專利名稱：嵌合異源多亞基粘附素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及嵌合異源多亞基粘附素，它包含異源多亞基受體的胞外結(jié)合區(qū)，該嵌合異源多亞基粘附素與天然受體的配體結(jié)合。本發(fā)明還涉及針對異源粘附素的抗體，產(chǎn)生粘附素的方法和使用異源粘附素及其抗體的方法。
背景技術(shù)：
調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的信號的傳導(dǎo)部分地受各種細(xì)胞蛋白的磷酸化作用的調(diào)控。蛋白質(zhì)酪氨酸激酶是催化該過程的酶。據(jù)信，受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶通過對胞內(nèi)基質(zhì)的受配體刺激的酪氨酸磷酸化作用來控制細(xì)胞的生長。
單一全長受體酪氨酸激酶的ErbB族有4個成員表皮生長因子受體(EGFR),ErbB2(HER2/neu),ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。已經(jīng)鑒定到許多配體(都是不同基因的產(chǎn)物)結(jié)合并激活EGFR(Groenen等在1994年對此有所論述)。相反，一個神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼許多蛋白質(zhì)異構(gòu)體，其原因在于mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同剪接(參見Lemke,G.(1996),mol.Cell.Neurosci.7:247-262)。ErbB3(Carraway,K.L．等，(1994)J.Biol.Chem.269:14303-14306)或ErbB4(Plowman,G.D．等，(1993)Nature 366:473-475)可以作為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的受體。這些受體和配體在正常的細(xì)胞生長和分化中起著重要作用。
生長因子受體蛋白酪氨酸激酶的Ⅰ類亞族包括由erbB1基因編碼的170kDa的表皮生長因子受體(EGFR)。erbB1已經(jīng)被認(rèn)為與導(dǎo)致人類惡性腫瘤有關(guān)。具體地說，已經(jīng)在侵害性較強(qiáng)的乳房癌、膀胱癌、肺癌和胃癌中觀察到該基因表達(dá)的增加(Modjtahedi,H．和Dean,C.(1994)Int.J.Oncol.4:277-296)。
Ⅰ類亞族的第二個成員，p185neu最初被認(rèn)定是經(jīng)化學(xué)處理過的大鼠的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物。該neu基因(又稱erbB2或HER2)編碼-185kDa的受體蛋白酪氨酸激酶。人HER2基因的擴(kuò)增和/或過表達(dá)與乳房癌和卵巢癌的預(yù)后差有關(guān)(Slamon,D.J．等，Science 235:177-182(1987)；和Slamon,D.J．等，Science244:707-712(1989))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HER2的過表達(dá)與其它癌癥有關(guān)，其中包括胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌和膀胱癌。所以，Slamon等在美國專利4,968,603中說明了許多檢測HER2基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增或表達(dá)的診斷試驗(yàn)并要求保護(hù)。Slamon等發(fā)現(xiàn)，HER2癌基因的多基因拷貝的存在表示疾病更可能由原發(fā)腫瘤位置發(fā)生擴(kuò)散，所以需要更積極的治療，而不是象可能由其它診斷性因素所顯示的那樣。Slamon等認(rèn)定，HER2基因擴(kuò)增測試結(jié)合對淋巴結(jié)狀態(tài)的檢測極大地改善了預(yù)后的效果。
另一相關(guān)基因，稱erbB3或HER3，已經(jīng)被人描述過。參見美國專利5,183,884；Kraus等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:9193-9197(1989)；歐洲專利申請No.444,961 A1；和Kraus等Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:2900-2904(1989)。Kraus等發(fā)現(xiàn)，人乳房腫瘤細(xì)胞系中存在著erbB3水平的顯著升高，這意味著erbB3和erbB1及erbB2一樣，可能在人惡性腫瘤中起著一定的作用。此外，Kraus等(1993)證明，對嵌合受體EGFR/ErbB3的ErbB3催化功能區(qū)的EGF依賴性激活在轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞中引起了增殖應(yīng)答。而且，這些研究人員證明，某些人乳房腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出明顯的穩(wěn)態(tài)ErbB3酪氨酸磷酸化加強(qiáng)，這意味著該受體可能在人惡性腫瘤中起一定的作用。其它研究者已經(jīng)對erbB3在癌癥中的作用進(jìn)行了研究。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在乳房癌(Lemoine等，Br.J.Cancer 66:1116-1121(1992))、胃腸癌(Poiler等，J.Pathol.168:275-280(1992)Raykumar等，J.Path ot,170:271-278(1993)和Sanidas等，Int.J.Cancer 54:935-940(19993)和胰腺癌(Lemoine等，J.Cancer 168:269-273和Friess等，Clinical Cancer Research 1:1413-1420(1995)中過量表達(dá)。
ErbB3在ErbB受體族中的獨(dú)特性在于它具有極小或沒有固有的酪氨酸激酶活性(Guy等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 91:8132-8136(1994)和Kim等，J.Biol.Chem.,269:24747-55(1994))。當(dāng)ErbB3與ErbB2共表達(dá)時，形成一活性信號復(fù)合物，針對ErbB2的抗體能夠分裂該復(fù)合物(Sliwkowski等，J.Biol.Chem.,269(20):14661-14665(1994))。此外，在與ErbB2共表達(dá)時，ErbB3與heregulin(HRG)的親和性升高。參見Levi等，Jounal of Neuroscience 15:1329-1340(1995)；Morrissey等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:1431-1435(1995)；Lewis,G.D．等，Cancer Res.,56:1457-1465(1996)；Pinkas-Kramarski,R等，(1996)EMBOJ.15:2452-2467；Beerli,R等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6496-6505；和Karunagaran,D.等(1996)EMBO J.15:254-264有關(guān)體內(nèi)ErbB2-ErbB3蛋白質(zhì)復(fù)合物的內(nèi)容。
生長因子的受體蛋白酪氨酸激酶Ⅰ類亞族還包括HER4/Erb4受體。參見，歐洲專利申請No.599,274；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:1746-1750(1993)；和Plowman等，Nature366:473-475(1993)。Plowman等發(fā)現(xiàn)，HER4表達(dá)的增加與源于上皮細(xì)胞的某些癌癥密切相關(guān)，其中包括乳腺癌。歐洲專利申請No.599,274說明了評價HER4表達(dá)的檢測人腫瘤性疾病(尤其是乳房癌)的診斷方法。
找尋HER2癌基因的激活物導(dǎo)至發(fā)現(xiàn)了一族heregulin多肽。這些蛋白似乎是來自同一基因的不同剪接，該基因在圖譜上位于人8號染色體的短臂上(Lee,J.和Wood,W.I.(1993)Genomics 16:790-791)。
Holmes等分離并克隆得到一族HER2受體的多肽激活物，它們稱其為heregulin-α(HRG-α)、heregulin-β1(HRG-β1)、heregulin-β2(HRG-β2)、類heregulin-β2(類HRG-β2)和heregulin-β3(HRG-β3)。參見Holmes等，Science256:1205-1210(1992)；WO 92/20798；和美國專利5,367,060。45kDa的多肽，HRG-α是從MDA-MB-231人乳房癌細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中純化得到的。這些研究者證實(shí)了純化heregulin多肽在MCF7乳房癌細(xì)胞中激活HER2受體的酪氨酸磷酸化作用的能力。而且，對heregulin多肽對SK-BR-3細(xì)胞(高水平地表達(dá)HER2受體)的促細(xì)胞分裂活性進(jìn)行了說明。和其它EGF族的生長因子一樣，可溶性HRG多肽似乎衍生自一膜結(jié)合前體(稱前-HRG)，該前體被蛋白酶加工后釋放出45kDa的可溶形式。這些前-HRG沒有N末端的信號肽。
雖然各heregulin的前213個氨基酸殘基基本一致，但是根據(jù)區(qū)別在于C末端部分的兩種不同的類EGF區(qū)，仍將它們歸為兩大類，α和β。但是，這些類EGF區(qū)都具有一段6個半胱氨酸構(gòu)成的間隔。根據(jù)氨基酸序列比較，Holmes等發(fā)現(xiàn)，在類EGF區(qū)的第一個至第六個半胱氨酸之間，HRGs與肝素結(jié)合性類EGF生長因子(BH-EGF)具有45％的相似性，與雙調(diào)蛋白(AR)具有35％的一致性，與TGF-α具有32％的一致性，與EGF具有27％的一致性。
Peles等在Cell,69:205-216(1992)和Wen等在Cell,69:559-572(1992)中首次描述了44kDa的neu分化因子(NDF)，它是大鼠內(nèi)的相當(dāng)于人HRG。和HRG多肽一樣，NDF具有一個免疫球蛋白(Ig)同源區(qū)，后續(xù)一個類EGF區(qū)，而且沒有N末端的信號肽。后來，Wen等在Mol.Cell.Biol.中,14(3):1909-1919(1994)中進(jìn)行了“全面克隆”以拓展NDF族。由此發(fā)現(xiàn)了6種不同的成纖維細(xì)胞性前-NDF。采用Holmes等的命名法，這些NDF根據(jù)其類EGF區(qū)的序列被歸為α或β多肽。同種型1至4的特征在于各自不同的膜延伸段(介于類EGF區(qū)和跨膜區(qū)之間)。而且，同種型a,b和c據(jù)稱具有長度不同的胞質(zhì)區(qū)。以上研究者論定，不同的NDF同種型是由于剪接的不同而產(chǎn)生的，并且行使著不同的組織特異性功能。參見EP505,148；WO93/22424；和WO94/28133中有關(guān)NDF的內(nèi)容。
雖然最初鑒定heregulin多肽是基于其激活HER2受體的能力(參見Holmes等，同上)，已發(fā)現(xiàn)，有些表達(dá)neu的卵巢細(xì)胞和neu轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞不與NDF結(jié)合或交聯(lián)，也不對NDF產(chǎn)生應(yīng)答而進(jìn)行酪氨酸磷酸化作用(參見Peles等，EMBO J.12:961-971(1993))。這意味著提供完全的heregulin應(yīng)答性必需有另一種細(xì)胞組份。Carraway等后來證明，125I-rHRGβ1177-244與牛erbB3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH-3T3成纖維細(xì)胞結(jié)合，但不與非轉(zhuǎn)染親本細(xì)胞結(jié)合。所以，他們認(rèn)為，ErbB3是HRG的受體，并在表達(dá)所述兩種受體的細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)固有酪氨酸殘基的磷酸化作用和ErbB2受體的磷酸化作用。Carraway等，J.Biol.Chem.269(19):14303-14306(1994)和Sliwkowski等，J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994)發(fā)現(xiàn)，僅以HER3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出與heregulin的親和性很低，但用HER2和HER3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則表現(xiàn)出較高的親和性。
這一發(fā)現(xiàn)與先前Kokai等，Cell 58:287-292(1989)；Stem等，EMBOJ.7:995-1001(1998)和King等，4:13-18(1989)所述的“受體串話”有關(guān)。以上研究者發(fā)現(xiàn)，EGF與EGFR的結(jié)合導(dǎo)致EGFR激酶區(qū)的活化和p185HER2交叉磷酸化。這被認(rèn)為是配體誘導(dǎo)的受體異二聚作用和與之相伴的異源二聚體內(nèi)受體間交叉磷酸化的結(jié)果(Wada等，Cell 61:1339-1347(1990))。
Plowman和他的同事對p180HER4/p185HER2的活化進(jìn)行了類似的研究。它們在人T淋巴細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)表達(dá)p185HER2，單獨(dú)表達(dá)p180HER4或者共表達(dá)兩種受體，證明，heregulin能夠激發(fā)p180HER4的酪氨酸磷酸化，但只能在表達(dá)兩種受體的細(xì)胞內(nèi)激發(fā)p185HER2的磷酸化。Plowman等，Nature336:473-475(1993)。所以，heregulin是能與數(shù)種受體相作用的EGF生長因子族成員之一例(Carraway和Cantley,Cell78:5-8(1994))。此外，β-動物纖維素(cellulin)配體被證明結(jié)合EGF受體和HER4，但不結(jié)合HER3(RieseⅡ,D.J．等，(1996)Oncogene 12:345-353)。
多人對heregulin的生物作用進(jìn)行了研究。例如Falls等(Cell 72:801-815(1993))發(fā)現(xiàn)，ARIA在肌管分化中起一定作用，即影響運(yùn)動神經(jīng)元突觸后肌細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)受體的合成和濃縮。Corfas和Fischbach證明ARIA還增加雞肌(chick muscle)內(nèi)鈉通道的數(shù)量。Corfas和Fischbach,J.Neuroscince,13(5):2118-2125(1993)。已經(jīng)證明，GGFⅡ?qū)嗕仢M(subconfluent)靜息人成肌細(xì)胞具有促細(xì)胞分裂活性，而且，克隆的人成肌細(xì)胞在GGFⅡ連續(xù)存在下，在6天的分化后產(chǎn)生大量肌管(Sklar等,J.Cell Biochem.,Abst.W462,18D,540(1994))。還可參見1994年11月24日公開的WO94/26298。
Holmes等，見上面，發(fā)現(xiàn)HRG對哺乳動物細(xì)胞系(例如SK-BR3和MCF-7)具有促細(xì)胞分裂作用。GGF對Schwann細(xì)胞的促細(xì)胞分裂活性也已為人所報道。參見，例如，Brockes等，J.Biol.Chem.255(18):8374-8377(1980)；Lemke和Brockes,J.Neurosci.4:75-83(1984)；Brockes等，J.Neurosci.4(1):75-83(1984)；Brockes等，Ann.Neurol.20(3):317-322(1986)；Brockes等，Methods in Enzym.,147:217-225(1987)和Marchnionni等，同上。Schwann細(xì)胞在神經(jīng)元軸突周圍形成髓鞘，由此形成單獨(dú)的神經(jīng)纖維。所以，顯然，Schwann細(xì)胞在外周神經(jīng)的發(fā)育、功能和再生中起著重要作用。Levi等在J.Neurosci.14(3):1309-1319(1994)中從治療性角度論述了這種內(nèi)在聯(lián)系。Levi等論述了構(gòu)建一包含Schwann細(xì)胞的細(xì)胞假體(prosthesis)的可能性，所述假體能夠移植到脊索的受損部位。體外培養(yǎng)Schwann細(xì)胞的方法已經(jīng)有所說明。參見WO94/00140和Li等J.Neurosci.16(6):2012-2019(1996)。
Pinkas-Kramarski等發(fā)現(xiàn)，NDF可能是在胚胎期和成年大鼠大腦內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，以及在大鼠腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中表達(dá)，而且提出，它可能起著星形細(xì)胞存活和成熟因子的作用(Pinkas-Kramarski等，NSPA,USA 91:9387-9391(1994))。Meyer和Birchmeier在PNAS,USA 91:1064-1068(1994)中利用原位雜交法和核糖核酸酶(RNase)保護(hù)實(shí)驗(yàn)，分析了小鼠胚胎發(fā)育期間和圍生期動物內(nèi)heregulin的表達(dá)。以上作者論定，根據(jù)heregulin的表達(dá)，它在體內(nèi)起著間充質(zhì)和神經(jīng)元因子的作用。而且，它們的發(fā)現(xiàn)還暗示，heregulin在上皮細(xì)胞的發(fā)育中起著作用。同樣，Danilenko等，Abstract 3101,FASEB 8(4-5):A535(1994)發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷修復(fù)期間，NDF和HER2受體的相互作用在指導(dǎo)表皮細(xì)胞遷移和分化中十分重要。
已經(jīng)對ErbB族內(nèi)成員間的相互作用進(jìn)行了體內(nèi)和體外研究。由配體與其它ErbB族成員間相互作用引起的ErbB2的反式激活是常見而且在生理上十分重要的事件(Dougall,W.C．等(1993)J.Cell.Biochem.53:61-73；Earp,H.S．等，(1995),Breast Cancer Res.Treatment 35:115-132)。ErbB2和ErbB3的共表達(dá)導(dǎo)致形成高親和性heregulin(HRG)結(jié)合位點(diǎn)(Sliwkowski,M.X．等(1994),J.Biol.Chem.269:14661-14665)。ErbB2調(diào)節(jié)ErbB3對HRG的親和性，而且似乎為ErbB3-HRG復(fù)合物提供酪氨酸激酶活性，因?yàn)镋rbB3是沒有酪氨酸激酶活性的功能障礙性信號受體(Guy,P.M．等(1994)PANS USA 91:8132-8136)。生理-化學(xué)研究沒有證明ErbB2的EDCs與ErbB3在體外的締合(Horan等，J.Biol.Chem.270:24604-24608(1995))。此外，neu分化因子(NDF)與可溶性HER3的結(jié)合并沒有因可溶性HER2的存在而加強(qiáng)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一出人意料的發(fā)現(xiàn)，即包含異源多聚受體單體的胞外區(qū)的可溶性嵌合異源多聚體結(jié)合該受體的配體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這種異源多聚體的方法，將其用作受體之配體拮抗劑的方法，具有受體之配體的拮抗劑或活化劑作用的嵌合異源多聚體的抗體，和治療涉及配體-受體相互作用的疾病的方法。
