用氫氧化鋁凝膠吸附而制備革蘭氏陰性菌疫苗的方法(WO93/10216)。該方法需要大量的氫氧化鋁凝膠，來(lái)吸附在革蘭氏陰性菌中產(chǎn)生的保護(hù)性組分和內(nèi)毒素。用WO93/10216的方法得到的疫苗由于稀釋的疫苗而將內(nèi)毒素釋放體內(nèi)，因而有副作用，如發(fā)燒和內(nèi)毒素-休克的危險(xiǎn)。
就包括組分混合物而不必分離百日咳桿菌中的每個(gè)組分的百日咳疫苗生產(chǎn)而言，一種可以得到的方法是使用磷酸鈣凝膠(EP-A-291968，日本未審查專利No.52726/1989)。但是在該方法中，存在1M氯化鈉的時(shí)，形成的磷酸鈣并不吸附保護(hù)性組分。
如上所述，總的來(lái)講，必須使用不同的純化方法分離百日咳桿菌中的相應(yīng)的保護(hù)性組分。由于辛苦的操作和實(shí)踐應(yīng)用難，所以該方法不適用于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。此外，在現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的分離保護(hù)性組分的常規(guī)方法還存在材料或試劑有致病性或毒性的問(wèn)題。
針對(duì)上述背景，本發(fā)明人研究了有效分離百日咳桿菌的保護(hù)性組分的方法，發(fā)現(xiàn)在存在過(guò)量磷酸離子的條件下，向百日咳桿菌培養(yǎng)物中加入鈣離子，可以有效地從百日咳桿菌中分離百日咳桿菌的保護(hù)性組分。在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人作了進(jìn)一步的研究，將有效安全分離保護(hù)性組分的方法與磷酸鈣凝膠處理和鹽洗脫以及加熱結(jié)合在一起，構(gòu)成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明涉及(1)通過(guò)將百日咳桿菌培養(yǎng)物與磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一種的方法，所述磷酸鈣凝膠是通過(guò)在存在磷酸離子的條件下，將鈣離子加到培養(yǎng)物中而形成的。
(2)通過(guò)將百日咳桿菌培養(yǎng)物分離到細(xì)胞和培養(yǎng)液中并完成(A)，(B)，(C)和(D)步驟中的至少一個(gè)步驟而分離百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一個(gè)成員的方法(A)在此步驟中，用鹽溶液洗脫分離的細(xì)胞，使洗脫的溶液與上述(1)中的磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，(B)在此步驟中，在存在鹽溶液的條件下，將從上述步驟(A)中洗脫處理的細(xì)胞殘留物加熱，然后與磷酸鈣凝膠接觸，通過(guò)將洗脫的溶液與上述(1)中的磷酸鈣凝膠接觸而分離pertactin(PRN，69K-OMP)，(C)在此步驟中，在存在鹽溶液的條件下，將從上述步驟(A)中洗脫處理的細(xì)胞殘留物加熱，將上清液與磷酸鈣凝膠接觸并用鹽溶液洗脫，通過(guò)將洗脫的溶液與上述(1)中的磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳菌毛(FIM)，(D)在此步驟中，將培養(yǎng)物或分離培養(yǎng)液與上述(1)中的磷酸鈣凝膠接觸，從所述上清液中分離百日咳毒素(PT)。
(3)上述(2)中的分離方法，其中將所述上清液與磷酸鈣凝膠接觸，然后用鹽溶液洗脫以分離在步驟(A)中的百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素。
(4)上述(2)中的分離方法，其中將所述上清液與磷酸鈣凝膠接觸后，與離子交換凝膠接觸，以分離步驟(B)中的pertactin(PRN，69K-OMP)。
(5)上述(2)中的分離方法，其中將所述上清液與磷酸鈣凝膠接觸，然后除去，將所得的殘留物用鹽溶液洗脫以分離步驟(C)中的百日咳菌毛(FIM)。
(6)上述(2)中的分離方法，其中將所述上清液與離子交換凝膠接觸以分離步驟(D)中的百日咳毒素(PT)。
(7)上述(2)中的分離方法，其中在步驟(A)和(C)中所用的鹽溶液是含堿金屬鹽的緩沖液。
(8)上述(7)中的分離方法，其中所述鹽溶液是含0.01-1.0M氯化鈉的緩沖液。
(9)上述(1)或(2)中的分離方法，其中，在存在磷酸離子的條件下，將鈣離子加到pH7-9的培養(yǎng)物或上清液中而形成磷酸鈣凝膠。
(10)上述(9)中的分離方法，其中磷酸離子和鈣離子的當(dāng)量比為每當(dāng)量鈣離子1.25-30當(dāng)量的磷酸離子。
(11)上述(9)中的方法論方法，其中存在0.05-0.1M磷酸鹽緩沖液時(shí)，加入0.1-2w/v％的醋酸鈣作為鈣離子源而形成磷酸鈣凝膠。
(12)上述(1)或(2)中的分離方法，其中分離百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)中的至少一個(gè)成員，此后，在存在硫酸銨的條件下，吸附到氫氧化鋁凝膠上而除去內(nèi)毒素。
(13)上述(1)或(2)中的分離方法，其中分離百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)中的至少一個(gè)成員，此后通過(guò)區(qū)離心除去內(nèi)毒素。
(14)百日咳疫苗，其中PT∶FHA∶FIM的混合比例為4-6∶8-10∶1。
(15)百日咳疫苗，其中PT∶FHA∶∶PRN∶FIM的混合比例為2-6∶4-10∶1-1∶1。
