專利名稱：Ob融合蛋白組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Fc-OB融合蛋白組合物及其制備和應(yīng)用的方法。
背景盡管肥胖的分子基礎(chǔ)大部分都未知，但“OB基因”及其編碼蛋白(“OB蛋白”或“l(fā)eptin”)的鑒定給機(jī)體調(diào)節(jié)脂肪沉積的機(jī)制帶來一線光明。見，PCT公開，WO96/05309(12/22/96)，F(xiàn)riedman等Zhang等，自然372425-432(1994)；也見修訂自然374479(1995)。同在正常野生型小鼠體內(nèi)一樣，OB蛋白在ob/ob突變小鼠(由于OB基因產(chǎn)物缺乏而肥胖的小鼠)也活化。該生物活性表現(xiàn)為體重減輕。綜合見，Barrinaga，“肥胖”蛋白使小鼠苗條，科學(xué)269475-456(1995)OB蛋白及衍生物因此作為動(dòng)物(包括哺乳類和人)控制體重和肥胖的調(diào)節(jié)分子，其詳細(xì)情況公布于PCT出版物WO96/05309(12/22/96)，在此收入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)及圖。
OB蛋白的其它生物學(xué)作用未被很好描述。據(jù)知，例在ob/ob突變小鼠中，施用OB蛋白導(dǎo)致血清胰島素水平及血清葡萄糖水平的降低。施用OB蛋白亦能造成軀體脂肪的減少。此現(xiàn)象在ob/ob突變小鼠及非肥胖正常小鼠中都被觀察到。Pelleymounter等.，科學(xué)269540-543(1995)；Halaas等.，科學(xué)269543-546(1995)。也見，Campfield等.，科學(xué)269546-549(1995)(外周及中心施用微克劑量的OB蛋白在ob/ob和飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠而非db/db肥胖小鼠中導(dǎo)致食物攝入減少和體重減輕。)以上報(bào)告中均未觀察到毒性，即使為最高劑量也是如此。
盡管OB蛋白被允諾進(jìn)行臨床應(yīng)用，其在體內(nèi)活化的方式并未被清楚地闡明。OB受體的消息顯示其被測出在大鼠下丘腦中與OB蛋白高親和結(jié)合力，這暗示了OB受體的定位。Stephens等.，自然377530-532。db/db鼠表現(xiàn)與ob/ob鼠相同的表型，即，極端肥胖和II型糖尿?。淮吮硇捅徽J(rèn)為是由于OB受體的缺乏引起，尤其因?yàn)閐b/db小鼠不能對(duì)OB蛋白施用產(chǎn)生反應(yīng)。見Stephens等.，上述。
隨著重組DNA技術(shù)的進(jìn)步，治療用的重組蛋白的有效性造成蛋白設(shè)計(jì)和化學(xué)修飾的進(jìn)步。上述修飾的一個(gè)目標(biāo)是蛋白保護(hù)和減少降解。融合蛋白和化學(xué)附著物能有效阻斷蛋白水解酶與蛋白主鏈的物理接觸，從而阻止降解。在某些情況下，附加優(yōu)點(diǎn)包括增加治療蛋白的穩(wěn)定性，循環(huán)時(shí)間及生物活性。綜述文章Francis，生長因子評(píng)論34-10(1992.5)(Mediscript，Mountview Court，F(xiàn)riern Barnet Lane出版，倫敦N20，OLD，UK)描述了蛋白修飾及融合蛋白。
上述的一種修飾方法是應(yīng)用免疫球蛋白的Fc區(qū)段。抗體包含兩個(gè)功能獨(dú)立的部分，一個(gè)稱為“Fab”的可變區(qū)，與抗原結(jié)合，一個(gè)稱為“Fc”的恒定區(qū)，提供對(duì)效應(yīng)子功能的連接如補(bǔ)體或吞噬細(xì)胞。免疫球蛋白的Fc部分具有長原生質(zhì)半衰期而Fab為短壽的。Capon等，自然337525-531(1989)。
治療用蛋白產(chǎn)品應(yīng)用Fc區(qū)域進(jìn)行構(gòu)建以提供較長半衰期或加入功能如Fc受體結(jié)合，蛋白A結(jié)合，補(bǔ)體固定和胎盤轉(zhuǎn)移，等這些功能位于免疫球蛋白的Fc蛋白中。例，將IgG1抗體的Fc區(qū)段與CD30-L的N-末端相融合。CD30-L是一種與在何杰金氏病腫瘤細(xì)胞，退行性淋巴細(xì)胞，T細(xì)胞白血病細(xì)胞和其它惡性細(xì)胞類型中表達(dá)的CD30受體結(jié)合的分子。見，美國專利，No.5,480,981。IL-10，一種抗炎癥及抗排斥劑與鼠的Fcγ2a融合，以延長細(xì)胞因子的短循環(huán)半衰期。Zheng，X.等，免疫學(xué)雜志，1545590-5600(1995)許多研究也評(píng)估了應(yīng)用腫瘤壞死因子受體與人IgG1的Fc蛋白相聯(lián)以治療敗血休克的病人。Fisher，C.等.，N.Eng1.醫(yī)學(xué)雜志.3341697-1702(1996)；Van Zee.K.等.，免疫學(xué)雜志，1562221-2230(1996)。Fc也被用于與CD4受體融合以產(chǎn)生治療AIDS的治療蛋白。見Capon等，自然，337525-531(1989)。此外，白細(xì)胞介素2的N-末端與IgG1或IgG3的Fc部分相融合，以克服白細(xì)胞介素2的短半衰期和其全身毒性。見，Harvill等.，免疫技術(shù)，195-105(1995)。
由于OB蛋白被鑒定為有前途的蛋白藥物，因此需要發(fā)展OB類似物組合物在臨床應(yīng)用上結(jié)合或替代OB蛋白的施用。這些進(jìn)步將包括OB類似物組合物，其中通過蛋白構(gòu)成和化學(xué)修飾成功降低蛋白的降解，提高其穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間。本發(fā)明提供上述組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及OB融合蛋白組合物，該組合物的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明尤其涉及一種遺傳性融合蛋白，該蛋白包括與OB蛋白或類似物的N端部分融合的免疫球蛋白的Fc區(qū)域或類似物。Fc-OB融合蛋白可通過Fc區(qū)域的半胱氨酸殘基二聚化。但與預(yù)期不同的是，對(duì)OB蛋白的N端用Fc進(jìn)行遺傳融合修飾表現(xiàn)出穩(wěn)定性，清除速率和減少降解的優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)在OB蛋白或以Fc與OB蛋白C末端融合中不可見。令人驚奇的也十分重要的是，與OB蛋白或?qū)B蛋白C末端的Fc修飾相比較，N-末端的修飾提供了預(yù)料之外的保護(hù)蛋白不降解的作用，增加了循環(huán)時(shí)間及穩(wěn)定性。這些對(duì)OB蛋白進(jìn)行Fc修飾帶來的預(yù)料之外的優(yōu)點(diǎn)給OB蛋白的使用者帶來了好處，因?yàn)檫@些變化可降低用藥劑量和用藥頻率。因此，在以下細(xì)節(jié)詳述中，本發(fā)明有許多方面涉及通過將Fc區(qū)域與OB蛋白(或其類似物)融合對(duì)蛋白進(jìn)行的遺傳修飾以及特異性修飾，其制備及方法。
因此，一方面本發(fā)明提供Fc-OB融合蛋白其中Fc基因融合于OB蛋白(及其類似物)的N-末端。而且，F(xiàn)c部分可通過本領(lǐng)域熟知的肽或化學(xué)連接物連于OB蛋白(或其類似物)的N-末端。如上所述且將在以下更多細(xì)節(jié)中描述的與OB蛋白及C端OB-Fc融合蛋白相比，F(xiàn)c-OB融合蛋白具有預(yù)料之外的保護(hù)不被降解作用及延長的循環(huán)時(shí)間和增加的穩(wěn)定性。本發(fā)明的其它方面，不僅包括Fc-OB融合蛋白組合物，還包括編碼這些蛋白的DNA序列，相關(guān)載體以及包含這些載體的宿主細(xì)胞，載體和宿主細(xì)胞對(duì)于生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白十分有用。
其二，本發(fā)明提供了制備Fc-OB融合蛋白的方法，該方法包括制備重組蛋白的重組DNA技術(shù)。此外，該方面還包括發(fā)酵和純化的方法。
另一方面，本發(fā)明提供在人或動(dòng)物中處理超重的方法，包括通過施用Fc-OB融合蛋白調(diào)節(jié)脂肪沉積。由于Fc-OB融合蛋白的特征，方法著重于通過應(yīng)用Fc-OB減重劑而減少OB蛋白的用藥量和用藥次數(shù)。
另一方面，本發(fā)明為治療過度肥胖引起的共發(fā)病，如糖尿病，血脂異?；蚋哐Y，動(dòng)脈硬化，動(dòng)脈噬斑，減輕或預(yù)防膽結(jié)石形成、中風(fēng)，以及增加胰島素敏感度，增加瘦肉組織重量。
另一方面，本發(fā)明還提供Fc-OB蛋白，類似物及其衍生物的相關(guān)藥用組合物，用于以上療法中。
附圖的主要描述

圖1重組鼠metOB(雙鏈)DNA(SEQ.ID.NOs.1和2)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.3)。
圖2重組人metOB類似物(雙鏈)DNA(SEQ.ID.NOs.4和5)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.6)。
圖3(A-C)重組人metFc-OB(雙鏈)DNA(SEQ.ID.NOs.7和8)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.9)。
圖4(A-C)重組人metFc-OB變異的(雙鏈)DNA(SEQ.ID.NOs.10和11)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.13)。
圖5(A-C)重組人metFc-OB變異的(雙鏈)DNA(SEQ.ID.NOs.13和14)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.15)。
圖6(A-C)重組人metFc-OB變異的(雙鏈)DNA(SEQ.ID.NOs.16和17)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.18)。
詳細(xì)說明本發(fā)明涉及Fc-OB融合蛋白組合物，該組合物的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明尤其涉及免疫球蛋白的Fc區(qū)遺傳地或化學(xué)方法融合到OB蛋白的N-末端。預(yù)料之外的，與OB蛋白或Fc融合在OB蛋白C末端相比，F(xiàn)c融合至OB蛋白N-末端顯示出其優(yōu)勢。N-末端修飾的Fc-OB蛋白令人驚訝地提供了預(yù)期之外的保護(hù)蛋白不降解的作用，延長循環(huán)時(shí)間以及增加穩(wěn)定性。因此，F(xiàn)c-OB融合蛋白和其類似物及衍生物的相關(guān)制備及應(yīng)用方法在以下詳述中都有描述。
組合物起始于SEQ.ID.NO.9(見圖3)的重組人Fc-OB序列的Fc序列可從人免疫球蛋白IgG-1重鏈中選擇，見Ellison，J.W.等.，核酸研究.104071-4079(82)，或本領(lǐng)域任何已知Fc序列(例其它IgG類，包括但不局限于IgG-2，IgG-3和IgG-4，或其它免疫球蛋白)中選擇。Fc部分的變異物，類似物或衍生物可通過如進(jìn)行不同的殘基或序列替代來構(gòu)建。
半胱氨酸殘基可被刪除或由其它氨基酸取代以防止Fc序列的二硫化物交聯(lián)的形成。位于SEQ.ID.NO.9的位置5的特殊氨基酸為半胱氨酸殘基。SEQ.ID.NO.9的重組Fc-OB序列為378氨基酸的Fc-OB蛋白(甲硫氨酸殘基不計(jì))。圖3的重組Fc-OB蛋白之首個(gè)氨基酸序列所示為在-1位置以甲硫氨酸為+1。
可在位置5移去半胱氨酸殘基或用一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。丙氨酸可在位置6取代半胱氨酸形成圖4(SEQ.ID.NO.12)的變異的氨基酸序列。圖4的重組Fc-OB蛋白是一種378個(gè)氨基酸的Fc-OB蛋白(未包括甲硫氨酸殘基。圖4的重組Fc-OB蛋白的第一個(gè)氨基酸序列，在-1位的甲硫氨酸指定為+1。
同樣地，位于SEQ.ID.NO.9位置5的半胱氨酸可被絲氨酸或其它氨基酸殘基取代或去除。在SEQ.ID.NO.15的位置1，2，3，4和5去除氨基酸也可制備變異物或類似物。在這些位置也可取代屬于本發(fā)明的范圍之中。圖5的重組Fc-OB蛋白為373氨基酸的Fc-OB蛋白(甲硫氨酸殘基不計(jì))圖5中重組Fc-OB蛋白的第一個(gè)氨基酸序列從在-1位置的甲硫氨酸為+1。
也可引入4個(gè)氨基酸的取代進(jìn)行修飾以去除Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和補(bǔ)體(Clq)結(jié)合位點(diǎn)。在SEQ.ID.NO.15進(jìn)行的不同修飾方法包括在位置15用谷氨酸取代亮氨酸，在位置98用丙氨酸取代谷氨酸、在位置100和102用丙氨酸取代賴氨酸。(見圖6和SEQ.ID.NO.18)。圖6中重組Fc-OB蛋白為373氨基酸的Fc-OB蛋白(不計(jì)甲硫氨酸殘基)。圖6所示的重組Fc-OB蛋白的第一個(gè)氨基酸序列從-1位的甲硫氨酸為+1。
同樣地，一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基可被苯丙氨酸替代。而且也可考慮其它不同的氨基酸插入，刪除和(或)取代，這些方法均屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。進(jìn)一步的，選擇方法也可以以改變的氨基酸的形式，如肽模擬物或D-氨基酸。Fc蛋白也可通過不同長度的化學(xué)的或氨基酸的連接子部分與Fc-OB蛋白的OB蛋白相聯(lián)。這些化學(xué)連接子在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。氨基酸連接子序列包括但不僅限于(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly，gly；(f)gly，gly，gly，gly，gly；(g)gly，gly，gly，gly，gly，gly，gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly，gly，pro，gly，gly；和(j)(a)～(i)的任意組合。
Fc-OB融合蛋白中的OB部分可從重組鼠中選擇SEQ.ID.NO.3(見圖3)中闡明，或來自重組人蛋白中，如Zhang等.，自然，上述，在此引入僅作參考，或來自那些在28位缺失谷氨酰胺殘基的蛋白。(見Zhang等，自然，上述428頁。)也可應(yīng)用如SEQ.ID.NO.6(見圖2)所述重組人OB蛋白類似物，它包括(1)在35位點(diǎn)精氨酸取代賴氨酸；和(2)74位點(diǎn)亮氨酸取代異亮氨酸。(此類似物簡短縮寫為重組人R-＞L35，I-＞L74)。重組人和重組鼠的蛋白或類似物在OB蛋白N-末端有或無融合Fc部分的氨基酸序列在以下闡明，-1位為甲硫氨酸殘基。但在任何現(xiàn)有OB蛋白類似物中，甲硫氨酸殘基可能缺失。
鼠蛋白基本上與人蛋白同源，尤其是成熟蛋白更是如此，更進(jìn)一步尤其在N-末端同源性高。在重組的人的蛋白序列中，通過改變與鼠序列不同的氨基酸(如取代氨基酸殘基，可制備重組人蛋白的類似物。因?yàn)橹亟M人蛋白在小鼠中具有生物活性，此種類似物在人中也很可能有活性。例根據(jù)SEQ.ID.NO.6的數(shù)字順序，使用在35位殘基為賴氨酸，74位殘基為異亮氨酸的人蛋白，其中第一位氨基酸為纈氨酸，146氨基酸為半胱氨酸，在位置32，35，50，64，68，71，74，77，89，97，100，105，106，107，108，111，118，136，138，142和145可用其它一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代?？蛇x擇小鼠蛋白(SEQ.ID.NO.3)相應(yīng)位置的氨基酸或其它氨基酸。
可根據(jù)大鼠OB蛋白序列，可進(jìn)一步制備“共有序列”分子。Murakami等，生物化學(xué)生物生理學(xué)研究通訊。209944-952(1995)在此引僅作參考。大鼠OB蛋白與人OB蛋白在以下位點(diǎn)不同(使用SEQ.ID.NO.6的編號(hào))4，32，33，35，50，68，71，74，77，78，89，97，100，101，102，105，106，107，108，111，118，136，138和145。在這些不同位點(diǎn)，可用另一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。下劃線的位點(diǎn)為小鼠和大鼠OB蛋白均與人OB蛋白差異的部位，因此，尤其適合改變。可根據(jù)大鼠OB蛋白在一個(gè)和多個(gè)位點(diǎn)以氨基酸取代或應(yīng)用其它氨基酸。
在大鼠和小鼠OB蛋白中與成熟人OB蛋白均有差異的位點(diǎn)為4，32，33，35，50，64，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111，118，136，138，142和145。根據(jù)SEQ.ID.NO.6 OB的蛋白可在以上一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)由另一個(gè)氨基酸取代，如在相應(yīng)大鼠或小鼠序列中找到的氨基酸取代仍具有活性。
