專利名稱：：肽及蛋白質(zhì)的修飾的制作方法產(chǎn)業(yè)上的利用領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)的修飾方法及其修飾物質(zhì)。
背景技術(shù)：
：已知有大量的生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)，以下將這些進行歸納，也可統(tǒng)稱為生物活性肽。這些生物活性肽，可以舉出如白細胞介素(IL)-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、促紅細胞生長素(Erythropoietin)、干細胞生長因子(干細胞因子、Stemcellfactor)、mpl-配體(mpl-ligand)、α-、β-、γ-干擾素、促生長素抑制素、加壓素(Vasopressin)、胰島素(Iinsulin)、生長激素(Growthhormone)、物質(zhì)P(SubstanceP)、ADF(ATLderivedfactor、人硫氧還蛋白)等、人體中起生理作用的肽及變型的這些的肽、來自蠶素類動物的物質(zhì)、來自天冬酰氨酶(Asparaginase)類微生物的物質(zhì)、來自細胞溶素類植物的物質(zhì)，另外抗體中也包括在這些的生物活性肽中。作為這些抗體不僅是人的單克隆抗體，也包括動物的單克隆抗體。這些中的某些物質(zhì)已經(jīng)被利用于醫(yī)藥和診斷中，另外還有一些物質(zhì)正在研究利用于醫(yī)藥或診斷藥中。例如，IL-2用于抗癌劑，促紅細胞生長素、G-CSF作為造血劑使用，胰島素和生長激素臨床應(yīng)用于先天的、后天的這些缺損或不足的患者治療。進而，IL-6作為血小板增強劑正在臨床應(yīng)用開發(fā)中。這些生物活性肽作為醫(yī)藥是很重要的，但是為了進而對生物活性肽賦予新的機能，或者彌補生物活性肽作為醫(yī)藥上缺點的目的，目前正在研究用高分子物質(zhì)等修飾生物活性肽。例如，作為先天性免疫疾病的腺苷脫氨酶缺損癥，是由于正常的腺苷脫氨酶缺損(ADA)而引起的，為了延長ADA在體內(nèi)的的停留時間，將用聚乙二醇(PEG)修飾過的ADA作為醫(yī)藥使用。另一方面，大多的生物活性肽必需特異地結(jié)合在對應(yīng)的受體或配位體上才能發(fā)揮其生理功能，所以利用這種的特異結(jié)合，考慮將特定的生物活性肽作為靶分子使用。例如，在IL-6分子上，結(jié)合白喉毒素，將該毒素特異地送入具有IL-6受體的癌細胞內(nèi)，試驗著殺死癌細胞。正在開發(fā)著在識別癌特異的抗原的單克隆抗體中結(jié)合制癌劑，將制癌劑特異地送入癌細胞內(nèi)產(chǎn)生同樣效果的方法。進而，在藥物傳送系統(tǒng)(DDS)中，利用生物活性肽的試驗方法在基因治療領(lǐng)域也很重要。特別是供給到基因的生物體內(nèi)(invivo)的基因治療具有很大的期待，GeorgeY.Wu等用化學(xué)的方法，開發(fā)了在血清類粘蛋白(orsomucoid)等的生物活性肽結(jié)合聚賴氨酸(具有正電荷)，用此復(fù)合體包含DNA質(zhì)粒(負電荷)以將DNA運送到具有血清類粘蛋白抗體的肝細胞中的基因治療法(J.Biol.Chem.，263，14621，1988)。這些生物活性肽在臨床上存在著以下的問題。1.副作用本來認為將這些在生物體內(nèi)起著生理作用的、生物活性肽投入人體后是沒有什么副作用的，可是在臨床上使用時，幾乎大多的生物活性肽都顯示了一些副作用。這是由于這些生物活性肽本來是在局部產(chǎn)生、放出、并在局部作用的，當(dāng)時大部分都被分解掉，與其相反，而在臨床上給予的生物活性肽可以在短時間內(nèi)以很高的血中濃度分布到全身，所以，一般會產(chǎn)生非生理的反應(yīng)和臨床上不希望的反應(yīng)。2.很快的代謝速度對于大多的生物活性肽，是不適宜在生物體內(nèi)長時間存在的，在血中被分解，或被一些器官捕集后而分解，所以以很快的速度從血中消失。這樣生物活性肽的藥效就難以發(fā)揮。3.抗原性人體內(nèi)的生物活性肽抗原性低，但對于重組體制作的生物活性肽，在臨床上是使用沒有糖鏈物質(zhì)和帶有與天然不同糖鏈物質(zhì)。根據(jù)情況，這些具有抗原性，但在長時間或多次給藥時，會形成抗體，中和給予的生物活性肽，產(chǎn)生藥效消失，最壞時會在人體內(nèi)引起過敏性反應(yīng)。為了解決這些生物活性肽所存在的上述問題，采取了以下的方法。1.將對于臟器或組織，具有特異親和性的分子，例如對骨髓細胞中大多分布的c-kit分子特異結(jié)合的干細胞生長因子(干細胞因子(SCF))與IL-6分子結(jié)合的分子，IL-6/SCF在骨髓中濃縮，IL-6的作用是促進巨核細胞向血小板的分化，可以增加血小板。IL-6是作用在視床下部，通過視神經(jīng)引起發(fā)熱，但是由于將IL-6向骨髓的濃縮，所以可減少發(fā)熱副作用。同樣，為了使IL-2作用在腫瘤特異的細胞毒素T細胞(CytotoxicTCell(CTL))，可以考慮在IL-2分子上結(jié)合腫瘤抗原分子、腫瘤自體或腫瘤細胞破碎組分的形式給藥。識別腫瘤抗原的CTL結(jié)合在該腫瘤抗原上，進而，結(jié)合在上面的IL-2有效地被活化，可以攻擊腫瘤細胞。用于病毒性肝炎的干擾素(α-、β-、γ-干擾素)與對asialoglycoprotein等的肝asialoglycoprotein受體的配位體結(jié)合，以肝臟為靶，期待著可以減輕IFN的副作用。另外，作用在造血系的前體細胞，將其分化增殖或者作用在造血系癌后，增強免疫性或抗癌劑作用的目的而使用的TNF、G-CSF、GM-CSF、IL-11、SCF、mpl-ligand、LIF、IL-3等，由于使用分別和其對應(yīng)的作用細胞或相鄰支持細胞上具有結(jié)合能的分子(靶分子)的結(jié)合體，所以期待可以減少各個的副作用。對于用在造血系以外的癌治療的TNF、IFN也有同樣的效果。2.