專利名稱：用標(biāo)記編碼的復(fù)雜組合化學(xué)文庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及組合化學(xué)，所謂組合化學(xué)包含多級合成，而每一級又納入多種選擇，由此獲得組成不同的大量產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
尋求容易的方法，合成大量各種不同的化合物，然后就其各種可能的生理及其它活性加以篩選，此種途徑具有十分重要的意義。一般這樣的合成包括多級連續(xù)步驟，而每一步又包括將得到的分子加以化學(xué)修飾。例如，化學(xué)修飾可以包括將某種單元如單體或合成聚合物加入到增長序列中或進(jìn)行官能團(tuán)修飾。因?yàn)椴捎蒙婕盎瘜W(xué)修飾的合成法，加入可以是天然存在的、合成的，或二者結(jié)合的某些單元物質(zhì)，例如氨基酸、核苷酸、糖、類脂、或雜環(huán)化合物等，可以創(chuàng)造出大量化合物。因此，即使僅將合成限制于天然存在的單元物質(zhì)或結(jié)構(gòu)單元，可供選擇的數(shù)量仍然極大，即有4種核苷酸、20種普通氨基酸、以及基本上數(shù)量無限的糖可供選擇。
而在生產(chǎn)大量不同化合物，其中每步合成有很多選擇余地時(shí)，一個(gè)固有的不利因素是每種個(gè)體化合物存在量甚少。雖然特定化合物之特性(如生理活性)可以測定出，但往往不可能鑒定出該存在的具體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
并且，生理活性化合物歷史上是使用Edisonian或概率技術(shù)，通過檢測未加工的液體培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)的，而每次只有相當(dāng)少的化合物被測出，或者說只檢測到有限量的天然存在的生理活性化合物的類似結(jié)構(gòu)的同系物。有兩個(gè)主要問題與使用此種未加工液體培養(yǎng)基相關(guān)，即必需將反應(yīng)混合物提純?yōu)閱我唤M份化合物，并需要耗費(fèi)很多努力來確定經(jīng)純化之化合物的結(jié)構(gòu)。
為了尋求解決這些缺點(diǎn)和問題，現(xiàn)已開發(fā)出種種新技術(shù)，其中之一是，以加以控制或隨機(jī)方式加入各種個(gè)體單元作為按順序化學(xué)合成的部份，產(chǎn)生在合成每個(gè)順序階段可能出現(xiàn)的，由于不同選擇所造成的所有按比例，或基本上按比例的可能化合物。然而，為使該項(xiàng)技術(shù)獲得成功，則制備化合物的該技術(shù)必需是能讓人們測定出具體化合物組成，以便使其證明有感興趣之特征的適宜方法。
一個(gè)這樣的方法包括采用一種片狀物，該片狀物表面的物理分離位點(diǎn)能進(jìn)行分離分析(Fodor等人，Science 251767 )。因?yàn)橐阎渲蟹磻?yīng)劑是按順序加入到該各位點(diǎn)的，人們便可以記錄發(fā)生順序，由此也就可記下反應(yīng)系列。然后假如人們將該片狀物用針對具體所需之特征的篩選方法處理，并檢測該特征，人們便可很容易地測定出表現(xiàn)該特征的位點(diǎn)所合成的化合物。
另一技術(shù)包括與合成感興趣之低肽類化合物相似的寡核苷酸推理合成法(Brenner和Lerner，PNAS USA 815381-5383)。
其它技術(shù)也披露在下述公開文獻(xiàn)中Amoto，Science(1992)257，330-331，討論利用共合成DNA標(biāo)記鑒定多肽；Lam等人，Nature(1991)354，82-84，介紹制備大型肽庫的方法；Houghton等人，Nature(1991)354，84-86，以及Tung和Beck-Sickinger，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(1992)91，367-383，介紹建立大型肽文庫的方法；Kerr等人，J.Amer.Chem.Soc.，(1993)115，2529-31，講解合成由肽鏈編碼的低聚物文庫的方法；最后，國際專利申請WO91/17823和WO92/09300也涉及組合文庫。
但是，因?yàn)榍笆鲆话惴椒ㄐ柘嗤糠葸B續(xù)加進(jìn)，因此，主要感興趣的問題在于發(fā)明一種不局限于相同部份連續(xù)加入而生產(chǎn)化合物的方法。此種方法例如可以在甾族化合物、抗生素、糖、輔酶、酶抑制劑、配位體等等的修飾中找到應(yīng)用，這些修飾反應(yīng)常常涉及多步合成，其中，人們希望改變反應(yīng)試劑和/或條件得到多樣性化合物。此類方法中所述試劑可以是有機(jī)試劑或無機(jī)試劑，其中可以引入或加以修飾官能團(tuán)，連接側(cè)基或除去側(cè)基，開環(huán)或閉環(huán)，改變立體化學(xué)結(jié)構(gòu)等等(例如見Bunin和Ellman，JACS 114，10997 )。然而為使該法可行，需要一個(gè)方便的方法鑒定由不同修飾的極廣變化所產(chǎn)生的大量化合物之結(jié)構(gòu)。因此，需要找到可以記錄下來反應(yīng)歷程的方法，并希望所得化合物的結(jié)構(gòu)得到鑒定。
最后，隨著合成的化合物文庫規(guī)律擴(kuò)大，解釋結(jié)構(gòu)和分離產(chǎn)物的已知技術(shù)已經(jīng)基本上失效和不確定，阻礙了對有重要鑒定的任何化合物結(jié)構(gòu)的精確測定。因此，對新方法的基本要求是，能合成復(fù)雜組合的化學(xué)文庫，其中能很容易對文庫中有重要鑒定的個(gè)體化合物進(jìn)行精確結(jié)構(gòu)測定。
前述方法的許多缺點(diǎn)以及許多未滿足之要求，由本發(fā)明便可解決，正如后面將要全面敘述的，本發(fā)明提供了超過前述方法的諸多優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明概述現(xiàn)對編碼組合文庫提供方法和組成，即，在合成的每一階段，在化合物進(jìn)行合成的載體(例如顆粒)上，被專一地進(jìn)行標(biāo)記，以定義隨同該載體上化合物合成時(shí)伴隨的特定事項(xiàng)(通常指所加化學(xué)試劑)。所述標(biāo)記使用鑒定劑分子來完成，該分子記錄合成期間載體顆粒所經(jīng)歷的按順序的事項(xiàng)。由此提供在該載體上生產(chǎn)化合物的反應(yīng)歷程。
各鑒定劑分子特征在于，在所采用的合成條件下是穩(wěn)定的，在合成期間保持與載體相結(jié)合，在能反映給定合成階段特定的反應(yīng)選擇的合成期間，獨(dú)特地定義特定事項(xiàng)，可區(qū)別于檢測期間可能存在的其它成份，以及可以移除由便捷分析技術(shù)加以辨別的標(biāo)記成份。
本發(fā)明所用鑒定劑相互結(jié)合，形成二進(jìn)制或更高階編碼體系，能用相當(dāng)少量的鑒定劑編碼相當(dāng)大量的反應(yīng)產(chǎn)物。例如，當(dāng)用于二進(jìn)碼時(shí)，N種鑒定劑可以獨(dú)特地編碼多達(dá)2N種不同化合物。
而且，本發(fā)明的鑒定劑不需逐次通過前面的鑒定劑結(jié)合，而是獨(dú)立地結(jié)合到基質(zhì)上，直接結(jié)合或通過合成的產(chǎn)物結(jié)合。所述鑒定劑是非可排序的。并且所述鑒定劑含有可裂解成份或部份，它可使容易分析的標(biāo)記成份移除。
組合合成采用限定性固體載體很方便，其上可以進(jìn)行反應(yīng)且鑒定劑可與之結(jié)合。可將攜載最終產(chǎn)品的個(gè)體固體載體或基質(zhì)針對所需特性進(jìn)行篩選，并通過分析相應(yīng)的鑒定劑標(biāo)記測定出反應(yīng)歷程。
附圖簡述

圖1表示標(biāo)記4的質(zhì)譜分析，觀察到相應(yīng)于標(biāo)記4的兩個(gè)信號。
圖2表示標(biāo)記11的質(zhì)譜分析，觀察到相應(yīng)于標(biāo)記11的二個(gè)信號。
圖3表示標(biāo)記13的質(zhì)譜分析，觀察到相應(yīng)于標(biāo)記13的二個(gè)信號。
圖4表示各自以近似相等之易混合在一起時(shí)的標(biāo)記4、11和13的正化學(xué)電離質(zhì)譜圖(PCIMS)，相應(yīng)于各分離標(biāo)記的二個(gè)信號可很容易地加以區(qū)別。
圖5表示僅有未衍生的d-7樣品時(shí)的質(zhì)譜和色譜圖。
圖6表示由于標(biāo)記的衍生作用，顯示出色譜法得到改善后的質(zhì)譜和色譜圖，d-5和d-7混合物樣品被評價(jià)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本申請中所謂“標(biāo)記”或“T”意指具兩種特性的化學(xué)物質(zhì)部份。第一，它能與所有其它化學(xué)物質(zhì)部份相區(qū)別，第二，當(dāng)以10-18-10-9摩爾之量存在時(shí)能被檢測出。這兩種性質(zhì)被包容于單一化學(xué)結(jié)構(gòu)中。此外，這兩種性質(zhì)還可包容在連接在一起的分離化學(xué)結(jié)構(gòu)中。就后者而言，化學(xué)結(jié)構(gòu)之一(稱之為C，如果有一個(gè)以上此種結(jié)構(gòu)，則稱為C，C’等等)提供使該標(biāo)記與其它標(biāo)記可區(qū)分的特性，而另一化學(xué)結(jié)構(gòu)E，則提供使該標(biāo)記可檢測的特性，并且或許還可任意提供使該標(biāo)記可與其它標(biāo)記分開之特性。
本申請中所謂“接頭”或“L”意指具有三種特性的化學(xué)物質(zhì)部份，第一，它可連接于固體載體上，第二，可連接于標(biāo)記上，第三，當(dāng)其與固體載體和標(biāo)記相連時(shí)，該連接可裂解，以使該標(biāo)記可從固體載體上釋放出來。該三種特性可包容于單一化學(xué)結(jié)構(gòu)中，此外，還可包容于連接在一起的三種化學(xué)結(jié)構(gòu)中。就后者而言，化學(xué)結(jié)構(gòu)之一(可稱之為F1)可提供使該接頭連接于固體載體上的性質(zhì)；第二化學(xué)結(jié)構(gòu)(可稱之為V)提供使該接頭可裂解之性質(zhì)；而第三化學(xué)結(jié)構(gòu)(可稱之為A’)則提供使該接頭連接于標(biāo)記上之特性?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)V和A’最好合一及相同，在這種情況下V-A’可稱之為F2。
本申請中所謂“鑒定劑”意指包括標(biāo)記和接頭二者的化學(xué)物質(zhì)本體。因此，從最廣意義上來說，鑒定劑可由式L-T代表，而其特定方案中，可用式F1-V-A’-T；F1-V-A’-C-E(或F1-V-A’-E-C)；L-C-E(或L-E-C)和L-C-E-C’來表示。
本申請中所謂“結(jié)合的鑒定劑”意指連接于固體載體上的鑒定劑。
本文中所謂“選擇”意指組合合成中在一給定階段可替換的多變因素，例如反應(yīng)劑、試劑、反應(yīng)條件及其組合等等。所謂“階段”相當(dāng)于化合物或配位體按順序合成的步驟，所述化合物或配位體是組合合成的最終產(chǎn)物。
所謂“烷基”包括直鏈、支鏈、環(huán)狀的以及其相結(jié)合的結(jié)構(gòu)。這樣，該術(shù)語包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、2-甲基環(huán)丙基等等。低級烷基是C1-C6烷基。低級鏈烯基是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀構(gòu)型及其相結(jié)合的C2-C6鏈烯基。
除非另外說明，一具體分子中任何取代基的定義(如R1，R2，Z等等)與該分子中其它地方它的定義無關(guān)。這樣NR4R4可代表NHH、NHCH3、NHCH2CH3、N(CH3)2等等。
本文所述某些化合物含一個(gè)或多個(gè)不對稱中心，因而可以存在對映異構(gòu)體、非對映體、和其它立體異構(gòu)形式。本發(fā)明意味著包括所有此種可能的立體異構(gòu)體，以及其外消旋及光學(xué)純形式。使用手性合成聚合物、手性試劑，或常規(guī)拆分技術(shù)，可以制備旋光活性(R)和(S)異構(gòu)體。若本文所述化合物含烯類雙鍵，則包括E和Z兩種幾何異構(gòu)體。
在其上進(jìn)行本發(fā)明組合合成的材料，本文中，可替換使用下述稱呼珠粒、固體表面、(固體)基質(zhì)、顆粒、載體等等。這些術(shù)語趨于包括a)固體載體，例如珠粒、片、園片、毛細(xì)管、中空纖維、針狀體、固體纖維、纖維素珠、有孔玻璃珠、硅膠、用二乙烯基苯交聯(lián)(或未交聯(lián))的聚苯乙烯珠、接枝共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳膠珠、用N，N’-雙-丙烯酰乙二胺交聯(lián)(或未交聯(lián))的二甲基丙烯酰胺珠、涂覆有疏水聚合物的玻璃顆粒等等，即具有堅(jiān)固或半堅(jiān)固表面的材料；和b)可溶性載體，例如低分子量未交聯(lián)的聚苯乙烯。
這些材料必需含官能團(tuán)，或者是能夠官能化的，以便鑒定劑或產(chǎn)物中間體可連接于其上。
此外，下面的簡寫表示下述意義AcOH＝乙酸BSA ＝二(三甲基硅甲基)乙酰胺CAN ＝硝酸鈰(iv)銨DEAD ＝偶氮二甲酸二乙酯DCM ＝二氯甲烷DIC ＝二異丙基碳二亞胺DMF ＝N，N-二甲基甲酰胺Fmoc ＝9-芴基甲氧羰基
HOBt＝1-羥基苯并三唑PhMe＝甲苯r.t. ＝室溫TFA ＝三氟乙酸THF ＝四氫呋喃本發(fā)明關(guān)系到產(chǎn)品(即化合物)文庫的生產(chǎn)，其中該文庫中存在的個(gè)體產(chǎn)品或化合物可以是相互物理分離開的，并可結(jié)合于固體載體上或從固體載體解離下后就其有意義特性進(jìn)行篩選。因?yàn)檫M(jìn)行一系列合成，其中每一合成階段，每一個(gè)體中間體均以各種方式處理，因此產(chǎn)生大量產(chǎn)物，每種產(chǎn)物僅以少量存在，常常少于100pmol，更通常少于10nmol。由于這樣產(chǎn)生的最終產(chǎn)物或化合物量很少，通過分離和結(jié)構(gòu)解釋未鑒定這些產(chǎn)物一般是不可能的。而且，除了加入相似物質(zhì)單元之外，其余所涉及的按順序合成中，假使并不是不可能使用一般可獲取的產(chǎn)物量，那么分析也將是很費(fèi)力的。然而，若配合該系列合成中每項(xiàng)選擇或多項(xiàng)選擇之結(jié)合(例如“加入試劑A”或“加入試劑A、然后加入試劑B、并加熱至100℃2小時(shí)”)加入一組鑒定劑(該鑒定劑限定各變化因素的選擇，例如反應(yīng)劑、試劑、反應(yīng)條件或這些因素之結(jié)合)，則人們可以利用這些鑒定劑定義各可定義及可分離基質(zhì)的反應(yīng)歷程。分析從鑒定劑中解離的標(biāo)記，使得反應(yīng)歷程的鑒定十分快捷，其量可限于皮摩爾級或更低濃度例如毫微微摩爾或更低。人們可以測定合成產(chǎn)物的特征，即通過各種篩選技術(shù)，通常測定化學(xué)和生物學(xué)特征，然后借助與產(chǎn)品相結(jié)合的標(biāo)記鑒定反應(yīng)歷程，并由此鑒定出具所需特征之產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
這種即時(shí)多標(biāo)記體系的采用，避免了必需進(jìn)行復(fù)雜的共合成反應(yīng)的缺點(diǎn)(此種復(fù)雜共合成減低產(chǎn)量并要求多保護(hù)基)，并避免了使用作為化學(xué)標(biāo)記的可定序標(biāo)記的必要性。必需多保護(hù)基和所有已知可定序標(biāo)記分子(即核酸或肽低聚物)的固有不穩(wěn)定性，二者嚴(yán)重限制了可用于所述文庫單元或配位體合成的化學(xué)途徑。
并且，使用二進(jìn)制或較高階多標(biāo)記體系，大大降低了合成中每一階段編碼試劑/反應(yīng)劑選擇所必需的標(biāo)記數(shù)量。例如，假定一個(gè)特定合成階段，對試劑可以有128種不同的選擇，則二進(jìn)制體系只需要7種標(biāo)記。這可造成實(shí)用的編碼體系和不實(shí)用體系之間的差別，因?yàn)橐@得并使用其它體系所需的大量可區(qū)別標(biāo)記可能是辦不到的。采用本發(fā)明的二進(jìn)制體系，可利用30種區(qū)分標(biāo)記，足夠編碼＞109種不同合成。
重要的是，本發(fā)明方法采用為解碼之目的能從配位體或固體載體上解離下來的標(biāo)記。此種可解離性也使得該標(biāo)記能基于一種以上的根據(jù)被區(qū)分，具體來說，它們可以被分離出(例如根據(jù)色譜保留時(shí)間)，然后進(jìn)行分析(例如第二根據(jù)是光譜特性，如質(zhì)譜m/e，或電泳動性)。有多種根據(jù)加以區(qū)分，便使得以少量標(biāo)記可編碼大量情報(bào)。
解離也使得標(biāo)記可在很低水平被檢測，因?yàn)樗鼈兛梢詮妮d體基質(zhì)(合成在其上進(jìn)行)和從合成的配位體上移出，否則二者中哪一種的存在都可能提供虛假背景信號，例如熒光猝滅等等。
可解離標(biāo)記也有助于通過自動取樣體系快速分析，并允許借助對官能團(tuán)的檢測進(jìn)行選擇性衍生作用，消除檢測部份和合成中所用反應(yīng)條件之間的任何不相容性。
任何標(biāo)記方案固有原則是，要求標(biāo)記的化學(xué)特征和其摻入的化學(xué)階段，要與配位體特征及其合成階段相容，反之亦然。一般化學(xué)惰性的標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)(如其后例舉的取代的芳氧基多亞甲基部份)是可以采用于配位體合成中的化學(xué)轉(zhuǎn)化和化學(xué)官能化的范圍較大。
本發(fā)明化學(xué)穩(wěn)定性標(biāo)記的另一優(yōu)點(diǎn)，是其與多種不同的快速、方便的分離和分析方法(例如氣相色譜和質(zhì)譜)相容。而且，本發(fā)明的有機(jī)標(biāo)記一般不與生物學(xué)受體發(fā)生特異性的相互作用。因此，這些標(biāo)記在生物檢測時(shí)一般不給出虛假結(jié)果，一般也不被酶或其它生物分子修飾。
最后，本發(fā)明標(biāo)記的化學(xué)穩(wěn)定性，使得它們可用前述促進(jìn)其分析敏感性的極為多樣之方法解離下來。
因此，本發(fā)明提供了編碼組合合成的方法和組合物，由此合成的每一階段提供一種或多種鑒定劑，所述鑒定劑編碼事項(xiàng)與在載體或顆粒上合成化合物時(shí)的顆粒階段有關(guān)。所述事項(xiàng)包括在該反應(yīng)階段選擇的反應(yīng)劑和/或反應(yīng)條件，其中每個(gè)此種階段，可涉及在相同或不同條件下的一種或多種，相同或不同的反應(yīng)劑，例如部分反應(yīng)、多樣加入、加入速度、反應(yīng)劑的不同結(jié)合等等。此外，顆粒組可和其它顆粒組隔絕，并經(jīng)歷按順序合成過程中，某一時(shí)間的不同系列事項(xiàng)。
若提供N種鑒定劑，每種有M種不同狀態(tài)，那么可以獨(dú)特地定義MN種不同的合成。若M＝2，則可以包括鑒定劑“存在”或“不存在”這樣兩種狀態(tài)，這樣該合成由基數(shù)2，或二進(jìn)碼限定。若M＝3，那么所述三種狀態(tài)便是“以兩種不同濃度存在的鑒定劑”或“鑒定劑不存在”，該合成將由基數(shù)3碼限定。本文中，此種M＞2的基數(shù)M碼稱之為高階碼。高階碼超過二進(jìn)碼的優(yōu)點(diǎn)在于，編碼同樣量的有關(guān)合成情報(bào)只需較少種的鑒定劑。生產(chǎn)的產(chǎn)物將作為系列合成之結(jié)果被定義。在合成的每一階段，有很多種反應(yīng)劑和/或試劑和/或條件可利用，結(jié)果產(chǎn)生之產(chǎn)物特性與可鑒定的并通?？煞蛛x的實(shí)體(例如標(biāo)記)有關(guān)。有關(guān)“反應(yīng)劑”和“試劑”的意義，大部份情況下，傾向于所謂反應(yīng)劑是要結(jié)合入產(chǎn)物中的物質(zhì)，例如氨基酸、核苷酸、親核試劑、親電試劑、雙烯、烷基化或環(huán)化試劑、二胺、或任何其它合成聚合物等等。而試劑則可以變成，也可以不變成結(jié)合入產(chǎn)物中的部份，例如堿、酸、熱、氧化劑或還原劑，但二者均納入所謂“化學(xué)劑”這一術(shù)語中。該合成可以包括結(jié)合入產(chǎn)物中的個(gè)體反應(yīng)劑。此外，在某一個(gè)階段還可包括結(jié)果修飾反應(yīng)中間體的一種或多種反應(yīng)。許多情況下，將包括這些可能性之結(jié)合。
若使用基數(shù)2或二進(jìn)碼(M＝2)和三種鑒定劑(N＝3)，則可以編碼合成中某一給定階段多達(dá)8(23)種因素。如果三種鑒定劑分別由T1、T2和T3代表，而每種鑒定劑“存在”或“不存在”分別用0或1表示，這樣所述8種不同因素可按如下方式以二進(jìn)碼表示

