專(zhuān)利名稱(chēng)：基于染料二聚作用的生熒光蛋白水解酶底物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備和使用蛋白水解酶底物的方法，這種底物會(huì)經(jīng)酶水解而發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。本發(fā)明可用于微生物檢測(cè)和鑒定、滅菌檢測(cè)、藥物開(kāi)發(fā)、酶試驗(yàn)、免疫試驗(yàn)及其它生物測(cè)試。
背景技術(shù)：
蛋白水解酶是一類(lèi)催化水解肽鍵的酶。它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)決定了它們的活性和專(zhuān)一性。根據(jù)活性位點(diǎn)的組成，蛋白水解酶主要分成天冬氨酸蛋白水解酶、金屬蛋白水解酶、巰基蛋白水解酶和絲氨酸蛋白水解酶。蛋白水解酶的生理作用是眾所周知的。它們不僅參與消化、血凝和血纖蛋白溶解等功能(Lottenberg，R.；Christensen，U；Jackson，C.M.；Coleman，P.L.，利用肽生色和生熒光底物進(jìn)行的凝聚蛋白水解酶測(cè)試(Assay of Coagulation Proteases Using PeptiedeChromogenic and Fluorogenic Substrates)；Methods in Enzymology 198180341-361)，而且還參與排卵、致瘤、免疫應(yīng)答和病毒及細(xì)菌感染等(Livingston，D.C.；Brocklehurst，J.R.；Cannon，J.F.；Leytus，S.P.；Wehrly，J.A.；Peltz，S.W.；Peltz，G.A.；Mangel，W.F.，新的絲氨酸蛋白水解酶熒光活性位點(diǎn)滴定劑的合成和特征說(shuō)明(Synthesis and characterization of a new fluorogenic active-site titrant of serineprotease)；Biochem.1981，204298-4306)。例如，已知例如HIV的逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼一種蛋白水解酶，它在特定的剪切位置加工前體蛋白。這種剪切發(fā)生在病毒包裝時(shí)，而且是感染性病毒顆粒成熟所必需的。所以，抑制這種蛋白水解酶已經(jīng)成為設(shè)計(jì)抗包括AIDS在內(nèi)的抗病毒藥物的重要目標(biāo)。
此外，人們對(duì)于具有抗生素抗性的菌株和由食物引起的疾病有了越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)。在物保健、化妝品、食品和飲料行業(yè)控制微生造成的危害是一個(gè)重要的健康和安全問(wèn)題。細(xì)菌檢測(cè)是控制微生物危害不可缺的一部分。許多細(xì)菌能夠產(chǎn)生蛋白水解酶，這被廣泛用作鑒定和表征某些致病菌的標(biāo)準(zhǔn)。
要闡明和理解蛋白水解酶的生物功能、診斷生理疾病和開(kāi)發(fā)新藥，必需進(jìn)行靈敏而且定量的酶測(cè)試。已經(jīng)用了許多技術(shù)來(lái)測(cè)量蛋白水解酶的活性，其中包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、高性能液相層析(HPLC)、蛋白免疫印跡分析和薄層電泳分析。但是，這些方法往往需要許多步驟和試劑，而且操作起來(lái)很慢很昂貴。有時(shí)它們并不適合某些應(yīng)用，例如大量篩選藥物例如蛋白水解酶抑制劑。
生熒光物質(zhì)即經(jīng)酶水解從非熒光性變成強(qiáng)熒光的分子。它們被廣泛用作分子探針研究和測(cè)試病毒和細(xì)菌的蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、磷酸酯酶和激酶(Manafit，M.；W.；Bascomb，S.，用于細(xì)菌診斷的生熒光和生色底物(Fluorogenic andChromogenic Substrates used in Bacterial Diagnostics)；Microbiological Reviesws1991，55535-348)。在UV照射下，利用熒光顯微鏡，可以在96格測(cè)試板讀數(shù)儀中或在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中方便地觀察熒光。