一方面，本發(fā)明包括一種嵌合異源多聚體，它包含一段第一氨基酸序列，所述序列形成一嵌合單體并包含(即一天然異源多亞基受體的第一單體)的胞外區(qū)(ECD)或其配體結(jié)合片段和一多聚化功能區(qū)，其中，ECD與多聚化功能區(qū)相融合。本發(fā)明的嵌合異源粘附素還包含另一氨基酸序列，該序列形成另一嵌合單體，該單體包含天然異源多亞基受體的另一單體的胞外區(qū)和一多聚化功能區(qū)。根據(jù)本發(fā)明這一方面的內(nèi)容，天然異源多亞基受體的第一和另一些單體在同一細(xì)胞內(nèi)締合形成一天然異源多亞基受體，該受體一旦與配體結(jié)合即被激活，而且，其中，可溶性嵌合異源多亞基粘附素對配體的親和性為天然受體之單體和天然受體之同源多聚體的10-1至106倍。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案之一中，所述嵌合異源多亞基粘附素是一種水溶性粘附素。
在本發(fā)明實(shí)施方案之一中，該嵌合多亞基粘附素是結(jié)合天然異源多亞基受體胞外區(qū)的配體的拮抗劑。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，第一氨基酸序列的多聚化功能區(qū)能夠與各另外氨基酸序列的多聚化功能區(qū)相互作用而形成一異源多聚體。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，該嵌合異源多亞基粘附素包含多聚化功能區(qū)，該區(qū)包含免疫球蛋白區(qū)，以免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM和IgF)恒定區(qū)為佳。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，該嵌合異源粘附素包括多聚化功能區(qū)，該區(qū)能夠形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。所述的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用區(qū)(或多聚化區(qū))包括一亮氨酸拉鏈(即一段含凸起序列與另一含凹陷序列互配)，一疏水區(qū)、一親水區(qū)和一段含游離巰基的氨基酸序列，所述巰基能與其它氨基酸序列的多聚化區(qū)反應(yīng)形成分子間二硫鍵。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一嵌合異源多亞基粘附素，其中，第一氨基酸序列包含ErbB2受體單體的胞外區(qū)，另一氨基酸序列包含ErbB3受體單體的胞外區(qū)，第一序列和另一序列的多聚化區(qū)各自包含一段免疫球蛋白恒定區(qū)。該多聚化區(qū)能夠使得第一氨基酸序列和另一氨基酸序列之間發(fā)生穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。所述嵌合異源粘附素的優(yōu)選配體是heregulin。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一嵌合異源多亞基粘附素，其中，第一氨基酸序列包含ErbB2受體單體的胞外區(qū)，另一氨基酸序列包含ErbB4受體單體的胞外區(qū)，第一序列和另一序列的多聚化區(qū)各自包含一段免疫球蛋白恒定區(qū)。該多聚化區(qū)能夠使得第一氨基酸序列和另一氨基酸序列之間發(fā)生穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。所述嵌合異源粘附素的優(yōu)選配體是heregulin。
另一方面，本發(fā)明包括分離的核酸分子，所述分子編碼本發(fā)明的嵌合異源粘附素的氨基酸序列。
在另一實(shí)施方案中本發(fā)明提供一分離的核酸分子，該分子編碼異源多亞基粘附素的單體如ErbB2-IgG,ErbB3-IgG和ErbB4-IgG。例如，核酸分子可選自以下組(a)一段包含天然異源多亞基受體單體之一的胞外區(qū)(即配體結(jié)合區(qū)或其結(jié)合片段)核苷酸序列的核酸，所述核酸以一致的轉(zhuǎn)錄相位和轉(zhuǎn)錄方向與編碼多聚化區(qū)的核酸序列共價結(jié)合，例如免疫球蛋白的恒定區(qū)；和(b)在基因編碼簡并性范圍之內(nèi)與(a)序列對應(yīng)的核酸。該分離核酸還可以任選地包含一個與之可操作性連接的可操縱的啟動子。
該分離的核酸還可以用于體內(nèi)或體外基因療法。本發(fā)明的這種實(shí)施方案包括給一哺乳動物使用本發(fā)明的核酸、包含所述核酸的載體或包含所述核酸的細(xì)胞，使得所編碼的嵌合粘附素在哺乳動物體內(nèi)表達(dá)，并起到其配體的拮抗劑的作用。例如，哺乳動物體內(nèi)表達(dá)的ErbB2/3-IgG可以用來降低ErbB2/3受體周圍的heregulin局部濃度，從而抑制表面具有該受體的細(xì)胞的生長。較好的是，表達(dá)的ErbB2/3-IgG被用來治療細(xì)胞增殖性疾病，例如癌癥，其中對heregulin與其受體結(jié)合的拮抗作用抑制細(xì)胞的生長。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，分離的嵌合氨基酸的核酸序列編碼ErbB2受體的胞外區(qū)或其結(jié)合片段，其中的多聚化區(qū)包括免疫球蛋白恒定區(qū)。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，分離的嵌合氨基酸的核酸序列編碼ErbB3受體ECD的胞外區(qū)或其結(jié)合片段，其中的多聚化區(qū)包括免疫球蛋白恒定區(qū)。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，分離的嵌合氨基酸的核酸序列編碼ErbB4受體ECD的胞外區(qū)或其結(jié)合片段，其中的多聚化區(qū)包括免疫球蛋白恒定區(qū)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括與所述核酸可操作性連接的啟動子。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含本發(fā)明分離核酸的載體。例如，本發(fā)明提供了包含核酸分子的載體(即包含核酸分子的表達(dá)載體，所述核酸與一調(diào)控序列可操作性連接，所述調(diào)控序列被載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞識別)；一種包含所述核酸分子的宿主細(xì)胞；和利用編碼嵌合異源多亞基粘附素(例如ErbB-IgG)的核酸分子來產(chǎn)生粘附素的方法，其步驟包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞和由宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲粘附素。在一相關(guān)實(shí)施方案中，利用核酸產(chǎn)生粘附素的方法包括引入編碼不同嵌合粘附素的多條核酸并表達(dá)這些嵌合粘附素的混合物。例如，將編碼ErbB2-IgG的核酸與編碼ErbB3-IgG的核酸引入同一宿主細(xì)胞，經(jīng)表達(dá)，由細(xì)胞或培養(yǎng)基分離得到同源二聚體和異源二聚體的混合物。
本發(fā)明的實(shí)施方案之一還包括包含本發(fā)明核酸的宿主細(xì)胞。較好的是，該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)所述核酸，所述的表達(dá)包括翻譯和產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合異源粘附素。本發(fā)明的實(shí)施方案包括一個宿主細(xì)胞，它包含并表達(dá)異源粘附素嵌合單體之一，同時在本發(fā)明另一宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源粘附素的另一嵌合單體。或者，本發(fā)明實(shí)施方案包括在同一宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一個以上的嵌合單體。
在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含第一分離核酸序列，所述核酸編碼本發(fā)明可溶性嵌合異源多亞基粘附素的第一氨基酸序列，其中的胞外區(qū)來自ErbB2受體，而其中的多聚化區(qū)包含免疫球蛋白恒定區(qū)；第二分離核酸序列，所述核酸編碼本發(fā)明嵌合異源多亞基粘附素的另一氨基酸序列，其中的胞外區(qū)來自ErbB3受體，而其中的多聚化區(qū)包含免疫球蛋白恒定區(qū)。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含第一分離核酸序列，所述核酸編碼本發(fā)明可溶性嵌合異源多亞基粘附素的第一氨基酸序列，其中的胞外區(qū)來自ErbB2受體，而其中的多聚化區(qū)包含免疫球蛋白恒定區(qū)；第二分離核酸序列，所述核酸編碼本發(fā)明嵌合異源多亞基粘附素的另一氨基酸序列，其中的胞外區(qū)來自ErbB4受體，而其中的多聚化區(qū)包含免疫球蛋白恒定區(qū)。
本發(fā)明另一方面內(nèi)容包括本發(fā)明嵌合異源多亞基粘附素的拮抗性抗體，所述抗體與天然異源多亞基受體結(jié)合，并抑制其活化。
本發(fā)明另一方面內(nèi)容包括本發(fā)明嵌合異源多亞基粘附素的活化性抗體，所述抗體與天然異源多亞基受體結(jié)合，并將其活化。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，活化性抗體能夠激活天然異源多亞基受體的活性是其天然配體的10-1至106倍。
嵌合異源多聚體特異性抗體的用途之一是用在檢測異源多亞基受體的方法中，其步驟包括疑含有異源多亞基受體的樣品與抗體(可以是標(biāo)記過的)接觸，和檢測是否結(jié)合?？贵w還可以用在純化異源多亞基受體的方法中，其步驟包括將含異源多亞基受體的混合物通過一結(jié)合有所述抗體的固相，并回收含有異源多亞基受體的流份。較好的是，在本發(fā)明實(shí)施方案之一中，異源多亞基受體是ErbB2/ErbB4，而異源多亞基粘附素是ErbB2-IgG/ErbB4-IgG。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，異源多亞基受體是ErbB2/ErbB3，而異源多亞基粘附素是ErbB2-IgG/ErbB3-IgG。
另一方面，本發(fā)明包括在含有配體的樣品中形成嵌合異源多亞基粘附素-配體復(fù)合物的方法。本發(fā)明的該方法包括在一定條件下將本發(fā)明的嵌合異源多亞基粘附素與樣品接觸，所述條件使得配體結(jié)合異源多聚體而形成嵌合異源二聚體粘附素-配體復(fù)合物。
本發(fā)明實(shí)施方案之一中，嵌合異源多亞基粘附素-配體復(fù)合物抑制配體與天然異源多亞基受體的結(jié)合。較好的是，樣品是哺乳動物的組織或哺乳動物體液，包括但不限于血液、血清、血漿、淋巴液和尿液。較好的是，所述哺乳動物是人。
另一方面，本發(fā)明包括抑制天然異源多亞基受體活化的方法。該方法包括1)將本發(fā)明嵌合多亞基粘附素與含有天然多亞基受體的配體和該受體的樣品接觸；和2)孵育嵌合異源多亞基粘附素與配體，形成一復(fù)合物，由此抑制天然異源多亞基受體被配體活化。
在抑制配體與天然異源多亞基受體結(jié)合的方法實(shí)施方案之一中，天然異源多亞基受體是ErbB，而可溶性嵌合多聚體包含ErbB2和ErbB3的胞外區(qū)。
在另一抑制配體與天然異源多亞基受體結(jié)合的方法實(shí)施方案中，天然異源多亞基受體是ErbB，而可溶性嵌合多聚體包含ErbB2和ErbB4的胞外區(qū)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是抑制配體結(jié)合天然異源多亞基受體的方法，其中受體的活化被抑制。所述方法包括將本發(fā)明的拮抗性抗體與天然異源多亞基受體接觸，形成拮抗性抗體-異源多亞基受體復(fù)合物，由此使得受體的活化被抑制。
另一方面，本發(fā)明涉及活化一天然異源多亞基受體的方法，其步驟包括經(jīng)本發(fā)明的活化性抗體與天然異源多亞基受體接觸，形成活化性抗體-異源多亞基受體復(fù)合物，由此將受體激活。
另一方面，本發(fā)明涉及一種治療疾病的方法，包括給需要治療的哺乳動物以治療有效量的本發(fā)明嵌合異源多亞基粘附素。本發(fā)明的實(shí)施方案包括如下疾病，即該疾病可以通過一種配體與天然異源多亞基受體間的接觸(例如異源粘附素與配體的競爭性結(jié)合)來治療。
在本發(fā)明實(shí)施方案之一中，嵌合異源多亞基粘附素是ErbB2/ErbB3-Ig異源粘附素。在另一實(shí)施方案中，嵌合異源多聚體是ErbB2/ErbB4-Ig異源粘附素。
本發(fā)明包括一種包含嵌合異源多亞基粘附素的組合物。該包含粘附素的組合物最好是無菌的。如果組合物是水溶液，粘附素宜為可溶性的。如果組合物是凍干粉，以粉末能夠在合適的溶劑中再生為宜。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，治療方法包括給予嵌合單體組成的異源多亞基粘附素，各自用目標(biāo)異源多亞基受體單體的胞外區(qū)制得。所述的胞外區(qū)宜來自選自以下異源多亞基受體的受體Axl,Rse，上皮生長因子(EGF)受體，肝細(xì)胞生長因子(HGF)受體，IL-2,c-mer,Al-1,EPH,TrkA,TrkB,TrkC,TNF,IL-10,CRF2-4,RXR,RON,AChRα/δ,TRα/RXRα,TRα/DR4,TRα/MHC-TRE,TRα/ME,TRα/F2,KDR/FLT-1,FLT/VEGF,VEGF121/165,Amt/Ahr,CGA/CGB,EGFR/p185-neu，促乳素受體(PRL),T細(xì)胞受體(TCR)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和Cak受體(Kishimoto,T等，(1994)Cell 76:253-262；Kendall,R.L．等，(1996)Biochem Biophys.Res.Comm.226:324-328；Chang,W.-P．和Clevenger,C.V.(1996)PNAS USA93:5947-5952；Lala,D.S．等，(1996)Nature 383:450-453；Collesi,C．等，(1996)Mol.Cell.Biol.16:5518-5526；Tzahar,E等(1996)Mol.Cell.Biol.16:5276-5287；Shtrom,S.S．和Hall,Z.W.(1996)J.Biol.Chem.271:25506-25514；Nagaya,T．等(1996)Biochem.Biophys.Res.Comm.226:426-430；Dendall,R.L．等(1996)Biochem.Biophys Res.Comm,226:324-328；Kainu,T．等(1995)Neuroreport 6:2557-2560；Yoo,S.H．和Lewis,M.S.(1996).J.Biol.Chem.271:17041-17046；Murali,R等(1996)PNAS USA 93:6252-6257；Dietrich J．等(1996)J.Cell.Biol.132:299-310；Tanahashi,T．等(1996)J.Biol.Chem.271:8221-8227；和Perez,J.L．等(1996)Oncogene 12:1469-1477)。較好的是，胞外區(qū)是以下受體的IL-6/gp130,IL-11/gp130白血病抑制因子(LIF)/gp130,cardiotrophin-1/gp130(CT-1),IL-11/gp130,睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子CNTF/gp130，制癌蛋白M(OSM)/gp130,γ干擾素和α、β干擾素(Kishimoto,T．等(1994)，同上，Taga,T.(1996)J.Neurochem.67:1-10；Pennica,D．等(1995)J.Biol.Chem.270:10915-10922；Marsters,S.A.(1995)PNAS USA92:5401-5405；和Wollert,K.C．等(1996)J.Biol.Chem.271:9535-9545)。最好，胞外區(qū)選自ErbB族受體。
治療方法實(shí)施方案涉及諸如免疫失調(diào)、癌癥和神經(jīng)失調(diào)等疾病或狀態(tài)。
如果實(shí)施方案中的異源粘附素是ErbB2/ErbB3-Ig或ErbB2/ErbB4-Ig異源粘附素，治療方法涉及以下疾病炎癥、癌癥、例如神經(jīng)纖維瘤和外周神經(jīng)病等神經(jīng)失調(diào)，和例如心臟肥大等心臟病。
本發(fā)明還包括一種治療哺乳動物的方法，包括給以哺乳動物治療有效量的嵌合異源多亞基粘附素，例如ErbB2/ErbB3-IgG或ErbB2/ErbB4-IgG。例如，所述哺乳動物可能患有神經(jīng)失調(diào)或細(xì)胞增殖性疾病。該患者可能因HRG水平/生物活性的降低而得到緩解(例如癌癥)。
另一方面，本發(fā)明包括藥物組合物。在藥物組合物的實(shí)施方案之一中，所述組合物包含本發(fā)明的嵌合異源多亞基粘附素，所述粘附素1)具有一天然異源多亞基受體的ECD或其結(jié)合片段，2)而且是結(jié)合天然異源多亞基受體ECD的配體的拮抗劑。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，藥物組合物包含本發(fā)明嵌合異源多亞基粘附素的抗體，所述抗異源粘附素抗體1)具有一天然異源多亞基受體的ECD或其結(jié)合片段，2)而且與該天然異源多亞基受體的ECD結(jié)合，是結(jié)合該天然異源多亞基受體的配體的拮抗劑。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，藥物組合物包含本發(fā)明嵌合異源多亞基粘附素的抗體，所述抗異源粘附素抗體1)具有一天然異源多亞基受體的ECD或其結(jié)合片段，2)而且與該天然異源多亞基受體的ECD結(jié)合，是結(jié)合該天然異源多亞基受體的配體的活化劑。
另一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)品，它包括一個容器、容器的標(biāo)簽和容器內(nèi)的組合物。在本發(fā)明實(shí)施方案之一中，所述組合物含有本發(fā)明嵌合異源多亞基粘附素組合物，所述粘附素是配體的拮抗劑。該組合物能夠有效地拮抗配體與其天然異源多亞基受體的結(jié)合，而容器上的標(biāo)簽說明如何拮抗配體與其天然受體的結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合異源多亞基粘附素選自ErbB2/ErbB3-Ig或ErbB2/ErbB4-Ig。
在另一產(chǎn)品實(shí)施方案中，所述組合物包含抗嵌合異源多亞基粘附素抗體，所述抗體是配體的拮抗劑。該組合物能夠拮抗配體與其天然異源多亞基受體的結(jié)合，而容器上的標(biāo)簽說明如何拮抗配體與其天然受體的結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗嵌合異源多亞基粘附素抗體針對的嵌合異源粘附素選自ErbB2/ErbB3-Ig或ErbB2/ErbB4-Ig。
在另一產(chǎn)品實(shí)施方案中，所述組合物包含抗嵌合異源多亞基粘附素抗體，所述抗體是配體的活化劑。該組合物能夠激活配體與其天然異源多亞基受體的結(jié)合，而容器上的標(biāo)簽說明如何激活配體與其天然受體的結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗嵌合異源多亞基粘附素抗體針對的嵌合異源粘附素選自ErbB2/ErbB3-Ig或ErbB2/ErbB4-Ig。
根據(jù)以下詳細(xì)說明，本發(fā)明上述以及其它方面的內(nèi)容對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1是ErbB族嵌合同源二聚體和異源二聚體的圖示。圖中表示出嵌合體的胞外區(qū)(ECD)和免疫球蛋白(Fc)區(qū)。胞外區(qū)來自天然異源多亞基受體，并通過重組技術(shù)與多聚化區(qū)，即免疫球蛋白區(qū)融合。
圖2曲線顯示嵌合免疫粘附素的結(jié)合分析。同源二聚體ErbB3-Ig和ErbB4-Ig能夠特異性結(jié)合125I-HRG，但是沒有測出ErbB2-Ig構(gòu)建物的結(jié)合。
圖3A-3D顯示嵌合粘附素ErbB2/3-IgG,ErbB2/4-IgG和ErbB3/4-IgG的125I-HRG結(jié)合研究結(jié)果。如圖3A所示，用含ErbB2的異源二聚體可以檢測到一個HRG高親和性結(jié)合位點(diǎn)，但是用ErbB3/4-IgG則不能。