同樣，甚至可以用更多鑒定劑編碼更多有關(guān)合成情報(bào)。例如9種鑒定劑(N＝3)和基數(shù)2碼(M＝2)，將達(dá)到29(或512)種不同因素選擇被編碼。使用基數(shù)3碼(M＝3)和3種鑒定劑(N＝3)，則使得多至27(33)種因素選擇被編碼。如果三種鑒定劑由T1、T2、T3代表，不存在鑒定劑由‘0’代表，每珠以約0.5pmol之量存在的情況由‘1’代表，而每珠以約1.0pmol之量存在由‘2’代表，那么27種不同因素可由三種鑒定劑以基數(shù)3碼表示如下

為使所述高階編碼方案實(shí)用，將一種附加鑒定劑，以給定量(如約1.0pmol/珠)加入到文庫中所有成員中，提供測定所有鑒定劑量的參照標(biāo)準(zhǔn)。鑒定劑量可以采用配有各種檢測方法的氣相色譜及高壓液相色譜測定。若用高壓液相色譜，如果該鑒定劑是由不同量放射性核素(例如氚3H)以放射性標(biāo)記過的，那么可以采用閃爍計(jì)數(shù)法便捷地測定其量。測定3H對14C之比(這樣使用14C作為標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行定量分析特別方便。該方法中，可以區(qū)分多達(dá)10種不同量的3H，則應(yīng)基數(shù)10或10階碼(M＝10)，只使用很少種類鑒定劑，該碼便可編碼大量情報(bào)。產(chǎn)物及合成策略大部份情況下，本發(fā)明方法所得產(chǎn)物將是有機(jī)化合物，其中系列合成將包括加入或除去化學(xué)物質(zhì)單元，涉及修飾的反應(yīng)或引入一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)、開環(huán)、關(guān)環(huán)等等?；瘜W(xué)物質(zhì)單元可取之多種形式，既可是天然存在的，也可是合成的，例如親核試劑、親電試劑、雙烯、烷基化劑或酰化劑、二胺、核苷酸、氨基酸、糖類脂、或其衍生物、有機(jī)單體、合成聚合物、以及其組合。另外，反應(yīng)可以包括引起烷基化作用、?；饔?、硝化作用、鹵化作用、氧化作用、還原作用、水解作用、取代作用、消除作用、加成作用等等的反應(yīng)。該方法可以以極少之量生產(chǎn)非低聚體、低聚體或其組合物，其中反應(yīng)歷程和特定情況下的組合可由存在的標(biāo)記限定。非低聚體包括極為廣泛的有機(jī)分子，例如雜環(huán)類、芳族類、脂環(huán)類、脂肪族類及其組合，包括甾類抗生素、酶抑制劑、配位體、激素、藥物、生物堿、阿片、萜烴、紫菜堿、毒素、催化劑以及其結(jié)合。低聚體包括寡肽、寡核苷酸、低聚糖、多脂、聚酯、聚酰胺、聚尿烷、聚脲、聚醚、聚磷衍生物，(所述磷衍生物為磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、亞磷酸酯或亞磷酰胺)、聚硫衍生物，(所述硫衍生物為砜、磺酸酯、亞硫酸酯、磺酰胺或亞磺酰胺)，其中對于磷和硫衍生物來說，絕大部份所示雜原子將鍵合于C、H、N、O或S及其結(jié)合上。
反應(yīng)可以包括在核心分子結(jié)構(gòu)的各種隨意位點(diǎn)修飾，或在特定位點(diǎn)修飾。例如溴化一種多環(huán)化合物時(shí)，溴化作用可在多種位置發(fā)生，或者可以使用例如N-溴代琥珀酰亞胺之類溴化劑，針對一特定位點(diǎn)進(jìn)行。大多數(shù)情況下，反應(yīng)將涉及單一位點(diǎn)或等同位點(diǎn)，例如乙二醇的兩個(gè)羥基之一。
大多數(shù)情況下，除了雙官能團(tuán)化合物用同一連接官能團(tuán)連接外，例如氨基酸和酰氨鍵、核苷酸和磷酸酯鍵、或其類似化合物(如氨基異氰酸酯和脲鍵)，本發(fā)明合成將有至少兩個(gè)步驟。
本發(fā)明方法允許各階段反應(yīng)之多樣性，這取決于有關(guān)試劑和條件的選擇。這樣，就氨基酸而言，若使用普通天然編碼氨基酸，則有多達(dá)20種氨基酸包括在內(nèi)，而如果希望使用其它氨基酸，例如，D-氨基酸、除α-位之外具其它氨基的氨基酸、側(cè)鏈上有不同取代基或氨基上有取代基的氨基酸等等，那么就有寬得多的選擇。就不同的核酸而言，通常將有DNA或RNA所用的至多4種天然核酸，如果不選擇這些特定核酸，則有大得多的數(shù)量可采用。就糖和類脂而言，存在非常之多的化合物，若使用各種取代基，那么這些化合物還可進(jìn)一步增加，所有這些化合物均可用于該合成。對于個(gè)別有機(jī)化合物而言，此選擇可達(dá)天文數(shù)字。此外，一種物質(zhì)還可有許多類似物，其中脲、尿烷、羰基亞甲基等可以代替肽鍵；各種有機(jī)和無機(jī)基團(tuán)可以代替磷酸酯鍵，而氮或硫可以取代醚鍵中的氧，反之亦然。
合成策略將隨人們希望生產(chǎn)的產(chǎn)物族之性質(zhì)而異。因此，所述策略必須考慮按階段改變產(chǎn)物性質(zhì)的能力，同時(shí)允許保留前面各階段結(jié)果，并需參與下一階段反應(yīng)。若各物質(zhì)單元是同一族，例如核苷酸、氨基酸和糖，則該合成策略是利用相對早已確定的，頻繁使用的常規(guī)化學(xué)法。因此，對于核苷酸而言，可采用磷酰胺化或亞磷酸化化學(xué)法，而對于寡肽而言，則可用借助常規(guī)保護(hù)基的Fmoc或Boc化學(xué)法；對于糖而言，所述策略較少常規(guī)使用，但大量保護(hù)基、活性官能團(tuán)和條件對合成多糖已是確定的。對于其它化學(xué)類型而言，人們將找到個(gè)體單元的性質(zhì)，并且將得知合成的機(jī)會，或者設(shè)計(jì)出相適應(yīng)的合成機(jī)會。
在某些例子中，人們可以希望在相同或不同的階段引入相同或不同的部件。例如，人們希望將普通肽功能單元(例如纖維連結(jié)素結(jié)合單元，RGDS)、多糖(如Lex)、有機(jī)基團(tuán)(例如內(nèi)酰胺、內(nèi)酯、苯環(huán)、烯烴、乙二醇、硫醚等等)在合成期間引入。以該方式，可以按可變性引入分子的前后。這些情況可以僅僅包括有多種選擇的很少幾個(gè)步驟，而產(chǎn)生與特定功能實(shí)體相關(guān)的大量產(chǎn)物。這對于有興趣得到與具有有益特征之核心分子或單元相關(guān)的大量衍生物，有特殊的應(yīng)用價(jià)值。
在開發(fā)合成策略中，人們可以實(shí)現(xiàn)在組合合成過程中制備的幾種化合物的批量合成。舉一個(gè)極端的例子，例如，可以包括空間障礙，電荷和/或偶極相互作用，交替反應(yīng)途徑等情況的合成，人們可以使條件最佳化，增加在其它情況下不能形成或僅以低產(chǎn)量形成的化合物的產(chǎn)量。以這種方式，則可以使組合合成期間反應(yīng)條件多樣性，包括不同溶劑，溫度，時(shí)間，濃度等等。而且，還可以使用批量合成，其提供的特定化合物濃度比組合合成高得多，以此促進(jìn)化合物活性鑒定。載體連接和解離該合成方法要求提供包括不同反應(yīng)劑的多種不同反應(yīng)，結(jié)果在合成各階段產(chǎn)生多種不同的中間體。當(dāng)可利用其它技術(shù)時(shí)，采用小型固定固體基質(zhì)，如市售珠粒，可最為便捷地實(shí)現(xiàn)，所述珠粒可以很容易混合，分離，及用作按順序合成的固體基質(zhì)。所述固體基質(zhì)可以是固態(tài)的，有孔的，可形變的或堅(jiān)硬的，并有任何合宜的結(jié)構(gòu)和形狀。某些例子中，磁性的或具熒光的珠粒很有用。所述珠粒直徑一般至少為10-2000μm，通常至少為20-500μm，更為普遍的是至少為50-250μm。
對于顆?；蛑榱６裕梢圆捎萌魏魏线m的組合，所述珠粒組合在各處理階段將保持其機(jī)械整體性，可以是功能化的，有官能團(tuán)或允許同活性物種反應(yīng)，允許進(jìn)行系列合成，以及連接鑒定劑，可以容易地混合和分離，并且允許標(biāo)記和產(chǎn)物便捷地解離?？梢圆捎玫闹榱０ɡw維珠、控制孔玻璃珠、硅膠、聚苯乙烯珠、尤其是用二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯珠、聚亞乙基二醇/聚苯乙烯之類的接枝共聚物珠、聚丙烯酰胺珠、乳膠珠、二甲基丙烯酰胺珠(特別是以N，N’-二丙烯酰亞乙基二胺交聯(lián)的和包含N-叔丁氧羰基-β-丙氨酰-N’-丙烯酰六亞甲基二胺的)、組合珠，例如用疏水聚合物(如交聯(lián)聚苯乙烯、氟代乙烯聚合物接枝的線性聚苯乙烯之類)涂覆的玻璃顆粒等等。包括共價(jià)連接活性官能團(tuán)的有用固體載體(顆粒)的綜述，可參見Atherton等人，肽化學(xué)前景(Prospective in Peptide Chemistry)，Karger，101-117(1981)；Amamath等人，化學(xué)綜述(Chem.Rev.)，77183-217(1977)；和Fridkin，肽(The Peptides)，Vol.2，Chapter 3，Academic Press，Inc.，(1979)，pp.333-363。
根據(jù)合成程序的性質(zhì)及最終產(chǎn)物的檢測，對這種或那種珠?？梢杂胁煌潭鹊匦枨?。雖然珠粒特別合宜，但其它固體載體也可使用，例如毛細(xì)管、中空纖維、針狀物、固體纖維等，其中固體載體的大小在反應(yīng)歷程中允許按所希望的改變。
根據(jù)合成性質(zhì)，所述珠粒可按不同方式進(jìn)行功能化處理，使之能連接于初始反應(yīng)劑中。這可以通過非活潑鍵，例如酯鍵、酰氨鍵、胺鍵、醚鍵連接，或通過硫、硅、碳等原子連接，視人們是否希望能從珠粒上移出產(chǎn)物而定。通常與珠粒鍵合的鍵是永久性的，但珠粒和產(chǎn)物之間的連接可以可裂解性的，例如表1所例舉的?？刹捎脙煞N或多種不同鍵使得標(biāo)記和/或產(chǎn)物有差別的釋放出。
根據(jù)結(jié)合于顆粒上的連接基團(tuán)的性質(zhì)，珠粒上的活性官能團(tuán)不一定是必需的，還允許是插進(jìn)單鍵或雙鍵之中的連接方式，例如可利用帶有碳雙鍵、氮雙鍵或其它高活性類雙鍵。這種情況下，可裂解鍵由將產(chǎn)物或標(biāo)記結(jié)合于珠粒上的連接基團(tuán)提供。
當(dāng)產(chǎn)物恒定連接時(shí)，則希望連于珠粒的鍵拉長，以免該珠粒不會對篩選期間產(chǎn)物的結(jié)合造成空間障礙?？刹捎酶鞣N鍵，特別是親水鍵例如聚亞乙基氧、糖類、多羥基化合物、酯、酰胺及其結(jié)合等等。
存在于珠粒上的官能團(tuán)可以包括羥基、羧基、偕鹵代亞氨基、氨基、硫基、活性鹵素(Cl或Br)或擬鹵素(如-CF3、-CN等)、羰基、硅甲基、甲苯磺酰基、甲磺酸酯基、對溴苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基等等。選擇官能團(tuán)時(shí)，對某些實(shí)際情況應(yīng)加以考慮，即鑒定劑也通常要結(jié)合于珠粒上。應(yīng)考慮的問題包括應(yīng)用相同或不同的官能團(tuán)與產(chǎn)物和鑒定劑是否有關(guān)，以及該兩官能團(tuán)與產(chǎn)物或鑒定劑連接和標(biāo)記解離專用階段是否相容。對產(chǎn)物可以采用不同連接基團(tuán)，以便使產(chǎn)物可以以特定的量有選擇地釋放出來。某此情況下，顆?？梢杂屑右员Ｗo(hù)的官能團(tuán)，在每一步驟之前，可以部份的或全部去保護(hù)基，若全部去保護(hù)基，則需再保護(hù)。例如在多肽合成中可以用芐酯基保護(hù)氨基，用芐基醚保護(hù)羥基等等。
若希望產(chǎn)物解離下來，則有很多官能團(tuán)和反應(yīng)劑可供利用。較合宜的是醚，其中取代的芐基醚或其衍生物，如二苯甲基醚、2，3-二氫化茚醚等，可以由酸或溫和的還原條件裂解。此外，也可采用β-消除反應(yīng)，其中可用弱堿釋放產(chǎn)物。也可以采用乙縮醛、包括其硫代類似物，其中可以借助于弱酸，尤其是在有俘獲羰基的化合物存在下。將甲醛、HCl和乙醇部份結(jié)合，形成α-氯代乙醚，然后再將其與珠粒上的羥基功能團(tuán)偶合形成乙縮醛。還可以采用各種光活性鍵、例如O-硝基芐基、7-硝基-2，3-二氫化茚基、2-硝基二苯甲基醚或酯等等。酯和酰胺可以作為接頭，其中形成半酸酯或酰胺，特別是用環(huán)酐，然后使用碳化二亞胺之類的偶合劑再與珠粒上的羥基或氨基官能團(tuán)反應(yīng)?？捎秒淖鳛榻宇^，其中將所述序列進(jìn)行酶水解，特別是酶能識別特定序列。使用碳酸衍生物，例如光氣、羰基二咪唑等和弱堿可以制備碳酸酯或氨基甲酸酯，該鍵可以用酸、堿或強(qiáng)還原劑(如LiAIH4)使之裂解，特別是裂解碳酸酯。為全面了解可裂解基團(tuán)，例如參見Green和Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，2nd ed. Wiley(1991)一書。已被開發(fā)的各種體系的多樣性，使得產(chǎn)物和鑒定劑的連接，及產(chǎn)物和標(biāo)記的有差別解離，正如所希望的，其條件可在很廣范圍內(nèi)變化。
下表表示各種所述連接單元(即式I中的F2)及其裂解方式表1.各所述連接單元及其裂解方式

