酮古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及微生物領域，特別設及酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 維生素C是維持機體生長和代謝所必須的一種水溶性維生素，目前廣泛應用于醫(yī) 藥、食品、飼料和化妝品領域，市場穩(wěn)定。目前維生素C的主流生產法是二步發(fā)酵法，主要指 從D-山梨醇開始，經過兩步發(fā)酵轉化為維生素C前體一2-酬-k古龍酸的過程。第一步， 利用氧化葡萄糖酸桿菌將D-山梨醇轉化為k山梨糖，第二步利用生酬古龍酸桿菌及其伴 生菌（主要為芽抱桿菌）的混菌體系將k山梨糖轉化為2-酬-k古龍酸。由于該菌株單 獨培養(yǎng)生長緩慢，影響其在擴增培養(yǎng)、菌種活化的工業(yè)應用，因此，尋找合適的培養(yǎng)基配方， 促進其生長，對工業(yè)應用有很高價值。
[0003] 對促進酬古龍酸桿菌生長的物質的研究，包括添加谷脫甘膚、Ξ簇酸循環(huán)中的四 碳酸或其鹽、硫辛酸、輔因子均對酬古龍酸桿菌生長有促進作用?，F(xiàn)有技術采用外源添加物 質嘗試提高小菌生物量及產酸量，但由于外源添加物質的濃度直接關系到企業(yè)成本，具有 企業(yè)應用局限。因此，提供一種酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法。本專利提出用D-山梨 醇、D-甘露醇替換山梨糖作為碳源的種子培養(yǎng)方案，提高菌株的生物量達2倍，對活化工業(yè) 菌株有重要意義。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術方案：
[0006] 本發(fā)明提供了山梨醇和/或甘露醇作為碳源在培養(yǎng)酬古龍酸桿菌中的應用。
[0007] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述應用中山梨醇或甘露醇在酬古龍酸桿菌的 種子培養(yǎng)基中的添加量為15~45g/L。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種酬古龍酸桿菌的種子培養(yǎng)基，用山梨醇和/或甘露醇代替山 梨糖作為碳源。
[0009] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述種子培養(yǎng)基包括玉米漿l-5g/l，酵母粉 1~5g/l，牛肉膏1~5g/L蛋白腺1~20g/l，尿素0. 2~2g/l，憐酸二氨鐘0. 1~2g/L， 硫酸儀0. 01~Ig/L碳酸巧0. 1~2g/L，pH調至6. 5~7. 5，12rC，滅菌20min，制成種子 培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[0010] 分別配置山梨醇和甘露醇20g/100ml，115°C，滅菌20min，在種子培養(yǎng)過程中添加 至質量濃度15~45g/L。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法，選用所述種子培養(yǎng)基對酬古龍酸 桿菌進行種子培養(yǎng)。
[0012]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)方法將活化的酬古龍酸桿菌接種于所 述種子培養(yǎng)基中，在30°c、250r/min的條件下種子培養(yǎng)4她。
[0013]本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產維生素C前體2-酬-k古龍酸的方法，選用所述種 子培養(yǎng)基對酬古龍酸桿菌進行種子培養(yǎng)，收集發(fā)酵產物。
[0014]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法將活化的酬古龍酸桿菌接種于所述種 子培養(yǎng)基中，在30°C、250r/min的條件下種子培養(yǎng)4她，收集發(fā)酵產物。
[0015]由于酬古龍酸桿菌單獨生長較弱，尋找合適的培養(yǎng)基配方，促進其生長，對工業(yè)應 用有很高價值。本發(fā)明比較該菌株在相同質量濃度的葡萄糖、果糖、山梨醇、山梨糖、甘露 醇下對酬古龍酸桿菌生長的作用，發(fā)現(xiàn)在山梨醇、甘露醇下，較山梨糖培養(yǎng)有1.6倍的生物 量，有菌種種子培養(yǎng)與工業(yè)發(fā)酵有重要意義。本發(fā)明設及生物技術/微生物發(fā)酵領域，特別 設及山梨醇、甘露醇增強菌株生長與活性的應用，并借助基因組對其代謝網絡進行分析，代 謝組對胞內重要代謝物的變化差異進行解析。證實酬古龍酸桿菌消耗山梨醇轉化為山梨 糖、2-酬基-k古龍酸的機制。