圖4A和4B顯示對抗ErbB2單克隆抗體(2C4)的結(jié)合研究結(jié)果，其中，在2C4的存在下，比較了嵌合ErbB同源二聚體與嵌合ErbB異源二聚體的活性。
圖5是條框圖，顯示ErbB-IgG蛋白在乳房癌細(xì)胞系，MCF7中抑制HRG依賴性胸苷摻入作用的能力。不同濃度的不同ErbB-IgG蛋白與1nM的rHRG一起孵育，然后加到MCF7細(xì)胞的無血清單層培養(yǎng)物中。用3H-胸苷標(biāo)記細(xì)胞以測定DNA合成。能夠結(jié)合HRG的受體融合體以劑量依賴性方式抑制了HRG介導(dǎo)的有絲分裂應(yīng)答。異源二聚體IgG，即ErbB3/2+IgG和ErbB4/2-IgG比各自相應(yīng)的同源二聚融合蛋白更有效。
圖6以圖解表示，ErbB2和ErbB3或ErbB4相互作用的可能的模型，左為“接觸”模型，右為“構(gòu)象”模型。
詳細(xì)說明至此，對本發(fā)明的嵌合異源多亞基粘附素，其制造方法及其用途進(jìn)行了說明，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明不局限于所述的具體粘附素或方法，因?yàn)榛衔锖头椒ó?dāng)然可以是變化的。還應(yīng)該理解的是，在此所用的術(shù)語僅是為了說明具體的實(shí)施方案，而不是為了限定本發(fā)明的范圍，因?yàn)?，本發(fā)明的范圍僅由后面的權(quán)利要求來限定。
定義一般說來，以下單詞和詞組在說明、實(shí)施例和權(quán)利要求中具有以下定義。
除非另作說明，“ErbB”在此指哺乳動物ErbB受體中的任何一種或多種(即ErbB1或上皮生長因子(EGF)受體；ErbB2或HER2受體；ErbB3或HER3受體；ErbB4或HER4受體；和將被鑒定為該Ⅰ類酪氨酸激酶族的任何其它成員)，而“erbB”則指編碼所述受體的哺乳動物erbB基因。
“HRG”(或“heregulin”)在此表示具有天然序列HRG生物活性(見下文)至少其一的任何多肽序列(美國專利申請No.60/021,640,PR1043，同上)。該定義不僅包括自天然HRG源(例如人MDA-MB-175細(xì)胞，或例如其它動物的其它來源)分離得到的多肽，而且包括利用重組或合成方法制備得到的多肽。它還包括它們的變體形式，例如功能性衍生物，同位變體，天然同種型或類似物。有時，HRG是“天然HRG”，即從哺乳動物分離得到的內(nèi)源HRG多肽。只要具有與天然HRG(如人HRG)相同的氨基酸序列，該HRG也可以是“天然序列HRG”。但是，“天然序列HRG”包括利用重組或合成方法制得的多肽?！俺墒斓腍RG”是可溶性的，或是由細(xì)胞釋放的分泌HRG(即沒有氨基末端序列)。HRG“同種型”指具有至少部分HRG的N末端區(qū)的天然多肽。
“免疫粘附素”在此指抗體樣分子，它將某種蛋白的結(jié)合區(qū)(例如某種細(xì)胞表面受體的胞外區(qū)(粘附素區(qū)))與具有免疫球蛋白恒定區(qū)功能的效應(yīng)物結(jié)合。免疫粘附素可能具有多種人抗體的有用的活性和生物特性。由于所述免疫粘附素可以由具有所需特異性并與合適的人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)(Fc)連接的人蛋白質(zhì)序列構(gòu)建，所以，完全使用人源組份就可以獲得所需的結(jié)合特異性。這樣的免疫粘附素對患者的免疫原性最小，可以安全地長期或重復(fù)使用。
文獻(xiàn)中有報道的免疫粘附素包括以下受體的融合體T細(xì)胞受體(Gascoigen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2936-2940(1987))；CD4(Capon等，Nature337:525-531(1989)；Traunecker等Nature339:68-70(1989)；Zettmeissl等，DNA Cell Biol.USA9:347-353(1990)和Byrn等Nature344:667-670(1990))；L-選擇蛋白或歸巢受體(Watson等，J.Cell.Biol.110:2221-2229(1990)；和Watson等Nature349:164-167(1991)；CD44(Aruffo等，Cell61:1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等，J.Exp.Med.173:721-730(1991)；CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174:561-569(1991)；CD22(Stamenkovic等，Cell66:1133-1144(1991))；TNF受體(Ashkenazi等，Proc.Natl.Aca.Sci.USA88:10535-10539(1991)；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27:2883-2886(1991)；和Peppel等，J.Exp.Med.174:1483-1489(1991))；NP受體(Bennett等，J.Biol.Chem.266:23060-23067(1991))；γ干擾素受體(Kurschner等，J.Biol.Chem.267:9354-9360(1992))；4-1BB(Chalupny等，PNAS USA 89:10360-10364(1992))和IgE受體α(Ridgway和Gorman,J.Cell.Biol.115:Abstract No.1448(1991))。
有記載的治療用同源多亞基免疫粘附素的例子包括用于抑制HIV與細(xì)胞表面CD4結(jié)合的CD4-IgG免疫粘附素。Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)(臨產(chǎn)前給孕婦使用CD4-IgG)獲得的信息顯示，該免疫粘附素可以用于防止HIV的母親-胎兒傳遞。Ashkenazi等，Intern.Rev.Immunol.10:219-227(1993)。已經(jīng)開發(fā)出來結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)的免疫粘附素。TNF是一種促炎細(xì)胞因子，被證明是濃毒性休克的主要介導(dǎo)物。根據(jù)濃毒性休克的小鼠模型，一種TNF受體免疫粘附素被證明有望臨床用于治療濃毒性休克(Ashkenazi A．等(1991)PNAS USA 88:10535-10539)。免疫粘附素還有非治療性用途。例如，L選擇蛋白受體的免疫粘附素被用作外周淋巴結(jié)高內(nèi)皮小靜脈(HEV)的組織化學(xué)染色劑。它還被用于分離和鑒定L選擇素配體(Ashkenazi A．等，同上)。
如果免疫粘附素結(jié)構(gòu)的兩臂具有不同的特異性，則比照雙特異性抗體稱該免疫粘附素為“雙特異性免疫粘附素”。Deitsch等，J.Immunol.Methods162:123(1993)描述了這樣一種雙特異性免疫粘附素，它結(jié)合了粘附分子即E選擇素和P選擇素的胞外區(qū)，在天然情況下，各自是在不同細(xì)胞種類中表達(dá)的。結(jié)合研究顯示，由此形成的雙特異性免疫粘附素與髓樣細(xì)胞系的結(jié)合能力強(qiáng)于作為其來源的單特異性粘附素。
“異源粘附素”在此與“嵌合異源多亞基粘附素”通用，表示一種嵌合分子復(fù)合物(氨基酸序列)，其中各嵌合性分子將一生物活性區(qū)(例如異源多亞基受體各單體的胞外區(qū))和一多聚化區(qū)結(jié)合。“多聚化區(qū)”促進(jìn)異源多亞基受體內(nèi)嵌合分子之間的穩(wěn)定相互作用。多聚化區(qū)可以通過免疫球蛋白序列、亮氨酸拉鏈、一個疏水區(qū)，一個親水區(qū)或在嵌合多聚體嵌合分子之間形成分子間二硫鍵的游離巰基相互作用。多聚化區(qū)可包含免疫球蛋白恒定區(qū)。一種可用于本發(fā)明的多聚化區(qū)可參見描述了一種雜和免疫球蛋白的美國專利申請No.07/440,625,P565P1(為本文所參考)。此外，多聚化區(qū)可以工程化，由此空間相互作用不僅促進(jìn)穩(wěn)定的相互作用，而且促進(jìn)由單體混合物形成的異源多聚體再形成異源多聚體。參見，例如，美國專利申請No.08/399,106,P0927(完整地為本文所參考)，其中描述了一種作為第一和第二多肽異源寡聚界面的“突出-進(jìn)入-空穴”的方法?！巴怀觥笔峭ㄟ^用大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換第一多肽界面的小氨基酸側(cè)鏈構(gòu)成的。大小與突出相同或相近的互補(bǔ)性“空穴”是在第二多肽界面上用小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈構(gòu)成的。免疫球蛋白序列最好但不一定是免疫球蛋白的恒定區(qū)。本發(fā)明嵌合體中的免疫球蛋白可以來自IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亞類，IgA,IgE,IgD或IgM，但是以IgG1或IgG3為佳。
“表位記號的”在此表示這樣的嵌合多肽，它包含與一“記號多肽”融合的完整嵌合異源粘附素或其片段。記號多肽應(yīng)具有足量的殘基以形成產(chǎn)生其對應(yīng)抗體所需的表位，但又短到不至于影響嵌合異源粘附素的活性。記號多肽宜具有相當(dāng)?shù)莫?dú)特性，以致其抗體基本上不與其它表位交叉反應(yīng)。適宜的記號多肽一般具有至少6個氨基酸殘基，一般介于約8至50個氨基酸殘基(以約9至30個殘基為宜)。本發(fā)明實(shí)施方案之一包含一種與表位記號連接的嵌合異源粘附素，所述的記號被用來檢測樣品中的粘附素或從樣品回收粘附素。
“分離的嵌合異源多亞基粘附素”，“高度純化的嵌合異源多亞基粘附素”和“基本均一的嵌合異源多亞基粘附素”在此通用，都表示從某種來源純化得到或利用重組或合成方法制備得到，而且經(jīng)層析或其它純化技術(shù)(例如非還原性條件或還原性條件下使用考馬氏(Commassie)藍(lán)或者銀染色(更好)的SDS-PAGE)基本上不含其它肽或蛋白質(zhì)而到達(dá)均一的粘附素。均一性在此表示被其它蛋白質(zhì)源的污染小于約5％。如下文所述，本發(fā)明的ErbB2/3-IgG或ErbB2/4-IgG嵌合異源粘附素比之同源二聚體具足夠大的結(jié)合親和性，使用同源二聚體和異源二聚體的混合物也認(rèn)為是本發(fā)明的有用的實(shí)施方案之一?！扒逗袭愒炊鄟喕掣剿亍?，“嵌合異源粘附素”和“CHA”在此通用。
“生物特性”在此與“嵌合異源多亞基粘附素”聯(lián)用時表示結(jié)合配體和起到配體結(jié)合天然受體的拮抗劑作用的能力?！吧锾匦浴痹诖伺c“嵌合異源多亞基粘附素的抗體”聯(lián)用時表示結(jié)合粘附素內(nèi)編碼的胞外區(qū)或天然異源多亞基受體胞外區(qū)，抗體從而成為配體拮抗劑或活化劑的能力。
“生物活性”在與嵌合異源多亞基粘附素(例如ErbB異源粘附素)聯(lián)用時，包括以下功能通過結(jié)合細(xì)胞表面締合heregulin或分泌heregulin作為heregulin受體活化作用拮抗劑(例如抗ErbB2,ErbB3和/或ErbB4受體的活化)；抑制在其表面表達(dá)ErbB受體的細(xì)胞的生長(例如SK-BR-3細(xì)胞，Schwann細(xì)胞，肝細(xì)胞，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，上皮細(xì)胞(包括乳房、卵巢、前列腺、肺、胰、結(jié)腸和直腸內(nèi)的))，肌細(xì)胞，星形細(xì)胞和/或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)；抑制與受體結(jié)合(例如與ErbB2/3,ErbB2/4,ErbB3和/或ErbB4受體)；抑制有絲分裂活性；抑制神經(jīng)肌肉連接處乙酰膽堿受體的合成；和抑制神經(jīng)元和肌肉、神經(jīng)或腺細(xì)胞之間突觸連接的形成。
“生物活性”在與嵌合異源多亞基粘附素活化性抗體(例如抗ErbB異源粘附素抗體活化劑)聯(lián)用時，包括以下功能作為heregulin受體活化作用的活化劑(例如激活ErbB2,ErbB3和/或ErbB4受體)；結(jié)合并激活例如ErbB2/3,ErbB2/4,ErbB3和/或ErbB4受體；促進(jìn)在其表面表達(dá)ErbB受體的細(xì)胞的生長；促進(jìn)表達(dá)上述受體的細(xì)胞的分化和/或增殖(例如SK-BR-3細(xì)胞，Schwann細(xì)胞，肝細(xì)胞，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，上皮細(xì)胞(包括乳房、卵巢、前列腺、肺、胰、結(jié)腸和直腸內(nèi)的))，肌細(xì)胞，星形細(xì)胞和/或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)；促進(jìn)有絲分裂活性；促進(jìn)神經(jīng)肌肉連接處乙酰膽堿受體的合成；和促進(jìn)神經(jīng)元和肌肉、神經(jīng)或腺細(xì)胞之間突觸連接的形成。
“氨基酸序列一致性百分比”就嵌合異源多亞基粘附素而言在此表示將序列對齊并在必要時引入空距以獲得最大的序列一致性百分比之后，與天然異源多亞基受體之單體的胞外區(qū)序列內(nèi)殘基相同的候選胞外區(qū)序列內(nèi)殘基的百分比，而且不將任何保守性取代作為部分序列一致性。N末端、C末端或內(nèi)部的延伸，缺失或插入都被視為影響序列一致性或同源性。
“疾病狀態(tài)”在此指細(xì)胞或哺乳動物整體的一種生理狀態(tài)，其中發(fā)生了細(xì)胞或機(jī)體的功能系統(tǒng)或器官的中斷、停止或紊亂。
“癌癥”或“癌性的”指或用于描述細(xì)胞或哺乳動物整體的一種生理狀態(tài)，其特征是細(xì)胞生長失控。癌癥的例子包括但不限于惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。上述癌癥更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞性肺癌、胃癌、胰癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤(例如成神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)纖維瘤病)、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳房癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎癌、前列腺癌、陰道癌、甲狀腺癌、肝管癌和各種腦癌和頸癌。如果本發(fā)明的嵌合異源粘附素是ErbB-Ig異源粘附素，其治療的癌癥最好是表達(dá)ErbB受體的細(xì)胞的癌性生長，例如乳房細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、肺細(xì)胞、胰細(xì)胞和結(jié)腸直腸細(xì)胞的癌性生長。
“炎癥”在此指一種基礎(chǔ)病理過程，即應(yīng)答因物理、化學(xué)或生物因子引起的損傷或異常刺激，在受損的血管及其鄰近組織內(nèi)發(fā)生的一系列動態(tài)復(fù)合的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)反應(yīng)，它包括1)局部反應(yīng)及造成的形態(tài)變化；2)損傷性物質(zhì)的降解或去除；3)引起修復(fù)和愈合的應(yīng)答反應(yīng)?？捎帽景l(fā)明治療的炎癥是與白細(xì)胞介素和白血病抑制因子之類的細(xì)胞因子有關(guān)的那些。這樣的疾病例如血小板生成異常、巨噬細(xì)胞生長和分化、造血祖細(xì)胞的增殖等。
“神經(jīng)病”指或描述哺乳動物內(nèi)以神經(jīng)細(xì)胞生長、分化或細(xì)胞信號傳遞為特征的生理狀態(tài)。神經(jīng)病的例子包括但不限于神經(jīng)纖維瘤和外周神經(jīng)病。
“心臟病”指或描述哺乳動物內(nèi)以心臟細(xì)胞生長和分化為特征的生理狀態(tài)。心臟病的例子包括但不限于心臟肥大和心力衰竭(包括充血性心力衰竭)，心肌梗塞和心動過速?！靶牧λソ摺敝感呐K功能異常，即心臟不能以代謝組織所需的速度泵送血液。
“確定疾病狀態(tài)”指確定癌癥(尤其是乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌和膀胱癌)患者存活的可能性和癌癥復(fù)發(fā)時間的活動。具體地說，本發(fā)明的抗體可以用來在取自癌癥患者的癌變組織中定量異源多亞基受體(例如ErbB2,ErbB3或ErbB4，但通常是ErbB2)的過表達(dá)。這又稱為“確定適合癌癥患者的療程”。例如，與根據(jù)其它確診因素所可能指示的疾病相比，以ErbB2過表達(dá)或ErbB2/3或ErbB2/4細(xì)胞表面受體增加為特征的患者可能需要更積極的治療(例如大劑量的化療或放療)。該用語包括對高級導(dǎo)管性癌癥患者的原位診斷，包括廣延性管內(nèi)癌。參見，例如Disis等，Cancer Research,54:16-20(1994)。
“樣品”指取自患者的組織、體液或細(xì)胞。一般說來，由患者取出組織或細(xì)胞，但是也考慮體內(nèi)診斷。如果是實(shí)體瘤，可以由手術(shù)切除的腫瘤獲取組織樣品并利用常規(guī)技術(shù)制備用于測試。如果是淋巴瘤或白血病，就獲取淋巴細(xì)胞、白血病細(xì)胞或淋巴組織并適當(dāng)處理。根據(jù)具體的腫瘤也可以使用患者的其它樣品，包括尿液、淚液、血清、腦脊髓液、糞便、唾液、細(xì)胞提取物等。
“標(biāo)記過的”在此指分子(以ErbB2/3-IgG為例的嵌合異源粘附素)直接或間接地與一可測化合物或組合物結(jié)合。標(biāo)記可以本身就是可測的(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者，如果是酶標(biāo)記，它可能催化某種底物化合物或組合物的可測的化學(xué)轉(zhuǎn)變。
“固相”表示有用的物質(zhì)(例如ErbB2/3-IgG、ErbB2/4-IgG或其抗體)可與之粘附的非液相基質(zhì)。固相的實(shí)例在此包括部分或完全由玻璃(調(diào)孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和二氧化硅形成的那些。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)上下文，固相可以是測試板上的孔；在其它實(shí)施例中，它是純化柱(例如親和性層析柱)。該用語還包括分散顆粒這樣的不連續(xù)固相，例如美國專利No.4,275,149中所述的那些。
“激活ErbB受體”指引起ErbB受體胞內(nèi)激酶區(qū)將酪氨酸殘基磷酸化的活動。簡而言之，這涉及(例如抗ErbB2/3-IgG)抗體的結(jié)合(所述的抗體已就其作為heregulin活化劑的能力經(jīng)與兩種或多種ErbB受體構(gòu)成的受體復(fù)合物的結(jié)合接受了測定)，這種結(jié)合激活了上述受體中一種或多種的激酶區(qū)，由此造成一個或多個受體內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化，和/或其它底物多肽內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化。ErbB受體磷酸化可以利用下文所述的酪氨酸磷酸化試驗(yàn)來定量?！耙种颇矱rbB受體”指嵌合ErbB異源粘附素或其抗體在與ErbB受體結(jié)合時阻止受體活化(即抑制激酶功能)的拮抗性。
“降低細(xì)胞存活率”指在體外或體內(nèi)，與未經(jīng)嵌合ErbB-IgG(或其拮抗性抗體)接觸處理的非處理細(xì)胞相比，縮短細(xì)胞存活時間的活動?！敖档图?xì)胞繁殖率”指體外或體內(nèi)，與非處理細(xì)胞相比，與嵌合ErbB-IgG(或其拮抗性抗體)接觸后樣群內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的減少。
“提高細(xì)胞的存活率”或“提高細(xì)胞的繁殖”指在體外或體內(nèi)，與非處理細(xì)胞相比，接觸抗本發(fā)明嵌合ErbB-IgG的活化性抗體后樣群內(nèi)細(xì)胞生存時間和數(shù)量的增加。細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)細(xì)胞繁殖的提高和降低可以通過在接觸活化性抗ErbB-IgG抗體前和接觸后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量來確定。繁殖程度可以通過顯微鏡檢鋪滿程度來定量。細(xì)胞繁殖還可以通過測定細(xì)胞對3H-胸苷的攝取來定量。