*(L)表示標(biāo)記或產(chǎn)物的連接點(diǎn)
(L)是直接鍵合于所示原子，或通過連接基團(tuán)(如C(O)O)間接鍵合的標(biāo)記或產(chǎn)物，所述連接基團(tuán)可以提供適宜的功能團(tuán)。
R是H或低級烷基。接頭針對配位體選擇接頭是合成策略的一部分，因?yàn)樗鲞B接基團(tuán)在產(chǎn)物上有可能形成殘留功能團(tuán)，對于從珠粒上解離之后進(jìn)一步修飾產(chǎn)物是很實(shí)用的。設(shè)計(jì)合成策略時(shí)，人們可以使用在產(chǎn)物中保留的官能團(tuán)，作為供連接基團(tuán)連接的點(diǎn)。此外，若由產(chǎn)物的性質(zhì)所決定，則可使用裂解或解離法除去連接官能團(tuán)，例如用金屬氫化物或酸裂解芳硫醚或硅甲基。因?yàn)樵谠S多情況下，合成策略將能夠納入供連接的功能位，該功能可利用來挑選連接基團(tuán)。在某些情況下，渴望在將產(chǎn)物連接到載體的位點(diǎn)上，有不同的官能團(tuán)，這樣可有必要使用不同的連接方式，所述不同方式必定提供相同解離方法或不同解離方法，解離可以同時(shí)完成或陸續(xù)完成，例如用光照射，和酸水解。
為將鑒定劑結(jié)合于顆粒，特別有用的是碳雙鍵或氮雙鍵，它們可以插入碳原子和氫原子之間形成共價(jià)鍵，或插入烯鍵形成環(huán)丙烷(就碳雙鍵而言)，或形成氮丙啶(就氮雙鍵而言)。
對于帶有碳雙鍵或氮雙鍵連接基，各種取代苯可以使用，其中苯被能提供碳雙鍵的基團(tuán)CHN2、COCHN2、SO2CHN2取代；或被能提供氮雙鍵的基團(tuán)N3、NO2、NO、SO2N3取代。碳雙鍵可以通過光解、熱解、或用低價(jià)過渡金屬化合物(如Rh(OAc)2)處理由重氮烷烴衍生物而產(chǎn)生。氮雙鍵可通過光解或熱解由疊氮化合物而產(chǎn)生，并可使用三價(jià)磷化合物或低價(jià)過渡金屬從硝基、亞硝基和疊氮化合物產(chǎn)生。
特別有用的一類接頭部分(F1-F2-)包括2-硝基-4-羧基芐氧基、2-硝基-4-重氮乙?；S氧基、4-或5-疊氮甲基羰基-2-甲氧基苯氧基和2-甲氧基-4-或5-羧基苯氧基部份。
T代表標(biāo)記，Z代表碳雙鍵或氮雙鍵前體或羧基，而R是H或低級烷基的所述化合物現(xiàn)列舉如下，對于光化學(xué)標(biāo)記解離(如用約350nm的紫外光)的T3-Z-2-硝基芐基醚、T4-Z-2-硝基芐基醚、T5-Z-2-硝基芐基醚、T6-Z-2-硝基芐基醚、T2-Z-4-硝基芐基醚、T3-Z-4-硝基芐基醚、T3-Z-2-硝基芐基碳酸酯、T4-Z-2-硝基芐基碳酸酯、T5-Z-2-硝基芐基碳酸酯、T6-Z-2-硝基芐基碳酸酯、T2-Z-4-硝基芐基碳酸酯和T3-Z-4-硝基芐基碳酸酯。對于氧化解離(如用硝酸鈰銨)的1-OT-2-OR-3-Z-苯、1-OT-2-OR-4-Z-苯、1-OT-2-OR-5-Z-苯、1-OT-2-OR-6-Z-苯、1-OT-4-OR-2-Z-苯和1-OT-4-OR-3-Z-苯。對于還原或烷基化解離(如用鋰/氨或碘甲烷)的T(2-Z-苯基)硫醚、T(3-Z-苯基)硫醚和T(4-Z-苯基)硫醚。對于脫硅甲基解離(如使用氟化叔丁基銨或酸)的T二烷基-(2-Z-苯基)甲硅醚、T二烷基-(3-Z-苯基)甲硅醚、T二烷基-(4-Z-苯基)甲硅醚、T-二烷基-(2-Z-苯基)硅烷、T-二烷基-(3-Z-苯基)硅烷和T-二烷基-(4-Z-苯基)硅烷。組合合成所述合成通常包括涉及至少兩種選擇，往往至少4種選擇，甚至可包括10種以上選擇的各階段。一般來說，每階段的選擇數(shù)不超過約100，更通常不超過約50。而階段數(shù)至少約3，更常用至少約4，往往至少5，但不超過30左右，更通常不超過25左右，優(yōu)選不超過20，更優(yōu)選不超過10左右，往往不超過8左右。
所述選擇數(shù)和階段數(shù)通常將產(chǎn)生至少足夠多樣性的大量化合物，提供至少有一種化合物將具有感興趣之特征的適當(dāng)可能性。本發(fā)明方法可以產(chǎn)生25000種以上的化合物，通常50000種以上、優(yōu)選2000000種以上的化合物，甚至百萬以上皆可生產(chǎn)。這就是說通常至少20種化合物，但可以達(dá)106或更多。
某些合成中，一個(gè)階段只可包括一種或二種選擇，但這種情況通常只限于人們希望生產(chǎn)的化合物數(shù)量有限和特定的合成策略。許多這些策略中，限制選擇數(shù)，即少于5種選擇，更通常2種或更少選擇，將限于階段總數(shù)40％以上，或者在順序合成的2個(gè)階段，更通常限于階段總數(shù)的20％。反應(yīng)程序進(jìn)行該合成可以用許多珠粒開始，通常至少103，更通常104，希望至少105，而一般不超過1015，更通常不超過至少1010。根據(jù)第一階段的選擇數(shù)，將該顆粒分裝進(jìn)與之?dāng)?shù)量相同的容器中。所述容器可以用微孔平板、個(gè)體容器、柱子、凝膠、Terasaki板、燒瓶、Merrifield瓶等等。該顆粒通常將分成至少每組一個(gè)顆粒的各組，通常是許多顆粒一組，一般1000或更多，甚至可達(dá)105或更多，這取決于顆?？倲?shù)及該階段所包括的選擇數(shù)。
在各獨(dú)立容器中然后加入專用試劑，在該階段中將其處理，并加入鑒定劑編碼試劑及該階段。每一階段應(yīng)提供所希望之反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，可洗滌該珠粒除去試劑，接著將所有珠?；旌显谝黄?，然后再根據(jù)下一階段的選擇數(shù)將其分開。將這種分開珠粒，接著標(biāo)記和合成(反之亦然)，然后再組合珠粒的程序反復(fù)進(jìn)行，直至該組合合成完成為止。
某些例子中，同一反應(yīng)可以在2個(gè)或更多容器中進(jìn)行，與其它選擇相比可增加某特定階段的某特定反應(yīng)產(chǎn)物的比例。在其它例子中，一個(gè)或多個(gè)階段可將珠粒的一部份置于一旁不進(jìn)行反應(yīng)，以便增加伴隨最終產(chǎn)物的多樣性。在另外的情況下，可按不同合成途徑批量生產(chǎn)。
為了記錄或編碼珠粒上的反應(yīng)歷程，每一階段，都應(yīng)標(biāo)記以其各自獨(dú)特的鑒定劑組合相伴隨的與每一選擇和步驟有關(guān)的珠粒。此外，也可使用單一標(biāo)記記錄或編碼該反應(yīng)歷程。根據(jù)所涉及的化學(xué)特性，該標(biāo)記可在包含每種選擇的反應(yīng)以前，以后，或同時(shí)進(jìn)行。而且為對照起見，在任何階段均可取出珠粒樣品，將其標(biāo)記的一部份裂解出和解碼，以證實(shí)正確的標(biāo)記已結(jié)合到珠粒樣品上。
如前所述，某些例子中，各份顆粒將分成子集，其中每一子集然后進(jìn)行不同的反應(yīng)系列。任何時(shí)候，各部份可再結(jié)合成單一混合物再進(jìn)行隨后的反應(yīng)。例如，若在一個(gè)階段，引入了不飽和化合物，將其分成兩個(gè)子集，其中一個(gè)子集中將不飽和物還原，而另一子集中則將其環(huán)氧化。然后該兩子集可以進(jìn)行不同的反應(yīng)系列。
產(chǎn)物合成完成之后，配位體從珠粒上解離下來之后，或仍連于其上時(shí)，針對其所需性質(zhì)進(jìn)行篩選。后一情況下，珠?？梢栽谟惺髥慰寺】贵wY的水緩中液中培養(yǎng)。培養(yǎng)和洗滌之后，該珠粒再與針對鼠抗體的堿性磷酸酶共軛的兔(或山羊)多克隆抗體一起培養(yǎng)。用熒光沉淀顯影劑鑒定出與單克隆抗體連接的熒光珠粒，并從大部份清潔的未污染的珠粒中人工分離出來。此外，也可使用熒光激活細(xì)胞分析器將熒光珠粒分離出，只要在分析條件下標(biāo)記仍保留在珠粒上即可，將各挑選出的熒光珠粒進(jìn)行處理，使所有標(biāo)記的至少某些部份從珠粒上釋放出來。
在合成不涉及分步加入同樣物質(zhì)單元，或形成反應(yīng)付產(chǎn)物的情況下，很多種化合物將出現(xiàn)在單一珠粒上，或活性化合物的結(jié)構(gòu)不可能從其反應(yīng)歷程知曉。根據(jù)本發(fā)明，因?yàn)橹婪磻?yīng)歷程，可以較大規(guī)模反復(fù)合成，以便獲得足量產(chǎn)物，并分離該產(chǎn)物及將活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
本發(fā)明方法可使用各種反應(yīng)序列來說明。例如，可將醛或酮與乙酸酯結(jié)合，在Claisen反應(yīng)條件下制備丁烯酸酯，得到未取代的至四取代的丁烯酸酯，由此制備巴比妥酸鹽。所述丁烯酸酯然后在Michael反應(yīng)條件下第二次與乙酸酯結(jié)合，由此可獲得至多達(dá)6個(gè)取代基的戊二酸酯，然后使該戊二酸酯與氨或單取代胺結(jié)合得到巴比妥酸鹽。若改變?nèi)┖屯?，改變乙酸酯及胺，那么可以獲得大量各種各樣的巴比妥酸鹽。如果在一個(gè)或多個(gè)取代基上還存在官能團(tuán)，例如氨基、羧基、羥基、硫羥基等等，這些基團(tuán)則可按所希望的加以保護(hù)或修飾。
在由Bunin和Ellman(J.Am.Chem.Soc.，114，10997(1992))所述另一例子中，生產(chǎn)苯并二氮雜、合成從通過如4’-氧基基團(tuán)將不同氨基加以保護(hù)的取代的2-氨基二苯甲酮結(jié)合于個(gè)體顆粒上開始。
不同反應(yīng)器中的各不同組顆粒，在脫保護(hù)之后，在形成肽鍵的條件下加入不同種Fmoc保護(hù)的α-氨基酸，所述氨基酸是天然存在的或合成的。脫保護(hù)后，引起內(nèi)部環(huán)化反應(yīng)，接著用烷基化試劑在氮上進(jìn)行烷基化反應(yīng)，僅需三個(gè)步驟，便可制備出大量種類的苯并二氮雜化合物，并將該文庫針對其安神活性或其它活性進(jìn)行篩選。
可以生產(chǎn)出廣泛多樣性的藥品類似物，例如enalapril之類的降血壓劑；丙醇之類的β-阻斷劑；甲腈咪胍和雷尼替丁之類的抗?jié)儎?H2-受體拮抗劑)；異康唑之類的抗真菌劑(膽固醇脫甲基酶抑制劑)；苯甲二氮之類的抗焦慮劑；阿斯匹林、苯乙酰胺和芬太尼之類的鎮(zhèn)痛藥；萬古霉素、青霉素和頭孢菌素之類的抗生素；可的松之類的消炎劑；孕激素之類的避孕藥；RU-456之類的墮胎藥；撲爾敏之類的抗組胺劑；可待因之類的鎮(zhèn)咳藥；巴比妥之類的安眠藥等等。
作為例證的甲腈咪胍類似物的合成包括羥甲基取代的組氨酸和相關(guān)雜環(huán)，其中保留的碳原子或氮原子可以進(jìn)一步取代或不取代，還包括α、ω-氨基烷硫醇和取代的硫代脒酯，其中氮上的基團(tuán)還可變化，例如硝基，氰基，羥基，烷基及其結(jié)合等等。鑒定劑本發(fā)明的鑒定劑可以由式I代表F1-F2-C-E-C’I其中F1-F2是接頭，能使之連接于載體上并使標(biāo)記從載體上解離下來；和C-E-C’是能檢測且具可區(qū)分性的標(biāo)記；E是標(biāo)記成份，其中(a)它可被檢測，例如能通過氣相色譜或質(zhì)譜分析的電泳基團(tuán)，或(b)允許被檢測和分離出；C和C’是標(biāo)記成份，它能使一種標(biāo)記與其它所有標(biāo)記分別地區(qū)別開，通常由不同長度和取代作用造成的結(jié)果分開來，例如，色譜保留時(shí)間的變化，或質(zhì)譜荷質(zhì)比的改變；F2是連接成份，能被有選擇性地裂解釋放出標(biāo)記成份；和F1是官能團(tuán)，提供載體連接作用；或者F2是一條鍵，而F1是OH或羧基之類的可裂解基團(tuán)。
雖然式I鑒定劑一般在組合合成期間的每一專門階段和專門選擇時(shí)加入，但E部份可在合成結(jié)束時(shí)，從基質(zhì)上裂解以前或以后(優(yōu)選以光化學(xué)或氧化方式裂解)再加入。特別是，若C含OH、NHR4或SH時(shí)，E可在裂解前與C連接。此外，如果E在裂解后連接，則C上的連接點(diǎn)可以連上F2。這可由下面的反應(yīng)路線圖說明 其中S＝基質(zhì)，而n＝1-40鑒定劑在基質(zhì)上的連接可由下式表示F1-F2-C-E-C’+S→S-F1’-F2-C-E-C’其中F1’-F2-C-E-C’代表連接于基質(zhì)上的鑒定劑殘基。例如當(dāng)珠粒以氨甲基功能化，而F1是CO2H時(shí)，則F1’是-C(O)-；若珠粒含不飽和鍵，而F1是N2CH-C(O)-時(shí)，則F1’是＝CH-C(O)-，或-CH2-C(O)-。
作為鑒定劑具體有用的化合物是式I中由式Ia代表的化合物F1-F2-(C(E-C’)a)bIa其中F1是CO2H，CH2X，NR1R1，C(O)R1，OH，CHN2，SH，C(O)CHN2，S(O)2Cl，S(O)2CHN2，N3，NO2，NO，S(O)2N3，OC(O)X，C(O)X，NCO，or NCS；F2是 -Si(R1)2A-，-Si(R1)2-，-OSi(R1)2-， -N(R1)C(O)O-，-CR1＝CR1-(CR21)2-，-CR1＝CR1C(R1)2-，-C(R1)2-CR1＝CR1-， -C(R1)2A-，-O-C(R1)2A-， -Si(CH3)2-(CR21)2-A-，-R3-(CR21)2A- -CR1＝CR1-C(R1)2A-， -S-C(R1)A- -S-C(R1)2A-，-C(X)R1-C(R1)2A-，-C(OH)R1-C(R1)2A-，-C(OH)R1-C(CH2X)R1-，-C(OH)R1-C(R1)2-C(X)R1-，-C(OH)(CH2CH2X)-， A是-O-、-OC(O)O-、-OC(O)-，或-NHC(O)-；C是一條鍵；由1-40個(gè)F、Cl、Br、C1-C6烷氧基、NR4R4、OR4、或NHR4任意取代的C1-C20亞烷基；或-[(C(R4)2)m-Y-Z-Y-(C(R4)2)nY-Z-Y]p-；其前提條件是C+C’中碳原子數(shù)最多優(yōu)選為20；C’是H；F；Cl；由1-40個(gè)F，Cl，Br，C1-C6烷氧基、NR4R4、OR4或NHR4任意取代的C1-C20烷基；或-[(C(R4)2)m-Y-Z-Y-(C(R4)2)nY-Z-Y]p-；
E是由1-20個(gè)F，Cl或Br取代的C1-C20烷基；或Q-芳基，其中芳基是由1-7個(gè)F、Cl、NO2、SO2R5、或取代苯基取代的，而取代苯基上的取代基是1-5個(gè)F、Cl、NO2或SO2R5；E-C’可以是-H、-OH、或氨基；R1是H或C1-C6烷基；R3是C＝O、C(O)O、C(O)NR1、S、SO、或SO2；R4是H或C1-C6烷基；R5是C1-C6烷基；a是1-5；b是1-3；m和n各自獨(dú)立地是0-20；p是1-7；Q是一條鍵、O、S、NHR4、C＝O、-C(O)NR5、-NR5C(O)-、-C(O)O-，或-OC(O)-；X是離去基團(tuán)，例如Br、Cl、三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、或OC(O)OR5；Y是一條鍵、O、S、或NHR4；Z是一條鍵；由1-4個(gè)F、Cl、Br、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、由1-13個(gè)F、Cl取代的C1-C6烷基，或由1-13個(gè)F、Cl、Br取代的C1-C6烷氧基任意取代的亞苯基；(C(R4)2)1-20；或(CF2)1-20；其先決條件是若Z是一條鍵，其相鄰的Y之一也是一條鍵；而芳基是含有至多10個(gè)碳原子和至多2個(gè)選自O(shè)、S和N的雜原子的單或雙芳香環(huán)。
式Ia中有關(guān)F2的定義中，左手邊的鍵表示連于F1上的鍵。
下式Ia’的化合物作為鑒定劑也是有用的F1-(C(E-C’)aIa’其中F1是OH或COOH；而其余定義與式Ia中相同。
優(yōu)選的式Ia化合物如下其中F1是CO2H、OH、CHN2、C(O)CHN2、C(O)X、NCS或CH2X；F2是 C和C’各自分別是由1-40個(gè)F或Cl取代或未取代的C1-C20亞烷基或C1-C20烷基，或是[O-(CH2)2-3]p；E是由1-20個(gè)F或Cl取代的C1-C10烷基；Q-芳基，其中芳基是由1-7個(gè)F或Cl取代的雙芳環(huán)；或由1-5個(gè)F、Cl、NO2或SO2R5取代的Q-苯基；而Q是一條鍵、O、-NR5C(O)-或-OC(O)-。
優(yōu)選式Ia化合物是其中-C(E-C’)a由-(CH2)0-15-(CF2)1-15F、-(CH2)0-15-(CCl2)1-15Cl、-(CH2CH2-O)1-5-Ar、-(CH2CH2CH2O)1-5-Ar、或-(CH2)1-12-O-Ar代表的化合物，其中Ar是五氟、五氯或五溴苯基，2，3，5，6-四氟-4(2，3，4，5，6-五氟苯基)苯基、2，4，6-三氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，6-二氯-4-氟苯基、或2，3，5，6-四氟苯基。
式Ia的一個(gè)優(yōu)選方案是其中F1是COOH、CHN2、C(O)CHN2、S(O2)CHN2、COCl、OH、SH、CH2X或NHR1；其中F2是 其中A是-O-、或-OC(O)O-；C(E-C′)a是-(CR42)1-15-(O)0-1-Ar，-(CR42)0-15-(CF2)1-15-F，-(CR42)0-15-(CF2)1-15-(CR42)0-15-H，or-(CH2)1-20((O)0-1-(CH2)1-19)0-24-(CH2)0-24-(O)0-1-Ar，其中Ar是五氟、五氯或五溴苯基，2，3，5，6-四氟-4(2，3，4，5，6-五氟苯基)苯基、2，4，6-三氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，6-二氯-4-氟苯基、或2，3，5，6-四氟苯基。其它式Ia優(yōu)選化合物由下述分子式代表 其中Ar是五氟、五氯或五溴苯基，2，3，5，6-四氟-4(2，3，4，5，6-五氟苯基)苯基、2，4，6-三氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，6-二氯-4-氟苯基、或2，3，5，6-四氟苯基。
其它式Ia優(yōu)選化合物是其中E-C’是H、OH、或NH2的化合物。此類化合物對于在組合合成結(jié)束時(shí)與E反應(yīng)的情況特別有用，尤其是E可由熒光或電子俘獲檢測的情況，例如1-二甲胺基萘-5-磺酰氯或多鹵代苯甲酰鹵。
本發(fā)明的另一方案由下式化合物代表 根據(jù)下面例舉的反應(yīng)路線，或本技術(shù)領(lǐng)域熟知的其它方法可以制備式I化合物。
反應(yīng)路線1鑒定標(biāo)記物的制備
反應(yīng)路線2帶有光裂解接頭的鑒定劑
反應(yīng)路線3帶有氧化裂解接頭的鑒定劑
反應(yīng)路線4帶有另外的氧化釋放接頭的鑒定劑
反應(yīng)路線5E-C’標(biāo)記物
反應(yīng)路線7帶有氧化裂解接頭的鑒定劑 所述鑒定劑可以包括一個(gè)或多個(gè)相同標(biāo)記。鑒定劑是可將一種物質(zhì)與其它區(qū)分開的個(gè)體化學(xué)化合物并能獨(dú)特地鑒定不同的選擇和階段。以該方式，可用相對少的鑒定劑品種(通常不到50種標(biāo)記)制備非常大的組合文庫。每一階段中，加入定義該階段和選擇的一組鑒定劑，各鑒定劑以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵與珠?；虍a(chǎn)物(通常是珠粒)相結(jié)合。鑒定劑組用于提供各階段的二進(jìn)碼或其它碼，由此可定義選擇和階段。所述鑒定劑組可以包括零種或僅僅一種鑒定劑。標(biāo)記現(xiàn)在開始討論標(biāo)記(C-E-C’)，被采用的標(biāo)記具下述特征可用由F1和F2所決定的方法從珠粒上除去，優(yōu)選用水解、光解、或氧化法；可按個(gè)體區(qū)分，通常是可分離的，在合成條件下是穩(wěn)定的；既能編碼階段又能編碼選擇，以便專一地定義該合成中各階段所選擇使用的試劑；希望用無需精良技術(shù)操作的易獲得裝備、以容易之方法即可鑒定各種標(biāo)記；它們應(yīng)相當(dāng)經(jīng)濟(jì)并在相當(dāng)少的分子基礎(chǔ)上可提供很強(qiáng)的信號；所述標(biāo)記應(yīng)有足夠的靈敏度，在標(biāo)記測定期間，能使該標(biāo)記與可能存在的其它成份區(qū)分開。
標(biāo)記之間可以是結(jié)構(gòu)上相關(guān)或不相關(guān)的，如處于同源系列，有重復(fù)的官能團(tuán)，元素周期表的相關(guān)元素，不同同位素，及其組合等等。所述標(biāo)記可作為二進(jìn)碼的元件，以便一種標(biāo)記可定義二種選擇，二種標(biāo)記可定義4種選擇，三種標(biāo)記可定義8種選擇，五種標(biāo)記則可以定義32種選擇等等。因此，合成的每一階段，相當(dāng)少的標(biāo)記種類，可以標(biāo)明數(shù)量大得多的選擇。包含于每一階段之鑒定劑的標(biāo)記，可以(或可以不)與其它階段相關(guān)。對任何組合合成的各標(biāo)記來說，必需使其能與所有其它標(biāo)記區(qū)分。按此方式，用相當(dāng)少的標(biāo)記種類，通常不到60種，更通常不到50種，便可制備極大的組合文庫。
就每個(gè)珠粒來說，各標(biāo)記通常至少要0.01 femtomol(毫微微摩爾)，更通常0.001-50pmol，但特定情況下也可用較少或較多量。產(chǎn)物量也通常在至少相同之范圍，多至至少104或更多，通常是至少0.01pmol，更通常至少1.0pmol并一般不超過10nmol左右。根據(jù)珠粒數(shù)，階段數(shù)和每步的選擇數(shù)，所產(chǎn)生的產(chǎn)物種類數(shù)通常超過102，更通常103，甚至可超過1010，但往往不超過108左右，優(yōu)選在約104-108范圍，更通常105-108。
大多數(shù)情況下，標(biāo)記是有機(jī)分子。各標(biāo)記往往含有不到約100個(gè)原子，更通常不到約80個(gè)原子，一般不到60個(gè)原子(除了氫原子，并排除該標(biāo)記從珠粒上釋放時(shí)不保留的連接部份)。該連接部份可以是任何大小，通常不到約30個(gè)原子，更通常不到20個(gè)原子(除了氫)。所述連接部份的大小并不至關(guān)重要，而視方便而定。所述標(biāo)記可形成化合物家族，其中所有化合物具相似性質(zhì)，或者可以是不同家族的組合，其中化合物可以是脂肪族、脂環(huán)族、芳香族、雜環(huán)、或其組合。區(qū)別特征可能是重復(fù)單元數(shù)，例如，烷基部份的亞甲基數(shù)，多亞烷氧基部份的亞烷氧基數(shù)，多鹵代化合物的鹵素基團(tuán)數(shù)，α和/或β取代的亞乙基，其中的取代基可以包括烷基，氧基，羧基，氨基，鹵素等，或同位素等等。標(biāo)記分析根據(jù)F2基團(tuán)的性質(zhì)，可采用還原、氧化、熱解、水解、或光解等條件，將標(biāo)記物從珠粒上除去，例如用硝酸鈰銨氧化兒茶酚醚，或光解硝基芐醚或酯或酰氨，或者用如示于表1中的其它方法。
標(biāo)記的分辨可由物理差別達(dá)到，例如標(biāo)記分子重量、氣相或液相色譜的色譜保留時(shí)間等。位置異構(gòu)體可能有不同的保留時(shí)間。如果位置異構(gòu)體或立體異構(gòu)體不足以達(dá)到物理分離，那么可以使用不同數(shù)量的取代基，例如鹵素(如氟)、甲基、氧基等，或與帶不同單元數(shù)量的其它側(cè)鏈結(jié)合，例如亞甲基或亞乙氧基，提供所需之分離條件。也可以采用放射性同位素比，所述放射性同位素提供有區(qū)別的發(fā)射，例如14C和3H。物理差別，特別是質(zhì)量數(shù)，可提供有關(guān)選擇和階段的情報(bào)。
若不用14C/3H比例，可用非放射性同位素組合，例如-CHmDn，其中m是0，至多為3，而n是3減m。例如，使用質(zhì)譜檢測此類多至4種不同甲基的不同量，便可以定義大量的選擇。
若E-C’是氫，從載體上釋放獲得的標(biāo)記，便有一能與引入可檢測標(biāo)記成份E的標(biāo)定試劑反應(yīng)的活性官能團(tuán)。該官能團(tuán)可以是雙鍵(尤其是活化雙鍵)、羥基、硫基、氨基、羧基等較宜。然后該標(biāo)記與過量標(biāo)定試劑反應(yīng)，提供供分析的產(chǎn)物(E-CH)。該方法中，范圍極廣的各種標(biāo)定試劑可用作該鑒定體系之部份，可以是與為得到所需產(chǎn)物的合成策略并不相容者?？捎糜谠摍z測的標(biāo)定試劑包括鹵代芳香化合物(如全氟芐基溴)、熒光物質(zhì)(如1-二甲胺基萘-磺酰氯)、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等等。
當(dāng)?shù)湫蜆?biāo)記和反應(yīng)已詳細(xì)介紹過后，那么很清楚，許多其它組合便可照此辦理。
根據(jù)標(biāo)記的化學(xué)和物理性質(zhì)，選擇適宜的分離方法，最好是各種色譜法之一，包括氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、特別是高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、電泳等等。代替色譜法，可用質(zhì)譜通過質(zhì)量數(shù)來使之分離。對于GC，針對的標(biāo)記包括有相同或不同分子量的化學(xué)惰性有機(jī)分子，包括烷烴、烯烴、芳烴、鹵代烴、醚、醇、硅烷、硫醚等，特別是帶有或不帶有其它官能團(tuán)的鹵代化合物，宜以毛細(xì)管GC分離配合電子俘獲檢測或質(zhì)譜檢測(MS)，而對于帶有一般有機(jī)化學(xué)中不常見元素(如Sn，Ge)的化合物，則用GC毛細(xì)管分離配合原子發(fā)射檢測。對于LC，MPLC或TLC，針對的標(biāo)記見上面有關(guān)GC所列舉的，適宜的是被分離之后適于放射性檢測的放射性同位素或放射性同位素組，或適于熒光檢測的其它適宜基團(tuán)取代的直鏈醚或烴。對于電泳，針對的標(biāo)記同上，特別是帶電荷功能性分子，例如陽離子或陰離子，特別是有機(jī)或無機(jī)酸基團(tuán)，其中分子還可進(jìn)一步由供電泳檢測的可檢測放射性同位素或熒光物加以修飾。對于質(zhì)譜，針對的標(biāo)記同上，尤其是由于不同同位素，相同或不同官能團(tuán)的不同數(shù)量，同源系列的不同數(shù)量及其組合，所造成的不同質(zhì)量數(shù)之分子。