有幾種市售的生熒光蛋白水解酶底物。例如EnzCheckTM試劑盒(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)，使用的是帶有熒光團(tuán)4，4-二氟-4-硼酸-3a-氮鎓-4a-氮雜-s-indacene(BODIPY)的快速猝滅酪蛋白底物。切斷時(shí)，熒光性BODIPY-肽被釋放。通常，如果胰蛋白酶濃度高達(dá)500ng/ml，在530nm可以觀察到強(qiáng)度增加2倍的熒光。有一種HIV蛋白水解酶的生熒光底物(Molecular Probes，Inc.)，它具有HIV蛋白水解酶的剪切位點(diǎn)，其一側(cè)有熒光團(tuán)5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸(EDANS)，另一側(cè)有受體生色團(tuán)4-(5-二甲基氨基苯基)偶氮苯磺酸(DABCYL)。如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)428,000中所述，EDANS熒光因分子內(nèi)共振能的轉(zhuǎn)移而被DABCYL生色團(tuán)猝滅，該過(guò)程要求供體和受體在肽鏈上彼此間的距離不超過(guò)100埃。熒光團(tuán)在340nm被激發(fā)，在490nm生熒光，它會(huì)因?yàn)榧?xì)菌培養(yǎng)基吸光或熒光而變暗。
美國(guó)專(zhuān)利4,314,936說(shuō)明的酶試驗(yàn)底物包含一條連續(xù)的肽鏈，在該肽鏈的一部分連接著熒光團(tuán)，另一部分連接著熒光猝滅基團(tuán)。在兩基團(tuán)之間任一位置的剪切釋放出熒光團(tuán)，可供檢測(cè)和定量。對(duì)于特定的酶需制備特定的氨基酸序列。熒光團(tuán)包括曙紅型、羅丹明型和熒光素型染料，以及EDANS型基團(tuán)。猝滅基團(tuán)(非染料或熒光團(tuán))包括硝基苯基、硝基芐氧基羰基、硝基苯甲?；认趸枷阕寤衔?。
PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO95/03429說(shuō)明了一種免疫酶試驗(yàn)過(guò)程，其中的熒光示蹤劑包含一段被轉(zhuǎn)移熒光能的供體和熒光能受體同時(shí)標(biāo)記的抗原模擬短肽。游離在溶液中時(shí)，因?yàn)榉肿觾?nèi)染料的二聚作用(猝滅)，示蹤劑表現(xiàn)出很微弱的熒光；當(dāng)與天然抗原的抗體結(jié)合時(shí)，熒光顯著增強(qiáng)，這是由于示蹤肽構(gòu)象的改變導(dǎo)致了分子二聚體的解離。代表形成分子內(nèi)二聚體的熒光能染料包括熒光素家族，例如熒光素、四甲基羅丹明、羅丹明B和Texas紅。所以，該申請(qǐng)說(shuō)明的是熒光因結(jié)合而增強(qiáng)而非因剪切而增強(qiáng)，以及，熒光的猝滅依賴(lài)于能轉(zhuǎn)移與染料二聚作用相結(jié)合。
美國(guó)專(zhuān)利4,822,764和5,254,477說(shuō)明了分析物的定量與定性分析，該分析依賴(lài)于熒光團(tuán)與生色性光吸收化合物或與另一種(光吸收)熒光團(tuán)之間的相互作用。當(dāng)熒光團(tuán)處于被激發(fā)態(tài)時(shí)，因其放射能和非放射能轉(zhuǎn)移而發(fā)生猝滅，而不是因?yàn)槿玖系亩圩饔谩４藭r(shí)，專(zhuān)利746的方法在分析物存在下只能使熒光增強(qiáng)10-20％。
美國(guó)專(zhuān)利5,605,809說(shuō)明了用于蛋白酶水解檢測(cè)的肽，這些肽在其兩端綴合有熒光團(tuán)，經(jīng)折疊使得熒光團(tuán)因分子內(nèi)的能轉(zhuǎn)移而猝滅。被目標(biāo)蛋白水解酶剪切時(shí)，熒光團(tuán)被釋放到附近，產(chǎn)生信號(hào)被檢測(cè)并定量。專(zhuān)利809的圖2A和2B顯示，當(dāng)?shù)孜锉患羟袝r(shí)，熒光最多增強(qiáng)了9倍。該專(zhuān)利說(shuō)明了許多肽，長(zhǎng)度為2至約8個(gè)氨基酸，2至約6個(gè)更好。這些熒光顯示劑吸收和發(fā)射可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)的光(400-700nm)。
熒光染料的猝滅通常有許多機(jī)制，包括能量轉(zhuǎn)移和染料二聚作用。在兩種情況中，當(dāng)含有通過(guò)X鏈連接的熒光染料供體和受體(受體可以是或不是熒光染料)的分子被輸入能激發(fā)(通常是特殊波長(zhǎng)光的輻照)時(shí)，能量被從供體染料轉(zhuǎn)移到受體染料，而不是由熒所發(fā)散掉。能量轉(zhuǎn)移，又稱(chēng)福斯特型偶極-偶極相互作用，一般發(fā)生在遠(yuǎn)距離(一般約100埃)的供體和受體之間。參見(jiàn)L.Stryer等，能量轉(zhuǎn)移發(fā)光標(biāo)尺；(Energy TransferSpectroscopic Ruler)；Biochemestry，1967，58719-726。另一方面，染料二聚或染料堆疊則發(fā)生在兩個(gè)或更多個(gè)熒光分子距離足夠近時(shí)，此時(shí)它們的平面芳香環(huán)相互作用而形成二聚體或三聚體。