專利名稱：Mhc－ⅱ結(jié)合和/或mhc－ⅱ模擬分子用于預(yù)防和/或治療炎性疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用特異分子來干擾毒素如脂多糖(LPS)本身或它與諸如CD14和LBP的其它分子組成的復(fù)合體與其轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞之間的相互作用。本發(fā)明還涉及將所述分子用于預(yù)防和治療炎性疾病，如敗血癥性休克的用途。
LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁組分。革蘭氏陰性細(xì)菌的感染會導(dǎo)致危及生命的疾病，這種疾病是由LPS與諸如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞之類的吞噬細(xì)胞的特異結(jié)合所致，這種結(jié)合能激活所述細(xì)胞并使其分泌各種細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子-α、白介素1(IL-1)、IL-6、IL-8及其它炎癥介質(zhì)。這些物質(zhì)或通過直接作用或通過激化次級介質(zhì)而引起一系列反應(yīng)，從而導(dǎo)致凝集系統(tǒng)病、血管舒張病、多器官缺損病并最終導(dǎo)致敗血癥性休克病(4，5)。
一般，能導(dǎo)致分泌多種炎癥介質(zhì)的吞噬細(xì)胞的顯著活化作用是在被稱為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的一種病態(tài)的發(fā)病過程中的一個(gè)重要反應(yīng)。除了由LPS激活之外，多種其它臨床疾病也會導(dǎo)致SIRS，如由細(xì)菌或病毒引起的感染、創(chuàng)傷、燒傷、胰腺炎、移植物抗宿主疾病和宿主抗移植物疾病、吞噬血細(xì)胞作用等。炎性疾病的例子之一是由來自革蘭氏陽性細(xì)菌的葡萄球菌毒素A之類的外毒素引起的中毒性休克。已知其為超級抗原的其它外毒素有葡萄球菌毒素B和鏈球菌毒素。
業(yè)已證實(shí)，LPS能與糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定的單核細(xì)胞抗原CD14結(jié)合。CD14存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的表面，但它也能以無GPI錨定的可溶形式存在于健康個(gè)體的血清中。此外還證實(shí)，抗-CD14單克隆抗體能抑制LPS對單核細(xì)胞的激活作用。由此表明，CD14可起到LPS受體的作用(1)，并能介導(dǎo)LPS對細(xì)胞質(zhì)的作用。不過，CD14-陰性細(xì)胞也能對LPS作出反應(yīng)(2，7，8)。
此外，還了解到CD14是一種缺乏跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定分子(9)。因此，CD14不能向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。一種被普遍接受的假設(shè)是，與GPI連接的蛋白需要相關(guān)的跨膜分子以便進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，LPS及其它可能的SIRS刺激的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子尚未得到鑒定。
在由LPS活化細(xì)胞的情況下，為了解釋LPS引起的細(xì)胞激活作用，迫切需要CD14之外的其它分子(10)。有人提出，LPS能與膜結(jié)合的或可溶的CD14以及LPS結(jié)合蛋白(LBP)組成復(fù)合體。其它源于血清的分子也能加入該復(fù)合體。該復(fù)合體能與細(xì)胞表面上的一種尚未得到鑒定的分子結(jié)合，使該細(xì)胞被激活。
已證實(shí)CD14在引起由來自革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)菌包膜產(chǎn)物產(chǎn)生的細(xì)胞激活作用方面起著重要作用(13)。同樣地，其它膜結(jié)合或源于血清的分子可能參與同所述細(xì)胞表面分子的相互作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞的激活作用。
本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，主要組織相容性復(fù)合體II(MHC-II)分子是LPS激活細(xì)胞所必須的，這種分子起著由LPS和諸如CD14和LBP之類的分子組成的分子復(fù)合體的受體和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的作用。在人體內(nèi)，MHC被稱為人類白細(xì)胞抗原(HLA)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，LPS-反應(yīng)性取決于MHC II型分子在細(xì)胞表面的表達(dá)。一種在本文中被稱為“THP-1MHC+”的細(xì)胞系是一種MHC II型表達(dá)單核細(xì)胞系，Tsuchiya等稱之為THP-1(3)。另一種在本文中被稱為“THP-1.6MHC-”的細(xì)胞系是由THP-1MHC+通過自發(fā)突變產(chǎn)生的一種MHC II型-陰性單核細(xì)胞系。THP-1MHC+細(xì)胞能效應(yīng)于LPS分泌細(xì)胞因子，而THP-1.6MHC-細(xì)胞不能。CD14-陽性、MHC II-陰性人類外周血單核細(xì)胞(PBMC)也不能對LPS作出反應(yīng)。通過用CIITA轉(zhuǎn)染THP-1.6MHC-細(xì)胞可以恢復(fù)MHC II型表達(dá)和LPS反應(yīng)性，CIITA是一種能編碼對MHC-II分子在細(xì)胞表面的表達(dá)很關(guān)鍵的核因子的cDNA。