用于本發(fā)明的百日咳桿菌菌株不受限制，只要它能夠產(chǎn)生百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)，所有百日咳桿菌保護(hù)性組分中的一個(gè)或一個(gè)以上的成員就行。有用的菌株包括已知菌株如百日咳桿菌TohamaPhase I菌株[Infection and Immunity，Vol.6，p.89，(1972)](保存在thenational institute of Health，Ministry of SocialWelfare，Tokyo，Japan(NIHJ1052)，自1980年8月13日保藏在theInstitute for Fermentation Osaka，保藏號(hào)為IFO14073)，百日咳桿菌Yamaguchi Phase I菌株，百日咳桿菌I期菌株18-322和百日咳桿菌I期菌株165，從生產(chǎn)率的角度看，優(yōu)選的是百日咳桿菌Tohama Phase I菌株(IFO14073)。用已知的方法可以培養(yǎng)百日咳桿菌。有用的培養(yǎng)基包括已知的基本培養(yǎng)基，如Cohen-Wheeler培養(yǎng)基，StaineF-Scholte培養(yǎng)基和其他液體培養(yǎng)基，優(yōu)選的是Stainer-Scholte培養(yǎng)基。含保護(hù)性組分和內(nèi)毒素的溶液可以是通過(guò)靜止培養(yǎng)或罐培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)物。在本發(fā)明中，培養(yǎng)物指因培養(yǎng)所述百日咳桿菌而產(chǎn)生的培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)液。而且在本發(fā)明中。上清液指因在存在鹽溶液的條件下加熱細(xì)胞或用來(lái)自按下述吸附保護(hù)性組分的磷酸鈣凝膠的鹽溶液洗脫而產(chǎn)生的培養(yǎng)物液體或上清液。細(xì)胞包括培養(yǎng)物細(xì)胞和細(xì)胞殘留物。在本發(fā)明中，用于將百日咳桿菌培養(yǎng)物分離成細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液的方法可以是已知方法，如離心或過(guò)濾。
用于本發(fā)明的磷酸鈣凝膠不是已經(jīng)制備好的凝膠，但優(yōu)選的是存在過(guò)量磷酸離子時(shí)，將鈣離子加到被處理的培養(yǎng)物或上清液中而形成的磷酸鈣凝膠(可以稱為內(nèi)部凝膠形成方法)。通過(guò)制備好的磷酸鈣凝膠(如市售的羥基磷灰石凝膠)。與使用制備好的上述羥基磷灰石凝膠(可以稱為外部凝膠形成方法)的前種方法相比，正如下文所述，使用磷酸鈣凝膠的本發(fā)明方法在百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)和百日咳菌毛(FIM)的吸附效率和其回收效率方面均較高。此外，由于不存在凝膠預(yù)處理和再生步驟，本發(fā)明中所用的磷酸鈣凝膠在操作效率方面也更好，而且成本上更有利。另外，通過(guò)適當(dāng)選擇磷酸離子與鈣離子的比例，可以選擇性地將百日咳桿菌中的每種組分吸附到磷酸鈣凝膠上。如果用磷酸鈣凝膠處理培養(yǎng)獲取上清液，所含的磷酸離子量不夠，可以加入適當(dāng)濃度的磷酸鹽緩沖液以便在加入鈣離子前提供磷酸離子。如，通過(guò)加入1M的磷酸鹽緩沖液，將磷酸離子的終濃度調(diào)整到0.02-0.2M，優(yōu)選的是0.05-0.1M。
可溶性鈣鹽是加入的鈣離子源的例子，如醋酸鈣，氯化鈣和硝酸鈣，優(yōu)選的是來(lái)自醋酸鈣的鈣離子。有關(guān)磷酸離子和鈣離子的比例，優(yōu)選的是與鈣離子相比，磷酸離子過(guò)量。按下文所述，針對(duì)百日咳桿菌中的每種保護(hù)性組分，可以適當(dāng)選擇所述比例。
在上述步驟(A)中，按如下分離百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)用已知方法，如離心或過(guò)濾從百日咳桿菌培養(yǎng)物中取出培養(yǎng)液，如培養(yǎng)上清液后，將1/10-1/20體積(相對(duì)于培養(yǎng)液的量)(相當(dāng)于50-100×109個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度)的鹽溶液加到細(xì)胞中以洗脫血細(xì)胞凝集素。在這種情況下，所用的鹽溶液優(yōu)選的是用堿金屬鹽或堿土金屬鹽補(bǔ)充的緩沖液，具體地是用0.25-1.0M堿金屬鹽或堿土金屬鹽補(bǔ)充的0.04-0.08M磷酸鹽緩沖液，特別優(yōu)選的是用0.5-1.0M堿金屬鹽補(bǔ)充的0.05M的磷酸鹽緩沖液。加到緩沖液中的堿金屬鹽或堿土金屬鹽的實(shí)例是氯化鈉，氯化鉀和氯化鎂。例如，優(yōu)選的是通過(guò)將1/10-1/20體積(相對(duì)于培養(yǎng)液的量)的0.04-0.08M用-.5-1.0M氯化鈉補(bǔ)充的磷酸鹽緩沖液(pH7-9)，更優(yōu)選的是0.05M用1M氯化鈉補(bǔ)充的磷酸鹽緩沖液(pH8)加到收集的細(xì)胞中，在4℃-室溫，優(yōu)選的8-15℃緩慢攪拌1-60分鐘，優(yōu)選的是1-30分鐘并靜置1-2天來(lái)洗脫血細(xì)胞凝集素。然后將含洗脫的百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)的溶液經(jīng)已知方法，如離心或過(guò)濾以回收上清液(用通過(guò)該處理而同時(shí)得到的細(xì)胞殘留物分離pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM))。然后將由此得到的上清液與磷酸鈣凝膠接觸。
就磷酸離子和鈣離子的比例而言，優(yōu)選的是與鈣離子相比，磷酸離子過(guò)量。例如，這些離子的當(dāng)量比優(yōu)選的是每當(dāng)量鈣離子的1.25-10當(dāng)量，更優(yōu)選的是1.5-7.5當(dāng)量的磷酸離子。可以將所述定量比例表達(dá)為0.8-20M的磷酸離子與1M鈣離子的摩爾比，優(yōu)選的是1-5M磷酸離子與1M鈣離子的摩爾比。例如，向含在上述濃度范圍內(nèi)濃度(0.02-0.2M，優(yōu)選的是0.05-1.0M)的磷酸離子的溶液(pH7-9)中加入鈣鹽達(dá)到4-70mM，優(yōu)選的是8-50mM(如加入醋酸鈣達(dá)到0.1-0.8w/v％，優(yōu)選的是0.2-0.6w/v％)的終濃度，然后在4℃-室溫，優(yōu)選8-15℃緩慢反應(yīng)1-4小時(shí)，優(yōu)選1或2小時(shí)以形成磷酸鈣凝膠。