二聚或堆疊狀態(tài)下染料的吸收光譜與其在能量轉(zhuǎn)移對(duì)中時(shí)是完全不同的。染料二聚體吸收譜表現(xiàn)出特征性的主吸收峰隨染料濃度增高而減弱，同時(shí)表現(xiàn)出特征性的肩峰增強(qiáng)。該現(xiàn)象通常稱(chēng)為“譜帶分裂”。參見(jiàn)K.K.Rohatgi和G.S.Singhal，J.Phys.Chem.，1966，701695-1701。還下文中的圖2?？梢酝ㄟ^(guò)以在單位體積中增加染料量，或在物理上將兩個(gè)或更多個(gè)染料分子在同一連接分子(例如肽或其它小分子)上相互靠近來(lái)實(shí)現(xiàn)濃度的增高。二聚作用或堆疊通過(guò)形成基態(tài)復(fù)合物而發(fā)生(即通過(guò)鄰近的物理接觸)，而能量轉(zhuǎn)移相互作用則夸空間發(fā)生。因此，通過(guò)能量轉(zhuǎn)移機(jī)制相互作用的染料是觀察不到上述光譜改變的。
發(fā)明概述簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明提供一種生物學(xué)測(cè)試方法，它包括以下步驟提供一種酶的底物，所述底物包含結(jié)合于肽鏈上的一個(gè)或多個(gè)熒光染料基團(tuán)，所述的肽具有一個(gè)或多個(gè)可酶切連接鍵，染料基團(tuán)足夠靠近以至基本上自發(fā)猝滅了染料基團(tuán)的熒光，其中染料基團(tuán)熒光的自發(fā)猝滅可以通過(guò)染料的堆疊，更好的是通過(guò)染料當(dāng)?shù)囟圩饔枚l(fā)生，以及酶切一個(gè)或多個(gè)可酶切連接鍵，從染料二聚或堆疊中釋放熒光染料，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增加。
在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種蛋白水解酶底物，它包含具有兩個(gè)熒光染料基團(tuán)的肽，染料基團(tuán)足夠靠近以至基本上因形成分子內(nèi)二聚體而猝滅了染料基團(tuán)的熒光。
顯然，兩個(gè)以上熒光基團(tuán)可以與蛋白水解酶底物肽結(jié)合，并參與分子內(nèi)猝滅。
檢測(cè)產(chǎn)生特征酶的微生物的一種方法包括a)提供所述特征酶的專(zhuān)一性底物，其中包含與肽鏈結(jié)合的兩個(gè)或更多個(gè)熒光染料基團(tuán)，所述肽鏈具有一個(gè)或多個(gè)可被所述特征酶剪切的連接鍵，染料基團(tuán)足夠靠近以至基本上自發(fā)猝滅了染料基團(tuán)的熒光，其中染料基團(tuán)熒光的自發(fā)猝滅因染料堆疊而發(fā)生；和b)用所述的特征酶剪切所述肽的一個(gè)或多個(gè)可剪切連接鍵，從染料二聚作用中釋放出熒光染料，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增加。
較好的是，底物是具有兩個(gè)熒光染料分子的短肽(例如四甲基羅丹明)。肽具有對(duì)酶的親和性和專(zhuān)一性，水解前，染料分子因?yàn)榭拷纬啥垠w，造成明顯的熒光猝滅。特定肽鍵的酶水解因?yàn)槿玖匣鶊F(tuán)的彼此分離而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的明顯增強(qiáng)。在UV輻照下，用熒光顯微鏡，可以在96格測(cè)試板讀數(shù)儀或在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中方便地觀察熒光。較好的是在可見(jiàn)光譜內(nèi)發(fā)生熒光。生熒光底物是均一的，因?yàn)椴恍枰渌@影劑。這很重要，因?yàn)檫@就能夠用主要分離介質(zhì)來(lái)檢測(cè)和鑒定微生物，而不需要鑒定前耗費(fèi)時(shí)間的分離步驟。
在本申請(qǐng)中“染料二聚作用”表示兩染料基團(tuán)間形成復(fù)合物；“染料堆疊”表示兩個(gè)或更多染料基團(tuán)間形成復(fù)合物；“熒光”表示物質(zhì)在給定波長(zhǎng)因吸收另外不同波長(zhǎng)的光而發(fā)光，其中的發(fā)光只發(fā)生在吸收光的過(guò)程中；“摩爾吸光度”表示吸光物質(zhì)的相對(duì)光吸收，是根據(jù)每摩爾濃度每厘米光程的吸光量計(jì)算的；“熒光量子產(chǎn)率”表示發(fā)射物質(zhì)發(fā)出的熒光量子數(shù)量與被該物質(zhì)吸收的光子總數(shù)之比；
“熒光團(tuán)”表示吸收另一不同波長(zhǎng)(通常較短)的光后在給定波長(zhǎng)發(fā)光的分子。