其它SIRS刺激向細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)也能由MHC-II分子介導(dǎo)。以前已經(jīng)證實(shí)，外毒素也能結(jié)合于細(xì)胞表面的MHC-II分子上。其它革蘭氏陽性產(chǎn)物的活性至少部分是由CD14介導(dǎo)的，因此，所述產(chǎn)物與CD14的復(fù)合體很有可能也會與MHC-II分子相互作用，以活化細(xì)胞。
因此，通過干擾由LPS和諸如CD14和LBP組成的復(fù)合體(以下稱“CD14/LPS/LBP復(fù)合體”)與細(xì)胞結(jié)合MHC-II之間的相互作用可以預(yù)防和/或治療系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征。根據(jù)本發(fā)明，可以兩種不同方式實(shí)施上述干擾。
首先，可以用諸如抗MHC-II抗體、CD14或其肽衍生物之類的MHC-II結(jié)合分子阻止CD14/LPS/LBP復(fù)合體與細(xì)胞結(jié)合MHC-II的結(jié)合。這種分子能與CD14/LPS/LBP復(fù)合體競爭，從而阻止該復(fù)合體結(jié)合，但它本身不能激活MHC-II。由此阻止了MHC-II的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。
其次，循環(huán)的LPS或CD14/LPS/LBP復(fù)合體能被MHC-II模擬分子捕捉。與可溶性MHC-II或類MHC-II分子結(jié)合的復(fù)合體不再能與細(xì)胞結(jié)合的MHC-II結(jié)合。從而防止對該細(xì)胞的激活作用。
MHC-II結(jié)合分子包括能阻止LPS或CD14/LPS復(fù)合體與MHC-II結(jié)合的任何分子。在實(shí)踐中，所述分子包括針對細(xì)胞的CD14/LPS或LPS結(jié)合位點(diǎn)的抗MHC II抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w片段也適于作為MHC-II結(jié)合分子。
MHC-II模擬分子同時(shí)包括可溶性MHC-II分子本身和任何其它能封閉LPS或CD14/LPS復(fù)合體上的MHC-II結(jié)合位點(diǎn)的分子。這類分子可以包括完整MHC-II分子或其片段或亞單位。此外，還可以采用能與LPS或LPS/CD14/LBP復(fù)合體結(jié)合而又不會激活MHC-II的肽。所述肽可以與MHC-II至少部分同源，并含有合適的D-氨基酸，使該肽具有拮抗特性。所述分子可以為可溶形式或與一種載體的表面連接。
根據(jù)本申請?zhí)峁┑男畔?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒定合適的結(jié)合和/或模擬分子。
這類分子可以來自任何合適的來源，如來源于人或其它生物，并可能用各種方法制備，例如，從MHC-II陽性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中提取或從細(xì)胞裂解液中提取。最佳提取方法為免疫親和層析法。還可以用基因技術(shù)、蛋白質(zhì)化學(xué)方法或任何其它合適方法制備合適的分子。
根據(jù)本發(fā)明，可將兩種類型的分子用于預(yù)防和/或治療炎性疾病，如敗血癥性休克、器官移植(例如骨髓移植)后的移植物抗宿主疾病、移植排斥反應(yīng)、因燒傷、意外傷害、胰腺感染等引起的炎癥反應(yīng)。
本發(fā)明還適于預(yù)防和/或治療其它炎癥反應(yīng)，例如手術(shù)后的炎癥反應(yīng)，如毛細(xì)管泄露綜合征、過敏性炎病，自身免疫病、如紅斑狼瘡(LE)及其亞型、硬皮病及其亞型、嗜伊紅性粒細(xì)胞筋膜炎(eosinophilicfasciitis)、Sjogren綜合征、多肌炎、皮膚肌炎、結(jié)節(jié)性動脈外膜炎、Wegener’s肉芽腫病、顳動脈炎、風(fēng)濕性多肌痛等，類風(fēng)濕病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、少年慢性關(guān)節(jié)炎、Felty綜合征、Caplan綜合征、類風(fēng)濕性脊椎炎(Marie-Strumpell-Bechterew病)、牛皮癬、Reiter綜合征、Behcet綜合征。
可以用本發(fā)明方法治療的而且至少部分地因自身免疫機(jī)制所致的其它疾病有糖尿病、Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎、消化道潰瘍、腎感染，如腎小球性腎炎和腎炎，動脈硬化病、多發(fā)性硬化、老年性癡呆、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺機(jī)能低下。
本發(fā)明還可用于與腫瘤病有關(guān)的一種或幾種器官的炎癥反應(yīng)，如白血病、血細(xì)胞瘤、癌癥、纖維瘤、肉瘤及各種類型的組織細(xì)胞增多病。