盡管百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)被吸附到所加入的醋酸鈣凝膠上，條件是將磷酸鈣凝膠的量加到超過(guò)0.8w/v％的終濃度，優(yōu)選的是以落在上述濃度范圍內(nèi)的終濃度量加入醋酸鈣凝膠以便只選擇性地吸附百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)。在完成反應(yīng)后，用已知方法，如離心或過(guò)濾除去所述上清液；收集所得的凝膠沉淀。為了沉淀，加入1/10-1/20體積(相當(dāng)于培養(yǎng)液的量)的鹽溶液以洗脫百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)。在這種情況下，所用的鹽溶液可以與從上述細(xì)胞中洗脫百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)所用的相同的鹽溶液。優(yōu)選的是將1/10-1/20體積(相當(dāng)于培養(yǎng)液的量)用1-2M氯化鈉補(bǔ)充的0.05-0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7-9)，更優(yōu)選的是用1-1.5M氯化鈉補(bǔ)充的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8)加入到上述凝膠沉淀中，然后在4℃-室溫，緩慢攪拌1-2小時(shí)以洗脫所述血細(xì)胞凝集素。在完成攪拌后，用已知方法，如離心或過(guò)濾除去沉淀以回收上清液中的百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)。如果需要，可以通過(guò)鹽析或用超濾膜濃縮所述上清液，并脫鹽。使用上述處理達(dá)到的上清液經(jīng)下述的氫氧化鋁凝膠處理或區(qū)離心，基本上沒(méi)有損失地分離選擇性除去了內(nèi)毒素的百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)。
在上述步驟(B)或(C)中，按如下分離pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)存在1/10-1/20體積(相當(dāng)于培養(yǎng)液的量)(相當(dāng)于500-100×109細(xì)胞/ml的終濃度)鹽溶液的條件下，加熱含百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)的從洗脫溶液而得到的細(xì)胞殘留物以便提取pertactin(PRN，69K-OMP)。在這種情況下，所用的鹽溶液與上述(A)中所用的相同。但是，優(yōu)選的是使用1/10-1/20體積(相當(dāng)于培養(yǎng)液的量)用0.01-0.25M氯化鈉補(bǔ)充的0.01-0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7-9)，更優(yōu)選的是用0.15-0.25 M氯化鈉補(bǔ)充的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7)。優(yōu)選的是在40-80℃，優(yōu)選的50-60℃的熱水中加熱60-120分鐘，優(yōu)選的80-90分鐘。用已知方法，如離心或過(guò)濾回收上清液中的的熱提取的pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)。然后將由此得到的上清液與磷酸鈣凝膠接觸。在這種情況下，按上述步驟(A)可以完成磷酸鈣凝膠；但是優(yōu)選的是在下列濃度內(nèi)完成。例如，向含磷酸離子的溶液(pH7-9)(通過(guò)加入1M磷酸鹽緩沖液等，按需要調(diào)整到0.05-0.1M，優(yōu)選的1M的終磷酸離子濃度)中加入鈣鹽達(dá)到40-180mM，優(yōu)選的55-150mM(如加入的醋酸鈣達(dá)到1-2w/v％，優(yōu)選的1.3-1.7w/v％的終濃度)，然后在4℃-室溫，優(yōu)選的8-15℃緩慢反應(yīng)1-4小時(shí)，優(yōu)選的1-2小時(shí)以形成磷酸鈣凝膠。完成該反應(yīng)后，用已知的分離方法，如過(guò)濾或離心將所得的沉淀和上清液彼此分離以基本上沒(méi)有損失地回收上清液中的pertactin(PRN，69K-OMP)和在凝膠殘留物中的百日咳菌毛(FIM)。
用已知方法，優(yōu)選的用離子交換凝膠處理可以進(jìn)一步純化用上述處理達(dá)到的粗純化的pertactin(PRN，69K-OMP)，優(yōu)選的是預(yù)先濃縮粗純化的pertactin(PRN，69K-OMP)用硫酸銨鹽析或用超濾膜脫鹽。在本發(fā)明中，有用的離子交換凝膠包括陰離子交換凝膠和陽(yáng)離子交換凝膠，優(yōu)選的是陽(yáng)離子交換凝膠。用柱層析方法或分批方法可以完成與離子交換凝膠的接觸。通過(guò)該處理，吸附雜質(zhì)，即在粗純化的pertactin(PRN，69K-OMP)中除pertactin(PRN，69K-OMP)以外的物質(zhì)；收集流出物以達(dá)到含pertactin(PRN，69K-OMP)的溶液中。用柱層析方法，用離子交換凝膠裝柱，起始材料即粗純化的pertactin(PRN，69K-OMP)以100-500ml/cm2/小時(shí)的流速通過(guò)該柱。用分批方法，將粗純化的pertactin(PRN，69K-OMP)放在容器中，直接向其中加入離子交換凝膠，然后攪拌約30-3小時(shí)，優(yōu)選的約1小時(shí)，以吸附雜質(zhì)，即除pertactin(PRN，69K-OMP)的物質(zhì)。用pH5.0-8.0和100-300umho(0.1-3.0mS)電導(dǎo)率的緩沖液，如0.01-0.02M磷酸鹽緩沖液(pH5.5-6.0)吸附損失雜質(zhì)。通過(guò)使上述處理得到的上清液經(jīng)下述的氫氧化鋁凝膠處理或區(qū)離心處理，基本上沒(méi)有損失就可以分離已除去了內(nèi)毒素的pertactin(PRN，69K-OMP)。
向用上述處理而得到的含粗百日咳菌毛(FIM)的凝膠殘留物中加入1/10-1/20體積(相對(duì)于培養(yǎng)液的量)的鹽溶液，以洗脫百日咳菌毛(FIM)。在這種情況下，鹽溶液可以與上述步驟(A)中所用的相同。例如，優(yōu)選的是加入1/10-1/20體積(相對(duì)于培養(yǎng)液的量)用1-2M氯化鈉補(bǔ)充的0.05-1.0M磷酸鹽緩沖液(pH7-9)，優(yōu)選的用1-1.5M氯化鈉補(bǔ)充的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8)，然后在4℃-室溫緩慢攪拌1-2小時(shí)以洗脫百日咳菌毛(FIM)。完成攪拌后，用已知方法，如離心或過(guò)濾取出沉淀，以回收上清液中的百日咳菌毛(FIM)。將上述處理后得到的上清液經(jīng)氫氧化鋁凝膠處理或區(qū)離心處理，可以基本上沒(méi)有損失地得到選擇性除去了內(nèi)毒素的百日咳菌毛(FIM)。