此外，在獼猴OB蛋白氨基酸中發(fā)現(xiàn)與成熟人OB蛋白有差異的為(用圓括號(hào)中單字母氨基酸縮寫形式區(qū)別)8(S)，35(R)，48(V)，53(Q)，60(I)，66(I)，67(N)，68(L)，89(L)，100(L)，108(E)，112(D)，和118(L)。因?yàn)橹亟M人OB蛋白在Cynomolgus猴中具有活性，根據(jù)SEQ.ID.NO.6的人OB蛋白(35位賴氨酸和74位異亮氨酸)，有一個(gè)或多個(gè)獼猴偏離氨基酸被其它氨基酸取代，如圓括號(hào)中的氨基酸，也可有效。應(yīng)該提到的是，一些獼猴中的偏離氨基酸也可在以上小鼠種中找到(位35，68，89，100和112)。因此，可制備鼠/獼猴/人共有的分子(使用SEQ.ID.NO.6的號(hào)碼，35位為賴氨酸，74位為異亮氨酸。)，在一到多個(gè)如下位點(diǎn)可被其它氨基酸取代，這些位點(diǎn)為4，8，32，33，35，48，50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111，112，118，136，138，142和145。
其它類似物可通過刪除一部分蛋白氨基酸序列制備。例如，缺少引導(dǎo)序列的成熟蛋白(-22至-1)?？芍苽淙缦陆囟绦问降娜薕B蛋白分子(使用SEQ.ID.NO.6編號(hào))(a)氨基酸98-146(b)氨基酸1-32(c)氨基酸40-116(d)氨基酸1-99和112-146相連(e)氨基酸1-99連接到112-146其中100-111的一至多個(gè)氨基酸置于氨基酸99到112之間。
而且，截短形式也可改變與人OB蛋白不同的一至多個(gè)氨基酸(在大鼠、小鼠或獼猴OB蛋白)。而且，任何改變可以以改變的氨基酸形式出現(xiàn)，如肽模擬物或D-氨基酸。
因此，本發(fā)明包括Fc-OB融合蛋白，其中OB蛋白從以下選擇。
(a)如SEQ.ID.NO.3(如下)或SEQ.ID.NO.6所示的氨基酸序列1-146；(b)如SEQ.ID.NO.6闡明的氨基酸序列1-146，其中35位為賴氨酸殘基，74位為異亮氨酸殘基；(c)(b)的部分氨基酸序列在以下1至多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生不同氨基酸取代(根據(jù)SEQ.ID.NO.6的編碼，即使28位谷氨酰胺殘基缺失的情況下也保留相同的計(jì)數(shù)順序)4，32，33，35，50，64，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111，118，136，138，142和145；(d)(a)(b)或(c)可以在28位缺失谷氨酰胺殘基的氨基酸序列；(e)(a)(b)(c)或(d)在N-末端具甲硫氨酸殘基的氨基酸序列；(f)來自以下(按SEQ.ID.NO.6號(hào)碼)的截短的OB蛋白類似物(i)氨基酸98-146(ii) 氨基酸1-32(iii) 氨基酸40-116(iv) 氨基酸1-99和112-146(v)氨基酸1-99和112-146其中100-111的一至多個(gè)氨基酸置于氨基酸99-112之間。
(vi) (i)截短OB類似物，該類似物在100，102，105，106，107，108，111，118，136，138，142和145位有一至多個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代；(vii) (ii)截短的類似物在4，8和32位有一至多個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代；(viii) (iii)截短的類似物在50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111和112位有，一至多個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代；(vix) (iv)截短的類似物在4，8，32，33，35，48，50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，112，118，136，138，142和145位有至多個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代；(x)(v)截短的類似物在4，32，33，35，50，64，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111，118，136，138，142和145位有一至多個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代；(xi) (i)-(x)的任何具N-末端甲硫氨酸殘基截短的類似物；(g)(a)～(f)之任一的OB蛋白或類似物的衍生物形成一個(gè)化學(xué)部分與蛋白部分相連的結(jié)構(gòu)；(h)(g)的衍生物，其中所述化學(xué)部分為水溶性聚合物部分。
(i)(h)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；(j)(h)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為多聚氨基酸部分；(k)(h)部分以由(f)形成的衍生物，其中所述部分只與N-末端所述蛋白部分相連；(l)在藥用可接受的載體中的(a)至(k)任何一種OB蛋白，類似物或衍生物。
衍生物本發(fā)明的Fc-OB融合蛋白(這里所指的“蛋白”不經(jīng)另外說明，慣指包括“肽”，F(xiàn)c，OB或類似物，如下所列舉。)由一至多個(gè)化學(xué)部分連接至Fc-OB融合蛋白部分衍生而成。這些化學(xué)修飾的衍生物可進(jìn)一步制成為動(dòng)脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)皮下，靜脈內(nèi)，口的、鼻的、肺的、表面的或如以下討論的其它途徑的施用。對(duì)生物活性蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾在特定環(huán)境下提供更多優(yōu)點(diǎn)，如提高穩(wěn)定性，延長蛋白藥物的循環(huán)時(shí)間，降低致免疫性。見，U.S.專利No.4,179,337，Davis等，授權(quán)于1979.12.18.綜述見Abuchowski等關(guān)于作為藥物的酶類。(J.S.Holcerberg和J.Roberts，eds.PP.367-383(1983)；Francis等，上述。
合適于衍生用的化學(xué)部分可從多種水溶性聚合物中選擇。所選的聚合物應(yīng)可水溶，這樣與聚合物連接的蛋白不會(huì)在水環(huán)境如生理環(huán)境下沉淀。優(yōu)選地，為最終產(chǎn)品制備的治療用途，聚合物應(yīng)為可藥學(xué)可接受的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)考慮選擇期待的聚合物，如聚合物/蛋白結(jié)合物是否用于治療，如果是這樣，還應(yīng)考慮要求劑量，循環(huán)時(shí)間，抗蛋白酶降解以及其它一些問題。對(duì)于本發(fā)明蛋白和肽，通過用要求形式(即通過滲透泵，或更優(yōu)選地，注射或輸注，或進(jìn)一步制成口服，肺或鼻傳遞)的施用衍生物，并如此處描述地觀察生物效用，可確定衍生過程的有效性。
水溶性聚合物可從包括聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊環(huán)，聚-1，3，6-三氧雜環(huán)己烷，乙二醇/馬來酐共聚物，多聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇同源聚合物，聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙烯多元醇和聚乙烯基醇中選擇。聚乙二醇丙醛因其在水中的穩(wěn)定性在工業(yè)生產(chǎn)中更具優(yōu)勢。同樣也可用琥珀酸鹽和苯乙烯。
用以制成Fc-OB融合蛋白的OB或Fc蛋白可通過將多聚氨基酸或分支點(diǎn)氨基酸與Fc或OB蛋白(或類似物)部分相連而制備。例如，多聚氨基酸可以為一個(gè)額外的載體氨基酸，它同F(xiàn)c融合至OB蛋白或本發(fā)明中OB類似物的作用一樣，除Fc-OB融合蛋白的其它優(yōu)點(diǎn)以外也可延長蛋白循環(huán)的半衰期。因本發(fā)明的治療和美容目的，這些多聚氨基酸應(yīng)不產(chǎn)生中和抗原反應(yīng)或其它不良反應(yīng)的種類。這類多聚氨基酸可從包括血清白蛋白(如人血清白蛋白)，額外抗體或其部分(例Fc區(qū))，或其它多聚氨基酸，例賴氨酸。如F所示，與多聚氨基酸相連的位置可為Fc-OB蛋白部分的N-末端，或C-末端，或其它中間部分，也可通過化學(xué)“連接子”部分連到Fc-OB蛋白上。
聚合物可為任意分子量，也可以分支或不分支。對(duì)于聚乙二醇，優(yōu)選的分子量大約在2kDa和100kDa之間(“大約”指在制備聚乙二醇過程中，一些分子比標(biāo)示分子量更重，而另一些更輕)，以便于處理或生產(chǎn)。根據(jù)要求的治療特點(diǎn)(例，要求的穩(wěn)定釋放的持續(xù)時(shí)間，效用，如果有生物學(xué)活性，處理的難易，抗原性的程度或缺失以及其它聚乙二醇對(duì)于治療用蛋白或類似物已知的作用)，其它規(guī)格也可應(yīng)用。
這樣連接的聚合物分子數(shù)目可能不同，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能確定其功能上的作用。聚合物分子可能是單來源衍生的，也可是用相同或不同化學(xué)部分(例，聚合物如不同分子量的聚乙二醇)在衍生過程中，雙，三，四或組合來源衍生。聚合物分子對(duì)蛋白(或多肽)分子的比例可隨其在反應(yīng)混合物中濃度變化。一般地說，最佳比率(就反應(yīng)效應(yīng)而言即無過剩反應(yīng)蛋白或聚合物)由以下因素決定，如要求的衍生程度(例單，雙，三，四等)，選擇的聚合物的分子量，聚合物是否分支以及反應(yīng)條件。
化學(xué)部分連到蛋白時(shí)應(yīng)考慮到對(duì)蛋白的功能性或抗原性區(qū)的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用多種連接方法。例，EP0401384在此引入僅作參考。(連接PEG至G-CSF)，也見Malik等，Exp.Hematol 201028-1035(1992)(用tresyl chloride報(bào)告GM-CSF的聚乙二醇化)。例，聚乙二醇可通過反應(yīng)基團(tuán)共價(jià)結(jié)合在氨基酸殘基上，如游離氨基或羧基。反應(yīng)基團(tuán)為活化的聚乙二醇分子可與之結(jié)合的那些種類。具游離氨基的氨基酸殘基包括賴氨酸殘基和N-末端氨基酸殘基。具游離羧基的氨基酸殘基包括天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基和C-末端氨基酸殘基。巰基也可用作反應(yīng)基團(tuán)以連接聚乙二醇分子。為治療目的，優(yōu)選的連接是在氨基上，如在N-末端或賴氨酸基團(tuán)的連接。如果要求受體結(jié)合，應(yīng)避免對(duì)受體結(jié)合起重要作用的殘基進(jìn)行連接。
Fc-OB融合蛋白可特殊要求為N-末端化學(xué)修飾的。本組合物以聚乙二醇為例說明，可選擇不同的聚乙二醇分子(根據(jù)分子量，分支等)，在反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子對(duì)蛋白(或多肽)分子的比例，執(zhí)行聚乙二醇化反應(yīng)的類型，及獲得所選N-末端聚乙二醇化蛋白的方法，獲得N-末端聚乙二醇化制備物(即必要時(shí)將此部分與其它單聚乙二醇化部分分離)的方法可通過從聚乙二醇化蛋白分子群體中純化N-末端聚乙二醇化物質(zhì)。選擇的N-末端化學(xué)修飾可伴隨還原的烷基取代，該烷基化作用利用在衍生特殊蛋白中所用不同類型的原始氨基(賴氨酸在N-末端)的差異反應(yīng)性。在合適反應(yīng)條件下，基本上可得到與N-末端用含聚合物的羰基群選擇性衍生化的蛋白。例，可在某pH進(jìn)行反應(yīng)以選擇地N-末端聚乙二醇化蛋白，該反應(yīng)允許利用蛋白賴氨酸殘基ε-氨基和N-末端殘基α-氨基pKa的差異進(jìn)行。通過這樣選擇性地衍生，可控制將水溶性聚合物連接到一種蛋白上；與聚合物的結(jié)合優(yōu)勢地發(fā)生在蛋白N-末端，且對(duì)其它反應(yīng)基團(tuán)如賴氨酸側(cè)鏈氨基無明顯修飾發(fā)生。使用還原性烷基取代，水溶性聚合物可為上述的類型，且應(yīng)具有單獨(dú)反應(yīng)醛基以同蛋白結(jié)合?？捎煤歇?dú)立反應(yīng)醛基的聚乙二醇丙醛。
為容易生產(chǎn)治療藥品，優(yōu)選的是N-末端單聚乙二醇化衍生物。N-末端聚乙二醇化保證為一種均質(zhì)產(chǎn)物。相對(duì)于雙-，三-或多聚乙二醇化產(chǎn)物，該產(chǎn)物的特征是簡化處理方法。應(yīng)用以上還原性烷基取代方法，制備N-末端產(chǎn)物，是易于商業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)選方法。
復(fù)合物Fc-OB融合蛋白，類似物或其衍生物可復(fù)合為一種結(jié)合組合物施用。這種結(jié)合組合物具有延長循環(huán)時(shí)間的效用，此效用超過Fc-OB融合蛋白，類似物或衍生物的作用。此組合物可為一種蛋白(或同義的，肽)。結(jié)合蛋白的例子之一為OB蛋白受體或其部分，如其水溶性部分。其它結(jié)合蛋白可通過檢查血清中Fc-OB蛋白或OB蛋白來確定，或通過經(jīng)驗(yàn)篩選結(jié)合的存在確定。應(yīng)用的結(jié)合蛋白一般不會(huì)干擾OB蛋白，F(xiàn)c-OB融合蛋白或其類似物或衍生物結(jié)合到內(nèi)源OB蛋白受體或作用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。
藥物組合物本發(fā)明也提供了應(yīng)用Fc-OB融合蛋白和衍生物的藥物組合物的方法，該藥物組合物可進(jìn)行注射，口服，肺，鼻，經(jīng)皮膚或其它形式的施用。一般地說，該發(fā)明包括的藥物組合物包括有效數(shù)量的蛋白和本發(fā)明的衍生產(chǎn)物以及藥用可接受的稀釋劑，防腐劑，溶劑，乳化劑，佐劑和/或載體。這些組合物包含不同緩沖液內(nèi)容(例Tris-HCl，乙酸鹽，磷酸鹽)的稀釋劑，pH和離子強(qiáng)度；添加劑如去污劑和溶劑(例Tween 80，聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80)，抗氧化劑(例，抗壞血酸，焦二硫酸鈉)；防腐劑(例，硫柳汞，苯甲醇)和大量物質(zhì)(例，乳糖，甘露醇)；結(jié)合形成質(zhì)如聚乳酸，聚羥基乙酸等的多聚化合物，或結(jié)合形成脂質(zhì)體，也可用Hylauronic酸，它具有在循環(huán)中促進(jìn)持久的持續(xù)時(shí)間的作用。這些組合物會(huì)影響物理狀態(tài)，穩(wěn)定性及體內(nèi)釋放的速率，以及在體內(nèi)本發(fā)明蛋白和衍生物的清除速率。見，例，Remington’s藥學(xué)科學(xué)，18th Ed.(1990 Mack出版公司.，Easton，PA，18042)1435-1712頁，在此引入僅作參考。組合物可制備成液體形式，或制成為干粉，如凍干的形式。也可考慮使用植入的持久釋放制劑如透皮制劑。
在此考慮應(yīng)用的是口服固體劑量形式，在Remington’s藥物科學(xué)18thEd.，1990(Mack出版公司EastonPA 18042)89章中概述，在此引入僅作參考。固體制劑形式包括片劑，膠囊，藥丸，錠劑或糖錠，扁囊劑，小糖丸。脂質(zhì)體的或類蛋白包被也可用于形成本發(fā)明的組合物(例如美國專利號(hào)4,925,673所披露的類蛋白微球)?？捎弥|(zhì)體囊化法以及脂質(zhì)體可由不同聚合物衍生而成(例，U.S.Patent No.5,013,556)。治療中可能的固體劑量形式在Marshall，K.In現(xiàn)代藥物學(xué)由G.S.Banker和C.T.Rhodes第四章，1979中詳細(xì)描述，在此引入僅作參考。一般地說，制劑將包括Fc-OB融合蛋白(類似物或衍生物)和惰性成分，惰性成分用來抵抗胃環(huán)境的，以及在腸中釋放的生物活性物質(zhì)。