標(biāo)記的相互分離可包括單一技術(shù)或結(jié)合技術(shù)，例如色譜和電泳；氣相色譜和質(zhì)譜等。
本發(fā)明的標(biāo)記具極低水平即可檢測之性質(zhì)，通常不到nanomole、優(yōu)選picomole或更低，更優(yōu)選femtomole或更低(且是在有明顯較高水平其它化合物存在下)，為此原因，可采用特異性原子取代使得標(biāo)定更易檢測，此種取代包括(a)對電子俘獲檢測配合毛細(xì)管GC，或負(fù)離子質(zhì)譜檢測而言，由電負(fù)性元素，如氟或氯取代；(b)對于原子發(fā)射光譜檢測配合毛細(xì)管GC而言，由非普通元素(即除C、H和O之外)取代；(c)對于原子發(fā)射光譜檢測測定元素之間比例而言，由幾種非普通元素取代；(d)對于放射自顯影或閃爍計(jì)數(shù)檢測配合LC，TLC或電泳而言，由放射性元素，例如3H取代；(e)對于放射自顯影或閃爍計(jì)數(shù)檢測測定不同放射性元素之比例而言，由多種有不同發(fā)射光譜的放射性元素，如3H和14C取代。
對于單元素取代(上述a、b、d)來說，只檢測單純“存在”或“不存在”之情況的A種可分離標(biāo)記混合物，能編碼多達(dá)2A種不同合成。而就多元素取代(上面c和e)而言，每種又有B種可區(qū)別狀態(tài)(例如不同的3H/14C比例，不同的Si/Sn比例)的A種可分離標(biāo)記混合物，能編碼多達(dá)BA種不同合成。
存在廣泛多樣性同位素，其中同位素的存在或其存在比例，可提供有關(guān)階段和選擇的情報(bào)。所述同位素可以是放射性的，或非放射性的。特別有意義的同位素包括氘、氚、14C、32P、131I等等。
若采用同位素修飾化合物之混合物，可極大地拓寬只由同位素存在加以區(qū)分的單一標(biāo)記化合物所獲得的情報(bào)。例如，可以制備氫和氘的不同比例之混合物，其中各種比例只相差10％之微。
若用其它元素例如氟取代氫，那么將獲得氫、氘和氟的各式混合物，提供大量的各種可區(qū)分性標(biāo)記。
可以包括的其它基團(tuán)是芳環(huán)，在其不同的位置，用不同官能團(tuán)，可將其進(jìn)行不同的取代。這樣，若帶有取代苯環(huán)，其中取代的位置和取代的性質(zhì)可以測定，那么可以提供能區(qū)分的多種分子，并可提供有關(guān)階段和選擇的情報(bào)。例如，假定C是不變的，而E是多鹵代芳環(huán)，則可以通過E上的取代情況來檢測和區(qū)分。
也可以使用熒光標(biāo)記。若是熒光標(biāo)記可能單獨(dú)不足以定義諸多階段及諸多選擇時(shí)，如上所述，賦予根據(jù)C或C’的多樣性來分離熒光標(biāo)記分子的方法，便可以借助其熒光來獨(dú)立地檢測該標(biāo)記。
與特定珠粒相結(jié)合的標(biāo)記混合物可以解離下來，并進(jìn)行初步分離，希望分開地檢測各種標(biāo)記。一旦各類標(biāo)記被分開，可以根據(jù)其特定官能團(tuán)和不同性質(zhì)分析其每一種。各種技術(shù)可用于檢測特定的標(biāo)記，包括放射自顯影或閃爍計(jì)數(shù)、電子俘獲檢測、正負(fù)離子質(zhì)譜、紅外光譜、紫外光譜、電子自旋共振光譜、熒光光譜等等。
另一種組合物含在一個(gè)試劑盒，或者說在一種共同介質(zhì)中共存的至少6種不同標(biāo)志，每種標(biāo)志具基本上化學(xué)惰性的，相互分子重量不同的可區(qū)分部份，所述標(biāo)志分子式如下(1) Λ-{Δ-(T)α或(T)α-Δ或Δ1-(T)α-Δ2}其中Λ是一個(gè)帶有鍵合于固體載體上的官能團(tuán)，并從固體載體上解離之官能團(tuán)的連接基團(tuán)，其中后一官能團(tuán)可包括于前者(即鍵合于固體載體之官能團(tuán))之中；Δ是可區(qū)別基團(tuán)，該基團(tuán)可使各標(biāo)志通過物理特征與所有其它標(biāo)志區(qū)別開(除熒光之外)以提供可編碼多步驟合成程序的一整套標(biāo)志，并且Δ還包括原與連接基團(tuán)結(jié)合在一起、解離之后仍然保留的任何官能團(tuán)；Δ1和Δ2是可區(qū)別基團(tuán)部份，二者結(jié)合在一起定義一個(gè)可區(qū)別基團(tuán)，當(dāng)其結(jié)合在一起時(shí)則有Δ的定義；
T是可檢測基團(tuán)，當(dāng)其與可區(qū)別基團(tuán)連接時(shí)，可使標(biāo)志于低水平檢測，所述可檢測基團(tuán)可以是在試劑盒中即存在于標(biāo)志上的，或者也可以其后再加入可區(qū)別基團(tuán)中，假如與連接基團(tuán)連接，則該T也包括原與連接基團(tuán)結(jié)合，解離之后仍然保留的任何官能團(tuán)；而α是0或1，表示所述可檢測基團(tuán)可以存在，亦可不存在；(2)SS-(Λ’-{Δ-(T)α或(T)α-Δ或Δ1-(T)α-Δ2})β除了ss是固體載體；Δ’是共價(jià)鍵合于ss的連接基團(tuán)；而β是與各固體載體有關(guān)的整數(shù)(至少為6，但通常不超過約30)外，其余符號定義同上；(3)Λ″-{Δ″-(T)α或(T″)α-Δ或Δ’1-(T)α-Δ2}除了Δ″是氫，或是使其從固體載體上解離的光裂解反應(yīng)，消除反應(yīng)，或其它化學(xué)反應(yīng)之后，所剩連接基團(tuán)的殘基；Δ″或Δ’1分別是作為標(biāo)志從固體載體上解離下的Δ或Δ1，或經(jīng)修飾的Δ或Δ；T″是作為標(biāo)志從固體載體上解離下來的T或修飾的T以外；其余所有符號定義均同上；(4)Tα-Λ’″-{Δ″-(T)α或(T″)α-Δ或Δ’1-(T)α-Δ2}除了Λ’″是一條鍵，或連接到T后連接基團(tuán)的保留部份，及附加限制是僅一個(gè)α是1外，其余所有符號定義同上。測試為測定有用產(chǎn)物的特性，可采用廣泛多樣的測試法和技術(shù)。
通常，篩選珠粒時(shí)，使用單一珠?；蚧旌现榱?，測定是否這種珠?；蚧旌现榱１憩F(xiàn)出有活性。這樣，混合珠?？砂?0、100、1000或更多珠粒，以這種方式，可以很快篩選化合物大類，并再分成較小的化合物類。
一種令人感興趣的技術(shù)是與特定生物分子(例如受體)結(jié)合。所述受體可以是單一分子，與微粒體或細(xì)胞締合的分子等。如果興奮劑活性是還要研究的，可以使用完整的生物體或細(xì)胞，可以測定本發(fā)明產(chǎn)物與之結(jié)合后的應(yīng)答。某些例子中，需將產(chǎn)物由珠粒上解離下來，特別是通過信號傳導(dǎo)的生理活性是要研究的情況下更如此。可采用檢測細(xì)胞應(yīng)答的各種裝置，例如生理測微器(購自Malecular Devices，Redwood City，CA.)。如果結(jié)合情況是要研究的，則可使用標(biāo)記受體，其中標(biāo)記物是熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素等等，由此可檢測受體與珠粒上化合物的結(jié)合情況。此外，可以提供針對該受體的抗體，其中抗體被標(biāo)記，它可使信號放大，并避免改變所研究的受體，所述受體能影響其與所研究產(chǎn)物的結(jié)合情況。通過配位體與受體結(jié)合的偏移，也可測定該結(jié)合，其中配位體是用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的。
某些例子中，可以進(jìn)行二階段篩選，由此首先使用結(jié)合作用作為初步篩選，接著用活細(xì)胞第二次篩選生物活性。采用重組技術(shù)，可以極大地改變細(xì)胞的遺傳能力。然后可以產(chǎn)生外源基因或外源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，以便結(jié)合于表面膜蛋白上，結(jié)果將產(chǎn)生可觀測信號，例如胞內(nèi)信號。例如，可將白染料引入細(xì)胞，其中將該白色染料轉(zhuǎn)化成有色產(chǎn)物，特別是熒光產(chǎn)物的酶，在結(jié)合于表面膜時(shí)變得易表達(dá)，例如β-半乳糖苷酶和二半乳糖苷熒光素。以這種方式，通過將特定的細(xì)胞(或多個(gè)細(xì)胞)與特定顆粒結(jié)合，使用EACS可測定細(xì)胞的熒光性質(zhì)，這樣攜帶活性化合物的顆粒便可以鑒定出。可以采用各種技術(shù)確保顆粒與細(xì)胞保持結(jié)合，即使產(chǎn)物從顆粒中釋放出。例如使用針對表面膜蛋白的抗體于顆粒上，可以將抗生物素蛋白連于細(xì)胞表面，并使生物素存在于顆粒上等等。
測試可以使用個(gè)體顆粒，或顆粒組，或者其組合來分階段進(jìn)行。例如，進(jìn)行組合合成之后，將約50-10000個(gè)顆粒的組分裝入分開的各容器中，每個(gè)容器中，就每一顆粒來說，結(jié)合于該顆粒的部份產(chǎn)物被釋放出來，這種部份釋放可能是產(chǎn)物與顆粒的不同連接所致，或者因使用的試劑量有限，條件限制等等，以致于每個(gè)顆粒釋放的產(chǎn)物分子平均數(shù)，要小于每個(gè)顆粒上產(chǎn)物分子的總數(shù)。然后取一小體積產(chǎn)物混合物，用于結(jié)合測試中，其中所述結(jié)合事項(xiàng)可能是對結(jié)合于受體的已知結(jié)合配位體的抑制作用，細(xì)胞代謝過程的激活作用或抑制作用等等。正如隨后要介紹的，有各種測試條件可用于檢測結(jié)合活性。一旦某組被證明是有活性的，然后通過相同或不同的測試法，可以篩選出個(gè)體顆粒。當(dāng)然也可用三步或四步程序，其中大組被分成較小組等，最后篩選出單個(gè)顆粒。每種情況下，顆粒上的產(chǎn)物按份釋放，新的混合物用于適當(dāng)測試中，測試法可以相同或不同，更為精細(xì)及耗時(shí)的測試法用于較后階段，或最后階段。
也可以采用一種立體測試法，即可將顆粒分配于整個(gè)蜂窩狀板上，每個(gè)蜂窩孔里有0個(gè)或1個(gè)顆粒。
本發(fā)明的方法可用于找到具催化性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，例如具水解活性，像酯酶活性之類。為此目的，可將珠粒嵌進(jìn)由可擴(kuò)散試驗(yàn)底物包圍的半固體基體中。采用不攪動該基體的檢測方法，如測光吸收改變，或測顯示裂解底物產(chǎn)生的熒光，若在該處檢測出催化活性物，則可將催化活性物區(qū)的珠粒分離出來，并使其標(biāo)記解碼。
代替催化活性物，還可以開發(fā)出抑制性或激發(fā)活性的化合物。可以尋求抑制或激活酶，或阻斷結(jié)合反應(yīng)的化合物。為檢測抑制某種酶的珠粒，該珠粒連接有具該所需性質(zhì)的產(chǎn)物，最好是能從該珠粒上將產(chǎn)物釋放出，將其擴(kuò)散入半固態(tài)基體中或置于濾器上，在這里可以觀察抑制作用，激活作用或阻斷作用。然后撿出顯現(xiàn)(或者說具可檢測)抑制作用、激活作用或阻斷作用區(qū)域的珠粒，并將標(biāo)記解碼。這種情況下，合成產(chǎn)物的一部份必需通過可裂解鍵連接于珠粒上，優(yōu)選光敏感鍵，而標(biāo)記的一部份還保留與珠粒連接，檢出之后采用與前面不同的方法再釋放出。
可以使用一種滲析膜，在其中，珠粒層與放射性標(biāo)記的配位體/受體對層分開。用紫外光照射珠粒層，從珠粒上釋放出的產(chǎn)物可擴(kuò)散進(jìn)所述配位體/受體對層，其中，放射性標(biāo)記配位體將按與化合物對受體之親合性成比例的方式釋放，該放射性標(biāo)記配位體將再擴(kuò)散回珠粒層。因?yàn)榉派湫詷?biāo)記與珠粒接近，便可分析帶有放射性發(fā)射的珠粒。
特別感興趣的是要找到具生物活性的產(chǎn)物，某些應(yīng)用領(lǐng)域希望找到對活細(xì)胞有影響的產(chǎn)物，例如抑制微生物生長，抑制病毒生長，抑制基因表達(dá)或激活基因表達(dá)等。要篩選出珠粒上的化合物可以很容易實(shí)現(xiàn)，例如，將珠粒嵌入半固態(tài)介質(zhì)中，而產(chǎn)物分子文庫從該珠粒上釋放(同時(shí)珠粒被固定住)，使化合物擴(kuò)散進(jìn)入周圍介質(zhì)?？梢杂^察到細(xì)菌坪中的菌斑之類的現(xiàn)象。隨后可顯現(xiàn)出生長抑制區(qū)，或生長激活區(qū)，或者影響基因表達(dá)的區(qū)域，檢出各區(qū)中心處的珠粒并分析。
測試方案將包括凝膠，其中準(zhǔn)備處理的分子或體系(如細(xì)胞)可以基本上均勻地嵌進(jìn)該凝膠中?？衫酶鞣N膠化劑，例如聚丙烯酰胺、瓊脂糖、明膠等等。然后將顆粒在凝膠上散開，使顆粒之間充分隔開，以便進(jìn)行個(gè)體檢測。假如希望產(chǎn)物是具水解活性的，則凝膠中加入一種底物，提供熒光產(chǎn)物。然后就熒光對凝膠進(jìn)行篩選，并機(jī)械挑選出帶熒光信號的顆粒。
可將細(xì)胞嵌入凝膠中，結(jié)果制造一種細(xì)胞坪。如上面所述將顆粒散開。當(dāng)然還可放柵格在凝膠上，限定一個(gè)顆?；驘o顆粒的區(qū)域。假如要判別細(xì)胞毒性，可將產(chǎn)物釋放出，培養(yǎng)足夠時(shí)間，接著將活體染料分布于該凝膠上，隨后可以區(qū)分吸收染料的細(xì)胞，或不吸收染料的細(xì)胞。
如上所示，細(xì)胞可以是遺傳工程細(xì)胞，以便當(dāng)信號被轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)能顯示。有許多受體對其來說表達(dá)被激活的基因是已知的。將一外源基因插入基因的某個(gè)位點(diǎn)，于該位點(diǎn)基因處于對此種受體有反應(yīng)的啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，可產(chǎn)生提供可檢測信號的酶，例如熒光信號。然后可針對其反應(yīng)歷程分析帶有熒光細(xì)胞的顆粒。文庫和試劑盒為方便起見，可以文庫和/或試劑盒的形式提供。所述文庫應(yīng)包括已帶有產(chǎn)物文庫和標(biāo)記的顆粒，以便能篩選結(jié)合于珠粒上的產(chǎn)物，或該文庫包括可供篩選的從珠粒上移出并單獨(dú)分組，或分成10-100，甚至1000個(gè)為一組的產(chǎn)物。所述試劑盒提供進(jìn)行文庫合成的各種用作標(biāo)記的試劑。該試劑盒通常至少有4種，往往有5種分裝于各容器的不同類化合物，更通常至少10類，甚至可以含至少102類不同分開的有機(jī)化合物，但往往不超過約102，更通常不超過約36類不同化合物。對于二進(jìn)制測定來說，檢測的模式通常為該分析所涉及之化合物共同的，以便可以有共同的發(fā)色團(tuán)、共同的原子等供檢測。如果各鑒定劑是預(yù)先制備的，則每類將以有可區(qū)分的組合物為特征，該組合物可編碼能通過物理計(jì)量測定的選擇和階段，并包括分享至少一個(gè)共同官能團(tuán)的化合物各種類型或所有類型。
此外，試劑盒還可提供可被結(jié)合得到各種鑒定劑的反應(yīng)劑。這種情況下，試劑盒將包括許多分隔開的含第一種功能性，并常常有雙功能的有機(jī)化合物，通常是4種或更多，通常一種針對合成的一個(gè)階段，其中該功能性有機(jī)化合物分享同一種官能團(tuán)，并可根據(jù)其至少一個(gè)決定性特征加以區(qū)別。另外，還可有至少一種(通常至少二種)第二有機(jī)化合物，該化合物能同功能性有機(jī)化合物的官能團(tuán)反應(yīng)并能形成根據(jù)所述第二有機(jī)化合物各不同量加以區(qū)分的混合物。例如可以含甘醇，氨基醇，甘醇酸，其中各種雙官能團(tuán)化合物由所存在的氟或氯原子相區(qū)別，來定義各階段，并還可以有碘甲烷，其中一種磺甲烷不含放射性同位素，另一種有14C，再有一種有一個(gè)或多個(gè)3H。使用二種或多種碘甲烷可以提供能由其放射性發(fā)射進(jìn)行測定的各種混合物。此外，還可以加多種第二有機(jī)化合物用于二進(jìn)碼中。
正如前面所述，可在釋放之后將標(biāo)記與能夠進(jìn)行檢測的分子反應(yīng)。此種情況下標(biāo)記可以十分簡單，帶有可連于顆粒的，與可檢測部份相同的官能團(tuán)。例如，若連接于羥羧基上，羥基會釋放出來，然后該羥基可以用能夠檢測的分子酯化或醚化。又例如，使用氟-或氯-烷基相結(jié)合，于二進(jìn)碼中，氟和/或氯基團(tuán)數(shù)可以決定選擇，而碳原子數(shù)可以表示階段。
特別有用的化合物類，包括可區(qū)分基團(tuán)(如C)結(jié)合于取代的鄰硝基芐氧基，2，3-二氫化茚氧基或芴基氧基，或者其它可光解或其它可選擇性裂解的基團(tuán)上的化合物。所述可區(qū)分基團(tuán)可以是2-20個(gè)碳的亞烷基、多亞烷氧基、特別是2-3個(gè)碳原子的亞烷氧基、4-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基、鹵代烷基、特別是2-20個(gè)碳原子的氟烷基、一個(gè)或多個(gè)芳環(huán)等，其中借助擁有不同的單元數(shù)和/或取代基，由此可區(qū)分基團(tuán)提供各類之間的差別。
個(gè)體顆?；蛟S多顆粒可以商品提供，特別是那些證明具有所需特性的顆粒。將其與標(biāo)記結(jié)合，可編碼反應(yīng)歷程。然后該產(chǎn)物可以用大規(guī)模合成來生產(chǎn)。如果反應(yīng)歷程專一地限定了結(jié)構(gòu)，那么可以使用相同的或類似的反應(yīng)系列，大批量生產(chǎn)該產(chǎn)物。如果反應(yīng)歷程并不專一地限定結(jié)構(gòu)，那么可大批量重復(fù)該反應(yīng)歷程，并將所得產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。在某些例子中，可以發(fā)現(xiàn)組合化學(xué)的反應(yīng)系列可能并不是大量生產(chǎn)產(chǎn)物的優(yōu)選方法。
本發(fā)明的一個(gè)方案是一種試劑盒，該試劑盒含有多類型分隔開的有機(jī)化合物，每類化合物的特征在于有可區(qū)分的組合物，該組合物至少編碼一個(gè)二進(jìn)制的，可由物理計(jì)量測定的不同情報(bào)，并分享至少一種共同官能團(tuán)。優(yōu)選方案是一種含至少4類不同功能性有機(jī)化合物的試劑盒。
更優(yōu)選的是其中所述功能性有機(jī)化合物是有如下分子式的試劑盒F1-F2-C-E-C’ I和 F1-F2-(C (E-C’)a)b(Ia)其中F1-F2是接頭，能同固體載體連接或解離；而C-E-C’是可由物理計(jì)量測定的標(biāo)記數(shù)，具體地說，所述功能性有機(jī)化合物由亞甲基數(shù)和/或鹵素、氮或硫的存在數(shù)相區(qū)別。
還優(yōu)選的是其中C-E-C’部份可經(jīng)光化學(xué)除去的試劑盒，或其中C-E-C’部份可經(jīng)氧化、水解、熱解、或還原除去的試劑盒。
在一個(gè)方案中，本發(fā)明是含至少6種不同成份、每種成份均有可區(qū)分部份的組合物。這些成份特征在于各可區(qū)分部份基本上是化學(xué)穩(wěn)定的或惰性的，并有不同于其它各個(gè)可區(qū)分部份的可鑒定特性。各可區(qū)分部份連接于有活性功能團(tuán)的連接基團(tuán)，通過連接基團(tuán)能與個(gè)體可分離固體表面形成共價(jià)鍵，或者該可區(qū)分部份與一種不到1毫微摩爾量便能檢測出來的基團(tuán)結(jié)合，其先決條件是若該部份與連接基團(tuán)結(jié)合，則所述各成份是物理分離開的。優(yōu)選固體載體是珠粒。一實(shí)施方案中，各成份包括結(jié)合于個(gè)體分離固體表面的不同化合物分子，所述分子在固體表面上。優(yōu)選本發(fā)明該部份定義一種同源系列和/或在核心分子上取代的系列。
本發(fā)明也涉及包含至少100個(gè)專用固體載體的化合物文庫。該化合物文庫中對各固體載體而言(1)當(dāng)大部份化合物與載體結(jié)合時(shí)，便有個(gè)體的化合物與所述固體載體結(jié)合；(2)有很多種標(biāo)記，例如不能定序的標(biāo)記，其中所述各標(biāo)記是個(gè)體的標(biāo)記分子，它們處于物理可分離狀態(tài)時(shí)是可物理區(qū)分的，并且可被取代，以便其量小于毫微摩爾級也能檢測出，或者有結(jié)合于小于毫微摩爾級也能檢測出的取代基的官能團(tuán)。優(yōu)選該化合物文庫中各固體載體有至少6個(gè)標(biāo)記。另一方案中，于化合物文庫中，標(biāo)記定義編碼固體上合成化合物所用合成方案的二進(jìn)碼。
本發(fā)明也提供了測定由一系列定義二進(jìn)碼的物理分離差別標(biāo)記所編碼的合成方案之方法。該方法中，至少有兩個(gè)標(biāo)記被用于定義合成方案中的各階段，共有至少6個(gè)標(biāo)記。該方法之步驟包括借助其物理差別來分離標(biāo)記，并檢測之。該合成方案被不同標(biāo)記的二進(jìn)碼定義。
本發(fā)明化合物可用作止痛藥，和/或治療炎癥，尤其是氮雜三環(huán)化合物用作神經(jīng)激肽I/牛血清激肽I型受體的拮抗劑。苯并二氮文庫各化合物可用作肌肉松弛劑和/或安定藥和/或安眠藥。2.35千萬數(shù)的混合酰胺文庫(實(shí)施例6)各化合物，借助其內(nèi)皮素拮抗劑活性，用于治療高血壓或Raynaud氏綜合癥。
實(shí)施例1肽文庫為編碼多達(dá)109種不同合成，要準(zhǔn)備30種攜帶獨(dú)立標(biāo)記，能通過毛細(xì)管GC相互分離的不同鑒定劑。若編碼較少合成數(shù)，則使用種類較少的鑒定劑。標(biāo)記一般可購自化學(xué)試劑商店，如下面的說明所示。ω-羥基烯烴-1，其中亞甲基數(shù)在1-5范圍內(nèi)改變，將與碘代全氟烷烴反應(yīng)，其中CF2基團(tuán)數(shù)是3，4，6，8，10和12。采用自由基催化劑，該碘代全氟碳將與雙鍵加成，其中碘基團(tuán)然后可用氫和催化劑或氫化錫還原。以此法，可以制備出30種不同的標(biāo)記。該化學(xué)程序由Haszeldine和Steele，J.Chem.Soc.(London)，1199(1953)；Brace，J.Fluor.Chem.，20，313(1982)等文介紹過。高氟標(biāo)記很容易由電子俘獲法檢測，有不同的GC保留時(shí)間，因此很容易用毛細(xì)管GC分離，并由于其氟化及烴結(jié)構(gòu)，而呈化學(xué)惰性，而各自又有一羥基官能團(tuán)可直接或間接地與顆粒連接。
與化合物前體連接之前，所述標(biāo)記(稱之為T1-T30)應(yīng)以對該組合合成所用的化學(xué)中間體適當(dāng)?shù)姆绞绞怪罨Ｋ鲞m當(dāng)方式，即試圖將能使之容易通過化學(xué)鍵連接于化合物前體或珠粒基體本身的官能團(tuán)引入?；罨^程將施用于30種不同標(biāo)記的每種，使這些標(biāo)記直接或間接地化學(xué)結(jié)合于組合化合物合成中的中間體上。例如，可用羧基衍生物與之偶合，并使之活化，所得羧基將鍵合于顆粒上。
如果組合合成肽化合物，或者由酰氨連接有機(jī)片段形成的其它結(jié)構(gòu)，則編碼過程可由羧酸裝配接頭的加成作用組成。例如可以在氫化鈉存在下，將標(biāo)記與鄰硝基對羧基芐基溴的叔丁酯偶合，然后可在稀三氟乙酸中使該酯水解。
經(jīng)活化的鑒定劑在組合化合物合成的每個(gè)階段與中間體偶合?；罨b定劑的鄰硝基芐醚部份，供組合合成完成后光化學(xué)解離該標(biāo)記用，并挑選出最所需之化合物。使用毛細(xì)管GC配合電子俘獲檢測法，將解離下來的標(biāo)記解碼，得到合成步驟的歷程，供制備所挑選的化合物使用。
雖然幾乎有無限套化學(xué)步驟和方法可供制備化合物組合文庫之用，但我們將以α-氨基酸偶合制造肽組合文庫，作為該編碼法應(yīng)用之典型例。該例中，我們將介紹一種五肽化合物文庫的制備，其中包括該五肽的五個(gè)殘基位的每一個(gè)上所有16種不同氨基酸的組合。此種文庫將包含165種化合物。為了專一地編碼該文庫的所有各化合物，將需要上面所述的20種可解離標(biāo)記(T1-T20)。
為制備該編碼文庫，我們將以大量(＞106)Merrifield固相合成所用的聚合物珠粒開始，并用游離氨基使之功能化。將這些珠粒分成16等份，16個(gè)不同反應(yīng)器(每一反應(yīng)器準(zhǔn)備加入每一種不同α-氨基酸)的每一個(gè)中放入一份。然后對每種氨基酸衍生物(例如Fmoc氨基酸)加入一小份(如1mol％)鑒定劑，在組合合成的第一步與之偶合。結(jié)合于所加鑒定劑中的特異性標(biāo)記組合，將代表一種簡單的二進(jìn)碼，它鑒定該合成第一步所用的氨基酸。加入的16種氨基酸由號碼1-16表示，而任何一個(gè)號碼又可以由前4種標(biāo)記(T1-T4)的組合以化學(xué)方式代表。在表2和表3中，列舉了一種典型的編碼方案，其中標(biāo)記的“存在”或“不存在”分別由“1”或“0”表示。字母T可以代表該標(biāo)記或者代表結(jié)合該標(biāo)記的鑒定劑。
表2一種典型的編碼方案