本發(fā)明具有常規(guī)微生物檢測(cè)和鑒定方法所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)。它提供了快捷而且均質(zhì)的方法，并使用生色或生熒光底物來(lái)測(cè)定胞外及胞內(nèi)酶的活性。本發(fā)明的方法和底物改善了檢測(cè)和鑒定微生物的精確度、提高了速度并降低了總費(fèi)用。在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供的熒光顯示劑在被剪切時(shí)顯示出很高的信號(hào)水平，而在未剪切時(shí)的噪音則很低，而且只在可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)有效。此外，通過(guò)設(shè)計(jì)和選用特定的肽和與之結(jié)合的熒光團(tuán)，本發(fā)明還可以同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示的是基于染料二聚作用的生熒光底物的概念。
圖2顯示T-VPRGK-T(約10-5M)在被胰蛋白酶水解前(A線)后(B線)的吸光度譜圖。
圖3顯示在接觸副溶血弧菌溶解前(D線)后(C線)的熒光光譜。
優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供蛋白水解酶底物和生物測(cè)試方法，使用的蛋白水解酶底物包含兩個(gè)或更多個(gè)熒光染料基團(tuán)，染料基團(tuán)足夠靠近以至基本上猝滅了染料基團(tuán)的熒光，蛋白水解酶底物具有一個(gè)或多個(gè)可酶切連接鍵，自發(fā)的熒光猝滅是通過(guò)染料堆疊，更好的是通過(guò)染料二聚作用發(fā)生的。
酶切所述的一個(gè)或多個(gè)可酶切連接鍵，得到各含一個(gè)熒光染料基團(tuán)的產(chǎn)物，由此提高熒光強(qiáng)度。
染料基團(tuán)是熒光團(tuán)，在剪切前彼此相距不超過(guò)100埃。
較好的是，本發(fā)明方法使用含兩個(gè)自猝滅熒光染料基團(tuán)的底物。更好的是，本發(fā)明方法使用含有兩個(gè)相同的自猝滅熒光染料基團(tuán)的底物。
本發(fā)明還提供生熒光的酶底物，它包含至少兩個(gè)與肽鏈共價(jià)連接的熒光染料基團(tuán)，染料基團(tuán)足夠靠近以至基本上自發(fā)猝滅了染料基團(tuán)的熒光，染料基團(tuán)熒光的自發(fā)猝滅是通過(guò)堆疊發(fā)生的。較好的是，至少兩個(gè)的熒光染料基團(tuán)完全相同。更好的是，生熒光酶底物含有兩個(gè)相同的熒光染料基團(tuán)。
熒光是目前最靈敏的檢測(cè)技術(shù)之一。已經(jīng)用熒光微試驗(yàn)對(duì)仄摩爾量(zeptomolar)的酶分子進(jìn)行了研究。利用熒光顯微鏡已經(jīng)能檢測(cè)發(fā)散在一滴油滴中的單個(gè)酶分子。人們已經(jīng)在毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行了酶的各個(gè)分子的電泳，并用熒光光譜學(xué)類(lèi)監(jiān)測(cè)。參見(jiàn)Xue，Q；Yeung，E.S.，酶各分子的化學(xué)反應(yīng)性差異；Nature 1995，373，681-683。已經(jīng)發(fā)明了用β半乳糖苷酶作為標(biāo)記酶來(lái)檢測(cè)大腸桿菌的試驗(yàn)。與比色法相比，熒光檢測(cè)法的檢測(cè)靈敏度提高了250倍，時(shí)間縮短了5小時(shí)。參見(jiàn)Van Poucher，S.O.；Neils，H.J.，開(kāi)發(fā)靈敏的檢測(cè)透化大腸桿菌內(nèi)β半乳糖苷酶的化學(xué)發(fā)光測(cè)定試驗(yàn)并與熒光檢測(cè)法和比色法相比較(Development of a SensitiveChemiluminometric Assays for the Detection of β-Galoctosidase in Permeabilizedcliform Bacteria and Comparison with Fluorometry and Colorimetry)；Appl.Env.Microbiol.1995，614505-4509。
為了制備本發(fā)明的生熒光底物，如后文所述選取一段2至10個(gè)氨基酸、通過(guò)肽鍵連接的短肽，然后用一對(duì)熒光染料標(biāo)記，染料在與肽正確結(jié)合形成“共軛物”時(shí)發(fā)生特征性的二聚作用或“堆疊”，以至猝滅兩個(gè)熒光團(tuán)的全部熒光。染料對(duì)不必是熒光能轉(zhuǎn)移的供體和受體。這類(lèi)染料在與短肽結(jié)合并與彼此足夠靠近時(shí)表現(xiàn)出所述的堆疊特征，其中包括含有基本為平面的芳香結(jié)構(gòu)的染料，此種結(jié)構(gòu)在濃度足夠高時(shí)(例如10-2至10-4M)，會(huì)形成同二聚體或異二聚體。
更具體的是，可以通過(guò)短肽(以小于100埃的為佳)和兩分子熒光染料的化學(xué)反應(yīng)來(lái)制備本發(fā)明所用生熒光蛋白水解酶底物。蛋白水解酶底物有市售的(例如GeneMed Biotechnologies，San Francisco，CA)。熒光染料與蛋白水解酶底物的共價(jià)連接是本領(lǐng)域眾所周知的。