給予的IL-6迅速地從血液中消失，但是若將IL-6與人體血清白蛋白(humanserumalbumin(HSA))、聚賴氨酸、PEG類的生物體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelialsystem，RES)難以捕集的高分子物質(zhì)結(jié)合時，可以延長IL-6在血液中的半衰期。另外，ADF(ATLderivedfactor、人硫氧還蛋白；Mitsui.etal.，(1992)Biophys.Biochem.Res.Com.186(3)，1220-1226.)或SOD(superoxidedismutase)是還原初生態(tài)氧的生物體內(nèi)分子，作為抗炎劑正在臨床試用，但是如果長時間地維持ADF或SOD中的血中濃度時，可以期待更高的抗炎效果。與IL-6相同地通過在ADF或SOD上結(jié)合HSA和PEG可以增加ADF或SOD的抗炎效果。對于IL-2、IFN、G-CSF、GM-CSF、IL-11、SCF、mpl-ligand、LIF、IL-3、TNF等同樣地可以期待提高效果。3.已知由于先天地缺損某些酶而引起的基因病有很多種。例如，缺損嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)時，會引起神經(jīng)障礙，導(dǎo)致死亡，但是若將牛的PNP結(jié)合在聚乙二醇(Polyethyleneglicol(PEG))上的物質(zhì)進行給藥時，可以在一定的程度上進行補救。結(jié)合了PEG，可以降低牛的抗原性，并能應(yīng)用在臨床上。這可以解釋為構(gòu)成PNP的抗原部位用PEG屏蔽的結(jié)果。將HSA結(jié)合在PNP上同樣可以期待減少抗原性。對于用在抗血栓癥的蛇毒肽等，通過結(jié)合HSA和PEG也可以得到同樣的減少抗原性效果。這樣，無論在彌補生物活性肽缺點的修飾的場合，或是將生物活性肽作為標(biāo)的分子使用場合，將生物活性肽和其它的生物活性肽、糖鏈、PEG等在不失去相互功能地結(jié)合、修飾是很重要的。一般，用于進行這樣修飾的結(jié)合是采用化學(xué)的方法?；瘜W(xué)反應(yīng)時，控制生成的化學(xué)結(jié)合位置和結(jié)合數(shù)是困難的，要想在保持結(jié)合對象兩者活性條件下得到結(jié)合體是困難的。另外，生產(chǎn)具有一定結(jié)構(gòu)的結(jié)合物的藥品是極其重要的，但是難以控制。特別是高分子間的結(jié)合時，同時會生成多個形式的結(jié)合物，精制單一物是極其困難的。發(fā)明的公開本發(fā)明涉及生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)的修飾方法，其特征在于將至少具有谷氨酰胺殘基的生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)和具有氨基供體的物質(zhì)，在來自微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在下進行反應(yīng)，在該谷氨酰胺殘基的γ-位酰胺上形成該氨基供體的氨基和酰胺鍵。另外，本發(fā)明涉及用生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)的修飾方法，制造出的肽或蛋白質(zhì)的修飾體，其特征在于將至少具有谷氨酰胺殘基的生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)和氨基供體的物質(zhì)，在來自微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在下進行反應(yīng)，在該谷氨酰胺殘基的γ-位酰胺上形成該氨基供體的氨基和酰胺鍵。本發(fā)明人等為了解決上述問題，不斷地進行了研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)了將具有生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)和氨基供體(氨基)的物質(zhì)通過使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，在緩和的條件下可以選擇地進行結(jié)合的事實。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13)(系統(tǒng)名protein-glutaminer-glutamyltransferase)是可以使肽或蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺殘基和具有氨基物質(zhì)的氨基進行特異結(jié)合的公知酶。關(guān)于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，已有各種文獻報道過，作為一部分例子舉例如下。(1)J.E.Folketal.Adv.ProteinChem.31，1-133，1977(2)J.E.Folketal.Adv.Enzymol，38，109-191，1973(3)H.Bohnetal，Mol.CellBiochem.20，67-75，1978(4)L.Lorandetal，HandbookofBiochemistryandMolecularBiology，vol.2，Proteins，edG.D.Fasman，PP.669-685，ClevelandCRC，3rded.(5)GuineapigandrabbitlivertransglutaminaseT.Abeetal，Biochemistry，16，5495-5501(1977)(6)humanredbloodcellstranglutaminaseS.C.Brenneretal，Biochim，Biophys，Acta，522，74-83，1978(7)RatcoagulatingglandtransglutaminaseJ.WilsonetalFed.Proc.