然后使用Fmoc氨基酸與少量如上所述的編碼活性鑒定劑混合，在16個(gè)反應(yīng)器每一個(gè)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)肽偶合反應(yīng)。偶合期間，氨基酸以及少量(如1％)鑒定劑，將與連接于珠粒上的中間體化學(xué)結(jié)合。
下一步，將珠粒充分混合并再次分成16份，每份再放入不同之反應(yīng)容器中。第二種氨基酸與專用的新的活化鑒定劑(T5-T8)混合后加入各反應(yīng)器中，并如前所示進(jìn)行DCC偶合反應(yīng)。結(jié)合有標(biāo)記(T5-T8)的特定混合物，再次代表該組合合成第二步所加氨基酸的簡單二進(jìn)碼。
表3一種典型的編碼方案

步驟2的16個(gè)偶合反應(yīng)完成之后，將珠粒再次混合，然后分成16個(gè)新的份，進(jìn)行第三步的合成。至于第三步，使用第一和第二步相同的方案，將T9-T12用來編碼結(jié)合于珠粒上的第三氨基酸。第三次偶合反應(yīng)完成之后，使用配合T13-T16的第四氨基酸和配合T17-T20的第五氨基酸，再將該程序重復(fù)兩次，得到連于珠粒上的1048576種不同肽的完整文庫。
雖然上述珠粒是肉眼不能區(qū)分的，但任何珠粒仍可挑選(例如根據(jù)其與肽或其它目標(biāo)分子結(jié)合的有用化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)來挑選)，并且其合成歷程可以從解離及解碼所結(jié)合的標(biāo)記而得知。
用于解離標(biāo)記的正確方法，取決于用于將其化學(xué)結(jié)合于目標(biāo)化合物組合合成之中間體的具體接頭。在上述例子中，已知碳酸鄰硝基芐酯連接對～300nm光不穩(wěn)定(Ohtsuka等人，J.Am.Chem.Soc.，100，8210 )，則以光化學(xué)照射珠粒來裂解。所述標(biāo)記從珠粒擴(kuò)散入自由溶液中，然后將其注射入裝配有靈敏電子俘獲檢測器的毛細(xì)管氣相色譜儀(GC)。因?yàn)闃?biāo)記(T1-T20)從GC中出現(xiàn)的次序，及標(biāo)準(zhǔn)條件下它們的保留時(shí)間是預(yù)先測定好的，T1-T20任意之一“存在”或“不存在”將直接由該GC圖譜上有沒有它們相應(yīng)的峰來決定。假如1和0分別代表相應(yīng)于Tl-T20的峰“存在”和“不存在”，那么該色譜圖可以看作20個(gè)二進(jìn)制碼，它可以專一地代表得到該肽文庫各化合物的每種可能的合成。使用安全、經(jīng)濟(jì)并由電子俘獲檢測法于Picomole級以下水平均能檢測的鹵化碳標(biāo)記，使該毛細(xì)管GC法成為該目的的特別便捷的編碼方案。
以上述五肽文庫所使用編碼方案作為例子，特定的珠粒用光照射解離標(biāo)記，將溶解的標(biāo)記注射入毛細(xì)管GC，獲得下面的色譜圖(“峰”行)標(biāo)記 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 GC注射峰 | | | | | | || | |二進(jìn)碼 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0步驟 ----5------ -----4----- ----3------ -----2----- -----1-----M 色氨酸 蘇氨酸 絲氨酸 丙氨酸 纈氨酸上圖中“標(biāo)記”行以圖表示發(fā)現(xiàn)的T20-T1峰(|)的GC色譜圖(注意“注射”列于右邊，該色譜圖從右至左讀出)。“峰”行表示標(biāo)記(T20-T1)的出現(xiàn)，以在色譜圖中的峰表示。“二進(jìn)碼”行給出作為二進(jìn)制數(shù)的峰存在(1)或不存在(0)。“步驟”行將二進(jìn)數(shù)碼分成五個(gè)不同部份，編碼合成中的五個(gè)不同階段。最后“AA”行給出每步中加入的，并由上述“二進(jìn)碼”行的二進(jìn)碼給出的氨基酸的鑒定。
實(shí)施例2放射性標(biāo)記TAGS下面的描述中，所用標(biāo)記是直鏈烷基-α，ω-二醇的單甲醚，該二醇有N+2個(gè)碳原子，其中N代表階段。甲基是放射性標(biāo)記試劑，該試劑帶有從1/1-m/l(其中m是選擇數(shù))的任何各種比例的3H/14C。該雙放射性標(biāo)記供精確定量存在于標(biāo)記中的氚。由于有10個(gè)不同的亞烷基及10個(gè)不同的放射性標(biāo)記比例，便產(chǎn)生1010專用10組份一套的標(biāo)記。首先將該標(biāo)記與活性劑(如與光氯形成氯代甲酸酯)反應(yīng)，接著與F1-F2成份反應(yīng)而連接。該情況下F1-F2是鄰硝基對羧基芐醇(形成叔丁酯而被保護(hù))。每進(jìn)行一個(gè)合成步驟，則將脫酯化的鑒定劑直接加入到珠粒中(所述珠粒有共價(jià)鍵合的胺或羥基)，以與用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)法，例如碳二亞胺偶合法活化的酸形成酰胺或酯。按順序合成結(jié)束后，用各種受體或酶測定某具體特征而篩選珠粒，然后可分離顯示該特征的珠粒，解離標(biāo)記并用HPLC分離，得到一系列甘醇單甲醚，然后采用標(biāo)準(zhǔn)放射性同位素鑒定法分析其放射活性。例如，假定從HPLC柱洗脫出的第一和第二標(biāo)記的3H/14C比例分別是5∶1和7∶1，那么顯示活性的產(chǎn)物已由第5號試劑在第一階段和第7號試劑在第二階段合成。
實(shí)施例32401肽文庫所用鑒定劑是2-硝基-4-羧基芐基、O-芳基取代的ω-羥基烷基碳酸酯，其中烷基是3-12個(gè)碳原子的烷基，而芳基是(A)五氯苯基、(B)2，4，6-三氯苯基、或(C)2，6-二氯-4-氟苯基。該標(biāo)記稱為NAr，其中N是亞甲基數(shù)減2，而Ar是芳基。這樣，標(biāo)記2A有通過氧結(jié)合于五氯苯基的亞丁基。本例標(biāo)記可以很容易地使用電子俘獲氣相色譜在約100fmol之量檢測。
本例分析中，標(biāo)記分子按其GC洗脫次序排列。從而，在GC柱上保留時(shí)間最長的標(biāo)記稱為T1，并與二進(jìn)制合成碼號中意義最小的二進(jìn)制數(shù)字相聯(lián)系，下一個(gè)最長保留標(biāo)記被稱為T2代表下一個(gè)最小意義二進(jìn)制碼數(shù)字，如此等等。使用0.2mM×20M甲基硅氧烷毛細(xì)管GC柱，獲得18個(gè)完好拆分的標(biāo)記，其中T1-T18分別相應(yīng)于10A、9A、8A、7A、6A、5A、4A、3A、6B、2A、5B、1A、4B、3B、2B、1B、2C和IC。
制備一個(gè)2401肽的編碼組合文庫。該文庫有氨基酸順序N-XXXXEEDLGGGG-珠粒，其中可變的X殘基是D、E、I、K、L、Q或S(單字母碼)。4個(gè)甘氨酸用作該編碼氨基酸順序和珠粒間的間隔。該組合文庫包括順序H2N-KLISEEDL，即已知由9E10(一種針對人C-myc基因產(chǎn)物的單克隆抗體)結(jié)合的10氨基酸表位之部份。為編碼該文庫，三個(gè)二進(jìn)制碼數(shù)字足以代表每階段的七種不同試劑，該碼如下001＝S、010＝I、011＝K、100＝L、101＝Q、110＝E、111＝D。
首先在1.5g 50-90μ聚苯乙烯合成珠粒上制備文庫H2NEEDLGGGG-珠粒恒定片段而合成該文庫，所述珠粒用1.1meq/g氨甲基，采用基于叔丁基側(cè)鏈保護(hù)和Fmoc主鏈保護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)固相法進(jìn)行過功能化處理(Stewart和Young，“Solid Phase Peptide Synthesis”，2nd edition，Pierce Chemical Co.，1984)。用二乙胺脫去保護(hù)基Fmoc基團(tuán)后，該珠粒被分成7份，每份200mg，每份放入安裝于單活動軸振蕩器上的不同Merrifield合成反應(yīng)器中。7個(gè)反應(yīng)器中的珠粒按下述方式(見表3-1)各自獨(dú)立地加以處理。本例中字母T代表標(biāo)記或配合標(biāo)記的鑒定劑。
表3-1

根據(jù)上面的方法，列于步驟1中的足量鑒定劑，通過其羧酸，使用二異丙基碳二亞胺連接，標(biāo)記相應(yīng)反應(yīng)器中每珠粒上約1％的游離氨基酸，然后各珠粒上其余的游離氨基在第三步與N-保護(hù)的氨基酸酐偶合。用二氯甲烷、異丙醇和N，N-二甲基甲酰胺洗滌之后，將7個(gè)反應(yīng)器中的珠粒結(jié)合并徹底混合。此處，該文庫有7個(gè)成員。
去Fmoc保護(hù)(用二乙胺)之后，珠粒再次分裝入7個(gè)反應(yīng)器中，除了用代表第二階段的鑒定劑(T4-6)代表前面所用的鑒定劑外，其余處理同前。再使用鑒定劑T7-9，然后用T10-12以相同之方法重復(fù)該程序另外二次，這樣只使用12種鑒定劑，便能制備74＝2401種不同肽的完整獨(dú)特的編碼文庫。
為從單一選擇珠上讀出合成碼，將該珠粒于小離心試管中用每份100μl DMF先洗四次，然后在Pyrex毛細(xì)管中再懸浮于1μl DMF中。用Rayonet 350nm光源光解2小時(shí)之后，用約0.1μl雙-三甲基甲硅烷基乙酰胺，將從結(jié)合鑒定劑上釋放出的標(biāo)記進(jìn)行硅烷基化處理，并將溶液注射入裝配有0.2mM×20M甲基硅氧烷融合二氧化硅毛細(xì)管柱，及電子俘獲檢測器的Hewlett Packard毛細(xì)管氣相色譜儀中。從所得標(biāo)記的色譜圖上直接測定所挑選珠粒的二進(jìn)制合成碼。
實(shí)施例4苯并二氮雜文庫一種苯并二氮雜組合文庫含30種式VIII化合物， 其中R是CH3、CH(CH3)2、CH2CO2H、(CH2)4NH2、CH2C6H4OH或CH2C6H5，而R1是H、CH3、C2H5、CH2CH＝CH2或CH2C6H5該文庫由下面的各反應(yīng)路線構(gòu)成 苯并二氮雜VIII在聚苯乙烯珠上以類似于Bunin和Ellman的方法(JACS，114，10997-10998 )合成，不同之處是珠粒和苯并二氮雜之間以可光分解接頭結(jié)合(見步驟A，B和C)。這樣，使得苯并二氮雜在步驟G可通過曝露紫外光下(于DMF中用350nm光照10分鐘至12小時(shí))而以非水解方式釋放出。另外，二進(jìn)碼在步驟D和E引入，供精確測定用于引入6種R基和5種R1基中每一種的反應(yīng)順序。按步驟H移出標(biāo)記，并用電子俘獲檢測配合GC分離之后，測定獨(dú)立的R和R1基的性質(zhì)。
步驟D、E、和F基本上遵從Bunin和Ellman的程序，但還包括在步驟D結(jié)合入鑒定劑IXa-c和在步驟E結(jié)合入IXd-f。鑒定劑均由式IX代表 其中IXa表示n＝6；IXb表示n＝5；IXc表示n＝4；IXd表示n＝3；IXe表示n＝2；和IXf表示n＝1。
各R和R1的編碼如下
表4-1

步驟A將Fmoc保護(hù)的2-氨基-5-氯-4’-羥基-二苯酮(1.3當(dāng)量)和二乙基氮雜二甲酸酯(1.3當(dāng)量)及三苯基膦(1.3當(dāng)量)加入到化合物I(1等量)在甲苯(濃度＝0.5M)里的溶液中，該混合物于室溫下攪拌24小時(shí)。真空除去溶劑，用乙醚研制殘留物并過濾，再次真空除去溶劑。所得產(chǎn)物II由硅膠色譜提純。步驟B將TFA(3當(dāng)量)加入到室溫?cái)嚢柘碌幕衔颕I在DCM(0.2M)里的溶液中，并將該溶液攪拌12小時(shí)。將該溶液真空蒸發(fā)至干，殘留物溶于DCM中，用鹽水洗一次并干燥(Na2SO4)。過濾并蒸發(fā)溶劑，得到III。步驟C將1％DVB(二乙烯基苯)交聯(lián)聚苯乙烯珠(50μ，用氨甲基以1.1meq/g之量進(jìn)行過功能化處理)，在肽反應(yīng)器(Merrifield容器)中懸浮于DMF中。加入DMF中的III(2當(dāng)量)和HOBt(3當(dāng)量)，并將該反應(yīng)器振蕩10分鐘。加入DIC(3當(dāng)量)，振蕩反應(yīng)器直至水合茚三酮試驗(yàn)陰性，表示反應(yīng)完全(12小時(shí)之后)為止。
除去DMF，再用DMF(×5)和DCM(×5)洗滌樹脂，隨后真空干燥。步驟D干燥后的樹脂分裝入6個(gè)反應(yīng)器中并用DCM配成懸浮液。將鑒定劑IXa-c專用組(見表4-1)加入到該燒瓶中，并振蕩1小時(shí)。加入Rh(TFA)2催化劑(1mol％)到每個(gè)燒瓶并再振蕩2小時(shí)。將燒瓶溶劑排干，用DCM(×5)洗滌樹脂。然后再用TFA的DCM溶液(0.01M)處理該樹脂并振蕩30分鐘。然后再用DCM(×3)，接著用DMF(×2)洗滌。用20％哌啶的DMF溶液處理樹脂并振蕩30分鐘。然后用DMF(×3)和DCM(×3)洗滌。
每個(gè)燒瓶中加入適當(dāng)?shù)腇moc保護(hù)的氨基酰氟(3當(dāng)量)(當(dāng)需要對側(cè)鏈功能團(tuán)加以保護(hù)時(shí)，便以叔丁酯(ASP)、叔丁醚(Tyr)或叔丁氧羰基(Lys)的形式保護(hù))及2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶(10當(dāng)量)，并將燒瓶振蕩過夜，或直至水合茚三酮試驗(yàn)呈陰性為止。將樹脂用DCM洗滌一次，然后將六批結(jié)合在一起，并再次洗滌(DCM×5)、然后真空干燥。步驟E將干燥的樹脂分裝進(jìn)5個(gè)反應(yīng)瓶中，并懸浮于DCM中，將專用的鑒定劑IXd-f組(見表4-1)加入燒瓶并振蕩1小時(shí)。將Rh(TFA)2催化劑(1mol％)加入各燒瓶并再振蕩2小時(shí)。排干燒瓶，用DCM(×5)洗滌樹脂。然后用TFA的DCM溶液(0.01M)處理樹脂，并振蕩30分鐘，然后用DMF(×3)和DCM(×3)洗滌。
每個(gè)燒瓶中加入5％乙酸的DMF溶液后，將混合物加熱至60℃，并振蕩過夜。排干溶劑，然后用DMF(×5)洗滌樹脂。步驟F各批樹脂懸浮于THF中，各燒瓶冷卻至-78℃。各燒瓶中加入鋰化的(lithiated)5-(苯基甲基)-2-噁唑啉二酮(2當(dāng)量)的THF溶液，該混合物于-78℃振蕩1小時(shí)。然后將適當(dāng)?shù)耐榛噭?表4-2)(4當(dāng)量)加入各反應(yīng)燒瓶，接著加入催化量的DMF。反應(yīng)容器升至室溫，并在該溫度下振蕩5小時(shí)。過濾除去溶劑，用THF(×1)洗滌樹脂，然后真空干燥。然后將各批樹脂合并在一起用THF(×2)和DCM(×2)洗滌，隨之用95∶5∶10的TFA∶水∶二甲基硫醚混合物處理該合并的樹脂2小時(shí)，除去側(cè)鏈保護(hù)基。
表 4-2