用于產(chǎn)生熒光蛋白水解酶底物的代表性肽包括哪些具有約2至10個(gè)氨基酸、更好的是4至8個(gè)氨基酸以便染料基團(tuán)二聚的肽，而且，所述肽還具有酶特異性可剪切位點(diǎn)?？傊?，隨著底物被剪切，熒光強(qiáng)度會(huì)因分子內(nèi)二聚體的解離而增強(qiáng)。
更好的是，本發(fā)明所用底物包括至少一段ARGGLY序列。更好的是，所述底物含有序列Val-Pro-Arg-Gly-Lys，兩端各共價(jià)連接一熒光染料基團(tuán)的肽。
本發(fā)明所用生熒光蛋白水解酶底物可以利用本領(lǐng)域已知方法來(lái)制備。參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP0428000。
用于與肽反應(yīng)形成蛋白水解酶底物的熒光染料包括發(fā)生染料堆疊的哪些。公知的是，有些熒光染料(例如熒光素、羅丹明、花青、例如4，4-二氟-4-硼酸-3a-氮鎓-4a-氮雜-s-indacene(BODIPY)等硼-雜環(huán)染料)當(dāng)它們?cè)谒芤褐斜舜俗銐蚩拷鼤r(shí)會(huì)形成二聚體。
例如熒光素，四甲基羅丹明(TMR)，羅丹明B和Texas紅代表了熒光素家族的平面芳香族染料。因?yàn)楣舱穸垠w結(jié)構(gòu)偶極間的相互作用，如果不存在能夠剪切肽的酶，二聚體的熒光量子得率將很低。當(dāng)二聚體經(jīng)酶剪切而解離后，可以觀察到水溶液中熒光量子得率顯著增高。用這種方式，可以設(shè)計(jì)一種均質(zhì)的酶測(cè)試溶液中是帶標(biāo)記的肽，加入待分析酶，酶剪切肽，導(dǎo)致二聚作用降低的同時(shí)熒光增強(qiáng)。
酶剪切可以通過(guò)生熒光底物與專(zhuān)一性酶或含酶介質(zhì)接觸來(lái)進(jìn)行。
適用于本發(fā)明的酶包括一般歸為蛋白水解酶的酶，即催化水解肽鍵的蛋白質(zhì)，例如天冬氨酸蛋白水解酶、金屬蛋白水解酶、巰基蛋白水解酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白水解酶和胰蛋白水解酶。較好的是胰蛋白酶家族的成員，例如凝血酶、類(lèi)胰蛋白酶等。
雖然有許多不同類(lèi)型的生熒光底物，它們的起效機(jī)制可以歸為三大類(lèi)化學(xué)的、物理的和物理化學(xué)的。
本發(fā)明的生物測(cè)試是均質(zhì)的。它不需要ELISA和生物發(fā)光法等試驗(yàn)中分離步驟。這對(duì)使用者和賣(mài)方來(lái)說(shuō)都意味著試劑、人力、時(shí)間和設(shè)備的利用效率更高。通常，本發(fā)明方法所用熒光團(tuán)吸收紫外光范圍內(nèi)的光。雖然可用UV檢測(cè)，但是在含有強(qiáng)烈吸收紫外光的分子的生物樣品中其靈敏度可能降低。此外，某些非剪切顯示劑會(huì)造成嚴(yán)重的背景熒光。較理想的是這樣的生熒光顯示劑，它在被剪切時(shí)顯示高信號(hào)水平而在完好是的噪音則很低，而且只在可見(jiàn)光范圍內(nèi)反應(yīng)。本發(fā)明說(shuō)明了一種提供上述優(yōu)點(diǎn)的方法，還提供了通過(guò)特意設(shè)計(jì)和選擇肽以及與之連接的熒光團(tuán)來(lái)同時(shí)檢測(cè)多份細(xì)菌的潛力。
羅丹明家族的染料，例如熒光素、四甲基羅丹明、X-羅丹明和羅丹明B在可見(jiàn)光范圍內(nèi)(400-700nm)具有很高的熒光量子得率(約0.85)。因此，它們常被用作激光染料、顯示劑、生物標(biāo)記，用于遠(yuǎn)程傳感或檢測(cè)微量物質(zhì)。重要的是，已知這類(lèi)染料在足夠靠近時(shí)(例如在高濃度(約10-2至10-4M))，它們會(huì)形成二聚體而自發(fā)猝滅熒光。對(duì)許多應(yīng)用來(lái)說(shuō)，以上現(xiàn)象顯然是不利的。但是，該現(xiàn)象也可以被利用成為優(yōu)點(diǎn)。如果短肽(2至10個(gè)氨基酸殘基)兩端都連有染料分子，即被標(biāo)記，帶標(biāo)記的共軛物會(huì)因?yàn)樽园l(fā)猝滅作用而幾乎不生熒光。因?yàn)檫@是局部濃度的有效增高，所以共軛物將不受總體濃度的影響而保持猝滅態(tài)。當(dāng)酶剪切時(shí)，兩標(biāo)記分離，產(chǎn)生很高的固有熒光。所以，可以將酶活性與熒光強(qiáng)度的增加直接關(guān)聯(lián)。如果酶是由真核或原核細(xì)胞分泌的，可以將熒光強(qiáng)度與細(xì)胞的代謝活性相關(guān)聯(lián)。一個(gè)酶分子轉(zhuǎn)化數(shù)以百萬(wàn)計(jì)底物分子的能力是一個(gè)放大過(guò)程。當(dāng)酶來(lái)自活細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，這一放大過(guò)程被進(jìn)一步加強(qiáng)，因?yàn)楦嗟拿阜肿与S著細(xì)胞的生長(zhǎng)而釋放出來(lái)。這種“雙重放大”與熒光技術(shù)相結(jié)合時(shí)，就提供了一種充滿前景的迅速、靈敏、特異性檢測(cè)細(xì)菌的方法。圖1顯示了這一概念。10代表細(xì)菌，例如金色葡萄球菌或副溶血弧菌，它們產(chǎn)生酶12例如類(lèi)胰蛋白酶。12催化剪切含有兩個(gè)猝滅態(tài)熒光染料基團(tuán)N和C的肽底物18(非熒光性)，產(chǎn)生片段14’和16’，各自含有強(qiáng)熒光基團(tuán)N’和C’。