在上述步驟(D)中，按下列步驟分離百日咳毒素(PT)盡管在該步驟中，不必將百日咳桿菌培養(yǎng)物分成培養(yǎng)的細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液，但就效率而論，優(yōu)選的是用已知方法，如離心或過(guò)濾從百日咳桿菌中回收上清液，用超濾膜等將上清液濃縮約10-20倍，然后在該步驟前通過(guò)離心力或另一種方法收集上清液。然后將上清液與磷酸鈣凝膠接觸。在這種情況下，可以用與上述步驟(A)相同的方法完成磷酸鈣凝膠處理，但優(yōu)選的是在下列濃度范圍內(nèi)完成所述處理。例如，向含磷酸離子的溶液(pH7-9)(按需要通過(guò)加入1M磷酸鹽緩沖液等而將磷酸離子終濃度調(diào)整到0.05-1.0M，優(yōu)選的0.1M)中加入鈣鹽，達(dá)到40-180mM，優(yōu)選的55-150mM的終濃度(如加入醋酸鈣達(dá)到1-2w/v％，優(yōu)選的1.3-1.7w/v％的終濃度)，然后在4℃-室溫，優(yōu)選8-15℃緩慢反應(yīng)1-4小時(shí)，優(yōu)選1-2小時(shí)以形成磷酸鈣凝膠。完成所述反應(yīng)后，用已知方法，如離心或過(guò)濾將所得的沉淀和上清液彼此分離以便基本上無(wú)損失地回收上清液中的百日咳毒素(PT)。通過(guò)離子交換凝膠處理，進(jìn)一步純化經(jīng)上述處理得到的粗純化的百日咳毒素(PT)；優(yōu)選的是預(yù)先濃縮并用硫酸銨鹽析或超濾膜濃縮粗純化的百日咳毒素(PT)。在此所用的離子交換凝膠的實(shí)例電話陰離子交換凝膠和陽(yáng)離子交換凝膠，優(yōu)選陽(yáng)離子交換凝膠。通過(guò)柱層析方法或分批法可以完成與離子交換凝膠的接觸。通過(guò)所述處理，在粗純化的百日咳毒素(PT)中的百日咳毒素(PT)被吸附到凝膠上，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌以洗脫并除去雜質(zhì)，此后，用適當(dāng)pH和離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫并分離百日咳毒素(PT)。在柱層析方法中，用離子交換凝膠裝柱，起始材料，即粗純化的百日咳毒素(PT)以100-500ml/cm2/小時(shí)的流速通過(guò)該柱以吸附毒素。在分批方法中，將粗純化的百日咳毒素(PT)放在容器中，向其中直接加入離子交換凝膠，然后攪拌約30分鐘-3小時(shí)，優(yōu)選約1小時(shí)，以便吸附毒素。用PH為5.0-6.0和電導(dǎo)率為100-300umho(0.1-0.3mS)的緩沖液，如0.01-0.02M磷酸鹽緩沖液(pH5.5-6.0)吸附粗純化的百日咳毒素(PT)。用PH為7.0-7.5和電導(dǎo)率為1000-2000umho(1-2mS)的緩沖液，如0.1-0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0-7.5)從已經(jīng)吸附了百日咳毒素(PT)的離子交換凝膠上洗脫百日咳毒素。使通過(guò)上述處理而得到的洗脫物將下述的氫氧化鋁凝膠處理或區(qū)離心處理，可以基本上不損失地分離已選擇性除去了內(nèi)毒素的百日咳毒素(PT)。
在本發(fā)明中，完成用于除去內(nèi)毒素的氫氧化鋁凝膠處理以便通過(guò)將所述材料與存在硫酸銨時(shí)預(yù)先制備的氫氧化鋁凝膠接觸，從而只選擇性地吸附內(nèi)毒素。但是，氫氧化鋁凝膠(其量低于WO93/10216中所用的1/10)幾乎不吸附任何量的百日咳桿菌的的保護(hù)性組分。填充優(yōu)選的是在用已知方法濃縮后，如硫酸銨鹽析或處理膜方法后，完成所述處理。用于預(yù)先制備的氫氧化鋁凝膠的鋁離子包括可溶的鋁化合物的那些，如硫酸鋁，氯化鋁，優(yōu)選氯化鋁的鋁離子。優(yōu)選通過(guò)將2M氫氧化鈉溶液加到25-190mM鋁鹽溶液(如0.9-4.5％氯化鋁溶液)中而制備pH為7.0-7.5的氫氧化鋁，在4℃-室溫緩慢反應(yīng)1-3小時(shí)以形成所需的氫氧化鋁凝膠。然后處理用上述處理得到的氫氧化鋁凝膠以回收用已知方法，如過(guò)濾或離心得到的凝膠沉淀以便在所述反應(yīng)后，除去游離的鋁離子。通過(guò)離心回收用已知方法，如硫酸銨鹽析濃縮的百日咳桿菌保護(hù)性組分；將所述沉淀溶解在用0.25M氯化鈉補(bǔ)充的0.25M磷酸鹽緩沖液(pH7.0-7.5)中。向該百日咳桿菌保護(hù)性組分中加入飽和的硫酸銨得到2.0-8.0v/v％的終濃度，然后加入預(yù)先制備的，回收的氫氧化鋁凝膠得到0.1-1.0mg/ml，優(yōu)選0.2-0.5mg/ml的終濃度，在4℃-室溫緩慢反應(yīng)30分鐘-1小時(shí)。完成反應(yīng)后，用已知方法，如過(guò)濾或離心除去氫氧化鋁以便不損失地分離已除去了內(nèi)毒素的百日咳桿菌保護(hù)性組分。
在本發(fā)明中，完成區(qū)離心以除去內(nèi)毒素，而且優(yōu)選在用已知方法，如硫酸銨鹽析濃縮后完成。區(qū)離心方法包括蔗糖密度梯度離心，氯化銫密度梯度離心和酒石酸鉀密度梯度離心，優(yōu)選蔗糖密度梯度離心。例如，在0-30％w/v％的蔗糖密度梯度上以60000-122000G離心約10-24小時(shí)而完成蔗糖密度梯度離心后，可以分離已除去了內(nèi)毒素的百日咳桿菌保護(hù)性組分。