“加強(qiáng)細(xì)胞的分化”指提高獲得或具有一種或多種不同于原細(xì)胞的特征或功能程度的活動(例如細(xì)胞特化)。這可以通過篩選細(xì)胞的表型變化來檢測(例如檢測細(xì)胞的形態(tài)變化)。加強(qiáng)細(xì)胞分化在此還指細(xì)胞的成熟，期間，例如，與成熟細(xì)胞相關(guān)的特種蛋白質(zhì)被合成。
“神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞”來自中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，可以選自少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞、室管膜細(xì)胞或小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)節(jié)的衛(wèi)星細(xì)胞和外周神經(jīng)纖維周圍的神經(jīng)鞘細(xì)胞。
“肌細(xì)胞”包括骨骼肌、心肌或平滑肌組織細(xì)胞。它包括那些分化為更加特化的肌細(xì)胞的細(xì)胞(例如成肌細(xì)胞)。
“分離的核酸”指沒有在天然狀態(tài)下通常與之締合的污染性來源核酸中至少一種的RNA或DNA，沒有任何其它哺乳動物RNA或DNA則更好?！皼]有在天然狀態(tài)下通常與之締合的污染性來源核酸中至少一種”包括這樣的情況，即核酸存在于來源或天然細(xì)胞內(nèi)，但位于不同的染色體位置，或者其兩側(cè)的序列不是正常情況下來源細(xì)胞中的。分離的核酸是編碼具生物活性的嵌合異源多亞基粘附素的RNA或DNA，所述粘附素各自的胞外區(qū)與作為其來源的天然受體中單體的胞外區(qū)具有至少75％的序列一致性，至少約80％為佳，至少85％更好，至少90％還要好，95％則最好。
“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指以下條件a)用低離子強(qiáng)度高溫洗滌，例如0.015MNaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％NaDodSO4(SDS),50℃；或b)在雜交過程中使用甲酰胺之類變性劑，例如50％(vol/vol)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM硫酸鈉緩沖液，pH6.5，加750mM NaCl,75mM檸檬酸鈉，42℃。另一實(shí)例是使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl,0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8),0.1％焦磷酸鈉，5×Denhardt′s溶液，經(jīng)超聲處理的鮭魚精子DNA(50微克/毫升)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃，在42℃用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌。
Sambrook等在Molecular Cloning:A Laboratory Mannual(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中說明了一種“較嚴(yán)謹(jǐn)條件”，它包括使用嚴(yán)謹(jǐn)性略低于以上所述的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度，離子強(qiáng)度和％SDS)。較嚴(yán)謹(jǐn)條件例如在以下溶液中于37℃培養(yǎng)過夜20％甲酰胺，5×SSC(150mMNaCl,15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),10％硫酸葡聚糖和20mg/mL變性剪切的鮭魚精子DNA，然后用1×SSC在約37至50℃洗滌濾膜。技術(shù)人員懂得如何適應(yīng)探針長度等因素來視必要調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等?！罢{(diào)控序列”指在特定的宿主微生物內(nèi)為表達(dá)可操作性連接的編碼序列所必需的DNA序列。適用于原核宿主的調(diào)控序列例如啟動子、可能是一段操縱子序列和一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知，真核生物使用啟動子、聚腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。
核酸被“可操作性連接”表示使其與另一段核酸序列具有某種功能關(guān)系。例如，如果某多肽分泌后參與其分泌，則一段前導(dǎo)序列或分泌前導(dǎo)序列與多肽的DNA可操作性連接；如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，則一段啟動子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作性連接；如果其位置有利于翻譯，則一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操作性連接。一般說來，“可操作性連接的”表示連接的DNA序列是毗鄰，如果是分泌前導(dǎo)，則毗鄰而且在閱讀相位內(nèi)。但是，增強(qiáng)子不一定毗鄰的。連接是通過在常規(guī)限制性酶切位點(diǎn)的連接完成的，如果沒有這樣的位點(diǎn)，可以按照常規(guī)方法使用合成寡聚核苷酸接泊或接頭。
HRG“拮抗劑”指阻止或干擾HRG效應(yīng)物功能的分子(例如阻止或干擾HRG結(jié)合和/或激活ErbB受體的分子)。例如，可以在本文所述的酪氨酸磷酸化試驗(yàn)中篩選它們競爭性抑制ErbB被HRG激活的能力。較好的拮抗劑不明顯干擾其它heregulin多肽與ErbB受體間的相互作用。HRG拮抗劑的例子如抗本發(fā)明ErbB2/3-Ig或ErbB2/4-Ig嵌合異源粘附素的中和抗體。
“抗體”使用其最廣義的意義，具體包括單個抗嵌合異源粘附素(例如抗ErbB2/3-IgG或抗ErbB2/4-IgG)的單克隆抗體和具有多表位特異性的抗嵌合異源粘附素抗體組合物(包括中和和非中和抗體)。本發(fā)明中特別有用的抗體是基本上不與其它異源多亞基受體發(fā)生交叉反應(yīng)的那種，例如上面在背景部分中所述的那些，所以也就是那些“特異性結(jié)合”異源多亞基受體(例如ErbB2/3或ErbB2/4)的那種。在這類實(shí)施方案中，根據(jù)例如放射性免疫沉淀法(RIA)測定，抗體與非ErbB受體的結(jié)合程度將低于10％。
“單克隆抗體”在此指由一群基本同源的抗體獲得的抗體，即，構(gòu)成該抗體群的各抗體是完全相同的，除了可能少量天然發(fā)生的突變。單克隆抗體具有很高的特異性，只針對單一的抗原性位點(diǎn)。而且，與一般包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體相比，各單克隆抗體只針對抗原上的一個決定簇。
此處的單克隆抗體包括雜和和重組抗體，即抗嵌合異源粘附素抗體的可變區(qū)(包括超變區(qū))與恒定區(qū)(例如“人源化”的抗體)剪接而成，或輕鏈與重鏈剪接而成，或一個物種的鏈與另一物種的鏈剪接而成，或異源蛋白(不論來自的種類或免疫球蛋白的類和亞類)以及抗體片段(例如Fab,F(ab)2和Fv)的融合，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性(參見美國專利4,816,567和Mage和Lamoyi,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.79-97(Marcel Dekker,Inc.),NewYouk(1987))。
所以修飾語“單克隆抗體”表明抗體的特征在于來自一群基本同源的抗體，而不應(yīng)理解成需要特殊的方法來產(chǎn)生所述的抗體。例如，本發(fā)明使用的單克隆抗體可以按照最先由Kohler和Milstein在Nature256:495(1975)所述的雜交瘤法來制備，或利用重組DNA法制備(美國專利4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可以從利用McCafferty等在Nature348:552-554(1990)中所述方法建立的噬菌體文庫中分離得到。
非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是一種特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv,Fab,Fab’,F(ab)2或抗體的其它抗原結(jié)合性序列)，它們含有盡可能少的來自非人免疫球蛋白的序列。就多數(shù)而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受抗體)，即接受抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)內(nèi)的殘基被具有所需特異性、親和性和功能的來自非人(供體抗體)(例如小鼠、大鼠)CDR內(nèi)的殘基所取代。有時，人免疫球蛋白Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人FR殘基所取代。而且，人源化抗體可能包含既不存在于接受抗體也不存在于輸入CDR或FR序列的殘基。這樣的修飾是為了進(jìn)一步改良和優(yōu)化抗體的性能。一般說來，人源化抗體具有幾乎完整的至少一個，通常為兩個可變區(qū)，其中整個或幾乎整個CDR區(qū)和非人免疫球蛋白的相對應(yīng)，或者，幾乎全部FR殘基是人免疫球蛋白的共同序列。人源化抗體還可以包含至少一免疫球蛋白，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分。
“中和抗體”在此指能夠抑制或明顯降低天然序列HRG效應(yīng)物功能的抗體分子。例如，在本文所述的酪氨酸磷酸化試驗(yàn)中，中和抗體可以抑制或減低HRG激活ErbB受體的能力。在本文所述的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，中和抗體還可以抑制HRG的有絲分裂活性。
“治療”包括治療性的和預(yù)防性的。需要治療的包括那些已經(jīng)患有疾病的，和容易患上疾病或需要防止疾病發(fā)生的那些。
就治療目的而言，“哺乳動物”包括各種歸為哺乳類的動物，其中包括人、家畜、動物園內(nèi)的、用于比賽的或?qū)櫸飫游?，例如綿羊、狗、馬、貓、母牛等。在此，最好是人。
“藥學(xué)上可接受的”載體、賦形劑或穩(wěn)定劑指在使用劑量和濃度下對與之接觸的細(xì)胞或哺乳動物無毒的那些。通常，生理上可接受的載體是水性pH緩沖液。生理上可接受的載體例如磷酸、檸檬酸或其它有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量多肽(小于10個殘基)；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；多糖，二糖或其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽反離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如TweenTM，聚乙二醇和PluronicsTM。
Ⅱ．本發(fā)明實(shí)施方式1．嵌合異源多亞基粘附素的產(chǎn)生本發(fā)明嵌合異源粘附素宜在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并從中分離來產(chǎn)生。通常，用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。較好的是，將核酸加入表達(dá)載體。在此，適合克隆或表達(dá)載體的合適的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞(例如大腸桿菌，芽孢桿菌，假單孢菌或其它細(xì)菌)，酵母和其它真核微生物，以及高級真核細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和其它哺乳動物細(xì)胞)。細(xì)胞也可以存在于動物活體(例如母牛、山羊或綿羊)內(nèi)。也可以使用昆蟲細(xì)胞?？寺『捅磉_(dá)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
為了表達(dá)嵌合異源多聚體，例如ErbB2-IgG,ErbB3-IgG和/或ErbB4-IgG,需要通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染將載體引入宿主細(xì)胞，并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基(被改進(jìn)成適合引入啟動子、選擇重組細(xì)胞或擴(kuò)增ErbB-IgG DNA)中培養(yǎng)所得的重組宿主細(xì)胞。簡而言之，為了在體外，在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得最大的產(chǎn)量，原理、方案和操作技術(shù)可以參見Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach,M.Butler等(IRL Press,1991)。
“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”在此通用，都指將DNA引入細(xì)胞的過程。在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染之后，本發(fā)明的核酸可以整合到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)，或者以染色體外元件的形式存在。如果使用原核細(xì)胞或具有完整細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，優(yōu)選的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法是鈣處理法，參見Cohen,S.N．等，Pro.Natl.Aca.Sci.USA.,69:2110-2114(1972)或聚乙二醇法，參見Chung等，Nuc.Acids,Res.16:3580(1988)。如果使用酵母作為宿主細(xì)胞，一般利用聚乙二醇完成轉(zhuǎn)染，參見Hinnen,Pro.Natl.Aca.Sci.USA.,75:1929-1933(1978)。如果使用哺乳動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，通常通過磷酸鈣沉淀法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參見Graham等，Virology52:546(1978),Gorman等，DNA and Protein Eng.Tech.2:3-10(1990)。但是，用于將DNA引入原核和真核細(xì)胞的其它已知方法，例如細(xì)胞核注射、電穿孔或原生質(zhì)體融合等也可以用于本發(fā)明。
本發(fā)明中特別有用的是能夠在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)提供DNA(編碼ErbB2/3-Ig或ErbB2/4-Ig)瞬時表達(dá)的表達(dá)載體。簡而言之，瞬時表達(dá)涉及使用能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制的表達(dá)載體，使得宿主細(xì)胞積累表達(dá)載體的大量拷貝，然后，高水平地合成表達(dá)載體所編碼的所需多肽。包括合適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的瞬時表達(dá)系統(tǒng)能夠使人方便地鑒定到克隆DNA編碼的多肽，并就所需的生物或生理特性篩選出這樣的多肽。
嵌合異源粘附素最好以分泌多肽的形式從培養(yǎng)基中回收得到，雖然它也可以從宿主細(xì)胞的裂解液中收獲。第一步，通過例如離心或超濾去除顆粒狀碎片(或者是宿主細(xì)胞或者是裂解片段)；可選的是，可以利用市售蛋白質(zhì)濃縮過濾器濃縮蛋白質(zhì)，然后用一種或多種以下純化方法將嵌合異源粘附素與其它雜質(zhì)分離在免疫親和性柱上層析分離；在離子交換柱上層析；硫酸銨或乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅柱層析；肝素Sepharose層析；陽離子交換樹脂層析；層析聚焦；SDS-PAGE；和凝膠過濾。
使用記號表位嵌合異源多聚體(例如ErbB-IgG)有助于使用免疫親和柱的純化，所述的柱具有吸附融合多肽的針對表位的抗體。可以使用例如家兔多克隆抗ErbB柱之類免疫親和柱來通過與一ErbB免疫表位的結(jié)合來吸附ErbB-IgG。
嵌合異源粘附素內(nèi)天然胞外區(qū)序列的氨基酸變體可以通過在天然胞外區(qū)DNA序列中引入合適的核苷酸變化來制備，或者通過體外合成所需嵌合異源粘附素單體多肽來制備。這樣的變體包括，例如，在嵌合粘附素序列內(nèi)的殘基的缺失、插入或取代。
上述天然序列的改變可以利用任何用于保守或非保守性突變的技術(shù)來制備，參見美國專利5,364,934。特別注意其中的表Ⅰ，和圍繞該表所作的論述，其中指導(dǎo)了如何選擇改變、加入或缺失的氨基酸。
胞外區(qū)天然序列的氨基酸序列變體的編碼核酸序列可以利用許多本領(lǐng)域已知的方法來制備。這些方法包括但不限于，從天然來源中分離(如果是天然存在的氨基酸序列變體)或?qū)υ戎苽涞奶烊恍蛄蠩rbB2,3和/或4的變體或非變體通過寡核苷酸介導(dǎo)的誘變(或點(diǎn)突變)，PCR誘變和盒式誘變來制備。
較好的一種嵌合氨基酸序列是融合蛋白，它包括一個胞外區(qū)(例如一個ErbB單體)與一異源多肽(例如多聚化區(qū)(免疫球蛋白恒定區(qū)等))連接。這樣的序列可以利用重組DNA技術(shù)來構(gòu)建。或者，異源多肽可以通過本領(lǐng)域的已知技術(shù)，例如使用異源雙官能交聯(lián)劑與胞外區(qū)多肽共價結(jié)合。偶合劑例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸(SPDP),iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙官能衍生物(例如鹽酸二甲基adipimidate)，活潑酯(例如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)，醛(例如戊二醛)，雙疊氮基化合物(例如雙(對疊氮苯甲酰己二胺)，雙-重氮衍生物(例如雙-(對重氮基苯甲酰)-乙二胺)，二異氰酸酯(例如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
在實(shí)施方案之一中，嵌合異源粘附素多肽包含嵌合異源粘附素單體與記號肽(提供抗記號抗體可以選擇性結(jié)合的表位)的融合。嵌合異源粘附素的這種表位記號形式是有用的，因?yàn)槠浯嬖诳梢岳每乖撚浱柖嚯牡臉?biāo)記抗體來檢測到。而且，提供了表位記號能夠使用抗記號抗體方便地通過親和純化法來純化嵌合異源粘附素。記號多肽及其相應(yīng)的抗體是本領(lǐng)域眾所周知的。例如flu HA記號多肽及其抗體12CA5,(Field等，Mo1.Cell.Bio1.8:2159-2165(1988))；c-myc記號及其抗體8F9,3C7,6E10,G4,B7和9E10(Evan等，Molecular and CellularBiology 5(12):3610-3616(1985)；和單純性皰疹病毒糖蛋白D(gD)記號及其抗體(Paborsky等，Protein Engineering 3(6):547-553(1990))。
在制備本發(fā)明嵌合異源粘附素時，編碼天然異源多亞基受體的胞外區(qū)的核酸在C末端與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列N末端的核酸融合，但是，也可以在N末端融合。典型的是，在這樣的融合中，被編碼的嵌合多肽將保留至少功能活性的鉸鏈區(qū)，即免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)。也可以與恒定區(qū)Fc部分的C末端，或者緊靠重鏈CH1區(qū)的N末端或輕鏈的相應(yīng)區(qū)融合。所得的DNA融合結(jié)構(gòu)體在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