如前所述，代表用于產(chǎn)生生熒光蛋白水解酶底物的肽包括約2至10個(gè)氨基酸的肽，以便染料基團(tuán)堆疊，肽還具有專(zhuān)一性酶切位點(diǎn)。因?yàn)橛兄罅靠捎糜诒景l(fā)明的蛋白水解酶，所以就有著同樣大量可用于本發(fā)明的肽。特殊要求是靶肽必須具有受蛋白水解酶攻擊所要求的化學(xué)鍵。例如，如下所述，已知胰蛋白酶在精氨酸或賴(lài)氨酸殘基的羧基側(cè)水解肽，所以各種具有此特征的底物都可以是胰蛋白酶底物。
副溶血弧菌是一種導(dǎo)致海洋食品中毒的病原菌，它胞內(nèi)產(chǎn)生類(lèi)胰蛋白酶，它一般用作鑒定副溶血弧菌的標(biāo)記。它專(zhuān)一地水解精氨酸后面的肽鍵。使用提高外膜(OM)透性的試劑使得酶能夠與生熒光底物接觸。二乙胺四乙酸(EDTA)一般通過(guò)影響革蘭氏陰性腸道菌的外膜屏障來(lái)達(dá)到上述目的。它通過(guò)螯合將穩(wěn)定化二價(jià)陽(yáng)離子從它們?cè)谥嗵?LPS)內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)上去除。結(jié)果從細(xì)胞中釋出大量LPS。LPS的流失造成OM外部小葉內(nèi)磷酸脂質(zhì)的暴露，由此成為通道讓疏水性化合物可以通過(guò)它們擴(kuò)散。在特定條件下，OM會(huì)開(kāi)裂而因讓大分子透過(guò)。參見(jiàn)Vaara，M.提高外膜透性的試劑(Agents that increase the permeability ofthe outer membran)；Microbiol.Reviews 1992，56，395-411。
胰蛋白酶剪切帶正電Arg殘基后面的任何肽鍵，不管該殘基相鄰的殘基是什么。但是，同一家族的其它酶(例如凝血酶)的剪切取決于周?chē)臍埢?，該特性使得它們各自具有?zhuān)一性。
為了表明這一概念，圖1模型中用的是胰蛋白酶和類(lèi)胰蛋白酶。胰蛋白酶是來(lái)自腸道的一種高度專(zhuān)一性蛋白水解酶，而且是已知的最強(qiáng)的酶之一。它水解精氨酸或賴(lài)氨酸殘基羧基側(cè)的肽鍵。胰蛋白酶的這種特性是眾所周知的。為了評(píng)價(jià)本發(fā)明概念，設(shè)計(jì)了以下序列(N-末端)Val-Pro-ARG-GLY-Lys(羧基末端)Seq.l其中的游離氨基在纈氨酸(N末端)上，游離羧基在賴(lài)氨酸(C末端)上。
兩粗體殘基之間的酰胺鍵即胰蛋白酶的剪切位點(diǎn)。兩側(cè)殘基的作用是減少結(jié)合染料時(shí)的位阻。Val和Lys上的氨基被用來(lái)與染料基團(tuán)反應(yīng)。C末端的羧基可用來(lái)根據(jù)需要連接固相載體。
本發(fā)明與市售使用蛋白水解酶底物的方法的區(qū)別在于起效機(jī)制及其靈敏度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，市售常規(guī)試劑盒使用蛋白水解酶只增強(qiáng)熒光2倍，與之相比，本發(fā)明的熒光至少增強(qiáng)10、20、30倍或更多。
對(duì)迅速而靈敏的測(cè)試來(lái)說(shuō)，盡可能增大信號(hào)與噪音之比是很重要的。大多數(shù)傳統(tǒng)生熒光底物在遠(yuǎn)UV波長(zhǎng)區(qū)(350-450nm)發(fā)光，大多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)基在該區(qū)域有明顯的自生熒光。例如，金色葡萄球菌的培養(yǎng)基在360nm被激發(fā)后，在425nm和475nm有兩處明顯的發(fā)射峰。通常使用高底物濃度來(lái)避免這一問(wèn)題。這會(huì)造成使用費(fèi)用升高、對(duì)微生物毒性加強(qiáng)、有時(shí)會(huì)發(fā)生底物沉淀。本發(fā)明通過(guò)將檢測(cè)波長(zhǎng)向可見(jiàn)光譜紅移而克服了自生熒光干擾的難題(四甲基羅丹明λab＝550nm，λem＝580nm)。而且，本發(fā)明的概念可以用于其它發(fā)射波長(zhǎng)也會(huì)發(fā)生向甚至更長(zhǎng)波長(zhǎng)紅移的染料。通常，可用的染料具有以下特性消光系數(shù)高(＞80,000cm-1M-1)；量子得率高(在水溶液中＞0.85)；具有對(duì)溶劑和pH不敏感的光譜；水溶性好、光穩(wěn)定性良好；二聚反應(yīng)常數(shù)高。