步驟G將該珠粒懸浮于DMF中，用U.V.(350nm)照射12小時(shí)，可將所得苯并二氮雜從聚苯乙烯珠上裂解下來。步驟H將所研究的珠粒放入玻璃毛細(xì)管中，該管中注射入1μl 1M硝酸鈰(IV)銨(CAN)水溶液、1μl乙腈和2μl己烷。將該管于火焰上密封，然后離心處理，保證該珠粒浸入試劑中。將該管放入超聲浴中，超聲處理1-10小時(shí)，優(yōu)選2-6小時(shí)。
將該管碎斷打開，將約1μl上層己烷層與約0.2μl雙(三甲基甲硅烷基)-乙酰胺(BSA)混合，然后注射入GC儀，各標(biāo)記成份用電子俘獲檢測法測定，如下述反應(yīng)路線舉例說明的一樣。 實(shí)施例5117649肽文庫制備117649肽編碼文庫。該文庫有順序H2N-XXXXXXEEDLGGGG-珠，其中可變殘基X是D、E、I、K、L、Q或S。該文庫使用實(shí)施例3所定義的18個(gè)標(biāo)記編碼；三個(gè)二進(jìn)制數(shù)足以表示各步驟使用的7個(gè)氨基酸，所述碼為001＝S、010＝I、011＝K、100＝L、101＝Q、110＝E、和111＝D，其中1表示標(biāo)記存在，而0表示標(biāo)記不存在。
在1.5g 50-80μ使用1.1mEq/g氨基甲基功能化處理過的Merrifield聚苯乙烯合成珠上，使用基于叔丁基側(cè)鏈保護(hù)和Fmoc主鏈保護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)固相合成該文庫的恒定片段(H2NEEDLGGGG-珠)。用二乙胺除去N-末端Fmoc保護(hù)基之后，珠粒被分成每份200mg共7份，每份被放入安裝于單活動軸振蕩器上的不同Merrifield合成器中。
7個(gè)反應(yīng)器中的珠粒按表3-1處理，連接于一組鑒定劑(T1-T3)上，并加入相應(yīng)的氨基酸到各份中，不同之處在于用異丁基氯代甲酸酯代替DIC進(jìn)行活化處理。
該程序是首先將少量專用鑒定劑，借助其羧酸化學(xué)連接到合成珠上。要實(shí)現(xiàn)該連接，用異丁基氯代甲酸酯活化接頭的羧基成為混合碳酸酐，然后加入與1％連接于珠粒上的游離氨基之量相當(dāng)?shù)脑摶罨b定劑。這樣，有約1％的游離氨基由加入的各鑒定劑終止。其余的游離氨基按常規(guī)方式與活化成其對稱酐的相應(yīng)保護(hù)氨基酸偶合。
洗滌之后，將7份合并，用二乙胺處理去除氨基的Fmoc保護(hù)基。珠粒再次分成7份，如前所述處理之，不同之處是將攜帶標(biāo)記T4、T5和T6的專用鑒定劑加入各反應(yīng)器中。
使用攜帶標(biāo)記T1-T18的鑒定劑，將分份、標(biāo)記、偶合組合氨基酸和主鏈去保護(hù)之程序進(jìn)行總共6次。得到117649種不同成員的編碼肽文庫。典型的鑒定劑制備法將碳酸鈰(1.70g，5.22mmol)加入到8-溴-1-辛醇(0.91g，4.35mmol)和2，4，6-三氯苯酚(1.03g，5.22mmol)的DMF(5ml)溶液中，結(jié)果放出氣體及產(chǎn)生白色固體沉淀。該反應(yīng)于80℃攪拌2小時(shí)。用甲苯(50ml)稀釋該混合物，倒入分離漏斗中，用0.5N NaOH(2×50ml)、1N HCl(2×50ml)和水(50ml)洗滌，干燥有機(jī)相(MgSO4)。蒸發(fā)除去溶劑，得到1.24g(87％產(chǎn)率)標(biāo)記，為清澈油狀物。
將上述標(biāo)記(0.81g，2.5mmol)加入到2M光氣的甲苯(15ml)溶液中，室溫下攪拌1小時(shí)，蒸發(fā)除去過剩的光氣和甲苯，所得粗氯代甲酸酯被溶于DCM(5ml)和吡啶(0.61ml，7.5mmol)中。加入4-羥基-甲基-3-硝基苯甲酸叔丁酯(Barany和Albericio，J.Am.Chem.Soc.，(1985)，107，4936-4942)(0.5g，1.98mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)混合物3小時(shí)。用乙酸乙酯(75ml)稀釋該溶液，并傾進(jìn)分離漏斗中。用1N HCl(3×35ml)、飽和NaHCO3(2×35ml)和鹽水(35ml)洗滌之后，有機(jī)相被干燥(MgSO4)。蒸發(fā)除去溶劑，用硅膠色譜(5％-7.5％乙酸乙酯的石油醚液洗脫)提純殘留物，得到0.95g(產(chǎn)率79％)鑒定劑叔丁基酯，為清澈油狀物。
將三氟乙酸(3ml)加入鑒定劑叔丁基酯(0.95g，1.57mmol)的DCM(30ml)溶液中，將接頭的酸(即式I的F1-F2)去保護(hù)基，該溶液于室溫下攪拌7小時(shí)。將混合物蒸發(fā)至干并將殘留物再溶解于DCM(30ml)中。用鹽水(20ml)洗滌溶液并干燥有機(jī)相(MgSO4)。蒸發(fā)除去溶劑，得到0.75g(87％產(chǎn)率)鑒定劑(6B)，為淺黃色固體。(標(biāo)記命名法與實(shí)施例3同)。典型的編碼文庫合成步驟將Nα-Fmoc-E(tBu)-E(tBu)-D(tBu)-L-G4-NH-樹脂懸浮于DMF(20ml)、并振蕩2分鐘。過濾之后，加入1∶1的二乙胺∶DMF(40ml)除去Fmoc保護(hù)基，樹脂再振蕩1小時(shí)。過濾分離樹脂、并用DMF(2×20ml每次2分鐘)、2∶1二噁烷∶水(2×20ml，5分鐘每次)、DMF(3×20ml，每次2分鐘)、DCM(3×20ml，每次2分鐘)洗滌，然后于25℃真空干燥(這一階段用苦味酸滴定，測出該樹脂有0.4mmol/g氨基)。
將每份150mg樹脂分別放入7個(gè)merrifield容器中并懸浮于DCM(5ml)中。如下述方法將專用鑒定劑活化為其碳酰酯形式(供第一次偶合用)將T1(6.6mg，0.0098mmol)溶解于無水乙醚(2ml)中，并加入吡啶(10μl)。氯代甲酸異丁酯(1.3μl，0.0096mmol)以其無水乙醚(0.1ml)的溶液形式加入。所得混合物于25℃攪拌1小時(shí)，此時(shí)形成白色細(xì)小沉淀。停止攪拌，使沉淀沉積30分鐘。T2和T3的碳酰酯溶液以同樣方法制得。各經(jīng)活化的鑒定劑上清液按等分量(0.25ml)混合得到專用的3位數(shù)二進(jìn)制標(biāo)記碼，并將鑒定劑的專用編碼混合物加入到七個(gè)合成反應(yīng)器的每一個(gè)中。該反應(yīng)器在黑暗中振蕩12小時(shí)，然后各自用DCM(4×10ml，每次2分鐘)洗滌。將Nα-Fmoc氨基酸對稱酐的DCM溶液(3當(dāng)量于10ml中)加入相應(yīng)的各批編碼樹脂中，并振蕩20分鐘。加入5％N，N-二異丙基乙胺的DCM(1ml)溶液，該混合物振蕩直至該樹脂的Kaiser試驗(yàn)為陰性止。
將各批樹脂過濾并合并，然后用DCM(4×20ml，每次2分鐘)、異丙醇(2×20ml，每次2分鐘)、DCM(4×20ml，每次2分鐘)洗滌。下一個(gè)標(biāo)記/偶合循環(huán)如上所述從脫Fmoc保護(hù)基開始。
肽的最后位置處的殘基脫Fmoc保護(hù)基之后，將樹脂懸浮于DCM(10ml)，加入苯硫基甲烷(2ml)、乙二硫醇(0.5ml)和三氟乙酸(10ml)，然后于25℃振蕩1小時(shí)，從而除去側(cè)鏈官能團(tuán)保護(hù)基。用DCM(6×20ml，每次2分鐘)洗滌樹脂，并干燥之。電子俘獲氣相色譜讀碼將單個(gè)挑選出的珠粒放于Pyrex毛細(xì)管，并用DMF(5×10μl)洗滌，然后將珠粒懸浮于DMF(1μl)中，并將毛細(xì)管密封。用366nm光照射該懸浮珠粒3小時(shí)，釋放出標(biāo)記醇，隨后將該毛細(xì)管放入90℃砂浴中2小時(shí)。打開毛細(xì)管加入雙-三甲基甲硅烷基乙酰胺(0.1ml)，使該標(biāo)記醇進(jìn)行三甲基甲硅烷基化。離心2分鐘后，該珠粒上面的標(biāo)記溶液(1μl)直接注射入電子俘獲檢測的毛細(xì)管氣相色譜儀中分析。該氣相色譜分析使用裝配0.2mm×20m甲基硅氧烷融合二氧化硅毛細(xì)管柱，及電子俘獲檢測器的Hewlett Packard Series II Model 5890氣相色譜儀進(jìn)行。光分解反應(yīng)用UVP“Black Ray”model UVL 56手持式366nm燈進(jìn)行?？贵w親和性法按Evans等人(Mol.Cell Biol.，5，3610-3616(1985)及Munro和Pelham(Cell，48，899-907(1987))所述，從腹水液制備抗-C-myc肽單克隆抗體9E10。為試驗(yàn)珠粒與9E10的結(jié)合情況，將珠粒在含1％牛血清白蛋白(BSA)的TBST〔20mM Tris-HCl(pH7.5)，500mM NaCl和0.05％Tween-20〕中培養(yǎng)，阻隔非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。然后將珠粒離心處理后，懸浮于1∶200 TBST+1％BSA稀釋的9E10脫水液中并培養(yǎng)過夜(4℃)。然后在TBST中將珠粒洗3次，并于室溫下，在堿性磷酸酶偶合的山羊抗鼠IgG抗體(Bio-RadLaboratories)中，培養(yǎng)90分鐘，按1∶3000之比用TBST+1％BSA稀釋。在TBST中洗珠粒兩次后，再在磷酸酶緩沖液(100mMTris-HCl，pH9.5，100mM NaCl和5mM MgCl2)中洗1次，在含各百分之一份的AP“彩色試劑”A&B(Bio-Rad Laboratories)的磷酸酶緩沖液中，室溫下將該珠粒培養(yǎng)1小時(shí)。為中止反應(yīng)，用20mM鈉EDTA、pH7.4洗珠粒兩次。采用修改的Harlow等人(AntibodiesaLaboratory Manual，507-573，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)所述競爭ELISA測試法，測定9E10和各種肽之間的溶液相親和性。
從30mg肽組合文庫樣品中，鑒定暴露于抗-C-myc單克隆抗體染色的40個(gè)獨(dú)立的珠粒。將呈陽性反應(yīng)的珠粒解碼，確定作為myc表位(EQKLISEEDL)的配位體的反應(yīng)順序，或三個(gè)N-末端殘基中有一個(gè)或二個(gè)取代基之差的順序。
實(shí)施例623540625混合酰胺文庫該編碼技術(shù)進(jìn)一步通過制備由肽和其它酰胺化合物組成的23540625個(gè)成員的組合文庫而加以試驗(yàn)。
該合成在5個(gè)步驟中使用15種不同試劑，并在第6步中用31種不同試劑而完成。帶15種試劑的5個(gè)步驟每步各用4種鑒定劑編碼，而于帶31種試劑的最后一步中用5種鑒定劑。預(yù)先制備25種鑒定劑的標(biāo)記組。采用2-硝基-4-羧酸芐基，O-芳基取代的碳酸ω-羥基烷基酯鑒定劑，其中標(biāo)記成份由3-12個(gè)碳原子的烷基部份組成，而芳基部份是(A)五氯苯基，(B)2，4，5-三氯苯基，(C)2，4，6-三氯苯基，或(D)2，6-二氯-4-氟苯基。25個(gè)標(biāo)記的一組，分別用帶上述A、B、C、D的專用鏈長烷基來制備，可采用0.2mM×25M甲基硅氧烷GC柱來分離。標(biāo)記T1-T25(其中T1代表保留時(shí)間最長的標(biāo)記，而T25則代表保留時(shí)間最短之標(biāo)記)的化學(xué)組合歸納如下

所謂10A，9A等的意義如實(shí)施例3所述。
前面五步所用15種試劑及其鑒定碼列于下表，其中“1”代表標(biāo)記“存在”，而“0”表示該標(biāo)記不存在。

第6步所用31種試劑及其各自代表的碼號列于下面


使用標(biāo)準(zhǔn)方法在珠粒上制備6個(gè)甘氨酸單元的間隔基。使用丁基側(cè)鏈保護(hù)構(gòu)建可變區(qū)，而氨基作為Fmoc衍生物而受保護(hù)。以DIC和HOBt活化羧酸而形成酰氨鍵。
實(shí)施例7雜-Diels-Alder文庫包含下式42種化合物的組合雜-Diels-Alder文庫

其中；R1是H，CH3O，F(xiàn)3C，F(xiàn)3CO，H5C6O，或C6H11；R2是H，CH3，或CH3O；R3是H(當(dāng)n＝2)，或CH3(當(dāng)n＝1)；和

R＝H或Cl或

由下述每種反應(yīng)路線而構(gòu)建 氮雜三環(huán)產(chǎn)物(VI)在聚苯乙烯珠上構(gòu)成，由通過紫外光(350nm，DMF中)曝光即能使該氮雜三環(huán)(VII)從珠粒上移出的可光裂解接頭，將其連于珠粒中。步驟C、D和E引入的二進(jìn)制碼供專一的測定使ArR、R1、R2和R3引入的反應(yīng)順序。按步驟G移出編碼標(biāo)記，并由配合GC分離的電子俘獲檢測法進(jìn)行分析。
用于本例反應(yīng)路線中的鑒定劑由式X代表， 其中Xa表示n＝10Xb表示n＝9Xc表示n＝8Xd表示n＝7Xe表示n＝6Xf表示n＝5Xg表示n＝4各R、R1、R2、R3的碼如下表7-1 a，b c R1＝H R2＝Hd R1＝H R2＝CH3d，c R1＝OCH3R2＝OCH3e R1＝CF3R2＝He，c R1＝C6H5O R2＝He，d R1＝F3CO R2＝He，d，cR1＝C6H11R2＝Hf R3＝CH3n＝1g R3＝H n＝2步驟A以30分鐘時(shí)間，于0℃，攪拌下，在化合物I(2.03g，8mmol)、4-羥基苯甲醛(1.17g，9.6mmol)和三苯基膦(2.73g，10.4mmol)的甲苯(20ml)溶液中加入二乙基氮雜二甲酸酯。使該溶液升溫，達(dá)到室溫后即攪拌1小時(shí)。真空除去約一半溶劑而使該溶液濃縮，并隨后用乙醚研制。過濾該混合物，用乙醚徹底洗滌該殘留物。真空除去溶劑，用硅膠色譜(15％的乙酸乙酯己烷洗脫)提純該殘留物，得到1.3g醚化合物IIa(47％產(chǎn)率)。
以相似的方式使2-氯-4-羥基苯甲醛和2-羥基-1-萘甲醛與式I化合物偶合，得到醚IIb和IIc，產(chǎn)率分別為91％和67％。步驟B醚IIa(0.407g，1.14mmol)的DCM(20ml)溶液于攪拌、室溫下加入TFA(8ml)中。將該溶液攪拌6小時(shí)，將其真空蒸發(fā)至干，得到0.343g酸化合物IIIa(產(chǎn)率100％)。用相似方法將醚IIb和IIc去保護(hù)，也得到酸IIIb和IIIc，產(chǎn)率分別為92％和100％。步驟C將以氨甲基(1.1meq/g)功能化的1％DVB(二乙烯基苯)交聯(lián)的聚苯乙烯珠(50-80μ，200mg樹脂)計(jì)量加入肽反應(yīng)器(Merrifield反應(yīng)器)中。該樹脂懸浮于DMF(2ml)中并振蕩20分鐘。加入酸IIIa(38mg，2當(dāng)量)、1-羥基苯并三唑(40mg，2當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(38mg，2當(dāng)量)，振蕩該混合物直至水合茚三酮試驗(yàn)呈陰性為止(22小時(shí))。過濾除去溶液，用DCM(8×10ml)洗滌樹脂。
該樹脂懸浮于DCM(5ml)中，加入鑒定劑Xa(15mg)并將燒瓶振蕩1小時(shí)。加入Rh(TFA)2催化劑(1mol％)，并再將該燒瓶振蕩2小時(shí)。過濾除去溶劑，樹脂再懸浮于DCM(5ml)中。加入三氟乙酸(1滴)，反應(yīng)器振蕩20分鐘。過濾除去溶劑，用DCM(8×10ml)洗滌樹脂。
以相似方式，將酸IIIb和IIIc連接于樹脂上，并用專用的鑒定劑(即Xb用于酸IIIb，而Xa和Xb用于酸IIIc)編碼。將三批樹脂合并、混合、洗滌及干燥。步驟D將干燥樹脂分成7等份(87mg)，放進(jìn)7個(gè)用加熱帶包裹的肽反應(yīng)器(Merrifield反應(yīng)器)中。各反應(yīng)器樹脂均懸浮于甲苯(10ml)中并振蕩20分鐘。然后各燒瓶中加入適量的一種苯胺(見表7-2)。
表7-2

接上加熱帶，使反應(yīng)混合物于70℃振蕩18小時(shí)。解下加熱帶并過濾除去溶劑，各批樹脂用無水DCM(4×10ml)、乙醚(10ml)、甲苯(10ml)和DCM(2×10ml)洗滌。再將每份懸浮于DCM(5ml)中，各燒瓶中分別加入專用的鑒定劑或鑒定劑(Xc-e)(15mg)組(見表7-1)。將燒瓶振蕩1小時(shí)，然后各瓶中加入Rh(TFA)2(1mol％)，再連續(xù)振蕩2小時(shí)。
然后除去溶劑，各批樹脂再懸浮于加有TFA(1滴)的DCM(5ml)中。該混合物振蕩20分鐘，然后過濾除去溶劑。洗滌各批樹脂(DCM，1×10ml)并合并，再用DCM(3×10ml)洗滌，隨后真空徹底干燥。步驟E將干燥樹脂分成2等份(0.3g)，分別放入肽反應(yīng)器中。用DCM(2×10ml)洗滌各批樹脂，然后再懸浮于DCM(5ml)中。一個(gè)瓶中加入鑒定劑Xf(15mg)，而另一個(gè)中加入Xg(15mg)。兩燒瓶振蕩1小時(shí)，然后加入Rh(TFA)2催化劑(1mol％)。振蕩燒瓶2小時(shí)，然后過濾除去溶劑。用DCM(3×10ml)洗滌各批樹脂，然后再將各批懸浮于DCM(5ml)中。
將適當(dāng)?shù)南┐济?1ml)(見表7-1)加入到各燒瓶中，并將其振蕩30分鐘。各燒瓶中加入BF3·OEt2溶液(0.5ml的5％DCM溶液)，再振蕩24小時(shí)。過濾除去溶劑，接著用DCM(10ml)洗滌樹脂，然后將樹脂合并。然后再用DCM(5×10ml)、DMF(2×10ml)、甲醇(2×10ml)和DCM(2×10ml)洗滌珠粒。然后真空徹底干燥樹脂。步驟F為確切鑒定雜-Diels-Alder文庫生產(chǎn)的產(chǎn)物，以大規(guī)模完成一個(gè)典型例供以光譜手段證實(shí)其結(jié)構(gòu)。所遵循程序基本上與結(jié)合文庫所述方法相同。在步驟A，將4-羥基苯甲醛偶合到可光解基團(tuán)上。在步驟D，苯胺與醛縮合，在步驟E，與4，5-二氫-2-甲基呋喃形成烯醇醚。
化合物(步驟F)的光解，通過將珠粒100mg懸浮于DMF(0.3ml)中并用UVP“Black Ray”model UVL56手持366nm燈照射該珠粒16小時(shí)而完成。用吸液管將DMF移出，用新的DMF(2×3ml)漂洗該珠粒。將原始溶液和漂洗液合并，真空除去溶劑。NMR分析反應(yīng)混合物，與可信樣品比較，表明其含有所需氮雜三環(huán)化合物。步驟G將要研究的珠粒放入-端密封的Pyrex玻璃毛細(xì)管中。將1M硝酸鈰(IV)銨水溶液和乙腈(1∶1)的溶液注射進(jìn)管中，然后離心處理該管，以使珠粒沉入毛細(xì)管底部，并完全被試劑溶液浸沒。注射加入己烷(2μl)，并再次離心處理該管。該毛細(xì)管的開口端用火焰密封，放入超聲浴4小時(shí)。然后該毛細(xì)管插入離心器旋轉(zhuǎn)，以使水層強(qiáng)制通過己烷層到管的底部。將該提取過程重復(fù)3或4次，然后打開該管。用注射器移出己烷層(1.5μl)并放入含BSA(0.2ml)的不同毛細(xì)管中，將該管密封，離心處理直至試劑徹底混合為止。取出一份溶液(約1μl)，注射入配有25M×0.2mM甲基硅氧烷融合二氧化硅柱和電子俘獲檢測器的氣相色譜化，分離及解釋標(biāo)記分子。
于200℃和25psi載氣(He2)的條件下將樣品注射入GC柱。1分鐘之后，按每分鐘升20℃的速度將溫度升至320℃，而壓力則按每分鐘升2psi的速度升至40psi。這些條件由下圖表示