特別要考慮的是以上衍生蛋白的口服劑量形式。Fc-OB融合蛋白也可被化學(xué)修飾，因此衍生物的口服傳遞是有效的。概括地講，期待的化學(xué)修飾是至少一部分與蛋白(或多肽)分子連接，所述的部分允許(a)抑制蛋白水解，(b)在胃或腸可攝入到血流中。同樣期待增加蛋白全面的穩(wěn)定性及增加在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。這樣部分的例子包括聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯基醇；聚乙烯吡咯烷酮和多聚脯氨酸，Abuchowski和Davis，可溶的多聚酶加合物。在“作為藥物的酶類，Hocenberg和Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New York，NY，(1981)，pp.367-383；Newmark，等，J.應(yīng)用生物化學(xué)雜志。4185-189(1982)。其它能用的聚合物為多聚1，3-二氧戊烷和多聚-1，3，6-三氧雜環(huán)己烷。優(yōu)選用于治療的，在上述所披露的，為聚乙二醇部分。
對(duì)于Fc-OB融合蛋白，類似物或衍生物，其釋放位置可能在胃，小腸(例，十二指腸，空腸，回腸)或大腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)有各種有效組方，這些組方不在胃溶解，而在十二指腸或腸其它地方釋放物質(zhì)。優(yōu)選地，該釋放將避免胃環(huán)境的有害作用，且由保護(hù)Fc-OB融合蛋白，類似物或衍生物，或在胃環(huán)境之外如在腸釋放生物活性物質(zhì)實(shí)現(xiàn)。
為保證對(duì)胃的抗性，至少在pH5.0不通透的包衣是必需的。更常見的無惰性成分的例子是那些用作腸道的包衣的醋酸纖維素偏苯三酸鹽(CAT)，羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸鹽(HPMCP)，HPMCP50，HPMCP55，聚乙酸乙烯酯鄰苯二甲酸鹽(PVAP)，Eudragit L30D，Aquateric，醋酸纖維素，鄰苯二甲酸鹽(CAP)，Eudragit L，Eudragit S，和Shellac。這些包衣可用作混合薄膜。
包衣或包衣的混合物也可用于片劑中，而其目的不為保護(hù)避免受胃環(huán)境破壞。這些包衣包括糖衣或使片劑更易吞咽的包衣。膠囊可包括一個(gè)堅(jiān)硬的殼(如明膠)組成，以便傳遞干藥物即粉末；可用對(duì)于液體形式藥物柔軟的明膠包被。扁囊劑的外殼物質(zhì)可能為濃淀粉或其它可食紙。對(duì)于丸劑，可應(yīng)用菱形，模型化片劑或片劑研磨劑，濕潤團(tuán)技術(shù)。
治療物可被包括在制劑中如細(xì)多粒子的1mm顆粒大小的顆粒或藥丸的形式。用于制成膠囊施用的物質(zhì)也可為粉末，輕微壓縮的填料，甚至片劑。治療藥物可通過壓縮制備。
色素和調(diào)味劑也可包括在內(nèi)。例蛋白(或衍生物)可先被制成制劑(如通過脂質(zhì)體或微球體囊化體)，然后納入到可食產(chǎn)品中，如含有色素和調(diào)味劑的冷藏飲料。
可用惰性物質(zhì)稀釋或增加治療物的體積。這些稀釋物包括碳水化合物類，尤其是甘露糖，α-乳糖，無水乳糖，纖維素，蔗糖，修飾過的葡聚糖和淀粉。某些無機(jī)鹽可用作填充物如三磷酸鈣，碳酸鎂和氯化鈉。一些商業(yè)用烯釋劑為Fast-Flo，Emdex，STA-Rx 1500，Emcompress和Avicell。
分解劑可以固體劑量形式加入到治療用的制劑中。用做分解劑的物質(zhì)包括但不僅限于淀粉，包括建立在淀粉基礎(chǔ)上的商用分解劑，Explotab。乙酸淀粉鈉，安伯來特。羧甲基纖維素鈉，Ultramylopectin，藻酸鈉，明膠，橙皮，羧甲基纖維素酸，天然海綿和皂土均可用。其它形式的分解劑為不溶的陽離子交換樹脂。粉狀樹膠可用作分解劑和粘合劑，粉狀樹脂包括瓊脂，Karaya或西黃蓍膠。藻酸和其鈉鹽作為分解劑亦十分有效。
粘合劑可用于保持治療劑一起形成為堅(jiān)硬的片劑，它包括來自天然產(chǎn)物的物質(zhì)如阿拉伯膠，西黃蓍膠，淀粉和明膠。其它種類包括甲基纖維素(Mc)，乙基纖維素(Ec)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙甲基纖素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)二者都可用于酒精溶劑中使治療物顆?；?br> 抗摩擦劑可加入到治療用制劑中以阻止制劑過程中的粘著。潤滑劑可用作治療物和模型外殼之間的隔離層，它們包括而不僅限于；硬脂酸包括其鎂鹽和鈣鹽的酸，聚四氟乙烯(PTFE)，液體石蠟，植物油和蠟?？扇艿臐櫥瑒┮部捎萌缡榛蛩徕c，十二烷基硫酸鎂，不同分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可提高制劑過程中藥物的流動(dòng)特性且在壓縮過程中幫助重排的滑劑也可添加。這些滑劑包括淀粉，滑石，熱源石英和水合硅鋁酸鹽。
為幫助治療物溶解至水環(huán)境，可加入表面活性劑作為濕潤劑，表面活性劑包括陰離子去污劑如十二烷基硫酸鈉，十六烷磺基琥珀酸鈉和十六烷磺酸鈉。也可用陽離子去污劑，包括潔爾滅或氯化芐乙銨?？赡艿姆请x子型去垢劑可加入到制劑中作為表面活性劑的有l(wèi)auromacrogol400，polyoxyl 40硬脂酸酯，聚乙烯加氫蓖麻油10，50和60，甘油單硬脂酸，聚山梨酸酯40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纖維素和羥甲基纖維素。這些表面活性劑可在蛋白或衍生物制劑中單獨(dú)或按不同比例混合摻入。
添加劑可能提高蛋白(衍生物)的攝入，例脂肪酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。
制劑被控制地釋放是所期待的?？蓳饺胨幬锏綗o活性基質(zhì)中，此無活性基質(zhì)可允許以滲透或?yàn)r濾機(jī)制釋放，例樹膠，緩慢降解基質(zhì)可加入到制劑中，例藻酸鹽，多糖。另一種使治療物被控釋放的形式是通過建立在Oros治療系統(tǒng)(Alza Corp)的一種方法，即藥物包被在半透膜中，此半透膜允許水進(jìn)入并推動(dòng)藥物因滲透作用而通過單個(gè)小孔。一些腸衣也具延遲釋放作用。
其它還有些可于制劑的包衣。這包括能應(yīng)用于包衣盤的不同的糖。治療劑可為薄膜包被的片劑形式，這樣應(yīng)用的物質(zhì)在本例中分為2類。第一類為非腸道物質(zhì)包括甲基纖維素，乙基纖維素，羥乙基纖維素，甲基羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧基-甲基纖維素鈉，providone和聚乙二醇。第二類包括腸道物質(zhì)，這些物質(zhì)為鄰苯二甲酸的普通酯。
物質(zhì)混合后可用于提供最佳的薄膜包衣。薄膜包衣可在包衣盤或液體床中制備或通過壓縮包衣法。
在此也注意到本蛋白(或其衍生物)的肺傳遞。該蛋白(或衍生物)在吸氣時(shí)傳遞到哺乳動(dòng)物的肺并橫越肺表皮至血流中(其它有關(guān)報(bào)告包括Adjei等藥物學(xué)研究7565-569(1990)；Adjei等，藥物國際雜志63135-144(1990)(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等，心血管藥物學(xué)雜志13(增刊5)s.143-146(1989)(內(nèi)皮素-1)；Hubbard等；國內(nèi)藥物年刊3206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等.，臨床研究雜志。841145-1146(1989)(α-1-蛋白酶)；Oswein等.，“蛋白的霧狀分散技術(shù)”，呼吸藥物傳遞專題討論會(huì)II進(jìn)展，Keystone，Colorado，March，1990(重組人生長激素)；Debs等，免疫學(xué)雜志1403482-3488(1988)(干擾素γ和腫瘤壞死因子α)和Platz等.，U.S.專利No.5,284,656(粒細(xì)胞集落刺激因子)。
為本發(fā)明的實(shí)踐應(yīng)用，注意到廣泛的用于治療產(chǎn)品的肺傳遞的醫(yī)學(xué)方法，包括但不僅限于霧化機(jī)，表控的劑量吸氣器，粉末吸氣器，這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。
一些適于本發(fā)明實(shí)施的商用設(shè)備的具體實(shí)施例子有Ultravent霧化機(jī)，由Mallinckrodt，Inc.，生產(chǎn)，St.Louis，Missoun；Acorn II霧化機(jī)Marquest醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)，Engleword，Colorado；Ventolin儀表控制的劑量吸氣器，Glaxo Inc.生產(chǎn).，Research Triangle Park，North Caroliha；Spinhaler粉末吸氣器，F(xiàn)isons Crop.生產(chǎn)，Bedford，Massachusetts。
所有這些裝置需要應(yīng)用合適的制劑來分散蛋白(類似物或衍生物)。典型的，每種制劑特殊對(duì)應(yīng)使用的裝置，除稀釋劑，佐劑和/或?qū)τ杏糜谥委煹妮d體外，還可加入合適的推進(jìn)劑。
蛋白(或衍生物)最好制備為，顆粒形式，一般顆粒大小不超過10μm(或微米)，最優(yōu)選的為0.5至5μm，以便最有效傳遞到遠(yuǎn)端肺。
載體包括碳水化合物如海藻糖、甘露糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、山梨糖醇。其它用于制劑的成分可包括DPPC，DOPE，DSPC和DOPC。天然或合成表面活性劑也可用?？蓱?yīng)用聚乙二醇(即使離開其在衍生蛋白或類似物中的應(yīng)用)。葡聚糖，如環(huán)化葡聚糖可用，膽鹽和其它相關(guān)促進(jìn)劑也可用。纖維素和纖維素衍生物也可用。氨基酸可用，如其在緩沖制劑中的應(yīng)用。
同時(shí)也注意到脂質(zhì)體，微囊體或微球體，包含物復(fù)合體或其它形式載體的應(yīng)用。
適用于噴霧器，無論噴射器或超聲發(fā)射器的制劑，一般包括Fc-OB蛋白，類似物或其衍生物。這些蛋白在水中以每毫升0.1至25mg生物活性蛋白溶液濃度溶解。制劑也可包括緩沖液或單糖(例，為蛋白的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)滲透壓。噴霧制劑還包括表面活性劑，用于減少或阻止表面誘導(dǎo)的蛋白聚集，這種聚集是形成氣霧劑時(shí)溶液的原子化引起。
用于儀表控制的劑量吸氣器的制劑一般構(gòu)成在表面活性劑幫助下，重懸在推進(jìn)劑中良好分配的含蛋白(或衍生物)的粉末。推進(jìn)劑可為任何便于此目的常規(guī)物質(zhì)，如氯氟烴，氫氯氟烴或氫氟烴或碳?xì)浠衔铮ㄈ渎确淄?，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，?，1，1，2-四氟乙烷或其組合，合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂，油酸也是有用的表面活性劑。
為粉末吸入設(shè)備準(zhǔn)備的制劑主要包括良好分散的干粉，其中包含蛋白(或衍生物)，也可包含大量試劑如乳糖，山梨糖醇、蔗糖，甘露糖，海藻糖、或木糖醇，其數(shù)量要使干粉末從設(shè)備分散的數(shù)量，例50至90％的制劑量。
也可考慮蛋白(或類似物或衍生物)的鼻傳遞。鼻傳遞允許蛋白在施用治療產(chǎn)物到鼻后直接傳到血流而無需產(chǎn)物在肺的沉淀。用于鼻遞的制劑包括葡聚糖或環(huán)葡聚糖也可考慮通過粘膜的傳遞。
劑量本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過施用和觀察期待的治療作用可確定有效的劑量。由于OB蛋白N-末端的修飾，與OB蛋白和C-末端修飾的OB蛋白相比，本發(fā)明提供了意想不到的保護(hù)不受降解作用，且提高了循環(huán)時(shí)間和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過這些變化確定可需要較少劑量或較小頻率劑量的有效劑量。
優(yōu)選地，該分子的制劑在10μg/kg/天和10mg/kg/天，將產(chǎn)生符合期待的治療作用。有效劑量可通過超時(shí)運(yùn)用診斷工具來決定。例，為測量血液中(血漿成分血清)中OB蛋白或Fc-OB融合蛋白的量的診斷可首先運(yùn)用以決定蛋白的內(nèi)源水平。這些診斷工具可以抗體分析形式，如抗體夾心分析。內(nèi)源OB蛋白的量需首先確定，才決定基線。當(dāng)內(nèi)源的和外源的OB蛋白或Fc-OB融合蛋白(即體內(nèi)找到的蛋白，類似物或衍生物，無論為自己產(chǎn)生的或施用的)的量在治療的連續(xù)過程中被確定的，治療劑量也被確定。劑量可能在治療過程中變化，在起始階段相對(duì)為高劑量，直到療效可見，然后施以較低劑量以保持療效。
理想地，在(X)下情況下，當(dāng)期待單獨(dú)的血脂水平降低，或期待保持血脂水平的降低，或期待自體物質(zhì)變瘦的增加，劑量將不足以導(dǎo)致體重減輕。因此，在治療肥胖病人伊始，劑量可被施用使體重減輕和伴隨血脂水平降低或伴行脂肪組織減少/瘦物質(zhì)增加，一旦成功減少足夠體重，可施用劑量以阻止重獲體重，更足夠保持期待的血脂水平或瘦物質(zhì)增加(或阻止瘦物質(zhì)的消耗)。此劑量可憑經(jīng)驗(yàn)確定，因OB或Fc-OB蛋白的作用是可逆的，(例，Campfield等科學(xué)269546-549(1995)在547)。因此，假如在未期待體重減輕時(shí)某劑量造成觀察到體重減少，就應(yīng)施用較低劑量以達(dá)到期待的血脂水平或瘦組織物質(zhì)的增加，且保持期待的體重。
為提高個(gè)體對(duì)胰島素的敏感性，應(yīng)考慮相似的劑量，瘦物質(zhì)增加而無體重減輕，可能足夠成功降低個(gè)體在施用胰島素(或潛在的，支鏈淀粉，噻唑烷二酮(thiazolidinediones)或其他潛在的治療糖尿病的藥物)進(jìn)行糖尿病治療時(shí)的量。
為增加全面的強(qiáng)度，應(yīng)考慮相似的劑量?？傻玫绞菸镔|(zhì)增加同時(shí)伴行全面強(qiáng)度增加，而所用的劑量不足以導(dǎo)致體重減少的結(jié)果。其它優(yōu)點(diǎn)，如紅血細(xì)胞(和血液中氧合作用)增加和骨骼吸收作用或骨質(zhì)疏松的下降可在非體重減輕下獲得。
組合本方法可應(yīng)用于與其它藥物結(jié)合，如那些處理糖尿病有效的(例胰島素，可能地，噻唑烷二酮支鏈淀粉，或其拮抗劑)，膽固醇和血壓降低藥物(如那些降低血脂水平或其它心血管藥物)，和增加活性藥物(例安非他明)。食欲抑制劑也可用(如那些作用于5-羥色胺或神經(jīng)肽水平的藥物)。這樣的施用可同時(shí)進(jìn)行或依次地進(jìn)行。
另外，本方法可用于與外科手術(shù)的步驟結(jié)合，如旨在改變身體的全面的美容手術(shù)外形(例旨在減身體物質(zhì)的吸脂術(shù)或激光手術(shù))。心臟手術(shù)的健康益處，如分流術(shù)手術(shù)或其它旨在緩解由于脂肪沉淀，血管阻塞而造成的有害病狀，如動(dòng)脈斑，可在同時(shí)使用本發(fā)明和方法下增加其益處。旨在消除膽結(jié)石的方法，如超聲或激光方法，也可在本治療方法之前，當(dāng)中或以后應(yīng)用。進(jìn)一步地，本方法可用作外科手術(shù)或治療骨折，肌肉損傷或其它可提高瘦組織物質(zhì)而改善的療法結(jié)合使用。
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步更詳盡解釋本發(fā)明，但不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.通過皮下注射應(yīng)用鼠Fc-OB蛋白本實(shí)施例論證了皮下注射鼠Fc-OB蛋白導(dǎo)致正常鼠體重減輕。正常(非肥胖)CD1小鼠通過皮下注射施用鼠Fc-OB蛋白經(jīng)過22天時(shí)間。注射到22天時(shí)10mg蛋白/kg體重/天的劑量導(dǎo)致體重從基礎(chǔ)重量下降了14％(+/-1.1％)。加入PBS劑量導(dǎo)致到22天注射后體重從基礎(chǔ)重量下降3.9％(+/-3.3％)。在肥胖CD1小鼠中，應(yīng)用10mg蛋白/kg體重/天Fc-OB蛋白，經(jīng)過22天注射后，導(dǎo)致體重從基礎(chǔ)重量下降10％(+/-4.3％)，而同樣施用PBS則導(dǎo)致體重從基礎(chǔ)重量下降8.7％(+/-1.3％)。
以下為CD1小鼠(8周齡)與基礎(chǔ)體重相比的百分比變化。
表1皮下注射體重減輕
<p>可見，在22天皮下注射方案之后，接受Fc-OB蛋白的動(dòng)物在瘦動(dòng)物中失去14.1％的體重，在肥胖動(dòng)物中失去10％體重，此值與僅接受PBS介導(dǎo)液的動(dòng)物和與基礎(chǔ)重量相比得到。