通過(guò)使用British Journal of Experimental Pathslogy，Vol.44，p.177(1963)中描述的常規(guī)解毒技術(shù)，將PT解毒。用在日本未審查專利No52726/1989中描述的方法可以將FHA，PRN和FIM滅活。通過(guò)以任何所需的比例混合用本發(fā)明方法得到的百日咳桿菌保護(hù)性組分，可以生產(chǎn)優(yōu)于已知的百日咳疫苗的改善的純化的百日咳組分疫苗。即不可能改變?cè)谌?xì)胞或共純化的無(wú)細(xì)胞疫苗中穩(wěn)定的各組分的比例，而不需得到分別純化的組分，而用本發(fā)明方法可以選擇在人中作為百日咳疫苗的抗原的比例，原因是在本發(fā)明中有效地純化了各組分。需要純化的百日咳組分疫苗以便以盡可能小的總蛋白質(zhì)量混合保護(hù)性組分并得到更有效的免疫原性。本發(fā)明純化的百日咳組分疫苗優(yōu)選的包括所有三種組分，即，F(xiàn)HA，F(xiàn)IM和PT，而且還可包括其他不產(chǎn)生不需要副作用的藥物學(xué)可接受的組分如PRN。
當(dāng)將這些組分混合以生產(chǎn)本發(fā)明純化的百日咳組分疫苗時(shí)，在下文實(shí)施例中舉證了其比例。本發(fā)明組分疫苗PT∶FHA∶FIM的比例近似是4-6∶8-10∶1，優(yōu)選，5-6∶8-10∶1，而且例如含有，20-30μg蛋白質(zhì)/ml的PT，40-50μg蛋白質(zhì)/ml的FHA和5-10μg蛋白質(zhì)/ml的FIM，優(yōu)選25-30μg蛋白質(zhì)/ml的PT，40-50μg蛋白質(zhì)/ml的FHA和5μg蛋白質(zhì)/ml的FIM。上述組分疫苗還可包含5-10μg蛋白質(zhì)/ml的PRN，而且PT∶FHA∶PRN∶FIM的比例為2-6∶4-10∶1-2∶1，優(yōu)選5-6∶8-10∶2∶1。即，優(yōu)選的它含有25-30μg蛋白質(zhì)/ml的PT，40-50μg蛋白質(zhì)/ml的FHA，10μg蛋白質(zhì)/ml的PRN和5μg蛋白質(zhì)/ml的FIM。
可以將本發(fā)明的上述效果總結(jié)如下本發(fā)明方法的特征在于使用同樣的方法純化所有的百日咳桿菌主要保護(hù)性組分。這樣不需要象現(xiàn)有技術(shù)那樣，因不同的組分而需要不同的煩瑣過(guò)程，因此，可以高效率和高回收率地純化每個(gè)組分，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)是非常有利的一個(gè)方面。另外，內(nèi)毒素含量(用Limulus試驗(yàn)確定的)對(duì)于本發(fā)明得到的所有百日咳桿菌的保護(hù)性組分來(lái)說(shuō)，每100μg蛋白質(zhì)不超過(guò)1ng，這樣提供了很高的實(shí)用價(jià)值。還可以有效地生產(chǎn)改進(jìn)純化的百日咳組分疫苗，該疫苗包括百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)的有效組合。
實(shí)施例下文通過(guò)下列實(shí)施例和參考例(但不限于這些例子)來(lái)更詳細(xì)地描述本發(fā)明。在下面的描述中，百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和內(nèi)毒素也分別稱之為PT，F(xiàn)HA，69K-OMP，F(xiàn)IM和ET。
實(shí)施例1使用Stainer-Scholte培養(yǎng)基通過(guò)Roux瓶靜止培養(yǎng)(450ml，35℃，5天)和罐攪拌培養(yǎng)(40l，35℃，2天)將百日咳桿菌Tohama I期菌株培養(yǎng)至最終濃度為2×109個(gè)細(xì)胞/ml，得到百日咳桿菌培養(yǎng)物。
使用超濾膜將細(xì)胞培養(yǎng)物濃縮至十分之一體積，在此之后離心分離上清液和細(xì)胞。向上清液中加入1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)至最終濃度為0.1M，接著加入醋酸鈣溶液至最終濃度為1.6w/v％并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾該磷酸鈣凝膠溶液。濃縮所得的濾液并使用超濾膜脫鹽至電導(dǎo)為200歐姆，通過(guò)一個(gè)磺丙基陽(yáng)離子交換層析柱(Tosoh Corporation生產(chǎn))，用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)洗滌，并用0.1M磷酸鹽緩沖溶液洗脫，得到百日咳毒素(PT)。其次，將細(xì)胞分散在十分之一體積(相對(duì)于培養(yǎng)液的量)的補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)中，接著離心分離得到上清液和細(xì)胞。向該上清液加入醋酸鈣溶液至最終濃度為0.5w/v％，接著在室溫?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾該磷酸鈣凝膠溶液；收集得到的凝膠層。用補(bǔ)充有0.15M氯化鈉的0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)洗脫該凝膠層得到含有百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)的溶液。分別地，將細(xì)胞分散在十分之一體積(相對(duì)于培養(yǎng)液的量)的補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)中，在此之后在60℃的溫水中加熱90分鐘，接著離心分離得到上清液。向上清液中加入1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)至最終濃度為0.1M，之后加入醋酸鈣溶液至最終濃度為1.6w/v％，接著在室溫?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾該磷酸鈣凝膠溶液，收集濾液和凝膠層。濃縮所得的濾液并使用超濾膜脫鹽至電導(dǎo)為200歐姆和通過(guò)一個(gè)磺丙基陽(yáng)離子交換層析柱(Tosoh Corporation生產(chǎn))；收集洗脫液得到含有pertactin(PRN，69K-OMP)的溶液。分別地，用補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)洗脫凝膠層得到含有百日咳菌毛(FIM)的溶液。