本發(fā)明還能用于預(yù)防和/或治療病毒病，如AIDS。已知LPS刺激能增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)人類免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制。通過本發(fā)明的MHC-II結(jié)合分子和/或模擬分子阻止LPS的刺激作用，可以克服這種復(fù)制刺激。因此，本發(fā)明的MHC-II結(jié)合分子和/或模擬分子可用于以通過細(xì)胞激活刺激的方式阻止對病毒復(fù)制的刺激而對HIV感染的細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。
基于在實(shí)施例中提供的資料，可以設(shè)想出以下用LPS激活細(xì)胞的模型。一方面，LPS可結(jié)合于膜結(jié)合CD14(mCD14)上，這是一種由LPS結(jié)合蛋白(LBP)加速的相互作用(14)。LPS和GPI錨定mCD14以及可能的LBP組成的復(fù)合體隨后與跨膜MHC II型分子相互作用，導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種情形如圖3A所示。另一方面，LPS與LBP一起能結(jié)合在存在于血清里的可溶性CD14(sCD14)上，該復(fù)合體然后結(jié)合于CD14-陰性細(xì)胞表面上的MHC II型分子上，導(dǎo)致CD14-陰性、但MHC II型-陽性的細(xì)胞被激活。這種情形如圖3B所示。盡管示出的接觸發(fā)生于CD14與MHC-II之間，LBP和LPS也可參與該相互作用，這與其它尚未得到鑒定的分子一樣。革蘭氏陽性細(xì)菌也能引起上述激活刺激，不過在這種情況下LBP的作用尚未確定。這里并不排除在沒有與CD14或LBP形成復(fù)合體的情況下某些激活刺激直接作用于MHC-II分子的可能性。現(xiàn)已證實(shí)這種刺激作用是由MHC-II分子介導(dǎo)的。所述封閉或模擬分子將阻止這種激活刺激的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明還涉及MHC-II結(jié)合分子、MHC-II模擬分子、以及包括兩種類型分子中的一種或兩種的藥物組合物。藥物組合物含有一種或幾種MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子作為活性成分，用于干擾用于諸如吞噬細(xì)胞的能表達(dá)MHC-II分子的細(xì)胞的諸如LPS的激活刺激物與細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子之間的相互作用，該組合物的形式為粉狀、懸浮液、溶液、氣霧劑、乳液、灌注液、吸入組合物、軟膏或乳液，并可用于局部施用、鼻內(nèi)使用、直腸內(nèi)使用、陰道內(nèi)使用，還可用于口服、腸胃外(靜脈、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)等)或經(jīng)表皮使用、吸入使用等。本發(fā)明的藥物組合物可以這樣制備將所述活性化合物與具有中性特征的可以藥用的賦形劑(如水或無水溶劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、去污劑、添加劑)合并(即通過混合、溶解等)，如果必要的話并進(jìn)一步與著色劑和調(diào)味劑合并。藥物組合物中活性成分的濃度根據(jù)處理的性質(zhì)和用藥方法可以在0.001％-100％間變化。所服用的活性成分的劑量還取決于具體用途和服用途徑，但舉例來說，可以在0.01μg-1mg/kg體重間變化，最好在0.1μg-100μg/公斤體重間變化。
將結(jié)合以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，這些實(shí)施例不是用于限定本發(fā)明范圍的。實(shí)施例例1說明通過比較用LPS刺激時(shí)由MHC II型-陽性(HLA-DR)和MHC II型-陰性細(xì)胞系分泌的細(xì)胞因子驗(yàn)證這樣的假說在由LPS激活吞噬細(xì)胞時(shí)，MHC-II是包括LPS、CD14、LBP以及可能有的其它分子的復(fù)合體的轉(zhuǎn)導(dǎo)物和/或受體。細(xì)胞因子的分泌可以指示細(xì)胞的激活。
材料和方法THP-1MHC+是一種來源于人的CD14-陰性、MHC II型-陽性單核細(xì)胞系(3)。THP-1.6MHC-是一種自發(fā)產(chǎn)生的THP-1MHC+的MHC II型-陰性突變體，它是通過重復(fù)限制稀釋克隆的。
通過用CIITA(II型反式激活蛋白；一種為MHC II型蛋白表達(dá)所必需的核蛋白(12))轉(zhuǎn)染THP-1.6MHC-細(xì)胞重建HLA-DR表達(dá)，以獲得THP-1.6MHC-CIITA。
通過流式細(xì)胞計(jì)量法評價(jià)HLA-DR和CD18在THP-1MHC+細(xì)胞(野生型)、THP-1.6MHC-細(xì)胞(突變細(xì)胞系)和THP-1.6MHC-CIITA(用CIITA轉(zhuǎn)染的THP-1.6MHC-細(xì)胞)表面的表達(dá)。
各細(xì)胞系以106細(xì)胞/ml的密度在補(bǔ)充了10％FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用LPS分別以0，1，10，100ng/ml和1μg/ml的劑量進(jìn)行刺激。24小時(shí)后收集上清液并通過ELISA測定其TNF-α和IL-8的含量。
結(jié)果和討論LPS處理不會損害細(xì)胞的生活力。通過臺盼藍(lán)染色證實(shí)，95％以上的細(xì)胞是有生活力的。
盡管CD18的表達(dá)在三個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)是類似的，但由THP-1.6MHC-細(xì)胞表達(dá)的HLA-DR量明顯低于THP-1MHC+細(xì)胞表達(dá)的。