令人驚奇的是，接受Fc-OB蛋白動(dòng)物在22天后繼續(xù)減少體重至28天，即最后一次注射的4天之后。正常(非肥胖)CD1小鼠通過皮下注射施用10mg蛋白/kg體重/天的鼠Fc-OB蛋白在第22天停止，導(dǎo)致第28天體重比基礎(chǔ)體重下降21％，與第22天相比，第22天體重下降14％。相似的，肥胖CD1小鼠施用10mg蛋白/kg體重/天的鼠Fc-OB蛋白在第22天停止導(dǎo)致第28天13％體重從基礎(chǔ)重量下降，而第22天僅下降10％。在第34天，肥胖小鼠體重下降保持在10％，而瘦小鼠恢復(fù)到5％下降。每個(gè)體系的對(duì)照組從22天到34天平均增重，在肥胖小鼠中為4％而瘦鼠中為7％。實(shí)施例2通過對(duì)C57小鼠的皮下注射使用人Fc-OB蛋白本實(shí)施例論證了在正常小鼠中皮下注射施用人Fc-OB蛋白導(dǎo)致體重下降，正常(非肥胖)C57小鼠通過7天時(shí)間的皮下注射施用人Fc-OB蛋白。10mg蛋白/kg體重/天的劑量導(dǎo)致7天注射后，體重從基礎(chǔ)體重下降12％(+/-1.3％)。1mg蛋白/kg體重/天的劑量7天注射后，導(dǎo)致體重從基礎(chǔ)體重下降8.9％(+/-1.5％)。7天注射后在肥胖C57小鼠中應(yīng)用10mg蛋白/kg體重/天人OB蛋白劑量導(dǎo)致體重從基礎(chǔ)體重下降1.1％(+/-0.99％)，而1mg蛋白/kg體重/天的劑量導(dǎo)致從基礎(chǔ)體重下降2.5％(+/-1.1％)。
結(jié)果以下為C57小鼠(8周齡)從基礎(chǔ)體重的百分比差別
表2皮下注射后體重減輕
可見，在以10mg/kg體重/天皮下注射方案7天后，到17天時(shí)，接受Fc-OB蛋白的動(dòng)物恢復(fù)了它們8％體重，接受1mg蛋白/kg體重/天劑量的動(dòng)物7天皮下注射方案后12天恢復(fù)6.4％的體重。
這些研究還顯示在第7天至第22天的恢復(fù)階段，在第7天最后注射之后，在以Fc-OB處理的C57小鼠中體重恢復(fù)比OB處理鼠緩慢。這說明Fc-OB蛋白不如OB蛋白清除快，因此造成延長的減輕體重效應(yīng)。實(shí)施例3以Fc-OB蛋白處理CF7小鼠的劑量反應(yīng)另一項(xiàng)研究證明持續(xù)施用Fc-OB蛋白具有劑量反應(yīng)。在該研究中，肥胖CF7小鼠，重35-40g，被用與以上實(shí)施例相似的方法施以人Fc-OB蛋白。結(jié)果顯示在以下表3(用％體重減少與基礎(chǔ)體重相比，與以上同樣方法測量)。
表3持續(xù)施用的劑量反應(yīng)
可見，劑量從0.25mg/kg/天到1mg/kg/天增加了體重減少從4％至16％。同樣值得注意的是，第5天，1mg/kg/天劑量造成體重16％減少。這些研究也顯示緩慢的體重恢復(fù)到0％說明Fc-OB蛋白不迅速清除，造成延長的體重減少效應(yīng)。實(shí)施例4重組人Fc-OB在CD1小鼠和狗中的藥物動(dòng)力學(xué)本研究證明人重組met Fc-OB蛋白在CD1小鼠和狗中的藥物動(dòng)力學(xué)特性。按照靜脈內(nèi)或皮下加藥1mg/kg/天，重組人met Fc-OB蛋白和人met OB蛋白在血清中的濃度由酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)確定。
在兩物種中，當(dāng)根據(jù)高峰血清濃度和該血清濃度以下曲線(AUC)的較大區(qū)域確定量時(shí)，與重組人met OB蛋白相比，這些數(shù)值在接觸該蛋白后增加。Fc-OB具有比重組人met OB蛋白緩慢的系統(tǒng)清除。在Fc-OB與OB蛋白比較時(shí)可見較緩慢的清除率和較長的半衰期。體積的加大不僅造成蛋白穩(wěn)定性增加還降低腎清除的效率。結(jié)果Fc-OB在循環(huán)系統(tǒng)中清除較慢。Fc-OB蛋白的峰值時(shí)間，峰值血清濃度和AUC的增加與較低清除率一致。Fc-OB蛋白與OB蛋白相比實(shí)際產(chǎn)出更高系統(tǒng)接觸。結(jié)果在以下表4所示。
表4藥物動(dòng)力學(xué)特征
實(shí)施例5本實(shí)施例論證了在既不肥胖且無升高的血脂水平的正常小鼠中，施用人重組Fc-OB蛋白導(dǎo)致膽固醇，葡萄糖和甘油三酯水平降低。另外，本實(shí)施例證明這些水平在經(jīng)過3天恢復(fù)期后仍保持低水平。
正常CD1小鼠通過皮下注射施用重組人Fc-OB蛋白，在即最后一天注射23天后，取24小時(shí)的血樣。如上所討論，動(dòng)物在所施劑量下體重減輕。如表5所示，與對(duì)照相比，小鼠以劑量依賴樣式，持續(xù)降低其血清膽固醇，葡萄糖，甘油三酯
表5
這些數(shù)據(jù)說明Fc-OB蛋白或類似物或其衍生物，是有效的血脂降低劑。實(shí)施例6肥胖人患者施用人Fc-OB蛋白，或其類似物或衍生物為減輕體重之目的。這些肥胖患者也具升高的血脂水平，包括高水平膽固醇，在200mg/100ml以上?；颊咴贔c-OB治療后獲得滿意的體重減少。Fc-OB蛋白或其類似物或衍生物的維持劑量施用至非肥胖患者以維持低血脂水平，包括低膽固醇水平，低于200mg/100ml。劑量施用不足以造成進(jìn)一步體重減輕。施用是慢性的。Fc-OB蛋白或類似物或衍生物的循環(huán)水平可用診斷試劑盒檢測，如抗OB蛋白(如果要求時(shí)，或其它可用的抗原來源)的抗體檢測。實(shí)施例7非肥胖患者經(jīng)過冠狀分流術(shù)手術(shù)或其它侵入處理以緩和發(fā)展階段動(dòng)脈斑形成期。手術(shù)后，患者施用維持劑量的Fc-OB蛋白或類似物或衍生物以阻止動(dòng)脈斑的重形成。施用劑量不足以造成體重減輕。服法為慢性。Fc-OB蛋白或類似物或衍生物的循環(huán)水平用診斷試劑盒檢測，如抗OB蛋白的抗體分析(如果要求時(shí)，或其它可用的抗原來源)。實(shí)施例8非肥胖患者因限制血流經(jīng)阻塞動(dòng)脈而患高血壓。該患者施以一定劑量Fc-OB蛋白或類似物或其衍生物，足以減少造成堵塞動(dòng)脈的動(dòng)脈斑。因此，該患者的進(jìn)一步動(dòng)脈斑的形成和高血壓被控制。如病情重出現(xiàn)，該患者則被重新施用有效量的Fc-OB蛋白。類似物或衍生物，該量足夠重新恢復(fù)血流，而不足以造成體重下降。Fc-OB蛋白或類似物或衍生物的循環(huán)水平用診斷試劑盒監(jiān)測，如抗體抗Fc-OB分析蛋白(如果要求時(shí)，或其它可用抗原來源)。實(shí)施例9患者患膽結(jié)石。無論膽結(jié)石移除，希望避免其他的膽結(jié)石生成，或膽結(jié)石移除但保留膽囊(例使用激光或超聲外科手術(shù))希望避免其他的膽結(jié)石生成?；颊弑皇┮杂行Я康腇c-OB蛋白，類似物或其衍生物以導(dǎo)致阻止另外的膽結(jié)石積累或膽結(jié)石重積累。循環(huán)Fc-OB蛋白或類似物的水平用診斷試劑盒監(jiān)測，如抗體抗Fc-OB分析蛋白(如果要求時(shí)，或其它可用的抗體來源)。實(shí)施例10一位糖尿病患者期待用較小劑量胰島素治療糖尿病。該患者被施以有效量的Fc-OB蛋白，類似物或其衍生物，導(dǎo)致瘦組織物質(zhì)增加，該患者對(duì)胰島素的敏感性增加，緩解糖尿病癥狀所需的劑量下降，無論以所需的胰島素單位形式或以每天所需注射胰島素的次數(shù)形式都下降。循環(huán)的Fc-OB蛋白或類似物或衍生物的水平可通過診斷試劑盒監(jiān)測，如抗OB蛋白的抗體分析(如果要求時(shí)，或其它可用抗原來源)。實(shí)施例11一個(gè)非肥胖患者為治療目的期待瘦組織物質(zhì)增加，例如從瘦組織物質(zhì)消耗的病癥中恢復(fù)。該患者被施以有效劑量的Fc-OB蛋白或其類似物或衍生物，導(dǎo)致期待的瘦組織物質(zhì)增加。瘦組織物質(zhì)增加用DEXA掃描法監(jiān)測。循環(huán)Fc-OB蛋白或類似物或衍生物水平可通過診斷試劑盒監(jiān)測，如抗OB蛋白(如果要求時(shí)，或其它可用的抗原來源)的抗體分析。材料和方法動(dòng)物野生型CD1小鼠V和(+/+)C57B16小鼠應(yīng)用于以上實(shí)施例。鼠齡在起始治療時(shí)間點(diǎn)為8周，動(dòng)物體重穩(wěn)定。
飼養(yǎng)和體重測量小鼠用在粉末食物進(jìn)料器磨碎的嚙齒動(dòng)物食物(PMI Feeds.Inc.)(Allentow Caging and Equipment)飼養(yǎng)，該法比常規(guī)塊狀食物更準(zhǔn)確和敏感的測量。每天同一時(shí)間(200pm)稱量體重，持續(xù)期待的時(shí)期。注射前一天的體重定為基礎(chǔ)體重，使用重達(dá)18-22克的小鼠。
籠養(yǎng)小鼠單獨(dú)籠養(yǎng)，保持在人道條件下。
施用蛋白或介質(zhì)蛋白(如下所述)或介質(zhì)(磷酸緩沖鹽，pH7.4)通過皮下注射或靜脈內(nèi)施用。
對(duì)照對(duì)照動(dòng)物為僅注射媒介質(zhì)，而未添加Fc-OB蛋白或OB蛋白至介質(zhì)中。
蛋白序列ID.Nos.1，2和3闡明鼠重組OB DNA和蛋白(圖1)，序列ID.Nos.4，5和6闡明重組人OB DNA和蛋白的類似物(圖2)。如上所指出，重組人OB蛋白如SEQ.ID.No.6，35位具賴氨酸殘基而74位具異亮氨酸殘基。進(jìn)一步的，重組人蛋白在Zhang等，自然，上述，和PCT出版物WO96/05 309(12/22/96)(二者連圖引入僅作參考)所闡述。圖1和2的鼠和人類似物重組蛋白，為以本方法處理形成Fc-OB蛋白和藥物生產(chǎn)的OB蛋白的例證。其它OB蛋白或Fc蛋白或其類似物或其衍生物也可用于形成Fc-OB融合蛋白。
在此，重組OB蛋白的氨基酸序列的(第一個(gè)氨基酸始為+1，為纈氨酸，在-1位的氨基酸為甲硫氨酸。C-末端氨基酸為146位(半胱氨酸)(見圖1和2)。圖3重組人Fc-OB蛋白的第一個(gè)氨基酸序列始為+1，為谷氨酸，-1位的氨基酸為甲硫氨酸。C末端氨基酸為378位(半胱氨酸)。圖4重組人Fc-OB蛋白變體的首個(gè)氨基酸序列始為+1，為谷氨酸，-1位氨基酸為甲硫氨酸。C-末端氨基酸為378位(半胱氨酸)。圖5的重組人Fc-OB蛋白氨基酸變體的第一個(gè)氨基酸序列始指為+1，為天冬氨酸，-1位氨基酸為甲硫氨酸。C-末端氨基酸為373位(半胱氨酸)。圖6的重組人Fc-OB蛋白變體中第一個(gè)氨基酸始為+1，為天冬氨酸，-1位氨基酸為甲硫氨酸。C-末端氨基酸為373位(半胱氨酸)。
表達(dá)載體和宿主菌株使用的表達(dá)載體質(zhì)粒為pAMG21(ATCC)登記號(hào)98113)，為pCFM1656(ATCC登記號(hào)69576)的衍生物，具合適限制性位點(diǎn)在lux PR啟動(dòng)子下游插入基因(見美國專利No.5,169,318描述lux表達(dá)系統(tǒng))。Fc-OB DNA，如下所述在圖3-6中所示，在限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和BamHI線性化作用下產(chǎn)生結(jié)合到表達(dá)載體pAMG21，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌株FM5。大腸桿菌FM5細(xì)胞由Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA從大腸桿菌K-12菌株衍生。(Bachmann，等，細(xì)菌綜述，40116-167(1976))，包括結(jié)合的λ噬菌體抑制子基因。cI587(Sussman等，C.R.學(xué)術(shù)科學(xué)2541517-1579(1962))。載體產(chǎn)生，細(xì)胞轉(zhuǎn)化，克隆篩選按標(biāo)準(zhǔn)方法操作，(例Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，NY.)。宿主細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中生長。
Fc-OB DNA構(gòu)建質(zhì)粒pFc-A3(下述)作為人免疫球蛋白IgG-1重鏈從氨基酸99位(谷氨酸)至天然羧基端的序列來源。人IgG-1序列可從Genebank(P01857)獲得。
人OB序列披露在上述Zhang等自然，同上PCT出版物WO96/05309包括圖引入僅作參考。OB DNA連接到以限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI連線性化的表達(dá)載體pCFM1656中，使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，例Sambrook，等.，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，N.Y.。攜帶OB DNA序列質(zhì)粒pCFM1656作為重組人OB基因序列的來源。
使PCR重疊擴(kuò)增法使兩序列融合(HO，S.N.，等多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重疊擴(kuò)增定點(diǎn)誘變，基因7751-59(1989))，PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeI切割，以產(chǎn)生5′-粘性末端，用限制性內(nèi)切酶BamHI產(chǎn)生3′-粘性末端。載體pAMG21，以相似方法切割。連接反應(yīng)用融合片段和線性載體實(shí)施。連接DNA通過電融合轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主菌中。檢查卡那霉素(50μg/ml)選擇瓊脂皿上存活的克隆的Fc-OB分類蛋白的表達(dá)。分離來自各個(gè)克隆的質(zhì)粒，檢驗(yàn)基因編碼區(qū)的序列。
當(dāng)要求對(duì)Fc-OB蛋白基因作額外修飾時(shí)，再次應(yīng)用PCR技術(shù)制造變化。在融合蛋白(SEQ.ID.No.9)的N-末端實(shí)施兩種變化以產(chǎn)生變體SEQ.ID.NOS.12和15。另一變體構(gòu)建以介導(dǎo)四個(gè)氨基酸取代以清除Fc-受體結(jié)合位點(diǎn)(15位亮氨酸以谷氨酸取代)，補(bǔ)體(Clq)結(jié)合位點(diǎn)(98位谷氨酸以丙氨酸取代100位賴氨酸被丙氨酸替代，102位賴氨酸被丙氨酸替代。(見Xin Xiao Zhang等免疫學(xué)雜志1545590-5600(1995))。該構(gòu)建體的模板為SEQ.ID.No.15，產(chǎn)生的變體為SEQ.ID.Nos.18。
pFC-A3載體構(gòu)建質(zhì)粒pFC-A3，含有編碼人免疫球蛋白IgG-1重鏈Fc部分(見Ellison，J.W.等，核酸研究，104071-4079(1982))，從鉸鏈區(qū)首位氨基酸Glu-99至羧基末端添加5′-NotI融合位點(diǎn)和3′-SalI和XbaI位點(diǎn)，均由PCR擴(kuò)增人脾cDNA文庫得到。PCR反應(yīng)終體積為(100μl)，使用2單位Vent DNA聚合酶加在20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，每個(gè)dNTP 400mM和要擴(kuò)增的1ng cDNA文庫和1μM每種引物。反應(yīng)起始為95℃變性2分鐘，而后30個(gè)循環(huán)，循環(huán)為95℃30秒，55℃30秒，73℃2分鐘。5′端引物摻入在NotI位點(diǎn)緊鄰5′端至IgG-1鉸鏈區(qū)的首個(gè)殘基(Glu-99)。3′-端引物摻入SalI和XbaI位點(diǎn)。717堿基對(duì)PCR產(chǎn)物用NotI和SalI消化，產(chǎn)生的DNA片段1％瓊脂糖電泳分離純化并克隆至NotI，SalI消化的pBluescript II KS載體(Stratagene)中。在得到的質(zhì)粒pFc-A3的插入，測序以確定PCR反應(yīng)的忠實(shí)性。
制備方法以下制備方法用于制備生物活性重組甲硫氨酸鼠或人類似OB蛋白和Fc-OB融合蛋白。相似方法可用于制備生物活性甲硫氨酸人OB蛋白。
發(fā)酵方法應(yīng)用批量發(fā)酵方法。培養(yǎng)基組成如下所述。
包括基本氮源的培養(yǎng)基部分進(jìn)行滅菌(升溫至120℃-123℃25-35分鐘)，在發(fā)酵容器中進(jìn)行，冷卻后，無菌加入碳，鎂，磷酸和微量金屬源。發(fā)酵罐中加入以上重組鼠蛋白制備菌500mL(LB液體培養(yǎng)基中生長)的過夜培養(yǎng)物。當(dāng)培養(yǎng)至最佳密度(600nm測量作為細(xì)胞密度指示)。達(dá)到15-25吸光值時(shí)，加入(1mL/L)自發(fā)誘導(dǎo)物溶液(0.5mg/mL高絲氨酸內(nèi)酯)入培養(yǎng)物中誘導(dǎo)重組基因表達(dá)。發(fā)酵過程允許另外進(jìn)行10至16小時(shí)，而后離心收獲液體培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基組成一次操作需原料
34g/L 酵母抽提物78g/L 大豆蛋白0.9g/L 氯化鉀5.0g/L Hexaphos1.7g/L 檸檬酸120g/L 甘油0.5g/L MgSO4·7H2O0.2mg/L痕量金屬溶液0.5mL/LP2000消泡劑痕量金屬溶性氯化鐵(FeCl3·6H2O) 27g/L氯化鋅(ZnCl2·4H2O) 2g/L氯化鈷(CoCl2·6H2O) 2g/L鉬酸鈉(NaMoO4·2H2O)2g/L氯化鈣(CaCl2·2H2O) 1g/L硫酸銅(CuSO4·5H2O) 1.9g/L硼酸(H3BO3) 0.5g/L氯化錳(MnCl2·4H2O) 1.6g/L檸檬酸鈉二水合物 73.5g/L人Fc-OB融合蛋白純化過程純化人Fc-OB融合蛋白按以下步驟進(jìn)行(除非其它說明，以下步驟在4℃操作)。純化鼠和人OB蛋白方法公開于PCT出版物WO96/05309，上述，在此引入僅作參考。