對嵌合異源多聚體的另一種共價修飾包括將異源多聚體的一個單體多肽與多種非蛋白質(zhì)聚合物(例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)連接?？梢詫⑶逗袭愒炊嗑垠w包裹在微囊中，所述微囊通過團(tuán)聚化技術(shù)或界面聚合法來制備(例如相應(yīng)的羥甲基纖維素或明膠微囊和聚-(甲基異丁烯酸甲酯微囊)，呈膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)，或呈大顆粒乳液(macroemulsion)。以上技術(shù)可參見Remington’sPhamaceutical Sciences，第16版，Oslo,A．編輯(1980)。
總的說來，本發(fā)明的ErbB嵌合異源多聚體將具有以下特性任何一種或多種(a)與異源多亞基受體競爭結(jié)合神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(例如heregulin)的能力；(b)形成ErbB2-IgG/ErbB3-IgG和/或ErbB2-IgG/ErbB4-IgG復(fù)合物的能力；(c)通過去除天然受體周圍的heregulin來抑制天然異源多亞基受體被激活，由此抑制表達(dá)ErbB2和ErbB3受體和/或ErbB2和ErbB4受體的能力。
為了篩選特性(a)，嵌合ErbB異源多亞基粘附素結(jié)合γ-heregulin的能力可以方便的體外測定。例如，可以形成這些受體的免疫粘附素形式(見下文)，而ErbB2/3-IgG或ErbB2/4-IgG異源免疫粘附素則固定在固相(例如涂有山羊抗人抗體的測試板)上。然后可測定HRG結(jié)合固定化免疫粘附素的能力，例如通過測定其它heregulin分子的競爭性置換。有關(guān)細(xì)節(jié)，參見下文實(shí)施例中的125I-HRG結(jié)合試驗(yàn)。
關(guān)于特性(c)，實(shí)施例中所述的使用MCF7細(xì)胞的酪氨酸磷酸化試驗(yàn)提供了篩選ErbB受體活化的方法。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以使用WO95/14930所述的KIRA-ELISA來定性定量地測定某ErbB嵌合異源粘附素抑制ErbB受體活化的能力。
嵌合異源粘附素(例如ErbB2/3-IgG或ErbB2/4-IgG)刺激表達(dá)ErbB2和ErbB3受體和/或ErbB2和ErbB4受體的細(xì)胞繁殖的能力可以方便地在細(xì)胞培養(yǎng)物中測定。適用于該試驗(yàn)的細(xì)胞包括MCF7細(xì)胞和來自ATCC和Schwann細(xì)胞SK-BR-3細(xì)胞(參見，Li等，J.Neuroscience16(6):2012-2019(1996))?？蓪⑸鲜瞿[瘤細(xì)胞系鋪在細(xì)胞培養(yǎng)板上任其與之粘附。加入有或沒有ErbB嵌合異源粘附素的HRG。細(xì)胞單層可以經(jīng)洗滌，并用結(jié)晶紫染色/固定。由此，可以如所述的那樣定量細(xì)胞的繁殖或生長抑制。
適合用本發(fā)明來制備有用的嵌合異源粘附素的其它異源多亞基受體包括Axl,Rse，上皮生長因子(EGF)受體，肝細(xì)胞生長因子(HGF)受體，IL-2,c-mer,Al-1,EPH,TrkA,TrkB,TrkC,TNF,IL-10,CRF2-4,RXR,RON,AChRα/δ,TRα/RXRα,Trα/DR4,Trα/MHC-TRE,Trα/ME,Trα/F2,KDR/FLT-1,FLT/VEGF,VEGF121/165,Amt/Ahr,CGA/CGB,EGFR/p185-neu，促乳素受體(PRL),T細(xì)胞受體(TCR)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)/gp130,Cak受體，IL-6/gp130,IL-11/gp130白血病抑制因子(LIF)/gp130,cardiotrophin-1/gp130(CT-1),IL-11/gp130,睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子CNTF/gp130，制癌蛋白M(OSM)/gp130,γ干擾素和α、β干擾素。
本發(fā)明嵌合異源粘附素包含天然異源多亞基受體的胞外區(qū)，如前所述，其中受體單體之一的ECD(或其配體結(jié)合片段)與一多聚化區(qū)融合。異源粘附素的嵌合單體通過多聚化區(qū)穩(wěn)定締合形成嵌合異源粘附素。本發(fā)明的異源粘附素結(jié)合天然受體(ECD來源)的配體，可以用作配體的拮抗劑。這樣的拮抗劑可以用于治療因配體結(jié)合并激活天然異源多亞基受體而引起的疾病。
2．治療用組合物和方法將本發(fā)明嵌合異源粘附素用作治療性組合物是本發(fā)明的實(shí)施方案之一。在此概述的用途只是對使用嵌合異源粘附素的一般性指導(dǎo)。進(jìn)一步的指導(dǎo)以EbrB嵌合異源粘附素為例。
HRG在體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育、維持和/或再生，包括中樞(腦和脊索)、外周(交感、副交感、傳感和腸神經(jīng)元)和運(yùn)動神經(jīng)元。所以，HRG活化劑例如抗EbrB-Ig抗體活化劑可以用作診斷和/或治療多種“神經(jīng)性疾病或失調(diào)”，這些疾病影響哺乳動物例如人的神經(jīng)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可制成針對EbrB嵌合異源粘附素的活化性抗體與EbrB受體交叉反應(yīng)并將其激活。
上述疾病或失調(diào)可能發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)因創(chuàng)傷、手術(shù)、中風(fēng)、局部缺血、感染、代謝性疾病、營養(yǎng)不良、惡性腫瘤或有毒藥物而受損的患者中。該藥物能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活、增殖或分化。例如，抗EbrB嵌合營養(yǎng)粘附素活化劑抗體可以用來刺激因創(chuàng)傷或手術(shù)受損的運(yùn)動神經(jīng)元的存活或增殖。它還可以用來治療運(yùn)動神經(jīng)元疾病，例如肌萎縮性側(cè)索硬化(Lou Gehrig氏病)，Bell氏病、和各種與脊椎肌肉萎縮或麻痹有關(guān)的疾病。該活化性抗體可以用來治療人“神經(jīng)變性性疾病”，例如Alzheimer氏病、Parkinson氏病，癲癇、多發(fā)性硬化癥、Huntington舞蹈病、Down氏綜合征，神經(jīng)麻木和Meniere氏病。
而且，抗EbrB粘附素活化性抗體可以用來治療神經(jīng)病，尤其是外周神經(jīng)病?！巴庵苌窠?jīng)病”指影響外周神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，多數(shù)表現(xiàn)為運(yùn)動、傳感、交感運(yùn)動或自律神經(jīng)功能失調(diào)之一或多種并發(fā)。多種外周神經(jīng)病表現(xiàn)出的多種形態(tài)各自可獨(dú)特地歸因于同樣多的原因中。例如，外周神經(jīng)病可能是遺傳獲得的，可能是由全身性疾病造成的，或者是由有毒藥物引起的。其實(shí)例包括但不限于末梢傳感運(yùn)動神經(jīng)病或自律性神經(jīng)病(例如胃腸道運(yùn)動減弱或膀胱張力缺乏)。與全身性疾病相關(guān)的神經(jīng)病例如脊髓灰質(zhì)炎后綜合征；遺傳性神經(jīng)病例如Charcot-Marie-Tooth病、Refsum氏病、血內(nèi)β脂蛋白缺乏癥、Tangier氏病，Krabbe氏病，異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，F(xiàn)abry氏病和Dejerin-Sottas綜合征；有毒藥物引起的神經(jīng)病包括因化療引起的那些。
本發(fā)明的抗EbrB嵌合異源粘附素活化性抗體還可以用來治療肌肉細(xì)胞或影響它們的疾病。例如，HRG可以用來治療哺乳動物肌肉系統(tǒng)病理生理病癥，例如骨骼肌疾病(例如肌病或營養(yǎng)不良)，心肌疾病(例如前房心律不齊、心肌病、心肌缺血損傷、充血性疾病或心臟創(chuàng)傷)，或平滑肌疾病(例如動脈硬化、脈管損傷或充血性脈管疾病)；治療肌肉損傷；減少肌肉細(xì)胞的萎縮；提高哺乳動物肌肉細(xì)胞的存活、增殖和/或再生；治療高血壓；和/或治療乙酰膽堿受體功能不足的肌肉細(xì)胞(例如在重癥肌無力或心動過速患者中)。
抗EbrB嵌合異源粘附素活化性抗體可以用來誘導(dǎo)在細(xì)胞膜表面形成離子通道和/或加強(qiáng)個體內(nèi)突觸連接的形成。HRG還可以用作記憶加強(qiáng)劑，并可以消除對尼古丁的“上癮性”。
抗EbrB嵌合異源粘附素活化性抗體可以用來加強(qiáng)修復(fù)和/或再生EbrB受體(尤其是EbrB2受體)的組織。例如，抗EbrB嵌合異源粘附素活化性抗體可以用來治療皮外傷、胃腸道疾病、Barrett氏食管；膀胱性或非膀胱性末期腎?。缓湍c炎。同樣，該分子可以促進(jìn)人胃腸道、呼吸道、生殖道或泌尿道內(nèi)上皮的重新生成。
當(dāng)哺乳動物內(nèi)出現(xiàn)HRG水平過高和/或HRG對EbrB受體活化過度時，可能需要用HRG拮抗劑，例如EbrB-Ig嵌合異源粘附素來治療該哺乳動物。用HRG拮抗劑治療的疾病例如良性或惡性腫瘤(例如腎、肝、腎、膀胱、乳房、胃、卵巢、結(jié)腸直腸、前列腺、胰腺、肺、陰道、甲狀腺、肝細(xì)胞癌；肉瘤；成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和各種腦部和頸部的癌癥)；白血病和惡性淋巴癌；其它疾病例如神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、基質(zhì)和囊胚腔疾?。谎仔?、血管生成性和免疫疾??；牛皮癬或結(jié)痂組織的形成。HRG拮抗劑還可以用來將腫瘤細(xì)胞對免疫應(yīng)答的抗性逆轉(zhuǎn)，以抑制病理性血管生成和激發(fā)免疫系統(tǒng)。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，作為HRG拮抗劑的抗EbrB嵌合粘附素可以給以HRG產(chǎn)生過量和/或ErbB被HRG激活過度為特征的神經(jīng)病患者使用?？笶brB嵌合異源粘附素拮抗性多肽可以用于防止可能在手術(shù)后發(fā)生的傳感神經(jīng)元異常再生，或用于在(例如)慢性疼痛綜合征的治療中選擇性地消除傳感神經(jīng)元。
有兩種主要方法將核酸(可操作性地包含于載體中)引入患者的細(xì)胞；體內(nèi)和體外。用于體內(nèi)傳遞，通常在需要嵌合異源粘附素的部位將核酸直接注入患者。用于體外傳遞，取出患者的細(xì)胞，將核酸引入這些分離的細(xì)胞，然后直接將修飾后細(xì)胞回輸給患者，或者用多孔性薄膜包裹后植入患者(參見美國專利4,892,538和5,283,187)。
有許多技術(shù)可用來將核酸引入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是要體外傳遞給培養(yǎng)中的細(xì)胞還是體內(nèi)傳遞給目標(biāo)受體的細(xì)胞而不同。適合體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞的方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、微注射、細(xì)胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸鈣沉淀法等。體外傳遞基因的載體之一是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前較好的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括利用病毒載體(例如腺病毒、單純性Ⅰ類皰疹病毒或腺相關(guān)性病毒)和基于脂質(zhì)體的系統(tǒng)(適用于脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)體是DOTMA,DOPE和DC-Chol)轉(zhuǎn)染。有時，需要提供具有定向于靶細(xì)胞的物質(zhì)(例如對細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞具有特異性的抗體，靶細(xì)胞上某受體的配體等)的核酸源。如果使用脂質(zhì)體，結(jié)合與胞吞作用有關(guān)的細(xì)胞膜蛋白的蛋白可用作定向和/或幫助吸收，例如偏好特定細(xì)胞類型的衣殼蛋白或其片段，在細(xì)胞周期內(nèi)經(jīng)歷內(nèi)化作用的蛋白質(zhì)的抗體和定向于胞內(nèi)位置并加強(qiáng)胞內(nèi)半衰期的蛋白。有關(guān)受體介導(dǎo)的胞吞作用的技術(shù)參見Wu等，J.Bio1.Chem.262:4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3410-3414(1990)。有關(guān)目前已知的基因標(biāo)記和基因療法的綜述可參見Anderson等，Science 256:808-813(1992)。還可參見WO93/25673和其中引用的參考文獻(xiàn)。
嵌合異源粘附素或其抗體的醫(yī)療性制劑可以通過將具有所需純度的異源粘附素或其抗體與選擇性生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington'sPharmaceutical Science，第16版,Osol,A．編輯(1980))混合，制成凍干塊或水溶液的形式保存。藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量和濃度對接受者無毒，它包括磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸緩沖液；包括抗壞血酸在內(nèi)的抗氧化劑；低分子量(少于10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽反離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如TweenTM,PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
體內(nèi)使用的嵌合異源粘附素或抗嵌合異源粘附素抗體必須是無菌的。這通過在低溫干燥和再建之前或之后進(jìn)行滅菌濾膜過濾即可以做到。制劑一般以凍干形式或溶液形式保存。
通常將治療用嵌合異源粘附素或抗嵌合異源粘附素抗體組合物放在一具有無菌出入口的容器內(nèi)保存，例如靜脈輸液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的藥瓶。
嵌合異源粘附素或抗體的給藥途徑可以根據(jù)已知方法，例如靜脈注射或輸液、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)或損害部位內(nèi)途徑，或通過下文中的緩釋系統(tǒng)。異源粘附素或抗體通過輸注或團(tuán)塊注射來連續(xù)給藥。
緩釋制劑的合適例子包括包含蛋白質(zhì)的半透性固體疏水聚合物，該基質(zhì)是有形的(例如膜或微囊)。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸)Langer等在J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)中所述的和Langer,Chem.Tech,12:98-105(1982)所述的聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸)或聚乙烯醇)，聚丙交酯(美國專利3,773,919,EP58,481),L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers,22:547-556(1983))，不可降解的乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，同上)，可降解的乳酸-羥乙酸共聚物(例如Lupron DepotTM(由乳酸-羥乙酸共聚物和leuprolide乙酸構(gòu)成的可注射微球))，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。
嵌合異源粘附素或活化性或拮抗性抗異源粘附素抗體組合物還包括嵌入脂質(zhì)體內(nèi)的組合物。含有HRG的脂質(zhì)體可利用以下已知方法制備DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本專利申請83-118008；美國專利4,485,045和4,544,545；和EP102,324。通常，這些脂質(zhì)體是小(約200-800)單片形式的，其中的脂質(zhì)含量為大于約30％甾醇，該比例根據(jù)最佳療效來選擇。特別有用的脂質(zhì)體可以通過反相蒸發(fā)來制備，其中的脂質(zhì)組合物包含縮醛磷脂酰膽堿、甾醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。脂質(zhì)體擠過具有特定孔徑篩網(wǎng)，從而得到具有所需直徑的脂質(zhì)體?？梢詫⒒熕幬?例如阿霉素)包含在脂質(zhì)體中。參見Gabizon等，J.NationalCancer Inst.81(19):1484(1989)。
本發(fā)明的EbrB-Ig嵌合異源粘附素可以用來在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和隔離HRG配體，由此抑制EbrB的活化，抑制患者體內(nèi)的細(xì)胞繁殖失調(diào)例如癌癥。
需用本文中EbrB2/3-Ig或EbrB2/4-Ig heregulin拮抗劑或作為拮抗劑的抗EbrB-Ig抗體治療的患者也可以接受放射治療?；蛘撸硗饨o該患者使用化療劑?？梢愿鶕?jù)生產(chǎn)商的說明來使用這類化療藥物的制備或劑量方案，或者由熟練技術(shù)人員憑經(jīng)驗(yàn)來確定。這類化療藥物的制備和劑量方案還可以參見ChemotherapyService Ed.,M.C.Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,MD(1992)?；熕幬锟梢栽诮o予拮抗劑之前、之后或同時給予。對癌癥來說，可能還需要使用抗腫瘤相關(guān)性抗原或抗原性因子的抗體，例如結(jié)合EGFR,EbrB2,EbrB3,EbrB4或脈管內(nèi)皮因子(VEGF)的抗體?；蛘撸€需要給患者另外聯(lián)用一種或多種細(xì)胞因子。
治療有效量的拮抗劑取決于治療對象、給藥途徑和病人狀態(tài)。所以，治療者有必要滴定劑量和修改給藥途徑以獲得最佳的治療效果。典型的劑量可以在約1微克/千克至100毫克/千克患者體重范圍內(nèi)，較好的是約10微克/千克至10毫克/千克。通常臨床醫(yī)生將逐漸給以拮抗劑，直至達(dá)到對上述疾病具有治療效果的劑量為止。
3．非治療方法HRG活化性抗EbrB2/3-Ig抗體或抗EbrB2/4-Ig抗體可以用來體外培養(yǎng)細(xì)胞(例如膠質(zhì)細(xì)胞和肌細(xì)胞)。為了分離得到細(xì)胞特異性因子(例如Schwann細(xì)胞特異性標(biāo)記P75NGFR)，需要在細(xì)胞培養(yǎng)物中含有此類細(xì)胞群。這類因子可以用作診斷工具，或者，以P75NGFR為例，可用作抗原來產(chǎn)生診斷用抗體。較好的還有，獲取哺乳動物細(xì)胞(例如Schwann細(xì)胞)群，用作置換細(xì)胞用于該哺乳動物移植(例如移植到受損的脊索區(qū)，以期作用于中斷中樞神經(jīng)節(jié)的再生，用于幫助外周神經(jīng)所述的修復(fù)和作為多次自體移植的替代方法)。
根據(jù)本發(fā)明的體外方法，包含EbrB受體的細(xì)胞被提供并處于細(xì)胞培養(yǎng)基中。合適的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括但不限于極限必需培養(yǎng)基(MEM),RPMI-1640和Dulbecco修改的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)。這些組織培養(yǎng)基可以向Sigma Chemical Company(St.Louis,MO)和GIBCO(Grand Island,NY)定購。然后在一定條件下將細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中，所述的條件足以在有效量活化性抗體存在下保持細(xì)胞活性并生長。細(xì)胞可以多種方法培養(yǎng)，包括培養(yǎng)在培養(yǎng)塊(clot)、瓊脂板或液體培養(yǎng)。
