專利名稱：ε－氨基的選擇性酰化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的?；?。更具體地講，本發(fā)明涉及在游離α-氨基的存在下，選擇性?；葝u素原、胰島素或胰島素類似物的ε-氨基的一步法。
氨基的?；堑鞍踪|(zhì)的化學(xué)修飾中最常用的方法之一。?；耐ㄓ梅椒ㄓ涊d于酶學(xué)方法，25494-499(1972)，該方法包括使用活性酯、酰鹵或酸酐。使用活性酯、特別是N-羥基琥珀酰亞胺的脂肪酸酯，是用脂肪酸?；坞x氨基酸的一個特別有效的方法。Lapidot等，類脂研究雜志(J.of Lipid Res.)8142-145(1967)。Lapidot等記載了N-羥基琥珀酰亞胺酯的制備及其在制備N-月桂酰-甘氨酸、N-月桂酰-L-絲氨酸、和N-月桂酰-L-谷氨酸中的用途。
對于選擇性?；葝u素氨基的早期研究記載于生物化學(xué)雜志，121737-745(1971)(Lindsay等)。Lindsay等記載了胰島素和乙酸N-琥珀酰亞胺基酯在低的試劑濃度及近中性的pH值下生產(chǎn)兩個單取代的產(chǎn)物PheR1-乙?；?胰島素和GlyA1-乙?；葝u素的反應(yīng)活性。在pH8.5，PheB1-乙酰基-胰島素的產(chǎn)量下降并且還有LysB29-乙?；?胰島素產(chǎn)生。因此，Lindsay等得出結(jié)論，在pH6.9，反應(yīng)活性的順序為甘氨酸(A1)≈苯丙氨酸(B1)》賴氨酸(B29)，而在pH8.5，甘氨酸(A1)＞苯丙氨酸≈賴氨酸(B29)。文獻出處同上。
Lindsay等在美國專利3869437中公開了用含有最多七個碳原子的?；；疊1氨基酸以及用含有最多四個碳原子的?；x擇性地保護A1和/或B29氨基。其中記載了N-羥基琥珀酰亞胺酯是特別有利的酰化劑。為了得到最高產(chǎn)率的B1氨基酰化的胰島素，?；瘎┑谋壤龖?yīng)相對較低(一至兩摩爾當(dāng)量以下的?；瘎?。另外，在pH等于7或接近大約7時可以得到單取代B1產(chǎn)物的最高產(chǎn)率。在pH8.5至9.0，所需的B1-?；膰?yán)物的產(chǎn)率大大降低而有利于在位置A1和B29發(fā)生進一步的取代。
在美國專利3868356(D.G.Smyth)和美國專利3868357(Smyth等)中公開了N-?；?、O-取代的胰島素衍生物，其中，A1、B1或B29氨基酸的氨基中至少有一個被轉(zhuǎn)變成了保護的氨基。酰化反應(yīng)用過量相對較少的?；瘎?例如每個氨基2至3摩爾?；瘎?在中性或弱堿性pH(例如7-8)下進行。該反應(yīng)在A1和B1-氨基上發(fā)生反應(yīng)，以非常高的產(chǎn)率生成二取代的衍生物。在過量?；瘎?例如最多10摩爾)的存在下，反應(yīng)進一步在B29氨基上進行，生成三取代的衍生物。
為了選擇性地酰化胰島素，Muranishi和Kiso在日本專利申請1-254699中公開了一種制備脂肪酸胰島素衍生物的五步合成法。第一步，制備活性脂肪酸酯；第二步，將胰島素的氨基用對甲氧基苯甲酰氧基碳酰疊氮化物(pMZ)保護；第三步，將胰島素-pMZ與脂肪酸酯反應(yīng)；第四步，將?；囊葝u素脫保護；第五步，將?；囊葝u素分離純化。很明顯，選擇性地?；粋€氨基基團只能通過用pMZ保護基團保護其它氨基來實現(xiàn)。使用這種方法，Muranishi和Kiso制備了如下化合物L(fēng)ysB29-棕櫚酰胰島素(ε-氨基被?；?、PheB1-棕櫚酰胰島素(B鏈上的N-末端α-氨基被酰化)和PheB1、LysB29-二棕櫚酰胰島素(ε-氨基和N-末端α-氨基均被?；?。