對(duì)照例制備如下每升培養(yǎng)液加入220g硫酸銨，接著充分?jǐn)嚢?。?℃保持約14天后，離心分離該混合物；除去上清液，并收集沉淀物。向這樣得到的沉淀物加入十分之一體積(相對(duì)于培養(yǎng)液)的補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)，接著充分?jǐn)嚢琛Ｔ?℃保持約4天后，再離心分離該混合物；收集上清液得到含有百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)或百日咳菌毛(FIM)的溶液。
通過(guò)ELISA，用純化的百日咳內(nèi)毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)的制品作為參考確定百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)或百日咳菌毛(FIM)在每個(gè)樣品中的含量。結(jié)果以μg蛋白質(zhì)/ml的單位表示。
蛋白質(zhì)含量的確定用加熱的三氯醋酸沉淀的蛋白質(zhì)通過(guò)Lowry法用牛血白蛋白(Fraction V，Wako Pure ChemicalIndustries生產(chǎn))作為參考定量。結(jié)果以μg蛋白質(zhì)/ml的單位表示。
Roux瓶培養(yǎng)液的結(jié)果和罐培養(yǎng)液的結(jié)果分別示于表1和表2。
表1
*每個(gè)數(shù)值表示相對(duì)于對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)。
表2
*每個(gè)數(shù)值表示相對(duì)于對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)。
從這些數(shù)值明顯看出，每個(gè)保護(hù)性組分被有效地分離了，并且在罐培養(yǎng)液的情況下，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)(兩者在Roux瓶培養(yǎng)液的情況下產(chǎn)率均低)的回收量很大。
參考例1向用實(shí)施例1中所述方法制備的對(duì)照溶液中加入醋酸鈣至最終濃度為0.5w/v％，接著在室溫下攪拌1小時(shí)。將一半量的飽和硫酸銨溶液加入到通過(guò)過(guò)濾該鈣溶液得到的濾液中；該混合物在4℃保持7天。離心分離硫酸銨鹽析出的產(chǎn)物；收集所得的沉淀并將其再懸浮在補(bǔ)充有0.25M氯化鈉的0.025M磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中得到起始原料。將氫氧化鋁凝膠(預(yù)先制備成最終濃度為0.4mg/ml)加入到這一起始原料中；將硫酸銨加入到通過(guò)離心分離回收的氫氧化鋁中至最終濃度為0，2，4或8w/v％，接著在室溫下緩慢攪拌30分鐘。反應(yīng)完成之后，通過(guò)離心分離除去氫氧化鋁凝膠以便分離上清液。用下面所述的方法測(cè)定每個(gè)上清液的血細(xì)胞凝集活性和內(nèi)毒素含量。結(jié)果示于表3。
血細(xì)胞凝集活性的測(cè)定在樣品被連續(xù)地用0.01M的磷酸鹽緩沖的鹽水稀釋2倍之后，加入0.6v/v％chick固定的紅血細(xì)胞引起血細(xì)胞凝集。每個(gè)樣品顯示出血細(xì)胞凝集的最大稀釋率作為血細(xì)胞凝集素滴定度HA。內(nèi)毒素(ET)含量的測(cè)定使用大腸桿菌(Difico055-B5)作為參考菌株，通過(guò)Limulus試驗(yàn)(Wako Pure Chemical Kit)測(cè)定ET含量。結(jié)果以ng/ml的單位表示。從表3可以明顯看出，通過(guò)在硫酸銨存在的條件下用預(yù)先制備的氫氧化鋁凝膠處理樣品，可以選擇性地除去內(nèi)毒素，而不損失活性組分。
表3
*每個(gè)內(nèi)毒素除去率即HA回收率的數(shù)值是相對(duì)于預(yù)處理數(shù)值的百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例2將一半量的飽和的硫酸銨溶液加入到在實(shí)施例1中得到的百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)的每一個(gè)中，接著充分?jǐn)嚢?。?℃保持一周之后，再離心分離該混合物；收集所得的沉淀。
把該沉淀溶解在補(bǔ)充有0.25M氯化鈉的0.025M磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中得到百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，或百日咳菌毛(FIM)溶液。將飽和的硫酸銨溶液加入到每個(gè)溶液中至最終濃度為4.0v/v％。將預(yù)先制備的，回收的氫氧化鋁凝膠加入到該混合物中至最終濃度為0.4mg/ml，接著在室溫下緩慢攪拌30分鐘。反應(yīng)完成后，通過(guò)離心分離除去氫氧化鋁凝膠得到百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)。
百日咳毒素(PT)含量，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)含量，pertactin(PRN，69K-OMP)含量和百日咳菌毛(FIM)含量用與在實(shí)施例1中同樣的方法測(cè)定；而內(nèi)毒素的含量用與在參考例1中同樣的方法測(cè)定。結(jié)果示于表4。
表4
*回收率的數(shù)值表示相對(duì)于預(yù)處理數(shù)值的百分?jǐn)?shù)。
從此表可以明顯看出，內(nèi)毒素被選擇性地除去，同時(shí)基本上沒(méi)有損失保護(hù)性組分，對(duì)于所有組分每100μg蛋白質(zhì)/ml內(nèi)毒素含量不大于1ng/ml。
實(shí)施例3將一半量的飽和的硫酸銨溶液加入到在實(shí)施例1中得到的百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)的每一個(gè)中，接著充分?jǐn)嚢?。?℃保持一周之后，再離心分離該混合物；收集所得的沉淀。把該沉淀溶解在補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)中，在此之后通過(guò)試管法使用補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)作為外部流體進(jìn)行滲析，得到百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)或百日咳菌毛(FIM)溶液。濃縮的滲析液在蔗糖密度梯度為1-30w/w％進(jìn)行蔗糖梯度密度離心分離并在Rmax為64900G條件下約18小時(shí)。完成離心分離之后，把34w/w％的蔗糖送入低轉(zhuǎn)速的旋轉(zhuǎn)器中收集餾份。