抗EbrB-Ig抗體可以用來診斷以erB(例如ebrB2)過表達(dá)和/或擴(kuò)增為特征的癌癥，其中使用與EbrB受體交叉反應(yīng)的抗嵌合異源粘附素抗體。這樣的診斷試驗(yàn)可以與其它診斷/預(yù)后評價聯(lián)用，例如測定淋巴結(jié)的情況、原發(fā)腫瘤的大小、組織學(xué)級別、雌激素或孕酮情況、腫瘤DNA含量(倍體)或細(xì)胞的繁殖(S期分級)。參見Muss等，New Eng.J.Med.,330(18):1260-1266(1994)。
此處的樣品是獲得的，例如，來自患者初期損傷的組織樣品。制備成福爾馬林固定的、石蠟包埋塊。參見Muss等，同上和Press等，Cancer Research54:2771-2777(1994)。按照已知技術(shù)制備組織切片(例如4微米的)。然后定量測定抗EbrB2/3-Ig或抗EbrB2/4-Ig抗體與組織切片結(jié)合的程度。
一般說來，嵌合異源粘附素或抗嵌合異源粘附素抗體是用可測標(biāo)記直接或間接標(biāo)記的。有許多標(biāo)記，大致分為以下幾類(a)放射性同位素，例如35S,14C,125I,3H和131I。γ-HRG或抗體可以利用已知技術(shù)用放射性同位素標(biāo)記，所述技術(shù)參見Current Protocols in Immunology,Ed.Coligen等，Wiley Publishers,VOL1和2，例如，可以利用閃爍計(jì)數(shù)法來測定放射性。
(b)熒光標(biāo)記，例如稀土螯合物(例如銪螯合物)或熒光素衍生物，羅丹明及其衍生物，丹酰、麗絲胺、藻紅素和得克薩斯紅都是可以購得的。這些熒光標(biāo)記可以通過已知技術(shù)與嵌合異源粘附素或抗體結(jié)合，所述技術(shù)可參見Current Protocolsin Immunology，同上?？梢岳脽晒庥?jì)(Dynatech)來測定熒光。
(c)有許多酶-底物標(biāo)記，美國專利4,275,149對此有所綜述。所述的酶通常催化一生色底物的化學(xué)改變，該改變可用多種技術(shù)測得。例如，酶催化底物中的變色反應(yīng)，這種變化可以利用分光光度計(jì)法來測得。或者，酶改變底物的熒光或化學(xué)光。定量熒光改變的方法見前文。化學(xué)發(fā)光底物經(jīng)化學(xué)反應(yīng)被電子激發(fā)，于是發(fā)光，以被測得，或向某熒光受體供能。酶標(biāo)記例如熒光素酶(螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；美國專利4,737,456)。螢光素、2,3-二羥基二氮雜萘二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)、蘋果酸脫氫酶、脲酶、以辣根過氧化物酶(HRPO)為例的過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。將酶與蛋白質(zhì)結(jié)合的技術(shù)參見O’Sullivan等，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugatesfor use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym.(J.Langone和H.Van.Vunakis編輯)，Academic press,New York,73:147-166(1981)。
酶-底物組合的例子包括(a)辣根過氧化物酶(HRPO)與作為底物的過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化一染料前體(例如正苯基二胺(OPD)或3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB))；(b)堿性磷酸酶(AP)與作為生色底物的磷酸對硝基苯酯；和(c)β-D-半乳糖苷(β-D-Gal)與生色底物(例如對硝基苯基β-D-半乳糖苷酶)或發(fā)熒光底物4-甲基傘形酰-β-D-半乳糖苷酶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以獲得許多其它酶-底物組合物。有關(guān)綜述可參見美國專利4,275,149和4,318,980。
可選的是，標(biāo)記可以與嵌合異源粘附素或抗-CHA抗體直接結(jié)合。熟練技術(shù)人員知道許多可以做到這一點(diǎn)的方法。例如，CHA或抗CHA抗體可以與生物素連接，而上述三種廣泛圍標(biāo)記中任何一種都可以與抗生物素蛋白結(jié)合，或者反過來也可進(jìn)行。生物素選擇性地結(jié)合抗生物素蛋白，由此標(biāo)記間接地與CHA或抗CHA抗體結(jié)合。有關(guān)涉及生物素-抗生物素蛋白結(jié)合技術(shù)的綜述可參見CurrentProtocols in Immunology，同上?；蛘?，為了將標(biāo)記與CHA或抗CHA抗體間接結(jié)合，CHA或抗CHA抗體先與一小半抗原(例如地高辛)結(jié)合，而上述抗體中任何一種與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)結(jié)合。這樣，標(biāo)記就與CHA或抗CHA抗體間接結(jié)合了。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，CHA或抗CHA抗體不必標(biāo)記，可以用標(biāo)記的抗CHA抗體或抗抗體抗體(例如結(jié)合了HRPO)來檢測其存在。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，HRG或抗體用酶標(biāo)記標(biāo)記，所述的酶催化底物(例如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或正苯基二胺(OPD))的變色反應(yīng)。由此避免了使用放射性物質(zhì)。可以在合適的波長處(例如對TMB而言是450納米，對OPD而言是490納米，參照波長為650納米)利用分光光度計(jì)法測得反應(yīng)試劑的顏色變化。
被認(rèn)為表達(dá)配體(例如HRG)的細(xì)胞與標(biāo)記過的EbrB CHA接觸，然后測得細(xì)胞培養(yǎng)基的染色強(qiáng)度。雖然一般考慮體外分析，但是也可以進(jìn)行使用與可測基團(tuán)結(jié)合的標(biāo)記EbrB CHA進(jìn)行體內(nèi)診斷(例如為了造影)。參見美國專利4,938,948。
當(dāng)用放射性碘、酶、熒光團(tuán)、自旋標(biāo)記等標(biāo)記時，CHA或抗CHA抗體還可以用于放射性免疫試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)或放射性受體試驗(yàn)，親和性純化技術(shù)(例如純化HRG，或EbrB受體EbrB3、EbrB4受體)和競爭性受體結(jié)合試驗(yàn)。這樣，CAH可以用作產(chǎn)生抗CHA抗體的免疫原，用于診斷。
4．抗嵌合異源粘附素抗體及其用途產(chǎn)生抗體，例如多克隆抗體和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。多克隆抗體一般通過用CHA或其片段(可以與對被免疫物種具有免疫原性的異源蛋白結(jié)合)免疫底物來產(chǎn)生。針對一種CHA的單克隆抗體可以利用多種方法來產(chǎn)生，所述方法將在培養(yǎng)物中由連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子。適用于產(chǎn)生單克隆抗體的方法例如最初Kohler等，Nature 256:495-497(1975)所述的雜交瘤法和人B細(xì)胞雜交瘤法，Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)的；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boener等，J.Immunol.147:86-95(1991)。
利用常規(guī)技術(shù)可方便地分離得到編碼本發(fā)明抗體的DNA并對其測序(例如通過使用寡核苷酸探針，所述探針能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞是此類DNA較好的來源。一旦分離后，就可將DNA放入表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染到不轉(zhuǎn)染則不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞)內(nèi)，以期在重組宿主細(xì)胞內(nèi)合成單克隆抗體。
可以對DNA進(jìn)行修飾，例如用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列替換同源鼠序列(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851(1984))，或?qū)⒁环敲庖咔虻鞍锥嚯木幋a序列的全部或部分與免疫球蛋白的編碼序列共價連接。以這種方式，就制備得到了“嵌合”或“雜和”抗體，它們具有對本文某抗CHA單克隆抗體的結(jié)合特異性。
人源化非人抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。總的說來，人源化抗體中引入了一個或多個來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常被稱為“進(jìn)口”殘基，多來自“進(jìn)口”可變區(qū)。基本上，人源化可以按照Winter及其同事(Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature,332:323-327(1988)和Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988)所述的方法來進(jìn)行，即將鼠CDR或CDR序列替換成人抗體的對應(yīng)序列。所以，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中實(shí)質(zhì)上只是部分人可變區(qū)被非人物種的相應(yīng)序列所取代。實(shí)際上，人源化抗體通常是人抗體，其中部分CDR殘基以及可能部分FR殘基被來自鼠抗體類似位置的殘基所取代。
選擇用于制造人源化抗體的人可變區(qū)(包括輕鏈和重鏈)對降低抗原性是十分重要的。根據(jù)所謂的“最適”法，對完整的已知人可變區(qū)序列文庫篩選鼠抗體的可變區(qū)序列。最接近鼠序列的人序列被作為人源化抗體的人框架(FR)(Sims等，J.Immunol.151:2296(1993)；和Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一種方法使用來自特定輕鏈或重鏈亞類的所有人抗體的一段共有序列的一種特殊框架。相同的框架可以用于多種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.151:2623(1993))。
更重要的是，抗體的人源化必需保留對抗體的高度親和性和其它有用的生物特性。為此，根據(jù)優(yōu)選方法，如此制備人源化抗體，即使用親本或人源化序列的三維模型分析親本和各種概念上的人源化產(chǎn)物。免疫球蛋白三維模型是常見的，而且是本領(lǐng)域眾所周知的。有計(jì)算機(jī)程序可以展現(xiàn)選定的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對這種展示的檢視可以分析出某殘基在候選免疫球蛋白序列功能中可能起的作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原能力的殘基。如此，F(xiàn)R殘基可以被選來與共有序列和進(jìn)口序列結(jié)合，由此獲得所需的抗體特征，例如對靶抗原的親和性提高。總而言之，CDR殘基直接并且最本質(zhì)地影響著抗原結(jié)合性。
根據(jù)另一種產(chǎn)生人抗體的方法，可以使用轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，它們能夠在免疫后完全生成人抗體而沒有內(nèi)源性免疫球蛋白。例如，已知，嵌合種系突變小鼠內(nèi)抗體重鏈鉸鏈區(qū)(JH)具有的純合缺失造成對內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因序列轉(zhuǎn)移到這樣的種系突變小鼠內(nèi)將在以抗原刺激后生產(chǎn)人抗體。參見，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362:255-258(1993)和Bruggermann等，Year in Immunol.7:33(1993)。
或者，可以用噬菌體展示技術(shù)(Mc Cafferty等Nature348:522-553(1990))由非免疫供體的全部免疫球蛋白可變區(qū)(Ⅴ)基因體外生產(chǎn)人抗體和抗體片段。根據(jù)這一技術(shù)，抗體Ⅴ區(qū)基因克隆在絲狀噬菌體(例如M13或fd)的主包被蛋白或次要包被蛋白框架內(nèi)，在噬菌體顆粒表面表達(dá)為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體功能進(jìn)行的選擇也就選出了編碼具有所述特性的抗體的基因。所以，噬菌體模擬了B細(xì)胞的部分特性。噬菌體展示技術(shù)還可以多種方式進(jìn)行有關(guān)綜述參見Johnson,Kevin S．和Chiswell,David J.,CurrentOpinion in Structural Biology 3:564-571(1993)。許多Ⅴ基因片段可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature 352:624-628(1991)從來自免疫小鼠脾臟的Ⅴ基因隨機(jī)組合文庫分離到一種抗噁唑酮抗體的不同排列。根據(jù)Marks等，J.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12:725-734(1993)所述的方法，可以構(gòu)建來自非免疫人供體的全部Ⅴ基因，并分離一系列不同抗原的抗體。
雙特異性抗體是至少對兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的抗體。在此，結(jié)合特異性之一針對CHA(最好是CHA的ECD)，另一特異性是針對其它抗原的。雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。下文所述的方法可用于制備雙特異性抗體和制備本發(fā)明CHA的多聚化區(qū)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。生產(chǎn)全長雙特異性抗體的常規(guī)方法基于兩免疫球蛋白重鏈對的共表達(dá)，所述的兩鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature 305:537-539(1983))。由于對免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)組合，雜交瘤(四交瘤)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和性層析進(jìn)行的正確分子的純化非常繁瑣，所以得率很低。WO93/08829和Traunecker等，EMBO J.10:3655-3659(1991)中描述了類似的方法。
根據(jù)另一種不同的方法，具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))與免疫球蛋白的恒定區(qū)序列融合。最好是與免疫球蛋白輕鏈的恒定區(qū)融合，包含至少部分鉸鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū)。第一重鏈恒定區(qū)(CH1)宜包含輕鏈(至少存在于融合體之一中)結(jié)合所必需的位點(diǎn)。編碼免疫球蛋白重鏈融合體和(視必要)輕鏈的DNA被分別插入不同的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體。當(dāng)在構(gòu)建中三種多肽鏈的不等比具有最佳的得率時，這為在實(shí)施中調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。但是，如果至少兩種多肽鏈的等比表達(dá)具有最佳得率，或者所述的比例并不重要時，可以將編碼三種多肽鏈中兩種或全部的基因插入同一表達(dá)載體中。
在這種方法的一優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體的一臂上為具有第一結(jié)合特異性的雜和免疫球蛋白重鏈，而在另一臂上是雜和的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)。已發(fā)現(xiàn)，這種不對稱結(jié)構(gòu)有助于將所需的雙特異性化合物與不需要的免疫球蛋白鏈混合物分離，因?yàn)橹辉陔p特異性分子的一半具有免疫球蛋白輕鏈為分離提供了便利。該方法參見WO94/04690。有關(guān)生產(chǎn)雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可參見Suresh等，Methods in Enzymology,121:210(1986)。
根據(jù)另一種方法，可以人為改變抗體分子對之間的界面，從而達(dá)到從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收異源二聚體的最大百分比。較好的界面具有某抗體恒定區(qū)的至少部分CH3區(qū)。在該方法中，第一抗體分子的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈被較大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)所替換。通過以小側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大側(cè)鏈在第二抗體分子的界面上形成與大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)“空穴”。這提供了一種機(jī)制使得異源二聚體的得率高于其它不需要的終產(chǎn)物(例如同源二聚體)。
雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源結(jié)合”的抗體。例如，異源結(jié)合物的抗體之一可以與抗生物素蛋白偶合，而另一個則與生物素偶合。有人提出用這樣的抗體將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞定向于不需要的細(xì)胞(美國專利4,676,980)，和用于治療HIV感染(WO91/00360)。異源結(jié)合抗體可以用任何一種常規(guī)交聯(lián)方法來制備。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，參見美國專利4,676,980，其中還說明了許多交聯(lián)技術(shù)。
文獻(xiàn)中也記載了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可以利用化學(xué)鍵制備雙特異性抗體。Brennan等，Science 229:81(1985)說明了一種方法，即完整的抗體經(jīng)酶切產(chǎn)生F(ab’)2片段。在二巰基砷酸鈉存在下還原片段，穩(wěn)定化連位二巰基以防形成分子內(nèi)二硫鍵。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化成硫硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后通過巰基乙胺還原反應(yīng)，將Fab’-TNB衍生物之一轉(zhuǎn)化成Fab’-巰基，并與等摩爾量的其它Fab’-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。所得的雙特異性抗體可以用于選擇性酶固定化。
最近的發(fā)展便利了從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，它可以化學(xué)偶合成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.,175:217-225(1992)對生產(chǎn)完全人源化的雙特異性抗體F(ab’)2分子進(jìn)行了說明。各Fab’片段分別由大腸桿菌分泌，并在體外直接化學(xué)偶合成雙特異性抗體。由此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達(dá)erbB的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞，并激發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對人乳房腫瘤目標(biāo)的裂解活性。