類似的，Hashimoto等在藥物研究6171-176(1989)中描述了一種制備N-棕櫚酰胰島素的四步合成法。該合成法包括用pMZ對N-末端A1-甘氨酸和B29-賴氨酸的ε-氨基進行保護和脫保護。在文獻所述的條件下制備了兩種主要的?；a(chǎn)物，B1棕櫚酰胰島素和B1、B29-二棕櫚酰胰島素。
因此，在本發(fā)明之前，胰島素B29-Nε-氨基的選擇性?；峭ㄟ^α-氨基保護并隨后脫保護來進行的。
本發(fā)明提供一種選擇性?；葝u素原、胰島素和胰島素類似物的ε-氨基一步合成法。非常令人驚奇的是，本發(fā)明可以在一步中高產(chǎn)率選擇性地酰化ε-氨基。因此，本發(fā)明無需對胰島素的其它氨基進行保護和脫保護。本發(fā)明提供制備ε-氨基酰化的胰島素衍生物的更有效且更廉價的方法。
本發(fā)明提供一種用脂肪酸選擇性地?；杏坞x的ε-氨基和游離的α-氨基的胰島素原、胰島素或胰島素類似物的方法，所述方法包括將ε-氨基與可溶性的活性脂肪酸酯在堿性條件下，在極性溶劑中反應(yīng)。
本文使用的所有氨基酸縮寫均為美國專利與商標(biāo)局所公認(rèn)的縮寫，參見37C.F.R.§1.822(B)(2)。
如上所述，本發(fā)明提供一種高度選擇性地?；葝u素原、胰島素或胰島素類似物的一步?；ā１景l(fā)明確定了在ε-氨基和α-氨基中優(yōu)先?；?氨基的條件。通常，單酰化α-氨基的產(chǎn)率不到5％。
本文使用的術(shù)語“胰島素”指人胰島素、豬胰島素或牛胰島素。胰島素含有三種游離的氨基B1-苯丙氨酸、A1-甘氨酸、和B29-賴氨酸。位于A1和B1的游離氨基是α-氨基。位于B29的游離氨基是ε-氨基。
本文使用的術(shù)語“胰島素原”是指如下結(jié)構(gòu)式的適當(dāng)交聯(lián)的蛋白質(zhì)B-C-A其中A是胰島素的A鏈或其官能化衍生物；B是胰島素的B鏈或其帶有ε氨基的官能化衍生物；并且C是胰島素原的連接肽。優(yōu)選的胰島素原為人胰島素的A鏈、人胰島素的B鏈，并且C是天然的連接肽。當(dāng)胰島素原是天然的序列時，胰島素原含有三種游離的氨基B1-苯丙氨酸(α-氨基)、C64-賴氨酸(ε-氨基)和B29-賴氨酸(ε-氨基)。
本文中使用的術(shù)語“胰島素類似物”指如下結(jié)構(gòu)式的適當(dāng)交聯(lián)的蛋白質(zhì)A-B其中A是胰島素A鏈的官能衍生物；并且B是帶有ε-氨基的胰島素B鏈的官能衍生物。
優(yōu)選的胰島素類似物包括如下胰島素，其中位置B28的氨基酸殘基是Asp、Lys、Leu、Val或Ala；位置B29的氨基酸殘基是Lys和Pro；位置B10的氨基酸殘基是His或Asp；位置B1的氨基酸殘基是Phe、Asp，或單獨缺失或與位置B2的殘基同時缺失；位置B30的氨基酸殘基是Thr、Ala、或缺失；并且位置B9的氨基酸殘基是Ser或Asp；條件是位置B28和B29之一是Lys。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)生化術(shù)語來表示，優(yōu)選的胰島素類似物為LysB28ProB29-人胰島素(B28是Lys；B29是Pro)；AspB28-人胰島素(B28是Asp)；AspB1-人胰島素、ArgB31，B32-人胰島素、AspB10-人胰島素、ArgA0-人胰島素、AspB1、GluB13-人胰島素、AlaB26-人胰島素、脫(B30)-人胰島素和GlyA21-人胰島素。
術(shù)語“?；敝敢胍粋€或多個與蛋白質(zhì)的游離氨基共價結(jié)合的?；?。