[0016]本發(fā)明建立了全新的酬古龍酸桿菌種子培養(yǎng)方式，獲得維生素C前體2-酬-k古 龍酸的新工藝流程。K.vulgare在果糖、山梨醇、甘露醇中培養(yǎng)5小時均已達到在山梨糖中 培養(yǎng)25小時的最高生物量（菌體密度達到3. 60)而在山梨醇、甘露醇中生長于10小時后， 更要明顯好于在山梨糖中，并在25小時達到最高生物量（菌體密度達到5. 20、4. 90)，相比 在山梨糖中培養(yǎng)要分別提高40. 72%和62. 97%。由此可W想到，在相同的培養(yǎng)時間和培養(yǎng) 條件下，使用山梨醇/甘露醇的種子培養(yǎng)將比使用山梨糖的培養(yǎng)方式獲得的菌體量高1. 5 倍及W上，為后續(xù)的發(fā)酵提供更為優(yōu)質的發(fā)酵菌種。如果從獲得同樣的菌種量來考慮，在山 梨醇、甘露醇中培養(yǎng)5小時均已達到在山梨糖中培養(yǎng)25小時的最高生物量，大大縮短種子 培養(yǎng)的時間，至少10小時。
【附圖說明】
[0017]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0018] 圖1示酬古龍酸桿菌在不同碳源下的生長及底物消耗情況；其中，A示酬古龍酸桿 菌在不同碳源下的生長曲線巧示酬古龍酸桿菌在不同碳源下的底物消耗；…，…示k山梨 糖；示D-山梨醇；示D-甘露醇；.哪^示D-葡萄糖；示D-果糖；
[0019] 圖2示酬古龍酸桿菌單糖轉化相關內酶；
[0020]圖3示對數(shù)期不同碳源培養(yǎng)下細胞內相關酸性產物的含量；其中，圖3(A)示心山 梨糖；圖3做示2-酬基-L古龍酸；圖3似示2-酬基-D-葡糖酸；圖3 (D)示k葡糖酸； 圖3似示D-葡糖酸；圖3 (巧示葡糖二酸；圖3似示甘露酸；
[0021]圖4示不同碳源的標準品出峰位置；其中，圖4(A)示甘露醇；圖4度）示山梨糖； 圖4(C)示山梨醇；圖4(D)示葡萄糖；圖4膽)示果糖。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法，本領域技術人員可W借鑒本文 內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人 員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實 施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法 和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0023] (1)酬古龍酸桿菌種子培養(yǎng)方法：
[0024]玉米漿l-5g/l，酵母粉l-5g/l，牛肉膏l(xiāng)-5g/L蛋白腺l-20g/l，尿素 0. 2-2g/L， 憐酸二氨鐘0.l-2g/l，硫酸儀0. 01-lg/L，碳酸巧0.l-2g/L，抑調至6. 5-7. 5,121°C，滅菌 20min，制成種子培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[002引分別配置山梨糖、山梨醇、葡萄糖、甘露醇、果糖20g/100ml，115°C，滅菌20min，在 種子培養(yǎng)過程中添加至質量濃度15~45g/L。
[0026] 將在固體平板上活化好的酬古龍酸桿菌接種于培養(yǎng)基中進行48小時種子培養(yǎng)， 30°C，250r/min，觀測不同碳源下的生長比對。
[0027] 似產物檢測：
[0028] 菌濃度測定：使用75-6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體生長曲線，波長采 用 600nm，即 0D600。
[0029] 底物消耗情況測定：高效液相色譜檢測，采用AminexHPX-87H色譜柱，示差檢測 器。0. 5mM硫酸作流動相，柱溫65°C，檢測器溫度50°C。
[0030] 對五種碳源配置20克/升的標品進行高效液相色譜檢測獲得，定量物質的峰位置 即對應保留時間。其中10. 295min的峰為山梨醇，對應保留時間9. 427min的峰為山梨糖， 對應保留時間10. 162min的峰為甘露醇，對應保留時間9. 184min的峰為葡萄糖，對應保留 時間9. 660min的峰為果糖。分別得到峰面積與質量濃度的對應關系，擬合標準曲線，從而， 檢測不同時段發(fā)酵液中底物的濃度，獲得隨時間的消耗曲線。
[0031] (3)代謝組學萃取方法與分析
[0032] 1.胞內代謝物提取：取適量發(fā)酵液，置于40%冷甲醇溶液中（-40°C)，快速中止細 胞代謝反應。600化pm，4°C離屯、lOmin。棄掉上清液，加水洗細胞兩次，再次離屯、，棄掉上清 液。加入預冷的水/甲醇（體積比1: 1，-40°C)混合液1血，并在液氮中反復凍融3次W提 取胞內代謝物。200μL提取物中添加50μL0. 040mg/mL気標記的班巧酸作為內標，真空干 燥。
[003引 2.衍生化：將樣品冷凍干燥后溶于50化20mg/血甲氧基胺鹽酸鹽/化晚溶 液中，40°C90min進行朽化反應；再添加80μΙN-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷）Ξ氣乙酷胺， 37°C30min進行Ξ甲基硅烷化反應，獲得經衍生化的胞內代謝物。
[0034] 3.代謝物的檢測：使用GC-TOF-MS測定，所用色譜條件和質譜參數(shù)具體色譜條 件為：1μL樣品按照1:10的分流比進樣，經DB-5MS毛細色譜柱分離；進樣后柱溫箱程序 升溫，按照先70°C2min、再