百日咳毒素(PT)含量，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)含量，pertactin(PRN，69K-OMP)含量和百日咳菌毛(FIM)含量用與在實(shí)施例1中同樣的方法測(cè)定；而內(nèi)毒素的含量用與在參考例1中同樣的方法測(cè)定。結(jié)果示于表5。
表5
*回收率的數(shù)值表示相對(duì)于預(yù)處理數(shù)值的百分?jǐn)?shù)。
從此表可以明顯看出，內(nèi)毒素被選擇性地除去，同時(shí)基本上沒(méi)有損失保護(hù)性組分，對(duì)于所有組分每100μg蛋白質(zhì)/ml內(nèi)毒素含量不大于1ng/ml。
實(shí)施例4向在實(shí)施例3中得到的PT中加入福爾馬林外加氨基酸例如賴氨酸至最終濃度為0.4v/v％，通過(guò)混合之后，讓其在39℃在恒溫箱中保持21-35天。
向在實(shí)施例3中得到的FHA，69K-OMP和FIM的每一個(gè)中加入福爾馬林至最終濃度為0.4v/v％，通過(guò)混合之后，讓其在39℃在恒溫箱中保持7天。
如上處理的每個(gè)這些組分用補(bǔ)充有0.15M氯化鈉的1mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)進(jìn)行滲析，得到解毒的PT，無(wú)活性的FHA，無(wú)活性的69K-OMP和無(wú)活性的FIM。
這些解毒的或無(wú)活性的組分以示于表6和表7中的幾個(gè)比例混合，并且接著加入氯化鋁至最終濃度為0.2mg/ml，分別得到疫苗。
老鼠與這些混合的疫苗的內(nèi)腦效力試驗(yàn)結(jié)果示于表6和表7。試驗(yàn)按照日本生物制品的最低要求(日本生物制造商協(xié)會(huì))的方法進(jìn)行。
表6
表7
從這些數(shù)值可以明顯看出，無(wú)活性的69K-OMP和無(wú)活性的FIM兩者對(duì)老鼠的內(nèi)腦效力有很小的作用，并且在含有大于25μg蛋白質(zhì)/ml解毒PT的混合疫苗中沒(méi)有觀察到明顯的不同。
實(shí)施例5用在實(shí)施例4中得到的混合疫苗進(jìn)行老鼠空氣傳染預(yù)防能力試驗(yàn)。每個(gè)稀釋到三分之一的疫苗分別以0.2ml的稀釋疫苗量皮下給藥到4周大的老鼠上。在給藥4周后，每個(gè)老鼠通過(guò)使用氣溶室用百日咳桿菌的18-323I期菌株進(jìn)行通氣傳染，在傳染10天后，打開(kāi)每個(gè)老鼠的腹部并且從感染的老鼠中取出氣管和肺。
將每個(gè)勻漿的組織樣品用于Bordet-Gengou瓊脂。該瓊脂在35℃培養(yǎng)5天并計(jì)數(shù)百日咳桿菌的菌落數(shù)。
根據(jù)無(wú)給藥老鼠的菌落數(shù)計(jì)算保護(hù)劑量。
在氣管的情況下，計(jì)算75％保護(hù)劑量，而在肺的情況下，計(jì)算50％保護(hù)劑量。結(jié)果以μg蛋白質(zhì)表示。
以高給藥劑量組計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率的公式如下 結(jié)果示于表8。
表8
從此表可以明顯看出，無(wú)活性的69K-OMP和無(wú)活性的FIM兩者對(duì)老鼠的內(nèi)腦效力有很小的作用，但它們均顯示出對(duì)空氣傳染能力的預(yù)防作用。
試驗(yàn)實(shí)施例1磷酸鈣凝膠(內(nèi)部凝膠)成形和羥基磷灰石凝膠(外部凝膠)之間對(duì)FHA和FIM吸收性能的差異。
用述于實(shí)施例1中的方法制備Roux瓶靜止培養(yǎng)物。使用超濾膜將細(xì)胞培養(yǎng)物濃縮至十分之一體積，在此之后離心分離上清液(樣品a)和細(xì)胞。將細(xì)胞分散在十分之一體積的補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)中并很好地?cái)嚢?。保持?℃4天，接著離心分離得到洗脫的含有PT，F(xiàn)HA，69K-OMP和FIM的上清液(樣品b)。
上述的培養(yǎng)物上清液(樣品a)和洗脫的上清液(樣品b)按照下面1)或2)處理。
1)磷酸鈣凝膠(內(nèi)部凝膠)成形處理將1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8)加入到樣品中，接著加入醋酸鈣溶液至最終濃度為0.5w/v％，1.0w/v％或2.0w/v％并在室溫緩慢地?cái)嚢?小時(shí)，接著在1000rpm下離心分離10分鐘成為上清液和凝膠殘余物。通過(guò)用補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)洗脫凝膠殘余物得到洗脫溶液。
2)羥基磷灰石凝膠(外部凝膠)處理用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)平衡羥基磷灰石凝膠(BDHChemical Ltd生產(chǎn))。將該凝膠加入到20w/v％，10w/v％或50w/v％(對(duì)于樣品體積)并在室溫?cái)嚢?小時(shí)，接著通過(guò)在1000rpm離心分離10分鐘從凝膠殘余物中分離上清液。通過(guò)用補(bǔ)充有1M氯化鈉的0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)洗脫凝膠殘余物得到洗脫溶液。
通過(guò)ELISA用FHA或FIM作為house參考確定每個(gè)樣品中的FHA或FIM的含量。分析結(jié)果μg蛋白質(zhì)/ml的單位表示。蛋白質(zhì)含量用加熱的三氯醋酸沉淀的蛋白質(zhì)通過(guò)Lowry法用牛血白蛋白(Fraction V，Wako Pure Chemical Industries生產(chǎn))作為參考定量。結(jié)果以μg蛋白質(zhì)/ml的單位表示。
分別用下面公式計(jì)算凝膠對(duì)FHA和FIM的吸收率和回收率。
結(jié)果示于表9和表10。