隨意挑選四個(gè)珠粒獲得下面之結(jié)果珠粒1

珠粒2

珠粒3

珠粒4

實(shí)施例8苯并二氮雜文庫遵循實(shí)施例4的程序，構(gòu)建式X的組合文庫。

其中R是天然存在的D或L氨基酸基團(tuán)；R1是H、C1-C6烷基、低級鏈烯基、C1-C6烷胺、羧基C1-C6烷基、或苯基C1-C6烷基，其中苯基由低級烷基、F、Cl、Br、OH、NH2、CO2H或O-低級烷基任意取代(或未取代)；R2是H或CO2H；R3是H或OH；R4是H或Cl；其前提條件是若R3是OH，則R2是H，而若R2是羧基，則R3是H。
該文庫由如下通式的許多編碼珠粒上釋放 其中IXn是式Ia的多種鑒定劑，其中所述“多種”代表一種編碼方案；S是基質(zhì)；F1’-F2是式Ia接頭元件的殘基；而R、R1、R2和R4與式X中定義相同。
實(shí)施例9典型的鑒定劑制備法現(xiàn)舉例說明通過形成碳雙鍵連接于樹脂上的重氮化合物鑒定劑的制備。通式如下的化合物 其中n是0-10；而Ar是五氯苯酚、2，4，6-三氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、或2，6-二氯-4-氟苯酚，其制備方法如下在1-羥基-4-(2，6-二氯-4-氟苯氧基)丁烷(0.38g，1.5mmol)、異香草醛(0.228g，1.5mmol)和三苯基膦(0.393g，1.5mmol)的THF(8ml)溶液中加入二乙基氮雜二甲酸酯(0.287g，1.7mmol)。該溶液于室溫下攪拌36小時(shí)。真空除去溶劑，用硅膠色譜(20％乙酸乙酯和80％石油醚的混合物為洗脫劑)將殘留物提純，得到0.45g醛化合物(產(chǎn)率77％)。
該醛(100mg，0.26mmol)溶于丙酮中(8ml)，用KMnO4(61mg，0.39mmol)的丙酮(4ml)和水(4ml)溶液處理。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?3小時(shí)。用乙酸乙酯(100ml)和水(50ml)稀釋該混合物并分層。再加乙酸乙酯(2×100ml)提取水層，合并的有機(jī)層用水(50ml)洗滌并干燥(MgSO4)。除去溶劑，得到109mg苯甲酸化合物(產(chǎn)率93％)。
該酸(76mg，0.188mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液用草酰氯(36mg，0.28mmol)和催化量DMF處理。室溫下攪拌10分鐘后，觀察到緩慢但穩(wěn)定的釋放出氣體來。繼續(xù)攪拌2小時(shí)，同時(shí)用DCM(15ml)稀釋溶液，并用飽和碳酸氫鈉水溶液(5ml)洗滌。分層，干燥有機(jī)層(Na2SO4)并蒸發(fā)溶劑，得到苯甲酰氯化合物，為淺黃色晶體。
將苯甲酰氯溶于二氯甲烷(5ml)中，并加入到攪拌著的過剩重氮甲烷的乙醚溶液(-78℃)中。使冷卻浴溫度升高，使該混合物于室溫下攪拌5小時(shí)。真空除去溶劑和過剩的重氮甲烷，采用硅膠色譜以梯度洗脫法提純殘留物，其梯度洗脫液為10％-40％的乙酸乙酯在己烷中的溶液，得到48mg重氮化合物(產(chǎn)率60％)。通式如下的化合物 其中n是0-10；而Ar是五氯苯酚，2，4，6-三氯苯酚，2，4，5-三氯苯酚，或2，6-二氯-4-氟苯酚，其制備如下將香草酸甲酯(0.729g，4.0mmole)、1-羥基-9-(2，3，4，5，6-五氯苯氧基)壬烷(1.634g，4.0mmole)、和三苯基膦(1.259g，4.8mmole)于氬氣下溶解于20ml無水甲苯中。滴加入DEAD(0.76ml，0.836g，4.8mmole)，并將該混合物攪拌(25℃)1小時(shí)。將該溶液濃縮至一半體積，采用快速色譜，以DCM洗脫將其提純，得到1.0g(1.7mmole，43％)產(chǎn)物，為白色晶狀固體。
將上述甲酯(1.0g，1.7mmole)溶于50ml THF中，加入2ml水接著加入氫氧化鋰(1.2g，50mmole)。該混合物于25℃攪拌1小時(shí)，然后回流5小時(shí)。冷卻至25℃之后，將該混合物傾入乙酸乙酯(200ml)中，溶液用1M HCl(50ml×3)，然后用飽和NaCl(1×50ml)水溶液洗滌，用硫酸鈉干燥。除去溶劑且酸粗產(chǎn)物與甲苯共沸一次。
將上述粗產(chǎn)物溶于100ml甲苯，加入10ml(1.63g，14mmole)亞硫酰氯，將該混合物回流90分鐘。蒸餾使該溶液體積減至約30ml，然后真空蒸發(fā)除去其余甲苯。將該酰氯粗品溶于20ml無水DCM中，氬氣下冷至-78℃，加入約10mmole重氮甲烷的50ml無水乙醚溶液?；旌衔锷潦覝兀嚢?0分鐘。通過溶液充入氬氣10分鐘，然后真空蒸發(fā)除去溶劑，采用以10-20％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫的快速色譜提純該粗產(chǎn)物。獲得重氮酮化合物(0.85g，1.4mmol，三步得82％產(chǎn)率)，為淺黃色固體。
如上所述制備下述鑒定劑可光裂解制備下式的50種鑒定劑 其中 n是1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。氧化裂解I型制備下式7種鑒定劑 其中Ar是n是4、5、6、7、8、9和10。氧化裂解II型制備下式13種鑒定劑 其中Ar是 n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；并且其中3Ar是 且n是0、3和9。
實(shí)施例10由質(zhì)譜可讀的標(biāo)記編碼的組合文庫將有相同結(jié)構(gòu)，但由于氘取代不同而分子量各異的標(biāo)記4、11和13(反應(yīng)路線8)分別合成(反應(yīng)路線9和10)，并用質(zhì)譜(MS)分開分析。MS技術(shù)中，正化學(xué)電離質(zhì)譜(PCIMS)給出標(biāo)記的最小片段，這樣僅有分子離子([M+NH4]+)，和一個(gè)其它片段([MH-H2O]+)是明顯的(圖1、2和3)。這實(shí)際使得標(biāo)記的存在或不存在，可通過觀察兩個(gè)信號來確定，這就消除了當(dāng)分析更為復(fù)雜的混合物時(shí)可能出現(xiàn)的不明確性。將近似等量的三個(gè)標(biāo)記混合并用PCIMS分析(圖5)，再次看出，相應(yīng)于各分離標(biāo)記的二個(gè)信號可很容易區(qū)分。
現(xiàn)將標(biāo)記4轉(zhuǎn)化成重氮酮前體8(反應(yīng)路線9)，然后連接到稱之為9的Tentagel樹脂上(反應(yīng)路線12)。隨后將9的一個(gè)珠粒移出，并使用硝酸鈰銨氧化釋放出4。PCIMS分析再次清楚地表示有標(biāo)記4存在。
綜上所述，標(biāo)記4、11和13組成的有相同結(jié)構(gòu)，但分子量不同的一組被合成。用PCIMS在混合物中均很容易同時(shí)檢測出所有各標(biāo)記。從用于組合文庫合成的單個(gè)Tentagel樹脂珠粒上釋放的少量4，由PCIMS可檢測出。MS是對標(biāo)記的有效且靈敏的檢測法，可用作編碼組合文庫方案的基礎(chǔ)。
采用PCIMS分析4、11和13是使用1％NH3在甲烷中的氣體混合物試劑完成的。
(2).在11.1ml(125mmol，5.00g)1，4-丁二醇(1)、6.97ml(50.0mmole，2.00當(dāng)量)Et3N和0.153g(1.25mmol，0.05當(dāng)量)4-二甲基氨基吡啶的無水CH2Cl2(100ml)溶液中，于0℃氬氣下加入3.88g(25.0mmol，1.00當(dāng)量)97％叔丁基二甲基甲硅烷基氯。新的溶液于0℃攪拌15分鐘，然后于25℃攪拌16小時(shí)。然后用CH2Cl2(250ml)稀釋反應(yīng)物，并用1M HCl(100ml)，飽和NaHCO3水溶液(100ml)，和H2O(100ml)洗滌，再干燥(MgSO4)。真空除去揮發(fā)物，得到粗產(chǎn)物2，為油狀物。
(3).在～10.0mmol粗產(chǎn)醇2，1.93g(10.5mmol，1.05當(dāng)量)五氟苯酚和2.89g(11.0mmol，1.10當(dāng)量)三苯基膦的無水CH2Cl2(40ml)溶液中，于0℃通氬氣下加入1.73ml(11.0mmol，1.10當(dāng)量)氮雜二甲酸二乙酯。將所得橙色溶液于0℃攪拌5分鐘，然后在25℃攪拌15小時(shí)。后用CH2Cl2(250ml)稀釋反應(yīng)物，并用飽和Na2CO3水溶液(100ml)、飽和NH4Cl水溶液(100ml)和水(100ml)洗滌，然后干燥(MgSO4)。真空除去揮發(fā)物，用快速色譜(0-20％EtOAc的己烷液)提純，得到產(chǎn)物3，為油狀物。
(4).在1.85g(5.00mmol，1.00當(dāng)量)經(jīng)甲硅烷基保護(hù)的醇3的THF(20ml)溶液中，25℃下加入10.0ml(10.0mmol，2.00當(dāng)量)1.0M四丁基氟化銨的THF溶液。將所得橙色溶液于25℃攪拌4小時(shí)。真空除去揮發(fā)物，用快速色譜提純(20-40％EtOAc的己烷液)，得到1.10g(86％)產(chǎn)物4，為油狀物。
(5).在0.800g(3.125mmol，1.00當(dāng)量)醇4、0.569g(3.125mmol，1.00當(dāng)量)香草酸甲酯、和0.984g(3.75mmol，1.20當(dāng)量)三苯基膦的無水CH2Cl2(20ml)溶液中，于0℃通氬氣下加入0.59lml(3.75mmol，1.20當(dāng)量)氮雜二甲酸二乙酯。新得淺黃色溶液于0℃攪拌5分鐘，然后于25℃攪拌19小時(shí)。然后用CH2Cl2(100ml)稀釋該反應(yīng)物，并用1M NaOH(50ml)、飽和NH4Cl水溶液(50ml)、和H2O(50ml)洗滌、爾后干燥(MgSO4)。真空除去揮發(fā)物，用快速色譜提純(20％EtOAc的己烷液)，得到產(chǎn)物5，為油狀物。
(6).在3.1 25mmol產(chǎn)物5酯化合物的THF(12ml)溶液中，加入1.31g(31.3mmol，10.0當(dāng)量)氫氧化鋰單水合物。新得懸浮液中加入MeOH(24ml)形成溶液，將其于25℃攪拌1小時(shí)，然后回流1天。真空除去揮發(fā)物，然后加入1M HCl直至該溶液pH約為1止。收集形成的白色沉淀產(chǎn)物，干燥，得到0.968g(二步產(chǎn)率76％)產(chǎn)物6。
(7).在羧酸6(0.968g，2.38mmol，1.00當(dāng)量)中，通氬氣下加入2.43ml亞硫酰氯。將新得懸浮液回流1.5小時(shí)，之后形成黃色溶液。真空除去揮發(fā)物，所得殘留物與甲苯共沸三次，得到產(chǎn)物7，為無色晶體。
(8).在2.38mmol酰氯7的1∶1 THFMeCN(20ml)溶液中，于0℃通氬氣中，加入1.16ml(8.33mmole，3.50當(dāng)量)Et3N，接著加入3.57ml(7.14mmol，3.00當(dāng)量)2.0M(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷的己烷溶液。所得黃色溶液于0℃攪拌1小時(shí)，爾后于25℃攪拌1天。用EtOAc(150ml)稀釋反應(yīng)物，用飽和NaHCO3水溶液(2×75ml)和飽和NaCl水溶液(2×75ml)洗滌，然后干燥(MgSO4)。真空除去揮發(fā)物，得到粗產(chǎn)物8，為油狀物。
(11).使用市售1，4-丁二醇-2，2，3，3-d4(10)代替1，用將1轉(zhuǎn)化為4所述類似程序，獲得產(chǎn)物11，三步產(chǎn)率41％。
使用市售1，4-丁二醇-2，2，3，3，4，4-d8(10)代替1，并用將1轉(zhuǎn)化為4所述類似程序，獲得產(chǎn)物13，三步產(chǎn)率42％。
使用5-50％(w/w對樹脂)前體重氮酮8將標(biāo)記4引入固體載體，用基本上與實(shí)施例4相同之方法得到9，即雜Diels-Alder文庫。并用實(shí)施例4步驟G基本相同之方法，隨后將標(biāo)記4從9中除去。
采用與標(biāo)記11和13相應(yīng)的重氮酮，將這些標(biāo)記引入固體載體，以便同8一起，這些重氮酮產(chǎn)生一組二進(jìn)制編碼元件。
反應(yīng)路線8 4M.W.＝256 11M.W.＝260 13M.W.＝264
反應(yīng)路線9
反應(yīng)路線10
反應(yīng)路線11
制備氘化標(biāo)記 在PPh3(3.2g，12.1mmol)的THF(30ml)溶液中，于0℃加入氮雜二甲酸二乙酯(1.9ml，12mmol)。10分鐘后，于0℃加入4-羥苯基乙酸甲酯(1.66g，10mmol)和d5-乙醇(800μl，12.3mmol)的10ml THF溶液。25℃攪拌2小時(shí)后，濃縮反應(yīng)混合物，并用快速色譜提純，得到4-d5乙氧基苯基乙酸甲酯(1.86g，93％)，為無色油狀物。 在4-d5乙氧基苯基乙酸酯(1g，5mmol)的無水乙醚溶液中，于0℃加入氫化鋁鋰(380mg，10mmol)。于25℃攪拌8小時(shí)后，將反應(yīng)混合物傾入冷3M HCl中。然后用乙醚提取該水溶液二次。合并有機(jī)層，用鹽水洗滌，并用MgSO4干燥。除去溶劑，得到4-d5乙氧基苯乙醇(850mg，100％)，為白色固體。H1NMR(CDCl3)2.79(2H，t，J＝6.6Hz)，3.80(2H，t，J＝6.5Hz)，6.83(2H，d，J＝8.6Hz)，7.12(2H，d，J＝8.6Hz)。
在4-d5乙氧基苯基乙酸酯(800mg，4mmol)的無水乙醚溶液中，于0℃加入氘化鋁鋰(340mg，8mmol)。25℃下攪拌8小時(shí)之后，將該反應(yīng)混合物傾入冷3M HCl中。然后用乙醚提取水溶液兩次、合并有機(jī)層，用鹽水洗滌，并用MgSO4干燥。除去溶劑得到4-d5乙氧基d2-苯乙醇(680mg，98％)，為白色固體。
H1NMR(CDCl3)2.79(2H，s)，6.85(2H，d，J＝8.5Hz)，7.13(2H，d，J＝8.5Hz)。
反應(yīng)路線12給出了一張表，該表中列出由橫向欄的化合物與相應(yīng)的豎向欄化合物結(jié)合所形成的7種不同的標(biāo)記。
反應(yīng)路線12
評價(jià)d-7或d-5氘樣品 為滿足靈敏度的要求，該兩樣品于室溫、使用衍生劑雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)定量地形成三甲基甲硅烷基酯而進(jìn)行衍生處理30分鐘。室溫下通N2(g)氣流除去試劑和溶劑。再用乙酸乙酯溶解樣品，注射入柱中用正化學(xué)電離質(zhì)譜分析。d-7和d-5成份不可能在GC上分離，但當(dāng)使用Hewlett-Packard GC/MS，以約20ng之量注射入柱中時(shí)，質(zhì)譜可測定兩種成份存在的比例。對于衍生d-5和d-7樣品的質(zhì)譜而言，圖6中所觀察到的(M+NH4)+離子表明d-7的m/z＝263，而d-5的m/z＝261，這與計(jì)算結(jié)果相符。對乙氧基芐基陽離子的片斷也在圖6中觀察到，d-7的m/z＝156，而d-5的m/z＝154。假如使用更為靈敏的JEOL SX-102高分辨質(zhì)譜，其靈敏度可以提高到只注射1ng或更少。JEOL SX-102比Hewlett-Packard體系靈敏度要高兩個(gè)數(shù)量級。圖6表示證明由于衍生作用色譜圖得到改善后的光譜和色譜圖。圖5表示僅有未衍生d-7樣品的質(zhì)譜和色譜圖。
從上面的介紹很清楚看出，本發(fā)明提供一種通用，簡單的鑒定化合物的方法，其中存在的化合物的量排除了任何能獲取測定其反應(yīng)歷程的保證。本發(fā)明能生產(chǎn)非常大量的不同產(chǎn)物，可用各種篩選技術(shù)測定感興趣之物的生物學(xué)及其它活性。使用操作條件下化學(xué)惰性的標(biāo)記，提供了在各種環(huán)境下，采用各種合成技術(shù)，生產(chǎn)感興趣之產(chǎn)物的極大適應(yīng)性。所述標(biāo)記可以很容易合成，并能精確地分析，使之能精確定義組合物之性質(zhì)。
本說明書所摘錄的所有公開文獻(xiàn)及專利申請均列入本文作為參考，正如曾在具體和個(gè)別地方表示過的將各文獻(xiàn)及各專利列為參考一樣。
雖然為清楚了解之目的，本發(fā)明前面已通過描述和舉例作過詳細(xì)介紹，但很明顯，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，根據(jù)本發(fā)明的指數(shù)，可以作出某些改變和修正，而并不偏離所附權(quán)利要求書的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種記錄在許多專用固體載體的每一個(gè)上進(jìn)行的反應(yīng)系列的反應(yīng)歷程之方法，其中所述反應(yīng)系列包括至少兩個(gè)要求不同化學(xué)劑或反應(yīng)條件的階段，結(jié)果產(chǎn)生與眾多所述專用固體載體相關(guān)的不同修飾，在不同專用固體載體上得到許多種不同的最終產(chǎn)物，采用一組鑒定劑記錄所述反應(yīng)歷程，所述鑒定劑的特征在于，能定義化學(xué)劑或反應(yīng)條件的選擇，并能定義所述反應(yīng)系列的階段，能就其選擇和階段加以分析，所述方法包括在所述系列的第一或中間階段，對所述專用固體載體的每一組，以不同化學(xué)劑或采用不同的反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，所述組包括至少一個(gè)所述專用固體載體和一組鑒定劑，其中所述鑒定劑組定義有關(guān)所述專用固體載體每一組的化學(xué)劑選擇和所述系列中的階段，所述鑒定劑的每一種直接地，或者通過除前面的鑒定劑之外的物質(zhì)獨(dú)立地結(jié)合于所述專用固體載體上；將各組載體混合在一起，然后再將所述許多專用固體載體分成許多新的組，再進(jìn)行第二中間階段或最終階段；并重復(fù)所述反應(yīng)至少一次，提供不同產(chǎn)物在不同個(gè)體專用固體載體上的許多種最終產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中至少100個(gè)專用固體載體，和至少兩個(gè)組被用于各所述反應(yīng)中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括就所感興趣的特性，對所述專用固體載體上的所述最終產(chǎn)物進(jìn)行篩選的附加步驟，并鑒定具所述感興趣特征的至少一種最終產(chǎn)物的反應(yīng)歷程。
4.權(quán)利要求1的方法，還包括從固體載體上解離最終產(chǎn)物并篩選所述最終產(chǎn)物。
5.權(quán)利要求1的方法，還包括處理鑒定劑、使標(biāo)記成份從固體載體上解離下來，并使所述標(biāo)記成份同能通過熒光或電子俘獲法檢測的部份反應(yīng)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中解離由光化學(xué)法或氧化法進(jìn)行，而可檢測部份衍生自1-二甲胺基萘-5-磺酰氯，或多鹵代苯甲酰鹵。
7.權(quán)利要求1的方法，其中鑒定劑包括具有二個(gè)特征的標(biāo)記成份，一個(gè)特征是可分離性，另一特征是可檢測性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述能檢測特征是指可由電子俘獲檢測的能力。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述可檢測特征是指可由質(zhì)譜檢測的能力。
10.權(quán)利要求9的方法，其中質(zhì)譜檢測氘原子的存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述能檢測特征是放射性。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述能檢測特征是熒光。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述標(biāo)記可通過色譜法分離。
14.一種試劑盒，包括多類型不同的分裝有機(jī)化合物，每類化合物的特征在于具有可區(qū)分的組合物，能編碼至少一個(gè)二進(jìn)制的可以由物理計(jì)量測定的不同情報(bào)，并分享至少一個(gè)共同的官能團(tuán)。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，含有至少4類不同功能性有機(jī)化合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述功能性有機(jī)化合物有如下分子式F1-F2-C-E-C’其中F1-F2是能使其于固體顆粒上連接和解離的接頭；而C-E-C’是可以由物理計(jì)量測定的標(biāo)記。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述功能性有機(jī)化合物的區(qū)別在于亞甲基數(shù)和/或鹵，氮或硫的存在數(shù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒，其中C-E-C’部份可用光化學(xué)方法除去。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒，其中C-E-C’可以由氧化、水解、熱解、或還原方式除去。
20.一種固體載體，其特征在于有配位體結(jié)合其上，并有一組鑒定劑與該固體載體結(jié)合。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的固體載體，其中所述配位體是低聚物，其為寡肽；寡核苷酸；低聚糖；多脂；聚酯；聚酰胺；聚尿烷；聚脲；聚醚；聚(磷衍生物)，(所述磷衍生物為磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、亞磷酸酯或亞磷酰胺)；聚(硫衍生物)，(所述硫衍生物為砜、磺酸酯、亞硫酸酯、磺酰胺或亞磺酰胺)；其中對于磷和硫衍生物來說，絕大部份所示雜原子將鍵合于C、H、N、O或S，及其組合上。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的固體載體，其中所述配位體是非低聚物，即雜環(huán)、芳族、脂族、或脂環(huán)、及其組合。
23.權(quán)利要求22的固體載體，其中非低聚物是二氮雜雙環(huán)、氮雜三環(huán)或支鏈酰胺化合物。
24.權(quán)利要求20的固體載體，其中配位體通過非不穩(wěn)定鍵連接于載體上。
25.權(quán)利要求20的固體載體，其中配位體通過可裂解鍵連接于載體上。