，38，1809(Abstr.)，(1979)另外，已經(jīng)知道轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶根據(jù)其來源有各種各樣，例如來自微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(BacterialTransglutaminase、以下稱為BTG。在H.Andoet，al，Agric.Biol.Chem.，53(10)，2613-2617(1989)，K，Wshizuetal，Biosci.Biotech.Biochem.，58(1).82-87(1994)等中有報道。)、肝轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Livertransglutaminase)、血漿因子XIII(aplasmafactorXIIIa)、血小板-胎盤因子XIIIa(PlateletandplacentalfactorXIIIa)、毛發(fā)濾胞轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Hair-follicletransglutaminase)、上皮轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Epidemaltransglutaminase)、前列腺轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Prostatetransglutaminase)等來自動物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Mammalliantransglutaminase)等。作為本發(fā)明使用的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，可以使用上述的一種，但是優(yōu)選的是使用BTG。用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶結(jié)合時由于可使反應(yīng)限制在特定的位置，所以副生物的種類少，也易于控制。另外由于是酶反應(yīng)，相對于化學(xué)反應(yīng)具有下列的優(yōu)點。1)不失掉結(jié)合對象的功能下，在特定位置作成結(jié)合物的可能性高。2)由于結(jié)合反應(yīng)條件是生化的條件，所以不會使結(jié)合對象物改性。3)由于保持了穩(wěn)定的質(zhì)量，所以可以制造高質(zhì)量的藥品。另外，使蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合的方法有使各基因結(jié)合的重組DNA的技術(shù)。相對于重組DNA方法，使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法有以下的優(yōu)點。1)與重組DNA方法比較，對從DNA不能直接合成的物質(zhì)，例如糖鏈、糖蛋白、糖脂質(zhì)、PEG等也可以結(jié)合。2)在重組DNA方法中，只能制作在一方蛋白質(zhì)的N末端或C末端結(jié)合另一方蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。3)在重組DNA方法中，只能得到在N末端或C末端結(jié)合另一方蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，所以活性中心若存在于蛋白質(zhì)的末端時，此融合蛋白質(zhì)失去活性的可能性大。另一方面，使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶時，是限定在谷氨酰胺的酰胺基，可以結(jié)合具有氨基的物質(zhì)，能得到與重組DNA方法不同的結(jié)合體。通過BTG的結(jié)合控制，可以得到保持兩者活性的結(jié)合體。本發(fā)明的生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)和具有氨基供體物質(zhì)的結(jié)合，在使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的反應(yīng)條件下進行反應(yīng)。例如，使用BTG時，可以在溫度4-55℃，優(yōu)選的是30-50℃，pH5-8，優(yōu)選的是pH6-7.5條件下進行反應(yīng)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的測定方法本發(fā)明所說的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性單位用以下的方法測定。即在溫度37℃、pH6.0的TRIS緩沖液中，使用來自動物的酶時在5mM的Ca2+存在下，來自微生物時，沒有Ca2+存在的條件下，以芐氧羰基-L-谷氨酰胺甘氨酸及羥基胺為基質(zhì)的反應(yīng)系中，使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用，生成的羥肟酸在三氯醋酸存在下形成鐵絡(luò)合物后，測定525nm的吸光度，用檢量線求出羥肟酸量，在1分鐘內(nèi)生成1μ摩爾的羥肟酸的酶作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性單位，1單位(IU)。作為修飾本發(fā)明的生物活性肽的氨基供體的物質(zhì)，只要在分子中有氨基即可，其它沒有特殊的限制，但是優(yōu)選的是使用具有氨基的肽和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)有上述的生物活性肽或蛋白質(zhì)、抗體、特別是單克隆抗體、抗原、多氨基酸、聚乙二醇的烷基胺衍生物、特別優(yōu)選的是聚賴氨酸或聚乙二醇的烷基胺衍生物。