表9a)培養(yǎng)物上清液
表10b)用補(bǔ)充有1M-NaCl的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)從細(xì)胞洗脫的溶液
磷酸鈣凝膠(內(nèi)部凝膠)很強(qiáng)地吸附FHA和FIM，但羥基磷灰石凝膠對(duì)FIM有小的吸收作用。與磷酸鈣凝膠相比，羥基磷灰石凝膠對(duì)FHA也有小的吸收作用并且取決于加入的體積。
本發(fā)明方法的特征在于使用同樣的方法純化所有的百日咳桿菌主要保護(hù)性組分。因此可以高效率和高回收率地純化每個(gè)組分，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)是非常有利的一個(gè)方面。還可以有效地生產(chǎn)改進(jìn)純化的百日咳組分疫苗，該疫苗包括百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)的有效組合。
權(quán)利要求
1.通過(guò)將百日咳桿菌培養(yǎng)物與磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一個(gè)成員的方法，所述磷酸鈣凝膠是通過(guò)在存在磷酸離子的條件下，將鈣離子加到培養(yǎng)物而形成的。
2.通過(guò)將百日咳桿菌培養(yǎng)物分成細(xì)胞和培養(yǎng)液，然后完成至少步驟(A)，(B)，(C)和(D)中的一個(gè)而分離百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一個(gè)成員的方法(A)在此步驟中，用鹽溶液洗脫分離的細(xì)胞，使洗脫的溶液與權(quán)利要求1中的磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，(B)在此步驟中，在存在鹽溶液的條件下，將從上述步驟(A)中洗脫處理的細(xì)胞殘留物加熱，然后與磷酸鈣凝膠接觸，通過(guò)將洗脫的溶液與權(quán)利要求1中的磷酸鈣凝膠接觸而分離pertactin(PRN，69K-OMP)，(C)在此步驟中，在存在鹽溶液的條件下，將從上述步驟(A)中洗脫處理的細(xì)胞殘留物加熱，將上清液與磷酸鈣凝膠接觸并用鹽溶液洗脫，通過(guò)將洗脫的溶液與權(quán)利要求1中的磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳菌毛(FIM)，(D)在此步驟中，將培養(yǎng)物或分離培養(yǎng)液與權(quán)利要求1中的磷酸鈣凝膠接觸，從所述上清液中分離百日咳毒素(PT)。
3.權(quán)利要求2的分離方法，其中將所述上清液與磷酸鈣凝膠接觸，然后用鹽溶液洗脫以分離步驟(A)中的百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)。
4.權(quán)利要求2的分離方法，其中將與磷酸鈣凝膠接觸過(guò)的所述上清液與離子交換凝膠接觸以分離pertactin(PRN，69K-OMP)。
5.權(quán)利要求2的分離方法，其中將所述上清液與磷酸鈣凝膠接觸，然后除去，將所得的殘留物用鹽溶液洗脫以分離組織(C)中的百日咳菌毛(FIM)。
6.權(quán)利要求2的分離方法，其中將所述上清液與離子交換凝膠接觸以分離步驟(D)中的百日咳毒素(PT)。
7.權(quán)利要求2的分離方法，其中在步驟(A)和(C)中所用的鹽溶液是含堿金屬鹽的緩沖液。
8.權(quán)利要求7的分離方法，其中所述鹽溶液是含0.01-1.0M氯化鈉的緩沖液。
9.權(quán)利要求1或2的分離方法，其中通過(guò)在存在磷酸離子時(shí)，將鈣離子加到pH7-9的培養(yǎng)物或上清液中而形成磷酸鈣凝膠。
10.權(quán)利要求9的分離方法，其中磷酸離子和鈣離子的當(dāng)量比為每當(dāng)量鈣離子1.25-30當(dāng)量磷酸離子。
11.權(quán)利要求9的分離方法，其中存在0.05-1.0M磷酸鹽緩沖液時(shí)，以0.1-2w/v％加入醋酸鈣作為鈣離子源而形成磷酸鈣凝膠。
12.利要求1或2的分離方法，其中分離了百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69-OMP)，和百日咳菌毛(FIM)中的至少一個(gè)成員，此后通過(guò)存在硫酸銨時(shí)，吸附到氫氧化鋁凝膠上而除去內(nèi)毒素。
13.權(quán)利要求1或2的分離方法，其中分離了百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69-OMP)，和百日咳菌毛(FIM)中的至少一個(gè)成員，此后用區(qū)離心除去內(nèi)毒素。
14.百日咳疫苗，其中以4-6∶8-10∶1的比例混合組分PT∶FHA∶FIM。
15.百日咳疫苗，其中以2-6∶4-10∶1-2∶1的比例混合組分PT∶FHA∶PRN∶FIM。
全文摘要
提供了有效分離百日咳桿菌保護(hù)性組分的方法，以對(duì)磷酸鈣凝膠的吸附能力的差異為基礎(chǔ)，從百日咳桿菌培養(yǎng)物中分離百日咳桿菌的保護(hù)性組分，所述磷酸鈣凝膠是在存在過(guò)量磷酸離子的條件下，提供將鈣離子加到百日咳桿菌培養(yǎng)物中而形成的。傳統(tǒng)上，已經(jīng)用用于不同組分的不同純化方法，分離百日咳桿菌的保護(hù)性組分。根據(jù)本發(fā)明，使用同樣的方法純化所有的百日咳桿菌主要保護(hù)性組分。因此可以高效率和高回收率地純化每個(gè)組分，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)是非常有利的一個(gè)方面。還可以有效地生產(chǎn)改進(jìn)純化的百日咳組分疫苗，該疫苗包括百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)的有效組分。
文檔編號(hào)C07K14/235GK1147259SQ9519278
公開(kāi)日1997年4月9日 申請(qǐng)日期1995年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月28日
發(fā)明者末原章宏, 山本英治, 藤井重男 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社