26.根據(jù)權(quán)利要求20的固體載體，其中鑒定劑包括標(biāo)記，所述標(biāo)記是放射性同位素或含鹵代烷基或鹵代芳基烯丙基化合物。
27.權(quán)利要求20的固體載體，它是直徑10-2000μm的珠粒，其中鑒定劑含標(biāo)記成份，所述標(biāo)記成份從珠粒上裂解下來后，可由氣相色譜和/或液相色譜分離，并配合電子俘獲、質(zhì)譜、熒光、或原子發(fā)射光譜等技術(shù)進(jìn)行檢測。
28.含根據(jù)權(quán)利要求23的許多固體載體的文庫。
29.權(quán)利要求28的文庫，其中終產(chǎn)物從固體載體上解離下來。
30.權(quán)利要求29的文庫，其中終產(chǎn)物是二氮雜雙環(huán)、氮雜三環(huán)、或支鏈酰胺化合物。
31.鑒定具感興趣特征之化合物的方法，包括篩選權(quán)利要求28的文庫。
32.權(quán)利要求31的方法，其中化合物從固體表面解離下來。
33.權(quán)利要求32的方法，其中化合物是二氮雜雙環(huán)、氮雜三環(huán)、或支鏈酰胺化合物。
34.生產(chǎn)配位體的一種方法，包括一個(gè)反應(yīng)系列，采用一種方法記錄在許多專用固體載體的每一個(gè)上進(jìn)行的該反應(yīng)系列的反應(yīng)歷程，其中所述反應(yīng)系列包括要求不同化學(xué)劑和/或反應(yīng)條件，結(jié)果產(chǎn)生與許多所述專用固體載體相關(guān)的不同修飾的至少兩個(gè)階段，結(jié)果在不同專用固體載體上得到許多種不同的終產(chǎn)物，采用一組鑒定劑記錄所述反應(yīng)歷程，所述鑒定劑的特征在于能定義化學(xué)劑或反應(yīng)條件的選擇和定義所述系列的階段，并能分析有關(guān)選擇和階段，所述方法包括在所述系列的第一或中間階段，對所述專用固體載體的每一組，以不同化學(xué)劑或采用不同反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，所述組包括至少一個(gè)所述專用固體載體和一組鑒定劑，其中所述鑒定劑組定義有關(guān)所述專用固體載體每一組的化學(xué)劑選擇和所述系列中的階段，所述鑒定劑的每一種直接地，或者通過除前面的鑒定劑之外的物質(zhì)獨(dú)立地結(jié)合于所述專用載體上；將各組載體混合在一起，然后再將所述許多專用固體載體分成許多新的組，再進(jìn)行第二中間階段或最終階段；重復(fù)所述反應(yīng)至少一次，提供不同產(chǎn)物在不同個(gè)體專用固體表面的許多種配位體；并且借助所述鑒定劑組，鑒定至少一個(gè)挑選的專用固體表面的反應(yīng)歷程。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的配位體，其中所述鑒定包括針對感興趣之特征篩選所述配位體的步驟。
36.生產(chǎn)配位體的一種方法，包括一個(gè)反應(yīng)系列，采用一種方法記錄在許多專用固體表面的每一個(gè)上進(jìn)行的該反應(yīng)系列的歷程，其中所述反應(yīng)系列包括要求不同化學(xué)劑和/或反應(yīng)條件，結(jié)果產(chǎn)生與許多所述專用固體表面相關(guān)的不同修飾的至少兩個(gè)階段，結(jié)果在不同專用固體表面上得到許多不同的配位體，采用鑒定劑組記錄所述反應(yīng)歷程，所述鑒定劑組的特征在于能定義化學(xué)劑和/或反應(yīng)條件的選擇和該所述系列的階段，并能分析有關(guān)選擇和階段，所述方法包括在所述系列的第一或中間階段，對所述專用固體表面的每一組，以不同化學(xué)劑或采用不同條件進(jìn)行反應(yīng)，所述組包括至少一個(gè)所述專用固體表面和一組鑒定劑，其中所述鑒定劑組定義有關(guān)所述專用固體表面每一組的化學(xué)劑選擇和所述系列中的階段，所述鑒定劑的每一種，通過除前面的鑒定劑之外的物質(zhì)，采用可裂解連接方式獨(dú)立地結(jié)合于所述專用固體表面；將所述各組混合在一起，然后再分所述許多專用固體表面成新的許多組，再進(jìn)行第二中間階段或最終階段；重復(fù)所述反應(yīng)，提供不同配位體在不同個(gè)體專用固體表面的許多配位體；針對感興趣之特征，從許多所述專用固體表面的每一個(gè)上篩選配位體；并且通過從所述專用固體表面解離標(biāo)記成份、并借助其不同特征來鑒定所述標(biāo)記成份，從而鑒定具有感興趣之特征的配位體結(jié)合于其上的至少一個(gè)挑選出的專用固體表面上的反應(yīng)歷程。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述標(biāo)記的差別是同源系列中的差別，并用電子俘獲氣相色譜或質(zhì)譜來檢測。
38.式I的化合物F1-F2-C-E-C’I其中F1-F2是供鏈接載體并與之解離的接頭；C-E-C’是能進(jìn)行分析的標(biāo)記；E是供檢測的標(biāo)記成份，或按取代的不同而供檢測和使之分離的標(biāo)記成份；C和C’是供獨(dú)立檢測的標(biāo)記成份；F2是能選擇性裂解釋放標(biāo)記成份的連接成份；而F1是供化合物容易地連接于合成載體的官能團(tuán)。
39.權(quán)利要求38的化合物，其分子式如下F1-F2-(C(E-C’)a)b其中F1是CO2H，CH2X，NR1R1，C(O)R1，OH，CHN2，SH，C(O)CHN2，S(O2)Cl，S(O2)CHN2，N3，NO2，NO，S(O2)N3，OC(O)X，C(O)X，NCO，或NCS；F2是 -Si(R1)2A-，-Si(R1)2--N(R1)C(O)O-，-CR1＝CR1-(CR21)2-，-CR1＝CR1-C(R1)2-，-C(R1)2-CR1＝CR1-， -C(R1)2A-，-O-C(R1)2A-， -Si(CH3)2-(CR21)2-A-，-R3-(CR21)2A- -S-C(R1)A-， -S-C(R1)2A-，-C(X)R1-C(R1)2A-，-C(OH)R1-C(R1)2A-，-C(OH)R1-C(CH2X)R1-，-C(OH)R1-C(R1)2-C(X)R1-，-C(OH)(CH2CH2X)-， 其前提條件是若F2是一條鍵，則F1-是OH或COOH；A是-O-、-OC(O)O-、-OC(O)-，或-NHC(O)-；C是一條鍵；由1-40個(gè)F、Cl、Br、C1-C6烷氧基、NR4R4、OR4、或NR4任意取代(或未取代)的C1-C20亞烷基；或-[(C(R4)2)m-Y-Z-Y-(C(R4)2)nY-Z-Y]p-；其前提條件是C+C’中的碳原子數(shù)最多為20；C’是H；F；Cl；由1-40個(gè)F，Cl，Br，C1-C6烷氧基，NR4R4，OR4，或NR4取代(或未取代)的C1-C20亞烷基；或-[(C(R4)2)m-Y-Z-Y-(C(R4)2)nY-Z-Y]p-；其前提條件是C+C’中的碳原子數(shù)最多為20；E是由1-20個(gè)F，Cl或Br取代的C1-C20烷基；或Q-芳基，其中芳基由1-7個(gè)F、Cl、NO2、SO2R5、或取代苯基取代，而取代苯基上的取代基是1-5個(gè)F、Cl、NO2或SO2R5；E-C’可以是-H、-OH、或氨基；R1是H或C1-C6烷基；R3是C＝O、C(O)O、C(O)NR1、S、SO、或SO2；R4是H或C1-C6烷基；R5是C1-C6烷基；a是1-5；b是1-3；m和n各自獨(dú)立地是0-20；P是1-7；Q是一條鍵、O、S、NR4、C＝O、-C(O)NR5、-NR5C(O)-、-C(O)O-，或-OC(O)-；X是離去基團(tuán)，例如Br、Cl、三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、或OC(O)OR5；Y是一條鍵、O、S、或NR4；Z是一條鍵、由1-4個(gè)F、Cl、Br、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、由1-13個(gè)F、Cl取代的C1-C6烷基，或由1-13個(gè)F、Cl或Br取代的C1-C6烷氧基任意取代的苯基；(C(R4)2)1-20或(CF2)1-20；其前提條件是若Z是一條鍵，其相鄰的各Y之一也是一條鍵；而芳基是含有至多10個(gè)碳原子、至多2個(gè)選自O(shè)、S和N的雜原子的單或雙芳香環(huán)。
40.權(quán)利要求39的化合物其中F1是CO2H，OH，CHN2，C(O)CHN2，C(O)X.NCS.或CH2XF2是 C和C’各自獨(dú)立地是由1-40個(gè)F或Cl取代或未取代的C1-C20亞烷基；或[O-(CH2)2-3]p；E是由1-20個(gè)F或Cl取代的C1-C10烷基；Q-芳基，其中芳基是由1-7個(gè)F或Cl取代的雙芳環(huán)；或是由1-5個(gè)F、Cl、NO2或SO2R5取代的Q-苯基；而Q是一條鍵、O、-NR5C(O)，或-OC(O)-。
41.權(quán)利要求39的化合物，分子式如下 其中A是五氟、五氯或五溴苯基，2，3，5，6-四氟-4(2，3，4，5，6-五氟苯基)苯基、2，4，6-三氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，6-二氯-4-氟苯基、或2，3，5，6-四氟苯基。
42.權(quán)利要求39的化合物，其中E-C’是H、OH、或NH2。
43.下式的組合物S-F1’-F2-C-E-C’其中S是可溶性或固體載體；C-E-C’是能分析的標(biāo)記，其中E是標(biāo)記成份，即是(a)允許被檢測，可由氣相色譜或質(zhì)譜分析的帶電基團(tuán)之類，或(b)作為各種取代產(chǎn)物而允許檢測和分離；C和C’是使得一個(gè)標(biāo)記能與其它標(biāo)記區(qū)分的標(biāo)記成份，通常因?yàn)槿〈蚱溟L度不同而得以分離，例如改變了色譜保留時(shí)間，或質(zhì)譜z/e比例；F2是能選擇性裂解釋放標(biāo)記的連接成份；和F1是供給與載體連接的功能團(tuán)。
44.權(quán)利要求43的組合物，其中S是毛細(xì)管、中空纖維、針狀物、固體纖維、纖維素珠、有孔玻璃珠、硅膠、任意由二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯珠、接枝共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳膠珠、任意由N，N’-二丙烯酰乙二胺交聯(lián)的二甲基丙烯酰胺珠、涂覆有疏水聚合物的玻璃顆粒、或低分子量非交聯(lián)聚苯乙烯；而F1’-F2-C-E-C’是連接于S上的式I殘基。
45.權(quán)利要求1的方法，其中鑒定劑組定義二進(jìn)制碼方案。
46.權(quán)利要求1的方法，其中鑒定劑是權(quán)利要求38的化合物。
47.權(quán)利要求1的方法，其中鑒定劑是權(quán)利要求39的化合物。
48.權(quán)利要求1的方法，其中鑒定劑是權(quán)利要求40的化合物。
49.權(quán)利要求1的方法，其中鑒定劑是權(quán)利要求42的化合物。
50.權(quán)利要求1的方法，還包括從所述專用固體表面解離標(biāo)記成分。
51.權(quán)利要求50的方法，其中標(biāo)記成份可以通過光化學(xué)法、氧化法、水解法、熱解法或還原法解離。
52.權(quán)利要求1的方法，還包括從所述專用固體表面光化學(xué)解離非低聚配位體。
53.下式的化合物 其中P是聚苯乙烯樹脂IXa-f很多下式的殘基 其中n是1-6；R是CH3、CH(CH3)2、CH2CO2H、(CH2)4NH2、CH2-C6H4-OH或CH2C6H5；而R1是H、CH3、C2H5、CH2CH＝CH2或CH2C6H5。
54.合成化學(xué)化合物的方法，以使化合物的結(jié)構(gòu)容易測定，該方法包括在固體載體表面合成化合物，其合成條件是化合物合成的整個(gè)過程固體載體均與許多種鑒定劑結(jié)合，所述鑒定劑編碼與化合物合成相隨的反應(yīng)各階段。
55.合成化學(xué)化合物文庫的方法，該方法要使文庫中的各化合物結(jié)構(gòu)容易測定，所述方法包括在專用固體載體表面合成各化合物，其合成條件是化合物文庫合成的整個(gè)過程此種各專用載體均與許多種鑒定劑結(jié)合，所述鑒定劑編碼與該固體載體上化合物合成相隨的反應(yīng)各階段。
56.測定化學(xué)化合物結(jié)構(gòu)的方法，包括由權(quán)利要求54或55的方法合成化合物，分離其上化合物被合成的固體載體，處理分離出的固體載體，使得結(jié)合于固體載體上的各鑒定劑的標(biāo)記成份釋放出，定性或定量，或既定性又定量地測定釋放的各標(biāo)記成份，從所有這些標(biāo)記成份的定性或定量，或者二者同時(shí)進(jìn)行的結(jié)果，推出該化合物的結(jié)構(gòu)。
57.鑒定有所希望之特性的化合物的方法，包括用權(quán)利要求55的方法合成化學(xué)化合物文庫，用能鑒定化合物有所希望之特性的測試手段，分別試驗(yàn)所得文庫中各化合物，以便鑒定出存在于文庫中的，有所希望之特性的任何化合物。
58.權(quán)利要求57的方法，還包括測定所鑒定的化合物結(jié)構(gòu)。
59.一種化學(xué)化合物文庫，文庫中每種化合物均與專用固體載體結(jié)合，并且每個(gè)此種固體載體結(jié)合于許多種鑒定劑上，該鑒定劑編碼與結(jié)合于該固體載體的化合物之合成相隨的反應(yīng)階段。
60.權(quán)利要求59的文庫，其中該文庫中的化合物是二氮雜雙環(huán)化合物。
61.權(quán)利要求59的文庫，其中該文庫中的化合物是氮雜三環(huán)化合物。
62.權(quán)利要求59的文庫，其中該文庫中的化合物是支鏈酰胺化合物。
63.權(quán)利要求59的文庫，其中該文庫中的化合物是肽。
64.鑒定有所希望特征之化合物的方法，包括用能鑒定化合物具所希望之特性的測試手段，試驗(yàn)權(quán)利要求58的化學(xué)化合物文庫，以便鑒定出存在于該文庫中的，具所希望之特征的任何化合物。
65.權(quán)利要求64的方法，還包括測定所鑒定的化合物結(jié)構(gòu)。
66.由權(quán)利要求64方法鑒定出的化合物。
67.權(quán)利要求64的方法，其中，所希望之特性是人神經(jīng)激肽I/牛血清激肽I型受體的拮抗作用，而該化學(xué)化合物文庫包含氮雜三環(huán)化合物。
68.權(quán)利要求64的方法，其中，所希望之特性在于可用作肌肉松馳劑、安神藥或安眠藥，而該化學(xué)化合物文庫包括苯并二氮雜。
69.權(quán)利要求64的方法，其中，所希望之特性在于可用于治療高血壓或Raynaud氏綜合癥，而該化學(xué)化合物文庫包括支鏈酰胺。
70.含有至少6種不同成份的組合物，所述成份共存于一個(gè)試劑盒或一種共同介質(zhì)中，每種成份有可區(qū)分部份，所述成份特征在于每種可區(qū)分部份是基本上化學(xué)惰性的，不同之處于在分子量、以及與其它各可區(qū)分部份存在除光發(fā)射之外的可鑒定區(qū)別特征；各部份結(jié)合于帶能形成共價(jià)鍵的活性官能團(tuán)的連結(jié)基團(tuán)上，通過連接單元連接到個(gè)體可分離的固體表面，或連接于在小于1毫微摩爾之量即能檢測的基團(tuán)上；其前提條件是，當(dāng)所述部份連接于所述連接基團(tuán)時(shí)，所述成份是物理分離狀態(tài)的。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的組合物，其中所述固體載體是珠粒。
72.根據(jù)權(quán)利要求70的組合物，其中每種成份包含結(jié)合于個(gè)體分離固體表面的不同化合物之分子，其中所述可區(qū)分部份編碼用于在所述固體表面合成所述分子的合成方案。
73.根據(jù)權(quán)利要求70的組合物，其中所述可區(qū)分部份定義同源系列和/或核心分子上的取代基系列。
74.包含至少6種不同標(biāo)志的組合物，所述標(biāo)志共存于一個(gè)試劑盒或一種共同介質(zhì)中，各標(biāo)志有基本上化學(xué)惰性的可區(qū)分部份，相互間之差別在于分子量，所述標(biāo)志分子式如下(1)Λ-{Δ-(T)α或(T)α-Δ或Δ1-(T)α-Δ2}其中Λ是一個(gè)帶有鍵合于固體載體上的官能團(tuán)，并帶有從固體載體上解離之官能團(tuán)的連接基團(tuán)，其中后一官能團(tuán)可包括于前者(即鍵合于固體載體之官能團(tuán))之中；Δ是可區(qū)別基團(tuán)，該基團(tuán)可使各標(biāo)志通過物理特征與所有其它標(biāo)志區(qū)別開(除熒光之外)以提供可編碼多步驟合成程序的一整套標(biāo)志，并且Δ還包括原與連接基團(tuán)結(jié)合在一起、解離之后仍然保留的任何官能團(tuán)；Δ1和Δ2是可區(qū)別基團(tuán)部份，二者結(jié)合在一起定義一個(gè)可區(qū)別基團(tuán)，當(dāng)其結(jié)合在一起時(shí)則有Δ的定義；T是可檢測基團(tuán)，當(dāng)其與可區(qū)別基團(tuán)連接時(shí)，可使標(biāo)志于低水平檢測，所述可檢測基團(tuán)可以是在試劑盒中即存在于標(biāo)志上的，或者也可以其后再加入可區(qū)別基團(tuán)中，假如與連接基團(tuán)連接，則該T也包括原與連接基團(tuán)結(jié)合，解離之后仍然保留的任何官能團(tuán)；而α是0或1，表示所述可檢測基團(tuán)可以存在，亦可不存在；(2)ss-(Λ’-{Δ’-(T)α或(T)α-Δ或Δ1-(T)α-Δ2})β其中除了ss是固體載體；Δ’是共價(jià)鍵合于ss的連接基團(tuán)；而β是與各固體載體有關(guān)的整數(shù)(至少為6，但通常不超過約30)外，其余符號定義同上；(3)Λ″-{Δ″-(T)α或(T″)α-Δ或Δ’1-(T)α-Δ2}其中除了Δ″是氫，或是使其從固體載體上解離的光裂解反應(yīng)，消除反應(yīng)，或其它化學(xué)反應(yīng)之后，所剩連接基團(tuán)的殘基；Δ″或Δ’1分別是作為標(biāo)志從固體載體上解離下的Δ或Δ1，或經(jīng)修飾的Δ或Δ1；T″是作為標(biāo)志從固體載體上解離下來的T或修飾的T以外；其余所有符號定義均同上；(4)Tα-Λ’″-{Δ″-(T)α或(T″)α-Δ或Δ’1-(T)α-Δ2}其中除了Λ’″是一條鍵，或連接到T后連接基團(tuán)的保留部份，及附加限制是只有一個(gè)α是1外，其余所有符號定義同上。
75.權(quán)利要求74的組合物，其中標(biāo)志是式(1)化合物。
76.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中標(biāo)志是式(2)化合物。
77.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中標(biāo)志是式(3)化合物。
78.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中標(biāo)志是式(4)化合物。
79.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中Δ鍵合于Λ上。
80.包括至少100個(gè)專用固體載體的化合物文庫，其特征在于對各固體載體而言，(1)當(dāng)大部份化合物與所述載體結(jié)合時(shí)，便有個(gè)體化合物結(jié)合于所述固體載體上；(2)有許多非定序標(biāo)志，其中所述標(biāo)志是單個(gè)分子，該單個(gè)分子處于物理可分離狀態(tài)下物理可區(qū)分，其差別在于分子量不同，可由除熒光以外的方法區(qū)分，并被取代，以便在不足約毫微摩爾級之量便可檢測，或者帶有與不足約毫微摩爾級之量便可檢測的取代基結(jié)合的官能團(tuán)。
81.根據(jù)權(quán)利要求80的化合物文庫，其中各固體載體有至少約6個(gè)標(biāo)志。
82.根據(jù)權(quán)利要求80的化合物文庫，其中所述標(biāo)志定義編碼所述固體載體上合成所述化合物所用合成方案的二進(jìn)制或高階碼。
83.權(quán)利要求38的化合物，其中F1是CHN2、C(O)CHN2、S(O2)CHN2、N3、NO2或SO2N3。
84.權(quán)利要求38的化合物，其中F1是COOH、CHN2、C(O)CHN2、S(O2)CHN2、COCl、OH、SH、CH2X或NHR1；F2是 其中A是-O-或-OC(O)O-；C(E-C′)a是-(CR42)1-15-(O)0-1-Ar，-(CR42)0-15-(CF2)1-15-F，-(CR42)0-15-(CF2)1-15-(CR42)0-15-H，或-(CH2)1-20-((O)0-1-(CH2)1-19)0-24-(CH2)0-24-(O)0-1-Ar，其中Ar是五氟-、五氯-或五溴苯基、2，3，5，6-四氟-4(2，3，4，5，6-五氟苯基)苯基，2，4，6-三氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，6-二氯-4-氟苯基或2，3，5，6-四氟苯基。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼組合化學(xué)，其中使用有機(jī)分子記錄按順序合成的反應(yīng)路線，所述有機(jī)分子定義反應(yīng)劑的選擇和階段，以相同或不同的二進(jìn)制碼情報(bào)表示。各種產(chǎn)物可以用多階段合成產(chǎn)生，例如低聚物和合成非重復(fù)有機(jī)分子。采用成套的化合物族作為鑒定劑很適宜，其中取代基的數(shù)量和/或位置可以定義選擇。此外可采用能檢測之官能團(tuán)，例如放射性同位素、熒光物質(zhì)、鹵素等，其中兩種不同基團(tuán)的存在和比例可用于定義階段或選擇。尤其是許多鑒定劑可用于提供二進(jìn)碼或高階碼，以便僅用很少幾種可檢測標(biāo)記便可定義許多選擇?？舍槍Ω信d趣之特征對顆粒進(jìn)行篩選，特別是結(jié)合親合性，其中產(chǎn)物可以從顆粒上解離下來或仍保留于其上。具有有用特性的顆粒之反應(yīng)歷程，可以通過釋放標(biāo)記，并進(jìn)行針對定義顆粒反應(yīng)歷程的分析來測定。
文檔編號C07H21/00GK1151793SQ95193518
公開日1997年6月11日 申請日期1995年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月13日
發(fā)明者W·C·施蒂, M·H·韋格勒, M·H·J·奧邁耶, L·W·迪拉德, J·C·里德 申請人:紐約市哥倫比亞大學(xué)信托人, 冷泉港實(shí)驗(yàn)室