在用LPS刺激THP-1MHC+細(xì)胞時(shí)，該細(xì)胞的反應(yīng)是分泌TNF-α和IL-8(

圖1)。形成對比的是，用LPS，即使是高劑量的LPS刺激HLA-DR-陰性細(xì)胞系THP-1.6MHC-，也不能誘導(dǎo)其分泌TNF-α或IL-8。然而，用CIITA轉(zhuǎn)染可以恢復(fù)HLA-DR-表達(dá)和LPS-反應(yīng)性。結(jié)論是，HLA-DR分子的表達(dá)是LPS激活單核細(xì)胞所必需的。例2說明為了證實(shí)例1的發(fā)現(xiàn)，用獲自患有MHC-II型缺陷-一種罕見的遺傳病，其表現(xiàn)為在幼兒的早期出現(xiàn)嚴(yán)重的合并性免疫缺陷-的患者的細(xì)胞證實(shí)用細(xì)胞系系統(tǒng)所獲得的結(jié)果。在這種患者體內(nèi)CD-14的表達(dá)不受影響。在存在大劑量LPS的條件下培養(yǎng)MHC II型缺陷型患者的PBMC和對照個(gè)體的PBMC，并測定所述培養(yǎng)物的上清液中TNF-α和IL-1的含量。
材料和方法從MHC-II缺陷型患者和健康的對照體內(nèi)獲取外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
通過直接免疫熒光染色和流式細(xì)胞計(jì)量法測定HLA-DR在所述患者的PBMC表面的表達(dá)(畫影線的直方圖，在圖2的左側(cè))和在健康的對照的PBMC表面的表達(dá)(灰色直方圖)。
以106細(xì)胞/ml的濃度在補(bǔ)充了10％正常的人AB-陽性血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲自患者的PBMC(粗線)和獲自對照的PBMC(細(xì)線)，并分別以0，1，10和100ng/ml的LPS進(jìn)行刺激。24小時(shí)后收獲上清液，并通過ELISA測其TNF-α含量。
結(jié)果和討論正象所預(yù)期的，由于LPS刺激，來自健康個(gè)體的PBMC分泌TNF-α和IL-1。然而，患者的MHC II型-缺陷的PBMC不會因LPS刺激而分泌顯著量的細(xì)胞因子(圖2)。由此證實(shí)了對表達(dá)MHC II型分子的要求并不局限于細(xì)胞系的THP-1MHC+家族。
數(shù)據(jù)表明，膜結(jié)合CD14不是由LPS激活細(xì)胞時(shí)所必需的(THP-1MHC+細(xì)胞不表達(dá)CD14)，而且量也不足(來自MHC II型缺陷型患者的PBMC表達(dá)正常水平的CD14)。
然而，上述實(shí)驗(yàn)未涉及可溶性CD14的作用。在所有實(shí)驗(yàn)中，采用補(bǔ)充了含有可溶性CD14的血清的培養(yǎng)基。因此，這些實(shí)驗(yàn)是重復(fù)的，在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)THP-1MHC+、THP-1.6MHC-和THP-1.6MHC-CIITA細(xì)胞。用大劑量LPS處理不會導(dǎo)致分泌顯著量的TNF-α。
以上結(jié)果表明，MHC II型分子重要地參與了LPS-反應(yīng)性。HLA-DR陰性細(xì)胞不會因LPS刺激而分泌細(xì)胞因子。人們也許會說，缺乏對LPS的反應(yīng)是與一個(gè)同MHC II型緊密結(jié)合的一個(gè)因子相關(guān)，而且也是由CIITA調(diào)節(jié)，而不是缺乏MHC II型表達(dá)本身導(dǎo)致抑制LPS-反應(yīng)性。然而，對LPS反應(yīng)的缺乏并不局限于單獨(dú)一種細(xì)胞因子的分泌，因?yàn)門NF-α及IL-1和IL-8的分泌也受到抑制。另外，盡管做了深入研究，至今尚未發(fā)現(xiàn)MHC II型之外的由CIITA調(diào)節(jié)的分子。最后，患者的疾病不是因?yàn)橐环N與CIITA相關(guān)的缺陷而起。轉(zhuǎn)染來自該患者的由EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞不能恢復(fù)MHC II型分子的表達(dá)。例3說明用3種不同方法驗(yàn)證MHC II型分子與CD14之間的物理相互作用。
首先，將MHC II陽性細(xì)胞系和MHC II陰性細(xì)胞系的裂解液與MHC II特異性抗體或?qū)φ湛贵w和放射性CD14(CD14*)或放射性對照分子一起培養(yǎng)。只有通過蛋白A瓊脂糖與MHC II特異抗體間的相互作用才能使MHC II與CD14*復(fù)合體沉淀。當(dāng)采用對照分子或?qū)φ湛贵w時(shí)，在該沉淀中不應(yīng)當(dāng)有放射性。如果無MHC II，在所述沉淀中也不會有放射性。
其次，將MHC II與放射性CD14一起培養(yǎng)。假設(shè)會形成MHCII/CD14*復(fù)合體。理論上講，這種復(fù)合體可以用對該復(fù)合體的兩種組分中任一種具有特異性的抗體和蛋白A瓊脂糖進(jìn)行沉淀。
第三，檢驗(yàn)抗CD14抗體是否能阻止MHC II與CD14*發(fā)生相互作用。