本發(fā)明可以用于檢測(cè)和鑒定微生物檢測(cè)、消毒滅菌檢測(cè)、藥物開(kāi)發(fā)、酶測(cè)試和免疫測(cè)試。此外，針對(duì)HIV蛋白酶活性的生熒光底物可用于測(cè)試抗病毒藥物，這可能可用于AIDS的治療。
以下實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)，但是實(shí)施例中的具體材料及其用量，以及其它條件和細(xì)節(jié)不應(yīng)該理解成是對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例在以下實(shí)施例中Val或V＝纈氨酸；Pro或P＝脯氨酸；Arg或R＝精氨酸；Gly或G＝甘氨酸；Lys或K＝賴(lài)氨酸；TMR＝四甲基羅丹明或四甲基羅丹明基團(tuán)；實(shí)施例1生熒光蛋白水解酶底物的制備用GeneMed Biotechnologies(South San Francisco，CA)合成Val-Pro-Arg-Gly-Lys，并用反相高效液相層析(HPLC)純化。利用快速原子轟擊(FAB)質(zhì)譜和氨基酸測(cè)序來(lái)進(jìn)行其化學(xué)鑒定。該肽與四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯在0.1M碳酸氫鈉，pH8.3中反應(yīng)一晝夜。反應(yīng)混合物用反相HPLC(C-18柱，粒徑15微米，WatersCorp.，Milford，MA)純化。全部化學(xué)反應(yīng)性染料均購(gòu)自Molecular Probes，Eugene，OR。這些染料-肽共軛物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如后文結(jié)構(gòu)式I所示為T(mén)MR-Val-Pro-ARG-GLY-Lys-TMR(在圖2中稱(chēng)為T(mén)-VPRGK-T)。用乙腈(ACN)的濃度梯度水溶液來(lái)純化該共軛物。在典型的洗脫過(guò)程中，在最初的15分鐘內(nèi)，乙腈濃度由15％升至30％，其后10分鐘內(nèi)，恒定在30％ACN中洗脫，5分鐘升至50％，后5分鐘恒定在50％ACN中洗脫。全部溶劑都含有0.1％三氟乙酸。純化后共軛物的分子量據(jù)FAB質(zhì)譜測(cè)定為1379，這是根據(jù)C74H85N13O14的化學(xué)組成的算得分子量。如下所示的雙標(biāo)記共軛物與其單標(biāo)記的對(duì)等物相比具有明顯低的熒光。
實(shí)施例2生熒光底物被純化酶水解室溫下，在pH8.9的50mM碳酸鹽緩沖液中酶水解實(shí)施例1的底物。表1列出了用胰蛋白酶處理前后溶液的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)分別為360nm、522nm、530nm和553nm。除了熒光強(qiáng)度增加之外，還觀察到吸收光譜的改變，如圖2所示。完好時(shí)，共軛物的最大吸收波長(zhǎng)為520nm，肩峰為550nm(A線)。如前所述，這就是染料的二聚作用或堆疊特征。剪切的結(jié)果是兩個(gè)峰的相對(duì)吸收逆轉(zhuǎn)，變成了游離四甲基羅丹明水溶液的光譜(線B)。熒光和吸光度數(shù)據(jù)都令人信服的證明共軛物內(nèi)染料分子間存在著基態(tài)相互作用，而這種作用被酶切而消除。
表1
<p>表1的數(shù)據(jù)顯示，在一段很寬的激發(fā)頻率中，酶切后底物溶液在570nm至585nm這一人眼可見(jiàn)段發(fā)射的熒光強(qiáng)度是酶切前底物溶液的29倍，平均為25至28倍。實(shí)施例3生熒光底物檢測(cè)副溶血弧菌的用途以下實(shí)驗(yàn)中所用的副溶血弧菌是Transport Swab System of Becton DickinsonMicrobiology Systems(Cockeysville，MD)的質(zhì)量控制用菌株。它購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心(ATCC 49398)。細(xì)胞被培養(yǎng)在含有3％氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。取10ml培養(yǎng)過(guò)夜的培養(yǎng)物離心。棄去肉湯，加入含50μl結(jié)構(gòu)式I雙標(biāo)記共軛物的試驗(yàn)緩沖液(1mM EDTA，50mM pH7.2的磷酸鹽緩沖液)，稀釋度為1000(參見(jiàn)實(shí)施例1有關(guān)標(biāo)記肽的制備)。為了確保酶切完全，反應(yīng)培養(yǎng)物孵育通宵。測(cè)定含細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞比色管熒光強(qiáng)度，分別得到曲線C和D。所得的圖見(jiàn)附圖3。