這些的分子量是3000-200000，優(yōu)選的是3000-100000。進而還可以舉出分子量為5000-200000，優(yōu)選的是10000-100000的。另外，作為本發(fā)明的生物活性肽，只要在氨基酸序列中含有谷氨酰胺即可，其它沒有特殊的限制，優(yōu)選的是上述的生物活性肽或蛋白質(zhì)，更優(yōu)選的是白細胞介素-2、白細胞介素-6、干擾素、ADF(ATLderivedfacta，人硫氧還蛋白)等。用本發(fā)明的方法得到的生物活性肽或蛋白質(zhì)的修飾體例如下。1)IL-2作用在擔(dān)負免疫細胞上后，增強免疫力，具有可殺滅癌細胞的可能性，但是投入到全身時，副作用很強，所以使其集聚到作用部位即T細胞和NK/LAK細胞或者癌細胞周圍是重要的。IL-2/抗CD8抗體〔向CD8陽性T細胞集聚〕IL-2/抗CD4抗體〔向CD4陽性T細胞集聚〕IL-2/抗NK/LAK細胞抗體〔向NK/LAK細胞集聚〕IL-2/對于肝細胞特異抗原的抗體)(例如，抗硫酸脂抗體、抗白蛋白受體抗體)〔向肝贓集聚后，增加肝臟周圍的免疫力〕IL-2/聚合HSA〔聚合HSA結(jié)合在肝臟的白蛋白的受體抗體上，集聚在肝癌上〕IL-2/抗ErbB2抗體或ErbB2配位體〔向具有ErbB2的癌集聚〕IL-2/對大腸特異的癌抗原的抗體〔向大腸癌集聚〕IL-2/對黑素瘤特異的抗原的抗體〔向黑素瘤集聚〕IL-2/聚賴氨酸〔延長血中半衰期〕IL-2/PEG(聚乙二醇)〔延長血中半衰期〕IL-2/HSA(humanserumalbumin)〔延長血中半衰期〕IL-2二聚物〔延長血中半衰期〕IL-2/蘑菇多糖〔增加相乘的抗癌作用〕IL-2/IL-9〔相乘的T細胞活性化〕IL-2/IL-12〔相乘的T細胞活性化〕IL-2/毒素(例如，破傷風(fēng)毒素(tetanustoxin)、假單胞菌毒素(pscudomonastoxin))〔除去具有IL-2受體的癌細胞〕2)IL-6作用在血小板的前體細胞后，具有增加血小板數(shù)的作用，但是作用在肝臟上后，放出急性期蛋白質(zhì)，或作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起發(fā)熱，所以作為血小板增加劑使用時，使其向骨髓集聚是非常重要的。IL-6在血中的濃度達到某種程度以上時，會產(chǎn)生副作用，但是若延長血中的半衰期，可以暫時地避免高濃度的給藥，所以延長血中的半衰期給予緩釋效果，可以產(chǎn)生減輕副作用的效果。IL-6/對骨髓細胞或骨髓細胞的支持細胞(基質(zhì)細胞等)的抗體〔向骨髓細胞集聚〕IL-6/對在骨髓細胞大多能表達的受體的配位體(例如，SCF、IL-11、mpl-配位體、G-CSF、GM-CSF或IL-3〔向骨髓細胞集聚及IL-6和SCF或mpl-配位體的血小板的增加作用或?qū)υ煅杉毎黾幼饔玫南喑俗饔?IL-6/對骨髓細胞特異細胞外基質(zhì)的配位體或具有特異親和力的分子〔向骨髓細胞集聚〕IL-6/聚賴氨酸〔延長血中半衰期〕IL-6/PEG〔延長血中半衰期〕IL-6/HSA〔延長血中半衰期〕IL-6二聚物〔延長血中半衰期〕IL-2/毒素(例如，破傷風(fēng)毒素(tetanustoxin)、假單胞菌毒素(pscudomonastoxin))〔除去具有IL-6受體的癌細胞，例如骨髓瘤〕3)進而，IL-6涉及慢性風(fēng)濕病、卡斯?fàn)柌〉鹊淖陨砻庖呒膊?，由于IL-6和IL-6受體異常表達引起白細胞癌細胞的異常增殖、某種的癌細胞的惡液質(zhì)原因、細菌感染時誘發(fā)的休克等，根據(jù)情況成為疾病的原因或增惡因子。因此通過抗IL-6抗體或抗IL-6受體的抗體消除IL-6作用物質(zhì)成為上述疾病的治療藥?？紤]將抗IL-6抗體用于治療慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病時，抗IL-6抗體是小鼠單克隆抗體，可以直接使用，或者使用其可變部(variableregion)與人的抗體恒定部(constantregion)融合的嵌合體抗體和L鏈可變部(lightchainvariableregion)和H鏈可變部(heavychainvariableregion)的融合蛋白構(gòu)成的1根鏈抗體等，將其投入關(guān)節(jié)腔?？傊?，對于人作成了對此抗體的抗體，這樣就存在消除抗IL-6抗體作用的危險。另外一根鏈抗體形式的人工抗體有可能縮短血中或關(guān)節(jié)腔中的半衰期。因此，降低抗IL-6抗體的抗原性和延長血中或關(guān)節(jié)腔中的半衰期等是有效的。具有一個特異性的抗體和另一個具有特異性的抗體結(jié)合而成的二官能性抗體(BFABifunctionalantibody)可能具有新的醫(yī)藥功能，例如，在抗IL-6抗體上結(jié)合抗IL-1抗體的BFA可以同時抑制作為慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的增惡因子的IL-1和IL-6，發(fā)揮了相乘的效果。以下舉出這些例子。抗IL-6抗體/HSA〔延長血中或關(guān)節(jié)腔中半衰期、減少抗原性〕抗IL-6抗體/聚賴氨酸〔延長血中或關(guān)節(jié)腔中半衰期、減少抗原性〕抗IL-6抗體/膠原〔延長血中或關(guān)節(jié)腔中半衰期、減少抗原性〕抗IL-6抗體/抗IL-1抗體〔增強慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的效果〕4)聚賴氨酸是帶有正電荷的聚合物，在水溶液中包復(fù)具有負電荷的DNA分子，對其進行保護，在聚賴氨酸上結(jié)合靶分子。通過結(jié)合物和DNA分子混合形成用靶分子包復(fù)DNA的復(fù)合體。此復(fù)合體通過投入到活體內(nèi)將基因?qū)氲脚c靶分子對應(yīng)的組織內(nèi)，可以表達蛋白質(zhì)。