術(shù)語“選擇性?；敝冈讦?氨基和α-氨基中優(yōu)先酰化ε-氨基。通常，選擇性?；a(chǎn)生單?；?氨基的產(chǎn)物與單?；?氨基的產(chǎn)物的量的比例大于大約5。優(yōu)選該比例大于大約10，并最優(yōu)選大于大約50。
術(shù)語“脂肪酸”指飽和或不飽和的C6-C21脂肪酸。術(shù)語“活性脂肪酸酯”指用常規(guī)技術(shù)活化了的脂肪酸，所述常規(guī)技術(shù)記載于酶學(xué)方法，25，494-499(1972)和類脂研究雜志，8142-145(1967)(Lapidot等)。優(yōu)選飽和的脂肪酸，包括肉豆寇酸(C14)十五烷酸(C15)、棕櫚酸(C16)、十七烷酸(C17)和硬脂酸(C18)。最優(yōu)選的脂肪酸是棕櫚酸?；钚灾舅狨グㄈ缦略噭┑难苌?，例如羥基苯并三唑(hydroxybenzotriazide)(HOBT)、N-羥基琥珀酰亞胺及其衍生物。優(yōu)選的活性酯是棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯。
術(shù)語“可溶的”指在?；葝u素、胰島素類似物或胰島素原的液相中含有足夠量的酯。優(yōu)選對于每摩爾胰島素在液相中含有大約1至4摩爾當(dāng)量的活性酯。
在此使用的術(shù)語“堿性條件”指反應(yīng)液的堿性。反應(yīng)必須在所有的游離氨基均基本去質(zhì)子化的條件下進行。在含水溶劑或半水性溶劑混合物中，堿性條件指反應(yīng)在pH大于9.0的條件下進行。在非水性的有機溶劑中，反應(yīng)在有堿存在的條件下進行，該堿的堿性相當(dāng)于在水中大于或等于10.75的pKa值。
術(shù)語“交聯(lián)”指在半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。適當(dāng)交聯(lián)的胰島素原、胰島素或胰島素類似物含有三個二硫橋。第一個二硫橋是在A鏈的位置6和位置11的半胱氨酸殘基之間形成。第二個二硫橋連接A鏈的位置7的半胱氨酸殘基和B鏈的位置7的半胱氨酸。第三個二硫橋連接A鏈的位置20的半胱氨酸和B鏈的位置19的半胱氨酸。
在本發(fā)明之前，本領(lǐng)域技術(shù)人員是通過使用保護基以多步合成法選擇性地?；?氨基。Muranshi和Kiso在日本專利申請1-254699中公開了一種制備?；囊葝u素衍生物的五步合成法。類似的，Hashimoto等在藥物研究，6171-176(1989)中描述了一種制備N-棕櫚酰胰島素的四步合成法。為了選擇性地?；葝u素，兩篇文獻均描述了pMZ保護基的使用。
本發(fā)明以高產(chǎn)率的一步合成法生成Nε-?；葝u素原、胰島素或胰島素類似物。該反應(yīng)可以在不使用氨基保護基的條件下制備Nε-?；牡鞍踪|(zhì)。通過將活性脂肪酸酯與蛋白質(zhì)的ε-氨基在堿性條件下的極性溶劑中反應(yīng)進行?；Ｔ谌鯄A性條件下，所有的游離氨基均未去質(zhì)子化，從而導(dǎo)致N-末端氨基大部分被?；?。在含水溶劑或半水溶劑混合物中，堿性條件指反應(yīng)在pH大于9.0的條件下進行。由于在pH大于12.0的條件下會引起蛋白質(zhì)的降解，所以反應(yīng)混合物的pH優(yōu)選為pH9.5至11.5，并最優(yōu)選10.5?；旌系挠袡C和含水溶劑中反應(yīng)混合物的pH測量值為混合前水相的pH。
表1的數(shù)據(jù)表明反應(yīng)液的堿性對反應(yīng)選擇性的影響。表1中的數(shù)據(jù)通過用兩摩爾當(dāng)量的棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯在50％的CH3CN/水中?；艘葝u素得到。
表1pH對胰島素?；挠绊?