在圖4中對這些實(shí)驗(yàn)的原理作進(jìn)一步說明。方法1.生產(chǎn)放射性CD14已通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯由全長CD14 cDNA生產(chǎn)出重組CD14。所述cDNA是用PCR技術(shù)制備的，并用TNT T7接合的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)，按生產(chǎn)商推薦的方案(Promega，瑞士)在有35S-蛋氨酸的條件下測定其核苷酸序列。作為對照，用相同的系統(tǒng)通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯生產(chǎn)放射性標(biāo)記的熒光素酶。2.生產(chǎn)細(xì)胞裂解物所謂293細(xì)胞是來源于人胚胎的腎臟的用人類腺病毒5型DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(ATCC命名為CRL 1573)；通過FACS分析發(fā)現(xiàn)，野生型293細(xì)胞不表達(dá)MHC II型分子。該細(xì)胞被作為MHC II陰性細(xì)胞。用源于人類MHC II型的α-、β和不變(i)鏈的cDNA轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞由Jacques Neefjes博士(Netherland Cancer Institute，阿姆斯特丹)惠贈。這種細(xì)胞能表達(dá)MHC II，因此被用作MHC II陽性細(xì)胞。按以下方法制備來自MHC II型陽性和MHC II型陰性細(xì)胞系的裂解物。
在培養(yǎng)皿中，在1ml裂解緩沖液(Boehringer Mannheim，細(xì)胞標(biāo)記和免疫沉淀試劑盒)里裂解5×106個(gè)細(xì)胞。30分鐘后收集裂解的細(xì)胞并進(jìn)行聲波處理(3×15秒)，接著在冰上培養(yǎng)30分鐘，然后離心。按下述方法對上清液進(jìn)行免疫沉淀。
3.在實(shí)驗(yàn)1中進(jìn)行免疫沉淀用購自Boehringer Mannheim(瑞士)的“細(xì)胞標(biāo)記和免疫沉淀試劑盒”，按所述試劑推薦的方案進(jìn)行免疫沉淀。簡言之，用50μl蛋白A-瓊脂糖懸浮液對樣品進(jìn)行預(yù)清除。離心除去該蛋白A-瓊脂糖，然后將上清液與以下抗體一起溫育L243(抗-HLA-DR，ATCC命名HB55)；IB5(抗-MHC II型，由Jacque Neefjes博士惠贈，Netherland Cancer Institute，阿姆斯特丹)；和抗-CD3(Pharminger，San Diego，USA/AMS Biotechnology，瑞士)。1小時(shí)后加入50μl蛋白A-瓊脂糖，并將該樣品溫育3小時(shí)，隨后洗滌6次。
然后將沉淀再懸浮于30μl緩沖液(50mM Tris，pH7.5，20mMNaCl，1mM EDTA，2mM PMSF)中，并加入5μl在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中獲得的含有放射性標(biāo)記CD14的溶液，在室溫下溫育該混合物30分鐘。離心之后用#2洗滌緩沖液洗滌2次，然后再用#3洗滌緩沖液洗滌2次(#2和#3緩沖液源自Boehringer Mannheim的細(xì)胞標(biāo)記和免疫沉淀試劑盒，瑞士)。將沉淀溶于標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE加樣緩沖液中并煮沸，在10％ SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后進(jìn)行放射性自顯影。4.純化MHC II型分子對Gorga等的方法(15)稍加改進(jìn)后將其用于從THP-1細(xì)胞中提取并純化MHC II型分子。通過與二甲基庚二酸亞胺化物(dimethypimelimidate)交聯(lián)將L243(抗-HL-DR，ATCC命名HB55)在蛋白A-Sepharose 4B柱上固定化。將THP-1細(xì)胞置于冰上，在含有0.1mM PMSF的Tris-HCl(pH8.0)中裂解。隨后的一切步驟均在4℃下進(jìn)行。以3000xg離心所得裂解物，洗滌沉淀直至上清液澄清。將收集的上清液以160000xg離心40分鐘，并通過以4％終濃度加入Nonidet P40的方式重新溶解沉淀。在以160000xg離心2小時(shí)后，將上清液以下述順序加至一系列的柱上Sepharose 4B(10ml)、正常兔血清Affigel 10(10ml)、蛋白A-Sepharose 4B(2ml)L243-Sepharose4B(12ml)。用以下溶液洗滌這些柱10mM Tris-HCl/0.1％ Nonidet P40pH8.0(5倍體積)；10mM MOPS/140 mM NaCl/0.1％脫氧膽酸鹽pH8.0(2倍體)；10mM Tris-HCl/0.1％脫氧膽酸鹽pH8.0(4倍體積)。將L243柱與其它柱分離，迅速用50mM甘氨酸/0.1％脫氧膽酸鹽pH11.5洗脫。收集10ml級分，并在其被2M甘氨酸pH2.0洗脫后調(diào)至pH7.0-8.0。通過用30kDal截?cái)嗄こ瑸V濃縮洗脫的HLA-DR分子。在Tris-HCl/0.1％脫氧膽酸鹽pH8.0中洗3次，然后將蛋白重新稀釋于同一緩沖液中。5.在實(shí)驗(yàn)2中進(jìn)行免疫沉淀將5μl在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中獲得的含有放射性標(biāo)記的CD14的溶液與1μl含有大約10ng MHC II型分子的溶液混合，并在室溫下溫育30分鐘。然后加入抗體，并將該樣品在4℃下溫育1小時(shí)。加入50μl蛋白A-瓊脂糖后再在4℃下溫育樣品3小時(shí)。離心后用#2洗滌緩沖液將沉淀洗2次，接著再用#3洗滌緩沖液洗2次(細(xì)胞標(biāo)記和免疫沉淀試劑盒，Boehringer Mannheim，瑞士)。然后將沉淀溶解于標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE加樣緩沖液中并煮沸，在10％ SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行凝膠電泳，然后進(jìn)行放射性自顯影。6.在實(shí)驗(yàn)3中進(jìn)行免疫沉淀在向與其它實(shí)驗(yàn)相同的免疫沉淀樣品中加入放射性標(biāo)記的CD14之前，將含有CD14的溶液與一種抗-CD14抗體混合物一起在室溫下溫育10分鐘。所述混合物含有以下抗-CD14抗體各10μgRMO 52(Immunotech，瑞士)；LeuM3(Beckton & Dickinson，瑞士)；MY4(Coulter，瑞士)；Tuk4(Dako，瑞士)；和100μl下列抗-CD14雜交瘤的上清液3C10，63D3(均獲自ATCC)。作為對照，將PBS以與抗體混合物相同的體積加至5μl含有放射性標(biāo)記的CD14的溶液中。