制造和從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)也已經(jīng)有所報道。例如，已經(jīng)用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)出了雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈通過基因融合技術(shù)與兩種不同抗體的Fab’部分連接。抗體同源二聚體在鉸鏈區(qū)經(jīng)還原形成單體，然后再氧化成抗體異源二聚體。該方法也可以用來生產(chǎn)抗體同源二聚體。Hollinger等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)所述的“雙體(diabody)”技術(shù)提供了另一種制造雙特異性抗體片段的機(jī)制。這些片段包含通過一接頭與一輕鏈可變區(qū)(VL)連接的重鏈可變區(qū)(VH)，接頭短至不允許同一鏈中的上述兩區(qū)配對。所以，一個片段的VH和VL區(qū)被迫與另一片段上互補(bǔ)的VL和VH配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。其它使用單鏈Fv(sFv)制造雙特異性抗體片段的方法也已經(jīng)有所報道。參見Gruber等，J.Immunol.152:5368(1994)。
也考慮過兩價或兩價以上的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)。
為了制造中和抗體，使用產(chǎn)生以上所述分子的技術(shù)來制造抗體。較好的中和抗體具有對CHA胞外區(qū)的特異性，并與天然異源多亞基受體的胞外區(qū)交叉反應(yīng)，但不與其它受體交叉反應(yīng)。在產(chǎn)生了一組抗體后，為了確定哪些分子符合所需的標(biāo)準(zhǔn)(即能夠在體外或體內(nèi)中和天然異源多亞基受體的生物活性)對這些抗體進(jìn)行篩選。例如，可以在任何上述試驗(yàn)之一或多個中評價ErbB-Ig CHA封閉ErbB活性的能力?？梢赃x擇能夠在細(xì)胞上抑制HRG結(jié)合和/或激活ErbB受體和/或HRG有絲分裂活性能力的CHA或抗CHA抗體作為中和CHA或CHA抗體。
這些抗體可以與細(xì)胞毒素或酶(例如前藥激活酶)偶合，所用方法與前文就CHA所述的相似。而且，可以如前所述標(biāo)記抗體，尤其是當(dāng)抗體用于診斷試驗(yàn)時。
5．診斷試劑盒和產(chǎn)品為了方便起見，本發(fā)明提供了兩種診斷試驗(yàn)(即，用抗ErbB-Ig抗體檢測癌癥，和用ErbB-Ig檢測樣品中HRG的存在)，試驗(yàn)所用的試劑可以試劑盒的方式提供(包裝在一起的試劑)以便與待測樣品組合。試劑盒中的組成以預(yù)定的比例提供。這樣，一個試劑盒可能包含以合適的標(biāo)記直接或間接標(biāo)記的CHA或抗CHA抗體。如果可測標(biāo)記是酶，試劑盒還包括底物和酶所需要的輔因子(例如提供生色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。此外，還可以包括其它添加物，例如穩(wěn)定劑、緩沖液等。為了使得試劑在溶液中的濃度使得試驗(yàn)具有盡可能高的靈敏度，各種試劑的相對比例可以在較寬范圍內(nèi)變化。具體地說，試劑可以是包含賦形劑的干燥粉末形式的(通常是低溫干燥的)，在溶解后就成為具有合適濃度的試劑溶液。試劑盒還宜包括有關(guān)實(shí)施生物試驗(yàn)的說明。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，提供了一種產(chǎn)品，其中包含治療前文所述疾病所需的材料。所述產(chǎn)品包括一容器和一標(biāo)簽。合適的容器包括大瓶、小瓶、注射器和試管。容器可以多種材料制成，例如玻璃或塑料。容器中盛有能夠有效治療疾病的組合物，并具有無菌入口(例如，容器可以是靜脈輸液袋或其塞能被皮下注射針頭刺穿的小瓶)。組合物中活性物質(zhì)是CHA或其HRG拮抗性抗CHA抗體。在容器上或與之放在一起的標(biāo)簽說明組合物是用來治療選定疾病的。該產(chǎn)品還可以包含第二容器，其中包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液、Ringer溶液和葡萄糖溶液。還可以包括就商業(yè)和使用者而言所需要的物質(zhì)，包括緩沖液、稀釋劑、針頭、注射管和有關(guān)使用說明的包裝內(nèi)附件。
實(shí)施例以下實(shí)施例是說明而不是限定。以下實(shí)施例是為了向一般技術(shù)人員就如何制造和使用本發(fā)明的混合物、組合物和方法提供全面的揭示和說明，而不是要限定發(fā)明的范圍。我們力求數(shù)據(jù)準(zhǔn)確(例如數(shù)量、溫度等)，但是不能排除部分實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另作說明，份都是重量份，溫度都是℃，壓力是大氣壓力或接近大氣壓力。說明書所引用的已公開內(nèi)容都在此公開地寫入本文作為參考。實(shí)施例1材料和方法本實(shí)施例說明了本發(fā)明ErbB2-IgG、ErbB3-IgG和ErbB4-IgG嵌合氨基酸序列及由其所得的嵌合異源多聚體的構(gòu)建、分離和生物化學(xué)鑒定。
試劑在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)HRGβ1(177-244)的類EGF區(qū)，如前所述進(jìn)行純化和放射性碘化(Sliwkowski,M．等，J.Biol.Chem.269:14661-14665(1994))。在中國倉鼠卵巢細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的全長HRGβ1被用于Western印跡分析實(shí)驗(yàn)?？笶rbB2單克隆抗體2C4和4D5可參見其它文獻(xiàn)(Fendly等，Cancer Research 50:1550-1558(1990))。
ErbB2-、ErbB3-和ErbB4免疫粘附素在表達(dá)人IgG重鏈的質(zhì)粒(pDR,J.Ridgeway和P.Carter,Genentech,Inc．贈與)編碼免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的區(qū)域內(nèi)用基因工程方法插入一個MluⅠ位點(diǎn)。MluⅠ位點(diǎn)還被加入一組ErbB表達(dá)質(zhì)粒，位于編碼所述受體ECD/TM連接的區(qū)域。全部突變都用Kunkel法進(jìn)行(Kunkel T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488(1985))。MluⅠ位點(diǎn)被用來制造正確的ErbB-IgG融合構(gòu)建物。各種ErbB-IgG嵌合物的融連物為ErbB2,L646ErbB2-(TR)-DKTH224VH；ErbB3,E636ErbB3-(TR)-DKTH224VH；ErbB4,G640ErbB4-(TR)-DKTH224VH，其中ErbB多肽的氨基酸編號參見Plowman等所述(Plowman,G.D．等，(1993a)PNAS USA90:1746-1750)。保守的TR序列來自MluⅠ位點(diǎn)。用于制備這些融合結(jié)構(gòu)的Fc區(qū)序列參見Ellison,J.W．等(Ellison,J.W．等(1982)NAR 10:4071-4079)。最后的表達(dá)結(jié)構(gòu)體位于pRK型質(zhì)粒骨架內(nèi)，在其中，由CMV啟動子驅(qū)動真核性表達(dá)(Gorman等，DNA Prot.Eng.Tech.2:3-10(1990))。
為了獲得用于體外實(shí)驗(yàn)的蛋白，以合適的表達(dá)質(zhì)粒用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣法(Gorman等，同上和Huang等，Nucleic Acids Res.18:937-947(1990))轉(zhuǎn)染貼壁HEK-293細(xì)胞(ATCC No.CRL-1573)。轉(zhuǎn)染后15小時，用無血清培養(yǎng)基替換含血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)5至7天。收獲所得的條件培養(yǎng)基，并通過蛋白A層析柱(1mlPharmacia HiTrapTM)。用0.1M的檸檬酸(pH4.2)將純化的IgG融合體洗脫在含1MTris pH9.0的試管內(nèi)。然后用PBS透析洗脫的蛋白，用Centri-prep-30過濾器(Amicon)濃縮。加入甘油至終濃度25％，保存于-20℃。用Fc-ELISA測定物質(zhì)的濃度。
125I-HRG結(jié)合試驗(yàn)在Nunc碎裂(breakapart)免疫模式測試板上進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。測試孔涂以100微升5微克/毫升山羊抗人抗體(Boehringer Mannheim)的50mM碳酸鹽緩沖溶液(pH9.6)，于4℃過夜。測試板用200微升洗滌緩沖液(PBS/0.05％Tween-20TM)洗滌兩次，然后與100微升1％BSA/PBS在室溫下短暫孵育30分鐘。去除緩沖液，各孔與100微升IgG融合蛋白的1％BSA/PBS在劇烈左右(side-to-side)旋轉(zhuǎn)下孵育1小時。測試板用洗滌緩沖液洗滌3次，進(jìn)行競爭性結(jié)合，即加入不同量的低溫競爭物γ-HRG和125I-HRGβ1并在室溫下，在劇烈左右(side-to-side)旋轉(zhuǎn)下孵育2至3小時。迅速用洗滌緩沖液洗滌測試孔3次，瀝干，用一臺100Series Iso Dataγ-計(jì)數(shù)器對各孔計(jì)數(shù)。使用經(jīng)修改的Ligand程序進(jìn)行Scatchard分析(Munson,P.和Robard,D.(1980)Analytical Biochemistry 107:220-239)。
3H-胸苷摻入試驗(yàn)以96孔格式進(jìn)行含氚胸苷摻入試驗(yàn)。MCF7-7細(xì)胞以10,000細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)在50:50F12/DMEM(高葡萄糖)0.1％胎牛血清(100毫升)中。任細(xì)胞穩(wěn)定3小時，然后在測試孔中加入ErbB-IgG融合蛋白和/或heregulin(最終體積為200毫升)，測試板在37℃的組織培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15小時。在測試孔中加入含氚胸苷(20ml,1/20稀釋的含氚胸苷儲備液Amersham TRA 120 B363,1毫居里/毫升)，測試板再孵育3小時。用Packard Filtermate 196收獲儀將含氚物質(zhì)收集到GF/C單層濾膜(96孔格式)上。用Packard Topcount儀計(jì)數(shù)濾膜。實(shí)施例2:ErbB3-IgG和ErbB4-IgG蛋白結(jié)合HRG如前所述，制備了一系列可在真核宿主內(nèi)表達(dá)與人IgG恒定區(qū)融合的ErbB受體胞外區(qū)(ECD)的質(zhì)粒。如圖1所示，這些受體-IgG結(jié)構(gòu)體以二硫鍵結(jié)合的二聚體形式存在于溶液中。ErbB2、ErbB3和ErbB4的同源二聚體IgG受體各自在HEK-293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，分泌出的受體融合蛋白在蛋白A上利用親和性層析純化。Chen等(Chen,X等(1996)J.Biol.Chem.271:7620-7629)報道了一種類似的同源二聚結(jié)構(gòu)ErbB3-和ErbB4-免疫粘附素，它們被用作產(chǎn)生受體特異性單克隆抗體的免疫原。用微滴板進(jìn)行嵌合免疫粘附素蛋白的結(jié)合分析(參見實(shí)施例1)。如圖2所示，同源二聚ErbB3-IgG和ErbB4-IgG能夠特異性結(jié)合125I-HRG，但是沒有測得ErbB2-IgG結(jié)構(gòu)體的結(jié)合。HRG結(jié)合ErbB3-IgG的Scatchard分析顯示單一一個親和性結(jié)合位點(diǎn)，其Kd為9.3±2.9nM。除垢劑溶解的昆蟲細(xì)胞表達(dá)的ErbB3(Carraway等，1994),COS7細(xì)胞表達(dá)的ErbB3(Sliwkowski等，(1994)同上)和K562細(xì)胞表達(dá)的ErbB3的結(jié)合常數(shù)在0.8至1.9nM。同源二聚ErbB3-IgG對HRG的親和常數(shù)高于最近Horan等(Horan等，(1995)g.Biol.Chem.270:24604-24608)報道的在使用單價可溶性ErbB3的ECD分析中所得的26nM。以上數(shù)據(jù)表明，ErbB3上HRG結(jié)合位點(diǎn)的最佳構(gòu)象可被脂質(zhì)雙層穩(wěn)定化。與完全受體相比，EGF受體可溶形式的結(jié)合親和性損失較大也曾有報導(dǎo)(Brown,P.M．等，(1994)Eur.J.Biochem.225:223-233；和Zhou,M等，(1993)Biochemistry 32:8193-8198)。ErbB4-IgG的親和常數(shù)是5.0±0.8nM。該值與Tzahar等報道的在COS7細(xì)胞中表達(dá)的全長ErbB4的1.5nM接近(Tzahar等，(1994)J.Biol.Chem.269:25226-25233)。
雖然神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是因不同的RNA剪接產(chǎn)生的一族蛋白，但受體結(jié)合是由所有活化形式中都有的類EGF模塊介導(dǎo)的。只要存在這些蛋白的類EGF區(qū)，含有ErbB3或ErbB4的ECD的嵌合同源二聚體免疫粘附素可與神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白族中的多種形式結(jié)合。結(jié)合這些同源二聚體的heregulin變體包括rHRGβ11-244,rHRGβ144-244，硫氧還蛋白-rHRGβ144-244和硫氧還蛋白-γHRG,rHRGα1-239。實(shí)施例3當(dāng)ErbB2與ErbB3或ErbB4共存時，異源二聚ErbB-IgG融合蛋白形成高親和性HRG結(jié)合位點(diǎn)通過將編碼不同受體的兩個表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入同一細(xì)胞來產(chǎn)生異源二聚受體-IgG結(jié)構(gòu)體(參見實(shí)施例1)。所得的受體-IgG分泌形式是兩種同源二聚體和預(yù)期的異源二聚體的混合物。進(jìn)行了3次不同的轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生以下ErbB混合物ErbB2/3-IgG,ErbB2/4-IgG和ErbB3/4-IgG。然后測定混合物中各自的結(jié)合親和性。如圖3A所示，用含ErbB2的異源二聚體測得一高親和性HRG結(jié)合位點(diǎn)，但是ErbB3/4-IgG則不然。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，含ErbB2異源二聚體混合物的Scatchard圖是曲直線形式的(圖3B和3C)，這表明存在著兩種不同的結(jié)合位點(diǎn)(Munson,P.和Robard,D.(1980)Analytical Biochem.107:220-239)。經(jīng)測定，高親和性結(jié)合位點(diǎn)的Kd是0.013nM，而低親和性結(jié)合位點(diǎn)的Kd是12nM。高親和性結(jié)合常數(shù)與ErbB3在含高水平ErbB2的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時測得的值(Carraway等，(1994)，同上)或在高ErbB3背景下對數(shù)據(jù)進(jìn)行2位擬和確定高親和性HRG結(jié)合位點(diǎn)時測得的值(Sliwkowski等，(1994)，同上)一致。與ErbB4-IgG同源二聚體相比，ErbB2/4-IgG也表現(xiàn)出類似的親和性改變(圖3C)。測得的ErbB2/4-IgG的親和性常數(shù)為0.017nM。再次利用2位擬和法，測得一Kd為5nM的低親和性結(jié)合位點(diǎn)。該值接近ErbB4-IgG同源二聚體的測得Kd。相反，ErbB3/ErbB4-IgG蛋白沒有表現(xiàn)出高親和性結(jié)合位點(diǎn)(圖3D)，只測得6nM的Kd，這與ErbB3-IgG和ErbB4-IgG同源二聚體的相當(dāng)。高親和性配體結(jié)合位點(diǎn)的形成與ErbB2的ECD與另一ErbB族成員的ECD共表達(dá)有關(guān)，這表明ErbB2是形成高親和性位點(diǎn)所必需的。表Ⅰ簡要地列出了ErbB-IgG融合蛋白的結(jié)合常數(shù)。形成的異源二聚ErbB2/3-IgG或ErbB2/4-IgG融合蛋白的高親和性結(jié)合位點(diǎn)比相應(yīng)的同源二聚體高300至700倍。
表Ⅰ.ErbB同源二聚體和異源二聚體免疫粘附素的結(jié)合常數(shù)ErbB-IgG結(jié)構(gòu)體 Kd(nM)ErbB2 NB*ErbB3 9.24+2.94ErbB4 4.98+0.80ErbB2/3 0.013+0.004ErbB2/4 0.017+0.009ErbB3/4 5.98+0.70*NB沒有可測得的結(jié)合為了進(jìn)一步證實(shí)ErbB2對形成高親和性結(jié)合位點(diǎn)有貢獻(xiàn)，對抗ErbB2 ECD抗體抑制與ErbB免疫粘附素的高親和性結(jié)合的作用進(jìn)行了檢查。結(jié)合反應(yīng)在抗體2C4存在下進(jìn)行，2C4具有對ErbB2 ECD的特異性(Lewis,G.D．等，(1996)Cancer Res.56:1457-1465；Sliwkowski等，(1994)同上)。如圖4A所示，加入2C4單克隆抗體明顯抑制HRG與ErbB2/ErbB3-IgG異源二聚體的結(jié)合，但是對其與相應(yīng)的ErbB3-IgG同源二聚體沒有作用。同樣，抗ErbB2單克隆抗體對ErbB2/ErbB4-IgG異源二聚體的結(jié)合也有影響，但是對相應(yīng)的ErbB4-IgG同源二聚體沒有作用。以上數(shù)據(jù)表明，ErbB2的ECD與ErbB3的或ErbB4的ECD間的物理作用導(dǎo)致在該可溶性受體系統(tǒng)內(nèi)形成高親和性生長因子結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)施例4ErbB-IgG融合蛋白抑制HRG的生物作用在用HRG處理后，已知，許多不同種細(xì)胞將經(jīng)歷增殖應(yīng)答。在乳房癌細(xì)胞系MCF7中測定了ErbB-IgG蛋白抑制HRG依賴性胸苷摻入的能力(Lewis等，(1996)，同上)。不同濃度的不同ErbB-IgG蛋白與1nM rHRG孵育，然后加至無血清MCF7細(xì)胞單層培養(yǎng)物(參見實(shí)施例1)。孵育24小時后，用3H-胸苷標(biāo)記細(xì)胞以測定DNA合成。如圖5所示，所有能夠結(jié)合HRG的受體融合體都以劑量相關(guān)性方式抑制HRG介導(dǎo)的有絲分裂應(yīng)答。異源二聚體IgGs、ErbB3/2-IgG和ErbB4/2-IgG比各自相應(yīng)的同源二聚融合蛋白更有效。