表1證實ε-氨基的酰化依賴于反應(yīng)液的堿性。在大于9.0的pH下，反應(yīng)選擇性地?；疊29-賴氨酸的ε-氨基。
在非水溶劑中，反應(yīng)在有堿存在的條件下進行，該堿的堿性相當(dāng)于在水中大于或等于10.75的pKa值，以便將ε-氨基充分去質(zhì)子化。即，該堿的堿性必須至少與三乙胺同樣強。優(yōu)選的堿是四甲基胍(TMG)、二異丙基乙基胺、或四丁基氫氧化銨。
對極性溶劑的選擇主要取決于胰島素原、胰島素、或胰島素類似物以及脂肪酸酯的溶解度。最重要的是，該溶劑可以完全是有機溶劑。通常可接受的有機溶劑包括DMSO、DMF等。也可以使用含水溶劑以及含水溶劑和有機溶劑的混合物。對極性溶劑的選擇僅受反應(yīng)物溶解度的限制。優(yōu)選的溶劑和溶劑系統(tǒng)是DMSO；DMF；乙腈和水；丙酮和水；乙醇和水；異丙醇和水；異丙醇、乙醇和水；和乙醇、丙醇和水。優(yōu)選的溶劑是乙腈和水；并最優(yōu)選50％的乙腈。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，其它的極性溶劑也可以使用對反應(yīng)物的比例沒有嚴(yán)格的限制。一般地，優(yōu)選活性脂肪酸酯為摩爾過量。反應(yīng)優(yōu)選用1至4摩爾當(dāng)量、最優(yōu)選1至2摩爾當(dāng)量的酯來進行。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在非常高的活性酯濃度下，將產(chǎn)生相當(dāng)量的二或三酰化的產(chǎn)物。
對反應(yīng)的溫度沒有嚴(yán)格的限制。反應(yīng)在0至40攝氏度之間進行并通常在15分鐘到24小時內(nèi)完成。
?；螅K止反應(yīng)，將產(chǎn)物通過常規(guī)方法如反相或疏水色譜進行純化。然后通過常規(guī)方法如冷凍干燥或結(jié)晶得到產(chǎn)品。
胰島素原、胰島素和胰島素類似物可以通過各種已知的肽合成方法中的任何方法進行制備，所述方法包括經(jīng)典(溶液)方法、固相法、半合成法、以及最近出現(xiàn)的重組DNA法。例如，Chance等在美國專利申請?zhí)?7/388201和EPO公開號383472；Brange等在EPO 214826；以及Belagaje等在美國專利5304473中公開了各種胰島素原和胰島素類似物的制備，在此將這些文獻引入本文作為參考。本發(fā)明的胰島素類似物的A和B鏈還可以通過類胰島素原的前體分子用重組DNA技術(shù)制備。參見Frank等，肽合成-結(jié)構(gòu)-功能，(Proc.Seventh Am.Pept.Symp.)，D.Rich和E.Gross編(1981)，在此將其引入本文作為參考。
提供以下實施例僅僅是為了進一步說明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不僅限于如下實施例的內(nèi)容。
實施例1用棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯在DMSO中?；葝u素將生物合成的人胰島素(BHI)結(jié)晶(71.9mg)溶于6.58mLDMSO。將溶液在室溫下攪拌至晶體全部溶解(肉眼觀察)。將20mg活性酯固體加入2mL DMSO中并劇烈攪拌至所有的活性酯顆粒全部溶解(肉眼觀察)，制得活性酯(棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯)的溶液。此時，將1，1，3，3-四甲基胍(26.8μl)加入5mL BHI溶液中，隨后加入DMSO(94.4mL)和預(yù)先制備的活性酯溶液(400μl)。反應(yīng)在室溫下(20至25℃)進行大約60分鐘。15分鐘后取樣，用1N乙酸稀釋20倍并用HPLC進行分析。用終止樣品中的B29-Nε-棕櫚酰人胰島素的量除以最初的BHI的量，計算出反應(yīng)產(chǎn)率為67.1％。