1.細(xì)胞糊。大腸桿菌細(xì)胞糊重懸在5倍體積蒸餾水中。水中的細(xì)胞進(jìn)一步二次通過微流體器破裂。破裂細(xì)胞在Beckman JB-6離心機(jī)用J5-4.2轉(zhuǎn)子4.2k rpm離心1小時(shí)。
2.包含體洗滌。來自上述的上清液去除，以5倍體積蒸餾水重懸沉淀?；旌衔锶绮襟E1離心。
3.溶解。沉淀以10體積50mM Tris.pH 8.5，8M鹽酸胍，10mM二硫蘇糖醇溶解，室溫?cái)嚢?小時(shí)。溶液為40mM胱胺二氫氯化物，攪拌1小時(shí)。
4.步驟3的溶液加入20至30體積的以下重新拌入溶液50mMTris。pH8.5，0.8M精氨酸，2M尿素和4mM半胱氨酸。重新拌入物8℃攪拌16小時(shí)。
5.緩沖液交換。步驟4的溶液濃縮，過濾到10mM Tris，pH8.5。
6.酸沉淀。步驟5的溶液用50％冰乙酸調(diào)至pH4.75，室溫孵育30分鐘，溶液過濾。
7.陽離子交換層析。步驟6的溶液調(diào)至pH7.0，10℃上樣至CM，瓊脂糖凝膠快速流動(dòng)柱中。20柱體積梯度洗脫，洗脫液為10mM磷酸鹽，pH7.0，0至0.1M NaCl。
8.陰離子交換層析。步驟7的CM洗脫集中液用5mM Tris，pH7.5稀釋5倍，10℃上樣至Q瓊脂糖快速流動(dòng)柱中，20柱體積洗脫液為10mM Tris，pH7.5，0至0.2M NaCl洗脫。
9.疏水相互層析。Q瓊脂糖洗脫集中液溶到0.75硫酸銨，室溫上樣到甲基Macroprep疏水相互作用柱。20柱體積洗脫液10mM磷酸鹽，pH7.0，0.75M至0M硫酸銨，洗脫。
10.緩沖液交換。步驟9的集中液如需要?jiǎng)t進(jìn)行濃縮再對(duì)PBS緩沖液透析。
當(dāng)本發(fā)明以優(yōu)選實(shí)施方案描述時(shí)，可以理解本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行各種變化和修飾。因此，應(yīng)該認(rèn)為所附的權(quán)利要求書覆蓋上述所有的等值變化方法，如權(quán)利所要求的，這些方法均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請人Mann，Michael B.
Hecht，Randy I.
(ii)發(fā)明題目OB融合蛋白組合物和方法(iii)序列數(shù)18(iv)通信地址(A)收件人Amgen Inc.
(B)大街1840 DeHavilland Drive(C)城市Thousand Oaks(D)州CA(E)國家美國(F)郵政編碼91320-1789(v)可讀計(jì)算機(jī)類型(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，版本1.30(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)朥S08/770,973(B)申請?zhí)岢鋈掌?996，12，20(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Knight，Matthew W.
(B)登記號(hào)36,846(C)參考/摘要號(hào)A-416(2)SEQ ID NO.1信息(i)序列特征(A)長度491堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵misc-feature(B)定位41
(D)其它信息/注意＝“Met＝ATG”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.1TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATGGTACCGA TCCAGAAAGT60TCAGGACGAC ACCAAAACCT TAATTAAAAC GATCGTTACG CGTATCAACG ACATCAGTCA 120CACCCAGTCG GTCTCCGCTA AACAGCGTGT TACCGGTCTG GACTTCATCC CGGGTCTGCA 180CCCGATCCTA AGCTTGTCCA AAATGGACCA GACCCTGGCT GTATACCAGC AGGTGTTAAC 240CTCCCTGCCG TCCCAGAACG TTCTTCAGAT CGCTAACGAC CTCGAGAACC TTCGCGACCT 300GCTGCACCTG CTGGCATTCT CCAAATCCTG CTCCCTGCCG CAGACCTCAG GTCTTCAGAA 360ACCGGAATCC CTGGACGGGG TCCTGGAAGC ATCCCTGTAC AGCACCGAAG TTGTTGCTCT 420GTCCCGTCTG CAGGGTTCCC TTCAGGACAT CCTTCAGCAG CTGGACGTTT CTCCGGAATG 480TTAATGGATC C491(2)SEQ ID NO.2信息(i)序列特征(A)長度491堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ.ID.NO.2AGATCTAAAC TCAAAATTGA AAATCTTCCT CCTTATTGTA TACCATGGCT AGGTCTTTCA60AGTCCTGCTG TGGTTTTGGA ATTAATTTTG CTAGCAATGC GCATAGTTGC TGTAGTCAGT 120GTGGGTCAGC CAGAGGCGAT TTGTCGCACA ATGGCCAGAC CTGAAGTAGG GCCCAGACGT 180GGGCTAGGAT TCGAACAGGT TTTACCTGGT CTGGGACCGA CATATGGTCG TCCACAATTG 240GAGGGACGGC AGGGTCTTGC AAGAAGTCTA GCGATTGCTG GAGCTCTTGG AAGCGCTGGA 300CGACGTGGAC GACCGTAAGA GGTTTAGGAC GAGGGACGGC GTCTGGAGTC CAGAAGTCTT 360TGGCCTTAGG GACCTGCCCC AGGACCTTCG TAGGGACATG TCGTGGCTTC AACAACGAGA 420CAGGGCAGAC GTCCCAAGGG AAGTCCTGTA GGAAGTCGTC GACCTGCAAA GAGGCCTTAC 480AATTACCTAC C491(2)SEQ ID NO.3信息(i)序列特征(A)長度147個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)定位1(D)其它信息/注意＝Met(ATG)從1開始(xi)序列描述SEQ.D.NO.3Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Lea Ile Lys1 5 10 15Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser20 25 30Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro35 40 45Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln50 55 60Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp65 70 75 80Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser85 90 95Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp100 105 110Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser115 120 125Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser130 135 140Pro Glu Cys145(2)SEQ ID NO.4信息(i)序列特征(A)長度454堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵misc-feature(B)定位4(D)其它信息/注意＝“Met＝ATG”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.4CATATGGTAC CGATCCAGAA AGTTCAGGAC GACACCAAAA CCTTAATTAA AACGATCGTT60ACGCGTATCA ACGACATCAG TCACACCCAG TCGGTGAGCT CTAAACAGCG TGTTACAGGC 120CTGGACTTCA TCCCGGGTCT GCACCCGATC CTGACCTTGT CCAAAATGGA CCAGACCCTG 180GCTGTATACC AGCAGATCTT AACCTCCATG CCGTCCCGTA ACGTTCTTCA GATCTCTAAC 240GACCTCGAGA ACCTTCGCGA CCTGCTGCAC GTGCTGGCAT TCTCCAAATC CTGCCACCTG 300CCATGGGCTT CAGGTCTTGA GACTCTGGAC TCTCTGGGCG GGGTCCTGGA AGCATCCGGT 360TACAGCACCG AAGTTGTTGC TCTGTCCCGT CTGCAGGGTT CCCTTCAGGA CATGCTTTGG 420CAGCTGGACC TGTCTCCGGG TTGTTAATGG ATCC 454(2)SEQ ID NO.5信息(i)序列特征(A)長度454堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ.ID.NO.5GTATACCATG GCTAGGTCTT TCAAGTCCTG CTGTGGTTTT GGAATTAATT TTGCTAGCAA60TGCGCATAGT TGCTGTAGTC AGTGTGGGTC AGCCACTCGA GATTTGTCGC ACAATGTCCG 120GACCTGAAGT AGGGCCCAGA CGTGGGCTAG GACTGGAACA GGTTTTACCT GGTCTGGGAC180CGACATATGG TCGTCTAGAA TTGGAGGTAC GGCAGGGCAT TGCAAGAAGT CTAGAGATTG240CTGGAGCTCT TGGAAGCGCT GGACGACGTG CACGACCGTA AGAGGTTTAG GACGGTGGAC300GGTACCCGAA GTCCAGAACT CTGAGACCTG AGAGACCCGC CCCAGGACCT TCGTAGGCCA360ATGTCGTGGC TTCAACAACG AGACAGGGCA GACGTCCCAA GGGAAGTCCT GTACGAAACC420GTCGACCTGG ACAGAGGCCC AACAATTACC TAGG454(2)SEQ ID NO.6信息(i)序列特征(A)長度147氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)定位1(D)其它信息/注意＝“Met(ATG)從1開始”(xi)序列描述SEQ.D.NO.6Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys1 5 10 15Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser20 25 30Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro35 40 45Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln50 55 60Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gln Ile Ser Asn Asp65 70 75 80Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser85 90 95Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly100 105 110Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser115 120 125Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser130 135 140Pro Gly Cys145(2)SEQ ID NO.7信息(i)序列特征(A)長度1150堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵misc-feature(B)定位4(C)其它信息/注意＝“Met＝ATG”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.7CATATGGAAC CCAAATCTTG TGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC AGCACCTGAA60CTCCTGGGGG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC 120TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC 180AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG 240GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 300CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG 360AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA 420TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT 480CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC 540ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 600AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 660AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AAGTACCGAT CCAGAAAGTT 720CAGGACGACA CCAAAACCTT AATTAAAACG ATCGTTACGC GTATCAACGA CATCAGTCAC 780ACCCAGTCGG TGAGCTCTAA ACAGAAAGTT ACAGGCCTGG ACTTCATCCC GGGTCTGCAC 840CCGATCCTGA CCTTGTCCAA AATGGACCAG ACCCTGGCTG TATACCAGCA GATCTTAACC 900TCCATGCCGT CCCGTAACGT TATCCAGATC TCTAACGACC TCGAGAACCT TCGCGACCTG 960CTGCACGTGC TGGCATTCTC CAAATCCTGC CACCTGCCAT GGGCTTCAGG TCTTGAGACT1020CTGGACTCTC TGGGCGGGGT CCTGGAAGCA TCCGGTTACA GCACCGAAGT TGTTGCTCTG1080TCCCGTCTGC AGGGTTCCCT TCAGGACATG CTTTGGCAGC TGGACCTGTC TCCGGGTTGT1140TAATGGATCC 1150(2)SEQ ID NO.8信息(i)序列特征(A)長度1150堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ.ID.NO8GTATACCTTG GGTTTAGAAC ACTGTTTTGA GTGTGTACGG GTGGCACGGG TCGTGGACTT 60GAGGACCCCC CTGGCAGTCA GAAGGAGAAG GGGGGTTTTG GGTTCCTGTG GGAGTACTAG 120AGGGCCTGGG GACTCCAGTG TACGCACCAC CACCTGCACT CGGTGCTTCT GGGACTCCAG 180TTCAAGTTGA CCATGCACCT GCCGCACCTC CACGTATTAC GGTTCTGTTT CGGCGCCCTC 240CTCGTCATGT TGTCGTGCAT GGCACACCAG TCGCAGGAGT GGCAGGACGT GGTCCTGACC 300GACTTACCGT TCCTCATGTT CACGTTCCAG AGGTTGTTTC GGGAGGGTCG GGGGTAGCTC 360TTTTGGTAGA GGTTTCGGTT TCCCGTCGGG GCTCTTGGTG TCCACATGTG GGACGGGGGT 420AGGGCCCTAC TCGACTGGTT CTTGGTCCAG TCGGACTGGA