包復(fù)DNA的分子不一定限定在聚賴氨酸，只要是具有與DNA有一些親和性的物質(zhì)，對活體無害，并且在循環(huán)器官系統(tǒng)的部位難以捕集的物質(zhì)都可以。5)INF-α-、β-、γ具有抗病毒的作用，可用于治療病毒性肝炎?？墒?，由于大量的、長期的給藥使副作用加劇，因此，通過對作用部位，即將肝臟作成靶，來減少IFN的副作用。此時，通過對存在于肝臟實質(zhì)細胞表面的asialoglico蛋白質(zhì)配位體的結(jié)合，可以發(fā)揮向肝臟的靶作用。另一方面，在血中，由于可以暫時抑制高濃度，所以能延長血中的半衰期，給予緩釋效果時，能減少副作用。INF/asia血清類粘蛋白〔向肝臟集聚〕INF/ァシァロフェッィン〔向肝臟集聚〕INF/半乳糖修飾白蛋白〔向肝臟集聚〕INF/半乳糖修飾聚賴氨酸〔向肝臟集聚〕INF/支鏈型半乳糖修飾合成配位體〔向肝臟集聚〕INF/PEG〔延長血中半衰期〕INF/HSA〔延長血中半衰期〕INF二聚物〔延長血中半衰期〕6)ADF(ATLderivedfactor)由于可以還原初生態(tài)氧，作為消炎劑正在臨床上試驗，但是在血中的停留性低。因此，通過延長血中的半衰期可以增加消炎效果。另外ADF可以期待治療肝組織障礙的線粒體的功能不全，所以通過以肝臟作為靶能增加其效果。ADF/PEG〔延長血中半衰期〕ADF/聚賴氨酸〔延長血中半衰期〕ADF/HSA〔延長血中半衰期〕ADF二聚物〔延長血中半衰期〕ADF/asia血清類粘蛋白〔向肝臟集聚〕ADF/ァシァロフェッィン〔向肝臟集聚〕ADF/半乳糖修飾白蛋白〔向肝臟集聚〕ADF/半乳糖修飾聚賴氨酸〔向肝臟集聚〕ADF/支鏈型半乳糖修飾合成配位體〔向肝臟集聚〕按照本發(fā)明，通過使用來自微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(BTG)，在具有谷氨酰胺生物活性肽或蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基部分，在特異的且是緩和的條件下，可以修飾該肽或蛋白質(zhì)。在不消失生物活性肽或蛋白質(zhì)特性下改善該肽或蛋白質(zhì)的性質(zhì)。按照本發(fā)明，將具有谷氨酰胺的生物活性肽或蛋白質(zhì)和具有氨基的肽或蛋白質(zhì)在緩和條件下特異地融和，所以可以得到具有兩方性質(zhì)的有用蛋白質(zhì)。例如，通過使用抗體，特別是單克隆抗體進行修飾，可以將該生物活性肽或蛋白質(zhì)特異地集聚在必要的組織、臟器、細胞等中。附圖的簡單說明圖1表示IL-6及IL-2的BTG處理物的SDS-PAGE圖。圖2表示精制結(jié)合聚賴氨酸的IL-6的色譜圖。圖3表示結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6的SDS-PAGE圖。圖4表示結(jié)合PEG的rhIL-6的SDS-PAGE圖。圖5表示結(jié)合單克隆抗體的rhIL-6的維斯坦布勒特法的結(jié)果圖。圖6表示結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rhIL-2的SDS-PAGE圖。圖7表示結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rhIL-6的SDS-PAGE圖。圖8表示結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rINF-α-2b的SDS-PAGE圖。圖9表示結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rADF的SDS-PAGE圖。實施發(fā)明的方案以下根據(jù)實施例具體的說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不受這些實施例的限制。實施例1構(gòu)成BTG基質(zhì)的各種生物活性蛋白質(zhì)的檢索。作為對象生物活性蛋白質(zhì)，使用重組物(リコンビナントヒト)(rh)IL-2、rhIL-6及HSA。rhIL-2，1mg/ml70mM醋酸鈉、pH5.0、250mMNaClrhIL-6，1.75mg/ml10mM檸檬酸鈉、pH6.0、HAS，PASTEURMERIEUX制(出售地富士レヒ才)、200mg/ml方法1)在含有各蛋白質(zhì)0.5-2mg的1ml溶液中，加入等量的50μM一丹酰戊二胺(Monodansylcadaverine)溶液(pH7.5、50mMTris-HCl)。添加必要最小量的0.1N-NaOH后，將各溶液的pH調(diào)節(jié)到7.2-7.4。2)向配制的各反應(yīng)液250μl中添加精制的BTG溶液(10unit/ml)10μl，在37℃下靜置培養(yǎng)2小時后，添加1M的硫酸銨20μl，結(jié)束反應(yīng)。作為對照，在添加酶液前是準(zhǔn)備了添加硫酸銨的溶液。3)將200μl的各反應(yīng)液作為樣品散布在Nunc社的96微孔板上，加在密力巴社(ミリポァ社)制的熒光板讀取器(Cytoflufuor)測定光強度。濾波器中，激發(fā)(Excitation)選擇360/40nm、發(fā)射(Emission)選擇530/25nm，靈敏度選擇6。結(jié)果，如表1所示。表1蛋白質(zhì)螢光強度對照BTG處理BTG的反應(yīng)性rhIL-2523597+rhIL-65502,267+HSA695940+</table></tables>實施例2使用BTG的rhIL-2、rhIL-6的交聯(lián)聚合反應(yīng)。試劑rhIL-2、rhIL-6溶液使用與實施例1相同的物質(zhì)。方法1)向rhIL-2或rhIL-6溶液100μl中添加實施例1使用的酶液10μl，在37℃下放置90分鐘。作為對照是添加同量的蒸餾水來代替酶液。反應(yīng)結(jié)束后，立即加入100μl的SDS-PAGE用試樣調(diào)節(jié)液，配制SDS-PAGE的試樣。2)試樣的SDS-PAGE是使用法斯特系統(tǒng)(Phastsystem)進行的。