實施例2用棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯在乙腈和水中?；葝u素將生物合成的人胰島素(BHI)結(jié)晶(199.5g)溶于20L 50mM pH2.5的硼酸溶液。用10％的HCl將溶液的pH調(diào)至2.5，并將溶液攪拌至晶體全部溶解(肉眼觀察)。對起始原料取樣，在276nm測得吸收值為10.55。將24g活性酯(棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯)固體加入到2.4L預(yù)先加熱至約50℃的乙腈中并劇烈攪拌至所有的活性酯顆粒全部溶解(肉眼觀察)，制得所述活性酯的溶液。此時，加入10％NaOH將BHI溶液的pH調(diào)至約10.22。向調(diào)節(jié)了pH的BHI溶液中加入乙腈(18L)。反應(yīng)在室溫下(20至25℃)進行110分鐘，然后加水(123L)終止反應(yīng)，用10％的HCl和10％NaOH將得到的稀釋液的pH調(diào)至2.01。用終止反應(yīng)液中的B29-Nε-棕櫚酰人胰島素的量除以最初的BHI的量，計算出反應(yīng)產(chǎn)率為73％。
實施例3用棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯在乙腈和水中?；疞ysB28ProB29-人胰島素將LysB28ProB29-人胰島素結(jié)晶(2.22g)溶于100mL pH2.5的50mM硼酸溶液。用10％HCl將溶液的pH調(diào)至2.5，并將溶液攪拌至晶體全部溶解(肉眼觀察)。將270mg活性酯(棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯)固體加入到27mL預(yù)先加熱至約50℃的乙腈中，劇烈攪拌至所有的活性酯顆粒全部溶解(肉眼觀察)，制得所述活性酯的溶液。加入10％NaOH將溶液的pH調(diào)至約10.22，并將該溶液在4℃下攪拌15分鐘。向調(diào)節(jié)了pH的溶液中加入乙腈(73mL)，隨后加入預(yù)先制備的活性酯溶液。反應(yīng)在4℃下進行85分鐘，然后加入1N乙酸(600mL)終止反應(yīng)，得到的pH為2.85。用終止反應(yīng)液中的B29-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素的量除以最初的LysB28ProB29-人胰島素的量，計算出反應(yīng)產(chǎn)率為72.5％。
實施例4用棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯在乙腈和水中?；疊HI將生物合成的人胰島素(BHI)結(jié)晶(3g)溶于300mL pH2.5的50mM硼酸溶液。按照需要將溶液的pH用10％的HCl調(diào)至2.5并將溶液攪拌至晶體全部溶解(肉眼觀察)。將400mg活性酯(棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯)固體加入到40mL乙腈中并劇烈攪拌，制得所述活性酯的溶液。此時，加入10％NaOH將BHI結(jié)晶的溶液的pH調(diào)至大約10.2。然后向BHI溶液中加入乙腈(240mL)，隨后加入預(yù)先制備的活性酯溶液。反應(yīng)在室溫下(20至25℃)進行約90分鐘，然后加水(1800mL)終止反應(yīng)并用10％ HCl將得到的稀釋液的pH調(diào)至約2.5。用反應(yīng)液中的B29-Nε-棕櫚酰人胰島素的量除以最初的BHI的量，計算出反應(yīng)產(chǎn)率為75.7％。
實施例5用棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯在乙腈和水中酰化胰島素原將人胰島素原(HPI)水溶液(28.2mg/mL)用50mM的硼酸稀釋至終體積為100mL，濃度為16.2mg/mL HPI。迅速攪拌下將150mg棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯溶于15mL乙腈(ACN)，制得活性酯的溶液，然后用10％NaOH將HPI溶液的pH調(diào)至10.2，隨后加入88mL ACN。加入12mL活性酯溶液(比HPI過量2倍摩爾量)引發(fā)反應(yīng)。最終的反應(yīng)體積為200mL，濃度為8mg HPI/mL 50％ACN水溶液。將反應(yīng)在室溫(20至25℃)下進行約60分鐘，然后加入相同體積(200mL)的pH10.0的50mM甘氨酸終止反應(yīng)。