用于免疫沉淀的抗體為MY4(抗-CD14)和L243(抗-MHCII)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1用來自MHC II型陽性和MHC II型陰性細(xì)胞的裂解物驗(yàn)證MHC II型分子與CD14的共沉降該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖5所示。圖的左側(cè)示出的是用來自用MHC II型轉(zhuǎn)染(即用MHC II型的α、β和i鏈共轉(zhuǎn)染)的293-細(xì)胞的裂解物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖的右側(cè)示出的是用MHC II型陰性293野生型細(xì)胞的裂解液獲得的結(jié)果。
泳道1和2中只有微弱的帶，可能是由對照抗體抗-CD3分另與放射性CD14(泳道1)和熒光素酶(泳道2)進(jìn)行非特異沉淀所致。在泳道3和5中相應(yīng)于放射性標(biāo)記CD14(CD14*)的帶清晰可見；識別MHC II型分子的兩種不同抗體(泳道3L243；泳道5IB5)具有(共-)沉淀的CD14*。這些抗-MHC II型抗體的共沉淀作用對CD14是特異性的，因?yàn)闊o顯著量的放射性標(biāo)記的對照蛋白(熒光素酶)被這些抗體共沉淀(泳道4和6)?？?MHC II型抗體對CD14的共沉淀取決于MHC II型分子的存在，因?yàn)樵跊]有MHC II型分子時(shí)無由抗-MHC II型抗體產(chǎn)生的沉淀(利用來自MHC II型陰性293細(xì)胞的裂解物，泳道7-9)。實(shí)驗(yàn)2用通過免疫親和層析柱純化的MHC II型分子驗(yàn)證MHC II型分子與CD14的共沉淀結(jié)果如圖6所示。在圖的左側(cè)示出的是在有純化的MHC II型分子的情況下進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果，圖的右側(cè)示出的是在沒有純化的MHC II型分子時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，即以緩沖液作為陰性對照的結(jié)果。
在泳道1和4中僅可見相當(dāng)于由對照抗體(抗CD3)非特異地沉淀的微弱帶。在泳道3中，由于抗-CD14抗體的沉淀作用而出現(xiàn)了一條相當(dāng)于CD14的帶。在泳道2中，相當(dāng)于CD14的帶比泳道3中的帶更明顯，盡管在該實(shí)驗(yàn)中是用抗-MHC II型分子進(jìn)行沉淀的。在無純化的MHC II型分子的條件下，CD14能由抗-CD14抗體進(jìn)行有效沉淀(泳道6)，但由抗-MHC型抗體與CD14進(jìn)行的共沉淀未超過背景水平(泳道5)。
實(shí)驗(yàn)3可以用抗-CD14抗體抑制CD14和MHC II型分子之間的物理相互作用結(jié)果如圖7所示。泳道1和5表明，抗-CD14抗體MY4能沉淀通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)生的放射性標(biāo)記的CD14，而與有(泳道1)或沒有(泳道5)MHC II型分子無關(guān)(對照)。在有MHC II型分子的條件下，一種抗-MHC II型抗體即L243能有效沉淀CD14(泳道2)，但在無MHC II型分子的條件下僅相當(dāng)于背景水平(泳道6)。如果在與含有MHC II分子的細(xì)胞裂解物混合之前首先用抗-CD14抗體混合物處理CD14，CD14就不能被抗-MHC II型抗體沉淀。泳道4顯示，緩沖液(對照)對于CD14與抗MHC II型抗體的共沉淀無影響。泳道7和8表示的是與在泳道3和4的相同實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果，但該實(shí)驗(yàn)是在無MHCII型分子的條件下進(jìn)行的。例4說明為了證實(shí)MHC II在體內(nèi)激活細(xì)胞的作用，使用MHC II型敲除(knock-out)小鼠。如果MHC II參與LPS引起的激活機(jī)制，缺乏MHCII的小鼠將不應(yīng)表現(xiàn)出常見的LPS刺激的生理效果。用同一小鼠的血進(jìn)行類似的體外實(shí)驗(yàn)。方法在進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，將100μg LPS(大腸桿菌0111B4，在無菌0.9％NaCl中稀釋)靜脈注射到野生型C57BL/6和B6-Aa°/Aa°MHC II型敲除小鼠(Hoffmann-La Roche；文獻(xiàn)16)。2小時(shí)以后，通過無菌操作殺死小鼠并放血。在室溫下讓血凝固，并以13,000rpm離心5分鐘。然后除去血清。通過ELISA(Biosource)測定血清里TNFα的含量，其為吞噬細(xì)胞激活的標(biāo)志。結(jié)果如圖8所示。