CGGACCAGTT TCCGAAGATA 480GGGTCGCTGT AGCGGCACCT CACCCTCTCG TTACCCGTCG GCCTCTTGTT GATGTTCTGG 540TGCGGAGGGC ACGACCTGAG GCTGCCGAGG AAGAAGGAGA TGTCGTTCGA GTGGCACCTG 600TTCTCGTCCA CCGTCGTCCC CTTGCAGAAG AGTACGAGGC ACTACGTACT CCGAGACGTG 660TTGGTGATGT GCGTCTTCTC GGAGAGGGAC AGAGGCCCAT TTCATGGCTA GGTCTTTCAA 720GTCCTGCTGT GGTTTTGGAA TTAATTTTGC TAGCAATGCG CATAGTTGCT GTAGTCAGTG 780TGGGTCAGCC ACTCGAGATT TGTCTTTCAA TGTCCGGACC TGAAGTAGGG CCCAGACGTG 840GGCTAGGACT GGAACAGGTT TTACCTGGTC TGGGACCGAC ATATGGTCGT CTAGAATTGG 900AGGTACGGCA GGGCATTGCA ATAGGTCTAG AGATTGCTGG AGCTCTTGGA AGCGCTGGAC 960GACGTGCACG ACCGTAAGAG GTTTAGGACG GTGGACGGTA CCCGAAGTCC AGAACTCTGA1020GACCTGAGAG ACCCGCCCCA GGACCTTCGT AGGCCAATGT CGTGGCTTCA ACAACGAGAC1080AGGGCAGACG TCCCAAGGGA AGTCCTGTAC GAAACCGTCG ACCTGGACAG AGGCCCAACA1140ATTACCTAGG 1150(2)SEQ ID NO.9信息(i)序列特征(A)長度379氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)定位1(D)其它信息/注意＝“Met(ATG)從1開始”(xi)序列描述 SEQ ID.NO.9Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10 15Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys20 25 30Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val35 40 45Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr50 55 60Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu65 70 75 80Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His85 90 95Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys100 105 110Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln115 120 125Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu130 135 140Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro145 150 155 160Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn165 170 175Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu180 185 190Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val195 200 205Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln210 215 220Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln225 230 235 240Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp245 250 255Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu260 265 270Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp275 280 285Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg290 295 300Asn Val Ila Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu305 310 315 320His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly325 330 335Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr340 345 350Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp355 360 365(2)SEQ ID NO.10信息(i)序列特征(A)長度1150堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵misc-feature(B)定位4(D)其它信息/注意＝“Met＝ATG”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.10CATATGGAAC CAAAATCTGC TGACAAAACT CACACATGTC CACCTTGTCC AGCTCCGGAA60CTCCTGGGGG GTCCTTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC 120TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC 180AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG 240GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 300CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG 360AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA 420TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT 480CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC 540ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 600AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 660AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AAGTACCGAT CCAGAAAGTT 720CAGGACGACA CCAAAACCTT AATTAAAACG ATCGTTACGC GTATCAACGA CATCAGTCAC 780ACCCAGTCGG TGAGCTCTAA ACAGAAAGTT ACAGGCCTGG ACTTCATCCC GGGTCTGCAC 840CCGATCCTGA CCTTGTCCAA AATGGACCAG ACCCTGGCTG TATACCAGCA GATCTTAACC 900TCCATGCCGT CCCGTAACGT TATCCAGATC TCTAACGACC TCGAGAACCT TCGCGACCTG960CTGCACGTGC TGGCATTCTC CAAATCCTGC CACCTGCCAT GGGCTTCAGG TCTTGAGACT 1020CTGGACTCTC TGGGCGGGGT CCTGGAAGCA TCCGGTTACA GCACCGAAGT TGTTGCTCTG 1080TCCCGTCTGC AGGGTTCCCT TCAGGACATG CTTTGGCAGC TGGACCTGTC TCCGGGTTGT 1140TAATGGATCC 1150(2)SEQ ID NO.11信息(i)序列特征(A)長度1150堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ.ID.NO.11GTATACCTTG GTTTTAGACG ACTGTTTTGA GTGTGTACAG GTGGAACAGG TCGAGGCCTT 60GAGGACCCCC CAGGAAGTCA GAAGGAGAAG GGGGGTTTTG GGTTCCTGTG GGAGTACTAG 120AGGGCCTGGG GACTCCAGTG TACGCACCAC CACCTGCACT CGGTGCTTCT GGGACTCCAG 180TTCAAGTTGA CCATGCACCT GCCGCACCTC CACGTATTAC GGTTCTGTTT CGGCGCCCTC 240CTCGTCATGT TGTCGTGCAT GGCACACCAG TCGCAGGAGT GGCAGGACGT GGTCCTGACC 300GACTTACCGT TCCTCATGTT CACGTTCCAG AGGTTGTTTC GGGAGGGTCG GGGGTAGCTC 360TTTTGGTAGA GGTTTCGGTT TCCCGTCGGG GCTCTTGGTG TCCACATGTG GGACGGGGGT 420AGGGCCCTAC TCGACTGGTT CTTGGTCCAG TCGGACTGGA CGGACCAGTT TCCGAAGATA 480GGGTCGCTGT AGCGGCACCT CACCCTCTCG TTACCCGTCG GCCTCTTGTT GATGTTCTGG 540TGCGGAGGGC ACGACCTGAG GCTGCCGAGG AAGAAGGAGA TGTCGTTCGA GTGGCACCTG 600TTCTCGTCCA CCGTCGTCCC CTTGCAGAAG AGTACGAGGC ACTACGTACT CCGAGACGTG 660TTGGTGATGT GCGTCTTCTC GGAGAGGGAC AGAGGCCCAT TTCATGGCTA GGTCTTTCAA 720GTCCTGCTGT GGTTTTGGAA TTAATTTTGC TAGCAATGCG CATAGTTGCT GTAGTCAGTG 780TGGGTCAGCC ACTCGAGATT TGTCTTTCAA TGTCCGGACC TGAAGTAGGG CCCAGACGTG 840GGCTAGGACT GGAACAGGTT TTACCTGGTC TGGGACCGAC ATATGGTCGT CTAGAATTGG 900AGGTACGGCA GGGCATTGCA ATAGGTCTAG AGATTGCTGG AGCTCTTGGA AGCGCTGGAC 960GACGTGCACG ACCGTAAGAG GTTTAGGACG GTGGACGGTA CCCGAAGTCC AGAACTCTGA1020GACCTGAGAG ACCCGCCCCA GGACCTTCGT AGGCCAATGT CGTGGCTTCA ACAACGAGAC1080AGGGCAGACG TCCCAAGGGA AGTCCTGTAC GAAACCGTCG ACCTGGACAG AGGCCCAACA1140ATTACCTAGG 1150(2)SEQ ID NO.12信息(i)序列特征(A)長度579氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)定位1(D)其它信息/注意＝“Met(ATG)從1開始”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.12Met Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10 15Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys20 25 30Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val35 40 45Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr50 55 60Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu65 70 75 80Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His85 90 95Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys100 105 110Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln115 120 125Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu130 135 140Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro145 150 155 160Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn165 170 175Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu180 185 190Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val195 200 205Phe Ser Cys Sar Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln210 215 220Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln225 230 235 240Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp245 250 255Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu260 265 270Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp275 280 285Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg290 295 300Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Lau Arg Asp Leu Leu305 310 315 320His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly325 330 335Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr340 345 350Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp355 360 365Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys370 375(2)SEQ ID NO.13信息(i)序列特征(A)長度1135堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵misc-feature(B)定位4(D)其它信息/注意＝“Met＝ATG”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.13CATATGGACA AAACTCACAC ATGTCCACCT TGTCCAGCTC CGGAACTCCT GGGGGGTCCT 60TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG 120GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC 180GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC 240ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG 300TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA 360GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG 420ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 480GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG 540GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG 600CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG 660AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAAGTA CCGATCCAGA AAGTTCAGGA CGACACCAAA 720ACCTTAATTA AAACGATCGT TACGCGTATC AACGACATCA GTCACACCCA GTCGGTGAGC 780TCTAAACAGA AAGTTACAGG CCTGGACTTC ATCCCGGGTC TGCACCCGAT CCTGACCTTG 840TCCAAAATGG ACCAGACCCT GGCTGTATAC CAGCAGATCT TAACCTCCAT GCCGTCCCGT 900AACGTTATCC AGATCTCTAA CGACCTCGAG AACCTTCGCG ACCTGCTGCA CGTGCTGGCA 960TTCTCCAAAT CCTGCCACCT GCCATGGGCT TCAGGTCTTG AGACTCTGGA CTCTCTGGGC1020GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT 1080TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTGTCTCCGG GTTGTTAATG GATCC1135(2)SEQ ID NO.14信息(i)序列特征(A)長度1135堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ.ID.NO.14GTATACCTGT TTTGAGTGTG TACAGGTGGA ACAGGTCGAG GCCTTGAGGA CCCCCCAGGA60AGTCAGAAGG AGAAGGGGGG TTTTGGGTTC CTGTGGGAGT ACTAGAGGGC CTGGGGACTC 120CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCGGTG CTTCTGGGAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG 180CACCTGCCGC ACCTCCACGT ATTACGGTTC TGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTCG 240TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGTGGCAG GACGTGGTCC TGACCGACTT ACCGTTCCTC 300ATGTTCACGT TCCAGAGGTT GTTTCGGGAG GGTCGGGGGT AGCTCTTTTG GTAGAGGTTT 360CGGTTTCCCG TCGGGGCTCT TGGTGTCCAC ATGTGGGACG GGGGTAGGGC CCTACTCGAC 420TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC CAGTTTCCGA AGATAGGGTC GCTGTAGCGG 480CACCTCACCC TCTCGTTACC CGTCGGCCTC TTGTTGATGT TCTGGTGCGG AGGGCACGAC 540CTGAGGCTGC CGAGGAAGAA GGAGATGTCG TTCGAGTGGC ACCTGTTCTC GTCCACCGTC 600GTCCCCTTCC AGAAGAGTAC GAGGCACTAC GTACTCCGAG ACGTGTTGGT GATGTGCGTC 660TTCTCGGAGA GGGACAGAGG CCCATTTCAT GGCTAGGTCT TTCAAGTCCT GCTGTGGTTT 720TGGAATTAAT TTTGCTAGCA ATGCGCATAG TTGCTGTAGT CAGTGTGGGT CAGCCACTCG 780AGATTTGTCT TTCAATGTCC GGACCTGAAG TAGGGCCCAG ACGTGGGCTA GGACTGGAAC 840AGGTTTTACC TGGTCTGGGA CCGACATATG GTCGTCTAGA ATTGGAGGTA CGGCAGGGCA 900TTGCAATAGG TCTAGAGATT GCTGGAGCTC TTGGAAGCGC TGGACGACGT GCACGACCGT 960AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA AGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 1020CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 1080AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG 1135(2)SEQ ID NO.15信息(i)序列特征(A)長度374氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)定位1(D)其它信息/注意＝“Met(ATG)從1開始”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.15Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu1 5 10 15Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu20 25 30Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser35 40 45His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu50 55 60Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr65 70 75 80Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn85 90 95Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro100 105 110Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln115 120 125Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val130 135 140Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val145 150 155 160Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro165 170 175Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr180 185 190Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val195 200 205Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu210 215 220Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr225 230 235 240Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln245 250 255Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly260 265 270Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val275 280 285Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile290 295 300Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe305 310 315 320Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp325 330 335Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val340 345 350Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu355 360 365Asp Leu Ser Pro Gly Cys370(2)SEQ ID NO.16信息(i)序列特征(A)長度1135堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA
(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵misc-feature(B)定位4(D)其它信息/注意＝“Met＝ATG”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.16CATATGGACA AAACTCACAC ATGCCCACCG TGCCCAGCTC CGGAACTCGA AGGTGGTCCG 60TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG 120GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC 180GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC 240ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAAGCT 300TACGCATGCG CGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA 360GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG 420ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 480GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG 540GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG 600CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG 660AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAAGTA CCGATCCAGA AAGTTCAGGA CGACACCAAA 720ACCTTAATTA AAACGATCGT TACGCGTATC AACGACATCA GTCACACCCA GTCGGTGAGC 780TCTAAACAGA AAGTTACAGG CCTGGACTTC ATCCCGGGTC TGCACCCGAT CCTGACCTTG 840TCCAAAATGG ACCAGACCCT GGCTGTATAC CAGCAGATCT TAACCTCCAT GCCGTCCCGT 900AACGTTATCC AGATCTCTAA CGACCTCGAG AACCTTCGCG ACCTGCTGCA CGTGCTGGCA 960TTCTCCAAAT CCTGCCACCT GCCATGGGCT TCAGGTCTTG AGACTCTGGA CTCTCTGGGC1020GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT1080TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTGTCTCCGG GTTGTTAATG GATCC 1135(2)SEQ ID NO.17信息(i)序列特征(A)長度1135堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ.D.NO.17GTATACCTGT TTTGAGTGTG TACGGGTGGC ACGGGTCGAG GCCTTGAGCT TCCACCAGGC 60AGTCAGAAGG AGAAGGGGGG TTTTGGGTTC CTGTGGGAGT ACTAGAGGGC CTGGGGACTC120CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCGGTG CTTCTGGGAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG180CACCTGCCGC ACCTCCACGT ATTACGGTTC TGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTCG240TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGTGGCAG GACGTGGTCC TGACCGACTT ACCGTTTCGA300ATGCGTACGC GCCAGAGGTT GTTTCGGGAG GGTCGGGGGT AGCTCTTTTG GTAGAGGTTT360CGGTTTCCCG TCGGGGCTCT TGGTGTCCAC ATGTGGGACG GGGGTAGGGC CCTACTCGAC420TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC CAGTTTCCGA AGATAGGGTC GCTGTAGCGG480CACCTCACCC TCTCGTTACC CGTCGGCCTC TTGTTGATGT TCTGGTGCGG AGGGCACGAC540CTGAGGCTGC CGAGGAAGAA GGAGATGTCG TTCGAGTGGC ACCTGTTCTC GTCCACCGTC600GTCCCCTTGC AGAAGAGTAC GAGGCACTAC GTACTCCGAG ACGTGTTGGT GATGTGCGTC660TTCTCGGAGA GGGACAGAGG CCCATTTCAT GGCTAGGTCT TTCAAGTCCT GCTGTGGTTT720TGGAATTAAT TTTGCTAGCA ATGCGCATAG TTGCTGTAGT CAGTGTGGGT CAGCCACTCG780AGATTTGTCT TTCAATGTCC GGACCTGAAG TAGGGCCCAG ACGTGGGCTA GGACTGGAAC840AGGTTTTACC TGGTCTGGGA CCGACATATG GTCGTCTAGA ATTGGAGGTA CGGCAGGGCA900TTGCAATAGG TCTAGAGATT GCTGGAGCTC TTGGAAGCGC TGGACGACGT GCACGACCGT960AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA AGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 1020CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 1080AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG1135(2)SEQ ID NO.1 8信息(i)序列特征(A)長度374氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)定位1(D)其它信息/注意＝“Met(ATG)從1開始”(xi)序列描述SEQ.ID.NO.18Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu1 5 10 15Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu20 25 30Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser35 40 45His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu50 55 60Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr65 70 75 80Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn85 90 95Gly Lys Ala Tyr Ala Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro100 105 110Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln115 120 125Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val130 135 140Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val145 150 155 160Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro165 170 175Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr180 185 190Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val195 200 205Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu210 215 220Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr225 230 235 240Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln245 250 255Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly260 265 270Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val275 280 285Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile290 295 300Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe305 310 315 320Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp325 330 335Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val340 345 350Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu355 360 365Asp Leu Ser Pro Gly Cys370