對于ε-氨基?；a(chǎn)物和α-氨基酰化產(chǎn)物的確切比例未進行計算，對于任何給定的時間點，色譜中所有ε-氨基?；a(chǎn)物的總和相當(dāng)于總面積的87-90％，而所有相關(guān)物質(zhì)(可能包括任何α-氨基?；漠a(chǎn)物)的總和相當(dāng)于總面積的不到7％。
實施例6用己酰N-羥基琥珀酰亞胺酯?；疉rgB31，ArgB32人胰島素將ArgB31，ArgB32人胰島素(1.3mg)溶于200μL pH10.4的200mM(3-〔環(huán)己氨基〕-1-丙磺酸)緩沖液中。將己酰N-羥基琥珀酰亞胺酯(0.3μ摩爾)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，然后在攪拌下加入上述溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫(20至25℃)下攪拌約四小時，然后用0.1N的HCl將pH調(diào)至大約2.5終止反應(yīng)。在HPLC分析前將混合物通過0.45微米的濾紙以濾除凝膠狀顆粒。在C4反相分析HPLC柱上將標(biāo)題產(chǎn)物與起始原料分離。用終止反應(yīng)液中B29-Nε-己酰-ArgB31，ArgB32-人胰島素的量除以最初的ArgB31，ArgB32-人胰島素的量，計算出反應(yīng)產(chǎn)率為69.4％。
實施例7用棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯在DMSO中?；疞euB26人胰島素將LeuB26人胰島素(1.0mg)溶于1mL含有95％二甲基亞砜(DMSO)和5％三乙胺(TEA)的混合物中。將棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯(0.7微摩爾)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，然后在攪拌下加入上述溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下(20至25℃)攪拌約90分鐘，然后用0.1N的HCl將樣品稀釋至0.2mg/ml以終止反應(yīng)。在HPLC分析前將混合物用0.45微米的濾紙過濾，以濾除凝膠狀顆粒。在C4反相分析HPLC柱上將標(biāo)題產(chǎn)物與起始原料分離。用終止反應(yīng)液中Nε-棕櫚酰-LeuB26-人胰島素的量除以最初的LeuB26人胰島素的量，計算出反應(yīng)產(chǎn)率為36.4％。
實施例8用棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯在二甲基亞砜(DMSO)中?；艘葝u素將生物合成人胰島素結(jié)晶(1g，0.17mmol)在室溫下完全溶于20mLDMSO制得胰島素溶液。同時，將棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯(0.0817g，0.23mmol)在50℃下溶于3mLDMSO，制得活性酯的溶液。劇烈攪拌下，向胰島素溶液中首先加入1，1，3，3 -四甲基胍(0.432mL，3.4mmol)，然后加入全部的活性酯溶液。30分鐘后，用120mL預(yù)先冷卻至0℃的0.05M HCl終止反應(yīng)?；旌衔锏膒H約為1.8。用反相HPLC分析終止混合物，結(jié)果表明B29-Nε-棕櫚酰胰島素占洗脫蛋白總量的72.2％，并占全部單?；葝u素的95％。
將全部反應(yīng)混合物上到Vydac C4制備反相柱(5×25cm)(預(yù)先用含有0.1％三氟乙酸、20％乙腈水溶液的溶劑混合物平衡)上。上樣后，將柱子首先用500ml同樣的溶劑沖洗，然后以4mL/分鐘的流速用由0.1％三氟乙酸、乙腈和水組成的溶劑系統(tǒng)展開，其中乙腈的濃度在9升內(nèi)從20％增加至80％。B29-Nε-棕櫚酰胰島素在含有約53％乙腈的溶劑系統(tǒng)時洗脫。冷凍干燥除去溶劑后得到414mg(0.0684mmol)Nε-棕櫚酰胰島素，以起始原料計，產(chǎn)率為40.2％。