類(lèi)胰蛋白酶剪切使熒光增強(qiáng)。該試驗(yàn)提供了一種簡(jiǎn)明而快捷的方法，在加入胰蛋白酶后的數(shù)秒內(nèi)，不僅可以用簡(jiǎn)單的熒光計(jì)來(lái)測(cè)定，而且可以用肉眼測(cè)定。
對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明范圍和宗旨內(nèi)可進(jìn)行的修改是顯而易見(jiàn)的，必須明白的是，本發(fā)明不局限于上述說(shuō)明性實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種生物測(cè)試方法，它包括以下步驟a)提供一種酶底物，它包含與肽鏈結(jié)合的兩個(gè)或更多個(gè)熒光染料基團(tuán)，所述肽含有一個(gè)或多個(gè)可酶切連接鍵，染料基團(tuán)足夠靠近以至基本上自發(fā)猝滅了染料基團(tuán)的熒光，所述染料基團(tuán)熒光的自發(fā)猝滅是因染料堆疊所致，b)酶切肽上的一個(gè)或多個(gè)可酶切連接鍵，釋放出堆疊的熒光染料基團(tuán)，使得熒光強(qiáng)度增加。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述染料基團(tuán)相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述染料基團(tuán)包含熒光供體和受體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，所述染料基團(tuán)間隔小于100埃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，所述獲釋熒光染料基團(tuán)在可見(jiàn)光范圍發(fā)射熒光。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，所述熒光染料基團(tuán)具有平面構(gòu)型。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，所述熒光染料基團(tuán)選自熒光素、羅丹明和花青染料基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，所述肽包含約2至10個(gè)氨基酸，所述染料基團(tuán)與所述肽結(jié)合并形成染料堆疊，所述肽具有至少一個(gè)專(zhuān)一性可酶切連接鍵。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，用來(lái)酶切的所述酶選自天冬氨酸蛋白水解酶、金屬蛋白水解酶、巰基蛋白水解酶、絲氨酸蛋白水解酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白水解酶和胰蛋白水解酶。
10.用于權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述方法中的蛋白水解酶底物，所述蛋白水解酶底物肽含有兩個(gè)熒光染料基團(tuán)，兩基團(tuán)足夠靠近以至因分子內(nèi)堆疊而基本上自發(fā)猝滅了染料基團(tuán)的熒光。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的蛋白水解酶底物，其通式為T(mén)MR-Val-Pro-Arg-Gly-Lys-TMR。
12.一種檢測(cè)微生物的方法，它形成一種特征性酶試驗(yàn)，所述酶試驗(yàn)是根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物測(cè)試方法,它包括以下步驟:提供一種酶底物,它包含與肽鏈結(jié)合的兩個(gè)或更多個(gè)熒光染料基團(tuán),所述肽含有一個(gè)或多個(gè)可酶切連接鍵,染料基團(tuán)足夠靠近以至基本上自發(fā)猝滅了染料基團(tuán)的熒光,所述熒光基團(tuán)熒光的自發(fā)猝滅是因染料堆疊所致,然后酶切肽上的一個(gè)或多個(gè)可酶切連接鍵,釋放出堆疊的熒光染料基團(tuán),使得熒光強(qiáng)度增加。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法的蛋白水解酶底物。本發(fā)明可用于檢測(cè)和鑒定微生物、消毒滅菌檢測(cè)、藥物開(kāi)發(fā)、酶試驗(yàn)、免疫試驗(yàn)和其它生物測(cè)試。
文檔編號(hào)C07K7/06GK1254383SQ97182147
公開(kāi)日2000年5月24日 申請(qǐng)日期1997年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月1日
發(fā)明者A·P·韋, M·G·威廉姆斯 申請(qǐng)人:美國(guó)3M公司