權(quán)利要求
1.一種具有選自R1-R2和R1-L-R2的通式的蛋白質(zhì)，其中R1為Fc蛋白或其類似物，R2為OB蛋白或其類似物，L為連接子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白，其中Fc，其類似物或衍生物選自下組(a)Fc氨基酸序列如SEQ.ID.NOS.9，12，15和18所示；(b)(a)的氨基酸序列，具有以下一個(gè)或多個(gè)位置(根據(jù)SEQ.ID.NOS.9使用編號(hào))，發(fā)生不同氨基酸取代或刪除(i) 一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基被丙氨酸或絲氨酸殘基取代；(ii) 一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基被苯丙氨酸殘基取代；(iii) 5位的氨基酸被丙氨酸取代；(iv) 20位的氨基酸被谷氨酸取代；(v) 103位的氨基酸被丙氨酸取代；(vi) 105位的氨基酸被丙氨酸替代；(vii) 107位的氨基酸被丙氨酸替代；(viii)1，2，3，4或5的氨基酸被刪除；(ix) 一個(gè)或更多殘基取代或刪除，以切除Fc受體結(jié)合位點(diǎn)；(x) 一個(gè)或更多殘基取代或刪除，以切除補(bǔ)體(Clq)結(jié)合位點(diǎn)；(xi) i-x亞部分的組合；(c)(a)或(b)氨基酸序列，其N-末端具甲硫氨酸殘基，(d)(a)至(c)的Fc蛋白、類似物或衍生物，包括與蛋白部分連接的一種化學(xué)部分；(e)(d)的衍生物，其中所述化學(xué)部分為水溶性聚合物部分；(f)(e)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；(g)(e)亞部分衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為多聚氨基酸部分；(h)(e)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分只與所述蛋白部分N-末端相連。
3.如權(quán)利要求1的蛋白，其中OB蛋白，其類似物或衍生物選自下組(a)SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.6所示的氨基酸序列1-146；(b)SEQ.ID.NO.6所示的氨基酸序列1-146，在35位為賴氨酸殘基和74位為異亮氨酸殘基；(c)(b)的氨基酸序列，在以下一個(gè)或更多位點(diǎn)發(fā)生了不同的氨基酸取代(根據(jù)SEQ.ID.NO.6編號(hào))4，8，32，33，35，48，50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111，112，118，136，138，142和145；(d)(a)，(b)或(c)的氨基酸序列，在28位可以缺失谷氨酰胺殘基；(e)(a)，(b)，(c)或(d)的氨基酸序列，在N-末端具甲硫氨酸殘基；(f)選自如下部分的截短的OB蛋白類似物(使用SEQ.ID.NO.6的號(hào)碼，35位具賴氨酸殘基，74位具異亮氨酸殘基)(i) 氨基酸98-146(ii) 氨基酸1-32(iii) 氨基酸40-116(iv) 氨基酸1-99和112-146(v) 氨基酸1-99和112-146有一個(gè)或多個(gè)氨基酸100-111順序地置于氨基酸99和112之間；和，(vi) (f)(i)截短的OB類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在100，102，105，106，107，108，111，112，118，136，138，142和145被另一個(gè)氨基酸取代；(vii) (f)(ii)截短的類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在4，8和32被其它氨基酸取代；(viii)(f)(iii)截短的類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111和112被其它氨基酸替代；(vix) (f)(iv)截短的類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在4，8，32，33，35，48，50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，112，118，136，138，142和145被其它氨基酸替代；(x) (f)(v)截短的類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在4，8，32，33，35，48，50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111，112，118，136，138，142和145位被其它氨基酸替代；(xi) (f)(i)-(x)之任一的截短的類似物，具N-末端甲硫氨酸殘基；(g)(a)～(f)之任一的OB蛋白或類似衍生物，包括一個(gè)與蛋白部分相連的化學(xué)部分；(h)(g)的衍生物，其中所述化學(xué)部分為水溶性聚合物部分；(i)(h)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；(j)(h)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為多聚氨基酸部分，和(k)(h)亞部分的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分只與所述蛋白部分的N-末端相連。
4.如權(quán)利要求1的蛋白，其中連接子序列是一個(gè)或多個(gè)選自甘氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸的氨基酸。
5.如權(quán)利要求1的蛋白，其中連接子選自(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly，gly；(f)gly，gly，gly，gly，gly；(g)gly，gly，gly，gly，gly，gly，gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly，gly，pro，gly，gly；(j)化學(xué)部分；和(k)(a)～(j)的任意組合。
6.一種融合蛋白，包括與OB蛋白，其類似物或衍生物相融合的Fc蛋白，其類似物或衍生物。
7.一種編碼如下一蛋白的核酸序列，所述蛋白具有選自從R1-R2和R1-L-R2的通式，其中R1為Fc蛋白或其類似物，R2為OB蛋白或其類似物，L為連接子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的編碼蛋白的核酸序列，該蛋白具有選自如下部分的Fc，類似物或衍生物部分；(a)如SEQ.ID.NOS.9，12，15和18所示的Fc氨基酸序列；(b)(a)的氨基酸序列，在以下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生不同氨基酸的取代或刪除，(根據(jù)SEQ.ID.NO.9編號(hào))；(i) 一個(gè)或多個(gè)半胱氨基酸被丙氨酸或絲氨酸殘基取代；(ii)一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基被苯丙氨酸殘基取代；(iii) 5位的氨基酸被丙氨酸取代；(iv)20位的氨基酸被谷氨酸取代；(v) 103位的氨基酸被丙氨酸取代；(vi)105位的氨基酸被丙氨酸替代；(vii) 107位的氨基酸被丙氨酸替代；(viii) 1，2，3，4或5位的氨基酸被刪除；(ix)一個(gè)或多個(gè)殘基取代或刪除，以切除Fc受體結(jié)合位點(diǎn)；(x) 一個(gè)或多個(gè)殘基取代或刪除，以切除補(bǔ)體(Clq)結(jié)合位點(diǎn)；(xi)i-x的組合；(c) (a)或(b)的氨基酸序列，其N-末端具有甲硫氨酸殘基；(d) 任何(a)～(c)的Fc蛋白、其類似物或衍生物，包括與蛋白部相連接的化學(xué)部分；(e) (d)的衍生物，其中所述化學(xué)部分為水溶性聚合物部分；(f) (e)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；(g) (e)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為多聚氨基酸部分；和(h) (e)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分單只與所述蛋白部分的N-末端連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的編碼一種蛋白的核酸序列，該蛋白具選自如下部分的OB蛋白，其類似物或衍生物部分(a)SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.6所示的氨基酸序列1-146；(b)如SEQ.ID.NO.6所示的氨基酸序列1-146，35位具賴氨酸殘基，74位具異亮氨酸殘基；(c)(b)的氨基酸序列，在以下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生不同氨基酸替代(根據(jù)SEQ.ID.NO.6編號(hào))4，8，32，33，35，48，50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111，112，118，136，138，142和145；(d)(a)，(b)或(c)的氨基酸序列，在28位可以缺失谷氨酰胺殘基；(e)(a)，(b)，(c)或(d)的氨基酸序列，在N-末端具有甲硫氨酸殘基；(f)一種選自如下的截短的OB蛋白類似物(采用SEQ.ID.NO.6的編號(hào)，在35位具賴氨酸殘基，74位具異亮氨酸殘基)(i)氨基酸98-146(ii) 氨基酸1-32(iii) 氨基酸40-116(iv) 氨基酸1-99和112-146(v)氨基酸1-99和112-146，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸100-111順序置于氨基酸99和112之間，(vi) (f)(i)截短的OB類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在100，102，105，106，107，108，111，112，118，136，138，142和145被其它氨基酸取代；(vii) (f)(ii)截短的類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在4，8和32被其它氨基酸所取代；(viii) (f)(iii)截短的類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111和112被其它氨基酸取代；(ix) (f)(iv)截短的類似物，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在4，8，32，33，35，48，50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，112，118，136，138，142和145被其它氨基酸所替代；(x)(f)(v)截短的類似物，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸在4，8，32，33，35，48，50，53，60，64，66，67，68，71，74，77，78，89，97，100，102，105，106，107，108，111，112，118，136，138，142和145被其它氨基酸所替代；(xi) (f)(i)～(x)之任一的截短的類似物，N-末端具甲硫氨酸殘基；(g)任何(a)～(f)之任一的OB蛋白或類似衍生物，包括連接到蛋白部分的化學(xué)部分；(h)(g)的衍生物，其中所述化學(xué)部分為水溶性聚合物部分。(i)(h)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；(j)(h)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為多聚氨基酸部分，和(k)(h)的衍生物，其中所述水溶性聚合物部分單獨(dú)與所述蛋白部分N-末端相連。
10.如權(quán)利要求7編碼一種蛋白的核酸序列，該蛋白具有的連接子序列的氨基酸選自Gly、Asn、Ser、Thr和Ala。
11.如權(quán)利要求7的編碼一種蛋白的核酸序列，該蛋白具有的連接子選自(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly，gly；(f)gly，gly，gly，gly，gly；(g)gly，gly，gly，gly，gly，gly，gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly，gly，pro，gly，gly；(j)化學(xué)部分；和(k)(a)～(j)的任何組合。
12.一種編碼融合蛋白的核酸序列，該蛋白具Fc蛋白，其類似物或衍生物，它與OB蛋白，其類似物或衍生物的N-末端融合。
13.一種含有如權(quán)利要求7或12的核酸序列的載體。
14.如權(quán)利要求13的載體，其中該載體是載有權(quán)利要求7或12的核酸序列的pAMG21。
15.一種包含權(quán)利要求13的載體的原核或真核的宿主細(xì)胞。
16.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求1或6蛋白的方法，該方法包括在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求15的宿主菌和分離所產(chǎn)生的蛋白的步驟。
17.權(quán)利要求16的方法，該方法進(jìn)一步包括純化產(chǎn)生的蛋白的步驟。
18.一種藥用組合物，該組合物包括在藥學(xué)可接受的稀釋劑，佐劑或載體中的有效量的權(quán)利要求1或6的蛋白。
19.一種治療以下疾病的方法，這些疾病包括肥胖，糖尿病，高血脂，動(dòng)脈硬化，動(dòng)脈斑，減少或阻止膽結(jié)石形成，瘦肉組織量不足，對(duì)胰島素敏感性不足，和中風(fēng)，其中所述的方法包括施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或6的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及Fc－OB融合蛋白的組合物,及該組合物的制備方法及其應(yīng)用。尤其是本發(fā)明涉及一種遺傳學(xué)的或化學(xué)的融合蛋白,該融合蛋白包括與OB蛋白,其衍生物或類似物的N末端部分融合的Fc免疫球蛋白區(qū),其衍生物或類似物。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1246154SQ97181817
公開日2000年3月1日 申請日期1997年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月20日
發(fā)明者M·B·曼, R·I·赫克特 申請人:安姆根有限公司