凝膠是用法斯特凝膠110-15，染色是使用銀染色的法斯特銀染劑盒(phastsilversteinkit)進行的。取樣的試劑量是1μl。圖1表示了結(jié)果的SDS-PAGE圖形。圖1中的1表示標(biāo)記、2表示rhIL-6、3表示BTG處理的rhIL-6、4表示rhIL-2、5表示BTG處理的rhIL-2。在BTG處理的3及5中，顯示著更高分子量的斑點，表示rhIL-2及rhIL-6用BTG處理而產(chǎn)生的交聯(lián)聚合化的事實。實施例3結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6制備將10mg的聚賴氨酸溴酸鹽(分子量7900、45700、83800Sigma社制)溶解在1ml的50mMTris-HCl(pH7.5)。向其中添加50μl的BTG溶液(14U/ml50mMTris-HClpH7.5)。在室溫下培養(yǎng)30分鐘。向其中加入2ml的rhIL-6溶液(2mg/ml10mM檸檬酸鈉、pH6.0)攪拌后，在37℃下放置2.5小時(分子量7900時)或20小時(分子量45700或83800時)，用逆相HPLC精制反應(yīng)液。洗脫條件與圖2所示的條件相同。收集聚賴氨酸結(jié)合rhIL-6流分，用逆相HPLC濃縮。條件與圖2相同，但是B0％→B100％，5分鐘。收集聚賴氨酸結(jié)合rhIL-6流分，用凝聚過濾，脫去溶劑。條件柱SephadexG-25(1×10cm)緩沖液20mMTris-HCl、0.5MNaCl、pH8.5流速2ml/min在圖2中表示了用逆相HPLC分析精制后的結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6的純度的結(jié)果。如圖2所示，大約精制成單一的物質(zhì)。圖2的1表示rhIL-6(保留時間14.12分鐘)、圖2的2表示分子量7900的結(jié)合了聚賴氨酸的rhIL-6(保留時間12.38分鐘)、圖2的3表示分子量45700的結(jié)合了聚賴氨酸的rhIL-6(保留時間12.16分鐘)、圖2的4表示分子量83800的結(jié)合了聚賴氨酸的rhIL-6(保留時間11.46分鐘)。該HPLC的條件，柱VydacProteinC4214TP54(4.6×250mm)。溶劑A是0.1％三氟醋酸(TFA)B是0.1％TFA-80％乙腈。洗脫順序從B40％20分鐘→B100％。流速1ml/分鐘。在圖3中表示了結(jié)合了聚賴氨酸的rhIL-6(分子量7900時)的SDS-PAGE。如圖3所示，結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6大約是單一的帶。圖3中1表示標(biāo)記，2表示rhIL-6，3表示結(jié)合了聚賴氨酸的rhIL-6(分子量7900時)。實施例4結(jié)合了聚乙二醇(PEG)的rhIL-6的制備將10mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350Sigma社制)溶解在1ml的50mMTris-HCl(pH7.5)。向其中添加50μl的BTG溶液(14U/ml50mMTris-HClpH7.5)。在室溫下放置30分鐘。向其中加入2ml的rhIL-6溶液(2mg/ml10mM檸檬酸鈉、pH6.0)攪拌后，在37℃下放置2.5小時，用逆相HPLC精制反應(yīng)液。精制條件與實施例3相同(圖2)。收集結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6流分，用逆相HPLC濃縮。條件與實施例3相同，但是洗脫順序是B0％→B100％，5分鐘。收集結(jié)合PEG的rhIL-6流分，用凝聚過濾，脫去溶劑。條件柱SephadexG-25(1×10cm)緩沖液20mMTris-HCL、0.5mNaCl、pH8.5流速2ml/min用SDS-PAGE解析精制物(圖4)。結(jié)合PEG的rhIL-6在分子量大約24000的位置顯示單一的帶?？烧J為相對于未修飾體結(jié)合了一個分子的PEG。圖4中，1表示rhIL-6、2表示精制的結(jié)合PEG的rhIL-6。結(jié)合PEG的rhIL-6大約是單一的帶。實施例51)結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6及結(jié)合PEG的rhIL-6的體外活性。方法使用的細胞系為亞克隆IL-6依賴的鼠雜交細胞瘤MH60BSF2所得到的MH60.32株。在96孔培養(yǎng)板的每一孔都加入以下的溶液。a)在培養(yǎng)基中逐步稀釋的100μl樣品溶液(從100mg/ml稀釋3倍)b)在培養(yǎng)基中洗滌三次并懸浮于100μl培養(yǎng)基中的5×103MH60。在37℃，50％CO2存在下培養(yǎng)60小時后，使用MTT測定法測定細胞數(shù)目，MTT法按以下進行。在每孔中加入50μlMTT溶液(3-〔4，5-二甲基噻唑-2-基〕-2，5-二苯基四唑溴1mg/mlPBS溶液)，放置大約6小時后，移出150ml上清液，在殘留物中加入100μlMTT溶液(20％SDS0.04NHCl溶液，放置一夜。通過微量培養(yǎng)板讀數(shù)器測定光吸收值(從570-620mm)。本實驗所使用的培養(yǎng)基是PRPMI1640(GIBCO社)、10％VCS(滅活的)。單位是按照平野等(proc.N.A.S.，82，5490(1985)的方法計算的。結(jié)果如表2所示，在MH60的增殖活性中，結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6(實施例3制備的三種結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6)及結(jié)合PEG的rhIL-6顯示了與rhIL-6大約相同的活性。