為了進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，在存在0，0.1，1，10和100ng/ml LPS的條件下溫育肝素化的獲自野生型MHC II陽性C57 BL/6小鼠(圖9中的黑圓點(diǎn))和B6-Aa°/Aa°敲除小鼠(空心方框)的全血，在所述敲除小鼠中，在定向破壞MHC II型基因Aa1后缺乏MHC II型表達(dá)。溫育4小時(shí)之后通過ELISA(Biosource)測血漿中TNF-α的含量。結(jié)果如圖9所示。
很明顯，在能表達(dá)MHC II型分子的小鼠或細(xì)胞內(nèi)TNF-α分泌較多。例5說明以如下方法測定MHC II結(jié)合分子和MHCII模擬分子的體內(nèi)作用。方法對野生型C57B1/6小鼠進(jìn)行單獨(dú)稱量，并以在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中確定的LD50進(jìn)行注射。在注射LPS之前，對小鼠做如下預(yù)處理第1組可溶性MHC II型分子，劑量范圍為1μg-1mg/kg體重；第2組抗-MHC II型抗體，劑量與第1組的相同；以及第3組僅有鹽水(對照組)；作為對照的其它三組，分別用可溶性MHC II型、抗MHC II或鹽水進(jìn)行預(yù)處理，但此后不用LPS進(jìn)行刺激。
監(jiān)測7天的存活率。在開始48小時(shí)在正常條件下觀察、注意癥狀。在LPS誘導(dǎo)致死之前將一個(gè)亞組的小鼠殺死并放血，通過ELISA測定來自上述小鼠的血清中的TNF-α含量。
結(jié)果比較而言，用可溶性MHC II型分子或抗MHC II抗體處理的小鼠組的死亡率和TNF-α在血清中的含量明顯降低(結(jié)果未顯示)。用MHC II型分子或抗-MHC II抗體處理、但不用LPS刺激的對照組與用鹽水處理、但不用LPS刺激的小鼠之間無顯著差異。參考文獻(xiàn)1.Wright，S.D.，Ramos，R.A.，Tobias，P.S.，Ulevitch，R.J.& Mathison，J.C.，Science 249，1431-1433(1990)2.Couturier，C.，Jahns，G.，Kazatchkine，M.D.& HaeffnerCavaillon，N.，Eur.J.Immunol.22，1461-1466(1992)。3.Tsuchiya，M.，等，Int.J.Cancer 26，171-176(1980)4.Bone，R.，Chest 101，802-808(1991)5.Glauser，M.，Zanetti，G.，Baumgartner，J.& Cohen，J.，Lancet 33R，732-736(1991)6.Schumann，R.R.，等，Science 249，1429-1431(1990)7.Frey，E.A.，等，J.Exp.Med.176，1665-1671(1992)8.Haziot，A.，Rong，G.W.，Silver，J.& Goyert，S.M.，J.Immunol.151，1500-1507(1993)9.Haziot，a.，等，J.Immunol.141，547-552(1988)10.Tobias，P.S.& Ulevitch，R.J.，Immunobiology 187，227-232(1993).11.Marrack，P.& Kappler，J.，Science 248，705-711(1990)12.Steimle，V.，Otten，L.A.，Zufferey，M.& Mach，B.，Cell75，135-146(1993)13.Pugin，J.，等，Immunity 1，509(1994)14.Hailmann，E.，等，J.Exp.Med.179，269-277(1994)15.Gorga，J.C.等，J.Biol.Chem.262，16087-16094(1987)16.Kntgen等，International Immunology 5，957-964(1993)
權(quán)利要求
1.MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子，用于干擾用于帶有MHC-II的細(xì)胞的激化刺激物與細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子間的相互作用。
2.將MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子，用于干擾用于吞噬細(xì)胞的激活刺激物與細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子之間的相互作用。
3.MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子，用于干擾脂多糖(LPS)或與諸如CD14和LBP之類的其它分子組成復(fù)合體的LPS和細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子之間的相互作用。
4.MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子用于干擾來自革蘭氏陽性細(xì)菌的產(chǎn)物或由來自革蘭氏陽性細(xì)菌的產(chǎn)物與諸如CD14分子組成的復(fù)合體和細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子的相互作用。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子，其中所述MHC-II結(jié)合分子是一種抗-MHC-II抗體或其片段，或任何由這樣的抗體衍生的分子，如人源化的、雙特異性的或其它工程分子等。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子，其中所述MHC-II結(jié)合分子選自CD14、其片段、其修飾形式或具有MHC-II結(jié)合特性的肽。