實施例9用1-辛酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯?；疞ysB28ProB29人胰島素將LysB28，ProB29人胰島素(KPB)結(jié)晶(2.0g)溶于200mL pH2.5的50mM硼酸溶液緩沖液中。用10％HCl將溶液的pH調(diào)至2.5，然后將溶液攪拌至晶體全部溶解(肉眼觀察)。將175mg活性酯(1-辛酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)固體加入25.62mL乙腈中并劇烈攪拌至活性酯顆粒全部溶解(肉眼觀察)，制得活性酯溶液。加入10％NaOH將KPB溶液的pH調(diào)至約10.4，然后將溶液在室溫下攪拌約5分鐘。向調(diào)節(jié)了pH的KPB溶液中加入乙腈(176mL)，隨后加入預(yù)先制備的活性酯溶液。反應(yīng)在室溫下進行90分鐘，然后加入5.5mL 10％HCl(2.75％v/v)和三倍體積的冷水終止反應(yīng)，得到的最終pH為2.70。用終止反應(yīng)液中LysB29(C8)KPB的量除以最初的BHI的量，計算出反應(yīng)產(chǎn)率為75.5％。將溶液分成兩個800ml的等份并通過疏水色譜(SP20SS)進行純化。柱色譜后進行超濾和冷干。
表2中的數(shù)據(jù)證實了胰島素、胰島素類似物和胰島素原的選擇性?；嶒炗肗-羥基琥珀酰亞胺的脂肪酸酯在室溫下進行。在下表中，TMG和TEA分別代表四甲基胍和三乙胺。ND表示沒有數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.用脂肪酸選擇性地酰化帶有游離ε-氨基和游離α-氨基的胰島素原、胰島素或胰島素類似物的方法，包括將ε-氨基與可溶性的活性脂肪酸酯于堿性條件下在極性溶劑中反應(yīng)。
2.權(quán)利要求2的方法，其中的蛋白質(zhì)是人胰島素、胰島素類似物、或LysB28ProB29-人胰島素。
3.權(quán)利要求1的方法，其中的活性脂肪酸酯是C6至C18脂肪酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的活性脂肪酸是C14至C18脂肪酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯。
5.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)項的方法，其中的活性脂肪酸是棕櫚酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯。
6.用脂肪酸選擇性地?；瘞в杏坞xε-氨基和游離α-氨基的胰島素原、胰島素或胰島素類似物的方法，包括將ε-氨基與可溶性的活性脂肪酸酯在半水性溶劑中，在pH為大約9.0至12.0的條件下反應(yīng)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的蛋白質(zhì)是人胰島素、胰島素類似物、或LysB28ProB29-人胰島素。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的pH為大約9.5至大約10.5。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的半水性溶劑是乙腈和水。
10.權(quán)利要求9的方法，其中的溶劑是50％的乙腈。
11.權(quán)利要求10的方法，其中的脂肪酸酯是棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯、辛酸N-琥珀酰亞胺基酯、或肉豆蔻酸N-琥珀酰亞胺基酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的酰化。更具體地講,本發(fā)明涉及在游離α－氨基的存在下,一步法選擇性地?；葝u素、胰島素類似物或胰島素原的游離ε－氨基。
文檔編號C07K1/13GK1171742SQ95197224
公開日1998年1月28日 申請日期1995年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月17日
發(fā)明者J·C·貝克, V·J·陳, J·M·漢奎爾, A·V·克里奧修納斯, B·A·莫薩, R·T·舒曼 申請人:伊萊利利公司