結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6及結(jié)合PEG的rhIL-6的體外活性結(jié)合聚賴氨酸的rhIL-6及結(jié)合PEG的rhIL-6的內(nèi)活性(血小板數(shù)增加)表3實施例6rhIL-6與單克隆抗體的結(jié)合在小鼠單克隆抗體白鼠巨核細胞/血小板抗體50μg/50μl、50mMTris-HCLpH7.5中，加入BTG1U/100μl、50mMTris-HCLpH7.5，在室溫下放置30分鐘后，加入rhIL-650μg/25μl、10mM檸檬酸鈉pH7.0，在20℃下反應(yīng)4小時。將反應(yīng)液供給到預(yù)先用10mM醋酸鈉緩沖液pH7.0平衡的小鼠單克隆抗rhIL-6抗體柱中，接著用0.1NHCl、2MNaCl洗脫。再用0.3MTris-HCl，pH8.5稀釋三倍后，供給到預(yù)先用10mM醋酸鈉緩沖液pH7.0平衡的蛋白G柱中(Pharmacia社制)，接著用0.1M賴氨酸-HCl緩沖液pH2.7洗脫，將洗脫級分加在SDS-PAGE上，用抗rhIL-6抗體進行嵌合(ゥェスタンブロッテング)。其結(jié)果表示在圖4中。在抗rhIL-6抗體柱和蛋白G柱上吸附的物質(zhì)均可在高分子區(qū)域檢測出，這表示單克隆抗體與rhIL-6的結(jié)合。圖4中，1表示標(biāo)記、2表示反應(yīng)液、3表示抗rhIL-6抗體、4表示抗rhIL-6抗體柱吸附級分、5表示蛋白G柱吸附級分。此外，3表示了超過抗體柱容量后，rhIL-6結(jié)合物溢流的事實。實施例7結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rhIL-2的制備將溶解在含有0.25M的NaCl50mM醋酸緩沖液(pH5.0)的rhIL-2溶液(2.5ml)加在預(yù)先用200mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡的柱中(SephadexG-25)，用上述緩沖液進行洗脫。洗脫液用280nm的吸光度監(jiān)測，得到rhIL-2的洗脫級分(3ml)。將此洗脫級分的蛋白質(zhì)濃度，以1.2×104M-1cm-1計換算成280下的摩爾吸光系數(shù)，進而用上述Tris緩沖液的稀釋，配制5μl的蛋白質(zhì)溶液。在此稀釋溶液中(2.5ml)添加75mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350、Sigma社制)，37℃下培養(yǎng)。向此反應(yīng)液中添加250μl的BTG溶液(220U/ml200mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.5))，37℃下培養(yǎng)2小時。使用“YMCC8AP”柱(山村化學(xué)社制)的反相HPLC精制反應(yīng)液。除去未反應(yīng)的rhIL-2級分。使用Phastsystem(Pharmacia社制)的SDS-PAGE(Monogenious20凝膠)分析精制物的純度。其結(jié)果，用PEG的修飾體(PEG-rHIL-2)比未修飾體，結(jié)合了1個分子的PEG并且只是在其予想程度上升的位置上，確認了來自蛋白質(zhì)的帶(圖6)。圖6中1表示分子量標(biāo)記、2表示rhIL-2、3表示結(jié)合PEG的rhIL-2。實施例8結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rhIL-2(PEG-rhIL-2)的活性將IL-2依賴性小鼠細胞“CTLL-2”在含有ratIL-2(Collaborative社制)約50units/ml10％FCS(牛胎血清)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本細胞用含有10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌后，使其以4×104cells/ml浮游在培養(yǎng)基中。將此100μl分注到組織培養(yǎng)用96孔板的各孔中，進而，將用含有FCS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的PEG-rhIL-2及未修飾的rhIL-2樣品液加入到各100μl孔中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)開始20小時后，用含有NEN社制“methyl-3H”Thymidine(740GBq/mmol)的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，將370GBq/50μl加入到各孔中，進而培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，用Packard社制“Matrix96DirectBetacounter”測定進入的放射活性。其結(jié)果，PEG-rhIL-2對rhIL-2的比活性是97％，rhIL-2的修飾體保持著IL-2活性。實施例9結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rhIL-6的制備將溶解在10mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中的rhIL-6溶液(1.75mg/ml)用200mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.5)進行稀釋，配制5μM的蛋白質(zhì)溶液，在此溶液中(2.5ml)，添加75mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350、Sigma社制)，37℃下予培養(yǎng)。向此反應(yīng)液中添加250μl的BTG溶液(220U/ml200mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.5))，37℃下培養(yǎng)2小時。