7.如權(quán)利要求1，2，3或4的MHC-II結(jié)合分子和/或模擬分子，其中所述MHC-II模擬分子選自可溶性完整MHC-II、MHC-II的一個(gè)或幾個(gè)亞基、完整MHC-II或其亞基的片段、完整MHC-II或其亞基的修飾形式、具有MHC-II或其亞基的LPS或LPS/CD14/LBP復(fù)合體結(jié)合特性的肽。
8.如權(quán)利要求1、2、3、4或7的MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子，其中所述MHC-II模擬分子與一種載體連接。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子，用于預(yù)防和/或治療炎性疾?。粩⊙Y性休克；器官移植，如骨髓移植后的移植物抗宿主疾?。灰浦才懦夥磻?yīng)；因燒傷、意外傷害、胰腺感染所造成的人體上的一種或多種器官的炎癥反應(yīng)，如成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)等；在手術(shù)后出現(xiàn)于一種或幾種人體器官的炎癥反應(yīng)，如毛細(xì)管泄露綜合征；發(fā)生于人體的一種或幾種器官的過敏反應(yīng)；與自身免疫病相關(guān)的一種或幾種器官的炎癥反應(yīng)，如紅斑狼瘡(LE)及其亞型、硬皮病及其亞型、嗜伊紅性粒細(xì)胞筋膜炎、Sjogren綜合征、多肌炎、皮膚肌炎、結(jié)節(jié)性動脈外膜炎、Wegener’s肉芽腫病、顳動脈炎、風(fēng)濕性多肌痛等；與類風(fēng)濕病有關(guān)的一種或幾種器官的炎癥反應(yīng)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、少年慢性關(guān)節(jié)炎、Felty綜合征、Caplan綜合征、類風(fēng)濕性脊椎炎(Marie-Strumpell-Bechterew病)、牛皮癬、Reiter綜合征、Behcet綜合征；與至少部分是因自身免疫機(jī)制而引起的疾病有關(guān)的一種或幾種器官的炎癥反應(yīng)，如糖尿病、Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎、消化道潰瘍、腎炎，如腎小球性腎炎和腎炎，動脈硬化病、多發(fā)性硬化、老年性癡呆、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺機(jī)能低下等；與腫瘤病有關(guān)的人體一種或幾種器官的炎癥反應(yīng)，如白血病、血細(xì)胞腫瘤、癌、纖維瘤、肉瘤、和各種類型的組織細(xì)胞增多癥；以及病毒病，如AIDS。
10.MHC-II結(jié)合分子。
11.MHC-II模擬分子。
12.含有作為活性成分的MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子及一種合適的賦形劑的藥物組合物。
13.將MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子用于制備一種用來干擾帶有MHC-II的細(xì)胞的激活刺激物與細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子之間的相互作用的藥物組合物的用途。
14.將MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子用于制備一種用來干擾吞噬細(xì)胞的激活刺激物與細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子之間的相互作用的藥物組合物的用途。
15.將MHC-II結(jié)合分子和/或MHC-II模擬分子用于制備一種用來干擾脂多糖(LPS)或與諸如CD14和LBP的其它分子形成復(fù)合體的LPS和細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子之間的相互作用的藥物組合物的用途。
16.將MHC-II結(jié)合和/或MHC-II模擬分子用于制備一種用來干擾來自革蘭氏陽性細(xì)菌的產(chǎn)物或由來自革蘭氏陽性細(xì)菌的產(chǎn)物與諸如CD14的其它分子形成的復(fù)合體和細(xì)胞結(jié)合的MHC-II分子之間的相互作用的藥物組合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及MHC－II結(jié)合和/或MHCII模擬分子,可將其用于干擾用于帶有MHC－II的細(xì)胞,如吞噬細(xì)胞的激活刺激物與細(xì)胞結(jié)合的MHC－II分子之間的互作,脂多糖(LPS)或與其它諸如CD14和LBP的分子組成復(fù)合體的LPS與細(xì)胞結(jié)合的MHC－II分子之間的互作,來自革蘭氏陽性細(xì)菌的產(chǎn)物或來自革蘭氏陽性細(xì)菌的產(chǎn)物與諸如CD14的分子組成的復(fù)合體同細(xì)胞結(jié)合的MHC－II分子之間的相互作用。MHC－II結(jié)合分子可以是任何抗MHC－II抗體或其片段,或任何由上述抗體衍生的分子,如人源化分子、雙特異性分子或其它工程分子等。MHC－II結(jié)合分子可選自CD14、其片段、其修飾形式或具有MHC－II結(jié)合特性的肽。
文檔編號C07K14/705GK1171117SQ95196985
公開日1998年1月21日 申請日期1995年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月23日
發(fā)明者R·P·拉恩爾 申請人:實(shí)驗(yàn)室奧姆公司, 德意志奧姆藥物股份有限公司