使用“YMCC8AP”柱(山村化學(xué)社制)的反相HPLC精制反應(yīng)液。除去未反應(yīng)的rhIL-6級分。使用PhastSystem(Pharmacia社制)的SDS-PAGE(Monogenious20凝膠)分析精制物的純度。其結(jié)果，用PEG的修飾體(PEG-rHIL-6)比未修飾體，結(jié)合了1個分子的PEG并且只是在其予想程度上升的位置上，確認了來自蛋白質(zhì)的帶(圖7)。圖7中1表示分子量標(biāo)記、2表示rhIL-6、3表示結(jié)合PEG的rhIL-6。實施例10結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rINF-α-2b的配制將rINF-α-2b的冷凍干燥物(山之內(nèi)制)溶解在200mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.5)中，在此配制溶液中(2.5ml)，添加22.5mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350、Sigma社制)，37℃下予培養(yǎng)。向此反應(yīng)液中添加250μl的BTG溶液(220U/ml200mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.5))，37℃下培養(yǎng)2小時。使用PhastSystem(Pharmacia社制)的SDS-PAGE(Monogenious20凝膠)分析反應(yīng)液。其結(jié)果，用PEG的修飾體(PEG-rINF-α-2b)比未修飾體，結(jié)合了1個分子的PEG并且只是在其予想程度上升的位置上，確認了來自蛋白質(zhì)的帶(圖8)。圖8中1表示分子量標(biāo)記、2表示rINF-α-2b、3表示修飾PEG的反應(yīng)液。3的43.0附近的斑點是反應(yīng)液的BTG。67.0KDa以上的斑點是原料rINE-α-2b中的人血清白蛋白(HSA)。實施例11結(jié)合聚乙二醇(PEG)的rADF的配制將rADF的冷凍干燥物溶解在200mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.5)中，配制5μM的蛋白質(zhì)溶液，在此配制溶液中(2.5ml)，添加22.5mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350、Sigma社制)，37℃下予培養(yǎng)。向此反應(yīng)液中添加250μl的BTG溶液(220U/ml200mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.5))，37℃下培養(yǎng)2小時。使用PhastSystem(Pharmacia社制)的SDS-PAGE(Monogenious20凝膠)分析反應(yīng)液。其結(jié)果，用PEG的修飾體(PEG-rADF)比未修飾體，結(jié)合了1個分子的PEG并且只是在其予想程度上升的位置上，確認了來自蛋白質(zhì)的帶(圖9)。圖9中1表示分子量標(biāo)記、2表示rADF、3表示修飾PEG的反應(yīng)液。3的43.0附近的斑點是反應(yīng)液的BTG。權(quán)利要求1.生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)的修飾方法，其特征在于將至少具有谷氨酰胺殘基的生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)和具有氨基供體的物質(zhì)，在來自微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在下進行反應(yīng)，在該谷氨酰胺殘基的γ-位酰胺上形成該氨基供體的氨基和酰胺鍵。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽或蛋白質(zhì)的修飾方法，其特征在于具有氨基供體的物質(zhì)是聚賴氨酸、單克隆抗體或聚乙二醇的烷基胺衍生物中的一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肽或蛋白質(zhì)的修飾方法，其特征在于具有谷氨酰胺殘基的生物活性蛋白質(zhì)是白細胞介素2或6、干擾素或ADF(ATLderivedfactor、人硫氧還蛋白)中的一種。4.用權(quán)利要求1所述的方法制造的肽和蛋白質(zhì)的修飾體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽或蛋白質(zhì)的修飾方法，其特征在于氨基供體的物質(zhì)是聚賴氨酸、單克隆抗體或聚乙二醇的烷基胺衍生物中的一種。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的肽或蛋白質(zhì)的修飾方法，其特征在于具有谷氨酰胺殘基的生物活性蛋白質(zhì)是白細胞介素2或6、干擾素或ADF(ATLderivedfactor、人硫氧還蛋白)中的一種。全文摘要本發(fā)明涉及生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)的修飾方法，其特征在于將至少具有谷氨酰胺殘基的生物活性肽或生物活性蛋白質(zhì)和具有氨基供體的物質(zhì)，在來自微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在下進行反應(yīng)，在該谷氨酰胺殘基的γ-位酰胺上形成該氨基供體的氨基和酰胺鍵。文檔編號C07K14/555GK1165539SQ9519539公開日1997年11月19日申請日期1995年9月29日優(yōu)先權(quán)日1994年9月29日發(fā)明者高原義之,山田尚之,本木正雄申請人:味之素株式會社