討論ErbB的胞外區(qū)調(diào)節(jié)HRG與ErbB3和ErbB4的結(jié)合免疫粘附素為體外分析提供了許多優(yōu)點(diǎn)(參見Chamow,S.M．和Ashkenazi,A.(1996)Trends in Biotechnology 14:52-60綜述)。是IgG融合體的二聚化能力(似乎模擬推定的ErbB族受體體內(nèi)異源二聚化作用)導(dǎo)致了高親和性heregulin結(jié)合位點(diǎn)的產(chǎn)生。HRG結(jié)合分析證明，包括ErbB2的異源二聚體混合物，即ErbB2/3-IgG和ErbB2/4-IgG，產(chǎn)生的heregulin結(jié)合位點(diǎn)，其親和性比ErbB3-IgG或ErbB4-IgG同源二聚體或ErbB3/ErbB4-IgG異源二聚體高300倍。ErbB3/ErbB4-IgG異源二聚體內(nèi)有低親和性HRG結(jié)合位點(diǎn)表明，不是任意兩種不同ErbB-IgG的組合都能形成高親和性heregulin結(jié)合位點(diǎn)，而是只有含ErbB2-IgG的混合物才能夠。用抗ErbB2的單克隆抗體進(jìn)一步證明了ErbB2為產(chǎn)生高親和性結(jié)合位點(diǎn)所必需(Lewis等，(1996)同上；Sliwkowski等(1994)同上)。當(dāng)用含ErbB2的異源二聚體進(jìn)行結(jié)合研究時，可以觀察到，在這些抗體的存在下，HRG結(jié)合親和性明顯降低。
在以正常水平表達(dá)這些受體的細(xì)胞系內(nèi)，常會形成HRG-ErbB3-ErbB2復(fù)合物。具體地說，HRG結(jié)合ErbB3和ErbB2然后再加入到該HRG占據(jù)的受體內(nèi)。該復(fù)合物的形成降低了配體的解離率，產(chǎn)生高親和性結(jié)合位點(diǎn)(Karunagaran,D等，(1996)EMBO J.15:254-264)?，F(xiàn)在，據(jù)報道，只要存在多聚化模塊，即使沒有跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，在一可溶性受體系統(tǒng)內(nèi)也會形成高親和性復(fù)合物。相比之下，Horan等(Horan,T．等，(1995)J.Biol.Chem.270:24604-24608)報道，加入ErbB2-ECD后，HRG與ErbB3-ECD的結(jié)合沒有明顯增加。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，如果將來自單轉(zhuǎn)染相比的同源二聚ErbB-IgG混合，測試其與heregulin的結(jié)合，將獲得類似的結(jié)果。所得的混合物，即ErbB2-IgG同源二聚體與ErbB3-IgG或ErbB4-IgG同源二聚體的混合物表現(xiàn)出的配體親和性一點(diǎn)都不比單獨(dú)的ErbB3-IgG或ErbB4-IgG強(qiáng)。所以，由Fc部分提供的二聚化模塊是高親和性結(jié)合位點(diǎn)形成中的一個重要特征。而且，鉸鏈區(qū)的靈活性可能也有助于所述的受體-配體相互作用。除理論所述之外，當(dāng)整個抗體包埋在細(xì)胞膜內(nèi)時，其它模塊，例如跨膜區(qū)或胞內(nèi)區(qū)可能也有助于含ErbB2異源寡聚復(fù)合物的穩(wěn)定化。ErbB2在寡聚heregulin-受體信號復(fù)合物中的作用配體誘導(dǎo)的受體寡聚化是單跨膜穿越受體的常見變化過程(Ullrich,A．和Schlessinger,J.(1990)Cell 61:203-212；和Wells,J.A.(1994)Curr.Opin.Cell Biol.6:163-173)。根據(jù)在此發(fā)現(xiàn)的ErbB3或ErbB4與ErbB2構(gòu)成的可溶性嵌合異源二聚體，可以推斷，這樣的嵌合異源二聚體足以形成高親和性結(jié)合狀態(tài)。為此提出了兩種與以上信息相一致的模式(圖6)。“接觸”模式與生長激素與其受體的模式類似(Well,J.A.(1996)PNAS USA 93:1-6)，所不同的是，位點(diǎn)1在ErbB3或ErbB4上，而位點(diǎn)2由ErbB2提供。該模式推定，HRG結(jié)合位點(diǎn)1的親和性將與就ErbB3或ErbB4同源二聚體測得的親和性接近。ErbB2然后加入到ErbB3-HRG或ErbB4-HRG復(fù)合物中，并與ErbB3(或ErbB4)-結(jié)合的HRG接觸。ErbB3-HRG-ErbB2復(fù)合物的形成降低了HRG的解離，由此形成高親和性結(jié)合狀態(tài)。另一種是“構(gòu)象”模式，它假定，ErbB2改變了HRG與ErbB3或ErbB4的相互作用，但是ErbB2并不與HRG接觸。在該模式中，ErbB2與ErbB3或ErbB4的相互作用改變了所述受體的構(gòu)象，由此形成高親和性結(jié)合狀態(tài)。
用表達(dá)ErbB3和ErbB2的細(xì)胞上的放射性標(biāo)記的HRG進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)技術(shù)(Holmes,W.E．等，(1992)Science 256:1205-1210；Sliwkowski等，(1994)同上)，觀察到了交聯(lián)復(fù)合物對分子量約為190kDa和大于500kDa的蛋白質(zhì)的應(yīng)答。這些結(jié)果表明，受體復(fù)合物的寡聚結(jié)構(gòu)可能包括多個ErbB3和ErbB2的拷貝。而且，由于ErbB3本沒有酪氨酸激酶活性(Guy等，(1994)同上)，該假設(shè)為觀察到的ErbB2和ErbB3的配體依賴的酪氨酸磷酸化作用都加強(qiáng)提供了一種解釋。例如，包含雙拷貝ErbB3和雙拷貝ErbB2的復(fù)合物允許ErbB3的磷酸化和第二ErbB2受體的反磷酸化(transphosphorylation)。TNF受體同源二聚體免疫粘附素(Ashkenazi,A等，(1991)PNAS USA 88:10535-10539)似乎與TNF受體系統(tǒng)類似，其中，細(xì)胞表面的TNF受體是一三聚體(Banner,D.W．等，(1993)Cell 73-431-445)。
ErbB2改變ErbB3和ErbB4的生物學(xué)意義既然發(fā)現(xiàn)了ErbB2，所以假定一定存在與ErbB2作用并將其激活的配體。雖然提出了許多候選蛋白作為ErbB2的推定配體(參見Hynes,N.E．和Stern,D.F.(1994)Biochem.Biophs.Acta 1198:165-184)，但是沒有一種蛋白在分子水平上經(jīng)鑒定符合這一標(biāo)準(zhǔn)。其它研究表明，ErbB2似乎在EGF和heregulin受體復(fù)合物中起著多面作用(Earp等，(1995)同上；Kamnagaran等，(1996)同上)。ErbB2在這些復(fù)合物中的作用包括改變配體結(jié)合區(qū)的親和性，提供一個很強(qiáng)的酪氨酸激酶部分和提供一旦被磷酸化則激活和放大多種信號傳導(dǎo)途徑的酪氨酸殘基。ErbB2的heregulin活化作用在神經(jīng)-肌肉連接處(Altiok,N．等(1995)EMBO J.14:4258-4266；Chu,G.C．等，(1995)Neuron 14:329-339；和Jo.SA．等，(1995)Nature373:158-161)和神經(jīng)-Schwann細(xì)胞連接處(Dong,Z．等，(1995)Neuron 15:585-596；Marchionni,MA．等，(1993)Nature 362:312-318；和Morrissey,T.K．等(1995)PNASUSA 92:1431-1435)具有生理學(xué)上的相關(guān)性。在人腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，數(shù)種受體證明，減弱ErbB2與ErbB3或ErbB4間的相互作用消除了下游的信號傳導(dǎo)以及繼而發(fā)生的生物應(yīng)答(例如生長)(Karunagaran等，(1996)同上；Lewis等，(1996)同上；Pinkas-Kramarski,R．等，(1996)EMBO J.15:2452-2467)。最近有關(guān)ErbB2表型和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白剔除(knockouts)的報道進(jìn)一步支持了ErbB2是一長期的“孤兒”受體這一概念(lonardo等，1990)。在兩種情況中，兩種突變都為純合的小鼠的胚胎死亡率接近E10.5(Lee,K.-F．等，(1995)Nature 378:394-398；和Meyer,D．和Birchmeier,C.(1995)Nature 378:386-390)。在兩種情況中，胚胎都死于相同的心臟表型，沒有形成心室小梁。兩種胚胎的菱腦畸形驚人地類似。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，ErbB2對于傳導(dǎo)HRG信號是至關(guān)重要的。在正常生理?xiàng)l件下，ErbB2唯一的作用似乎就是作為這些受體復(fù)合物的共有成員介導(dǎo)HRG和EGF配體應(yīng)答。
雖然在此參照優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了說明，應(yīng)該理解的是，在本發(fā)明宗旨之下可進(jìn)行多種改變。所以，本發(fā)明僅由下面的權(quán)利要求來限定。
權(quán)利要求
1．一種嵌合異源多亞基粘附素，它包含第一氨基酸序列，其中包含天然異源多亞基受體第一單體的胞外區(qū)和一多聚化區(qū)；另一氨基酸序列，其中包含天然異源多亞基受體另一單體的胞外區(qū)和一多聚化區(qū)；其中第一單體和另一單體的胞外區(qū)在同一細(xì)胞內(nèi)締合成可在與配體結(jié)合后被激活的天然異源多亞基受體，并且其中嵌合異源多亞基粘附素對配體的親和性比受體的單體或受體的同源多聚體高10-1至106倍。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素，其中的嵌合異源多聚體是配體的拮抗劑。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素，其中的嵌合異源多亞基粘附素可溶于水性溶液。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素，其中第一氨基酸序列的胞外區(qū)與各另一氨基酸序列的多聚化區(qū)都相互作用而形成異源多聚體。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素，其中的多聚化區(qū)包含免疫球蛋白恒定區(qū)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素，其中的多聚化區(qū)選自亮氨酸拉鏈、與包含孔結(jié)構(gòu)的氨基酸序列互補(bǔ)的含突出結(jié)構(gòu)的氨基酸序列、疏水性區(qū)、親水性區(qū)和包含可與另一氨基酸序列的多聚化區(qū)反應(yīng)形成胞間二硫鍵的游離巰基的氨基酸序列。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素，其中第一氨基酸序列包含ErbB2受體單體的胞外區(qū)或其片段；另一氨基酸序列包含ErbB3受體單體的胞外區(qū)或其片段；第一和另一氨基酸序列的多聚化區(qū)都包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段；第一和另一氨基酸序列通過多聚化區(qū)相互作用而形成異源二聚體；并且配體是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素，其中第一氨基酸序列包含ErbB2受體單體的胞外區(qū)或其片段；另一氨基酸序列包含ErbB4受體單體的胞外區(qū)或其片段；第一和另一氨基酸序列的多聚化區(qū)都包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段；第一和另一氨基酸序列通過多聚化區(qū)相互作用而形成異源二聚體；并且配體是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。
9．一種分離的核酸序列，它編碼權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素的氨基酸序列。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸序列，其中的胞外區(qū)或其片段來自ErbB2受體，其中的多聚化區(qū)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段。
11．根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸序列，其中的胞外區(qū)或其片段來自ErbB3受體，其中的多聚化區(qū)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段。
12．根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸序列，其中的胞外區(qū)或其片段來自ErbB4受體，其中的多聚化區(qū)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段。
13．根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸序列，它還包含與核酸分子可操作性連接的啟動子。
14．一種載體，它包含權(quán)利要求13所述的分離的核酸。
15．一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求9所述的核酸。
16．一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求10所述的核酸。
17．一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求11所述的核酸。
18．一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求12所述的核酸。
19．一種宿主細(xì)胞，它包含編碼權(quán)利要求1所述嵌合異源多亞基粘附素的第一氨基酸序列的核酸序列，和編碼權(quán)利要求1所述嵌合異源多亞基粘附素的另一氨基酸序列的核酸序列。
20．一種宿主細(xì)胞，它包含第一分離核酸序列，它編碼權(quán)利要求1所述嵌合異源多亞基粘附素的第一氨基酸序列，其中的胞外區(qū)或其片段來自ErbB2受體，多聚化區(qū)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段；和第二分離核酸序列，它編碼權(quán)利要求1所述的可溶性嵌合異源多亞基粘附素的另一氨基酸序列，其中的胞外區(qū)或其片段來自ErbB3受體，多聚化區(qū)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段。
21．一種宿主細(xì)胞，它包含第一分離核酸序列，它編碼權(quán)利要求1所述嵌合異源多亞基粘附素的第一氨基酸序列，其中的胞外區(qū)或其片段來自ErbB2受體，多聚化區(qū)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段；和第二分離的核酸序列，它編碼權(quán)利要求1所述的可溶性嵌合異源多亞基粘附素的另一氨基酸序列，其中的胞外區(qū)或其片段來自ErbB4受體，多聚化區(qū)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段。
22．權(quán)利要求1所述嵌合異源多亞基粘附素的抗體，其中的抗體是配體的拮抗劑，它結(jié)合天然異源多亞基受體并抑制其活化。
23．權(quán)利要求1所述嵌合異源多亞基粘附素的抗體，其中的抗體是配體的活化劑，它結(jié)合天然異源多亞基受體并將其活化。
24．一種在樣品中形成嵌合異源多亞基粘附素-配體復(fù)合物的方法，所述方法包括在可使配體結(jié)合異源多聚體并形成嵌合異源二聚體粘附素-配體復(fù)合物的條件下令權(quán)利要求1所述的嵌合多聚體與樣品接觸。
25．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中的復(fù)合物抑制配體與天然多聚體的結(jié)合。
26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中的樣品是一種組織。
27．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中的樣品是一種流體。
28．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中的流體是體液。
29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中的體液選自血清、血液、尿液和淋巴液。
30．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中的樣品是哺乳動物體內(nèi)的。
31．一種抑制天然異源多亞基受體活化的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素與包含天然異源多亞基受體的配體和該受體的樣品接觸；孵育嵌合異源多亞基粘附素與配體，使之形成一抑制天然異源多亞基受體被配體激活的復(fù)合物。
32．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中的天然異源多亞基受體是ErbB，嵌合異源多亞基粘附素包含ErbB2和ErbB3的胞外區(qū)或其片段。
33．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中的天然異源多亞基受體是ErbB，嵌合異源多亞基粘附素包含ErbB2和ErbB4的胞外區(qū)或其片段。
34．一種抑制天然異源多亞基受體活化的方法，該方法包括將權(quán)利要求22所述的拮抗性抗體與天然多亞基受體接觸形成拮抗性抗體-異源多亞基受體復(fù)合物，其中受體的活化被抑制。
35．一種激活天然異源多亞基受體的方法，該方法包括將權(quán)利要求23所述的活化性抗體與天然多亞基受體接觸形成活化性抗體-異源多亞基受體復(fù)合物，其中的受體被激活。
36．一種治療疾病的方法，它包括給需要治療的哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素。
37．一種治療疾病的方法，它包括給需要治療的哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求7所述的嵌合異源多亞基粘附素。
38．根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，所述的疾病包括炎癥、癌癥、神經(jīng)纖維瘤病、外周神經(jīng)疾病和心臟肥大。
39．根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中嵌合異源多亞基粘附素的胞外區(qū)來自以下天然異源多亞基受體的胞外區(qū)或其片段，所述受體選自Axl,Rse，上皮生長因子(EGF)受體，肝細(xì)胞生長因子(HGF)受體，IL-2,c-mer,A1-1,EPH,TrkA,TrkB,TrkC,TNF,IL-10,CRF2-4,RXR,RON,AChRα/δ,TRα/RXRα,Trα/DR4,Trα/MHC-TRE,Trα/ME,Trα/F2,KDR/FLT-1,FLT/VEGF,VEGF121/165,Arnt/Ahr,CGA/CGB,EGFR/p185-neu，促乳素受體(PRL),T細(xì)胞受體(TCR)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF),Cak受體，IL-6/gp130,IL-11/gp130白血病抑制因子(LIF)/gp130,cardiotrophin-1/gp130(CT-1),IL-11/gp130，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子CNTF/gp130，制癌蛋白M(OSM),γ干擾素和α、β干擾素。
40．根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中的疾病選自炎癥、癌癥和心臟病。
41．一種藥物組合物，其中包含權(quán)利要求1所述的嵌合異源多亞基粘附素和藥學(xué)上可接受的載體。
42．一種藥物組合物，其中包含權(quán)利要求22所述的拮抗性抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
43．一種藥物組合物，其中包含權(quán)利要求23所述的活化性抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
44．一種產(chǎn)品，它包括一容器；所述容器上的標(biāo)簽；所述容器內(nèi)的組合物；其中所述的組合物包含權(quán)利要求2所述的嵌合異源多亞基粘附素，其中所述的組合物能夠抑制配體與其天然異源多亞基受體的結(jié)合，容器上的標(biāo)簽說明組合物如何可用于拮抗配體與天然異源多亞基受體的結(jié)合。
45．一種產(chǎn)品，它包括一容器；所述容器上的標(biāo)簽；所述容器內(nèi)的組合物；其中所述的組合物包含權(quán)利要求22所述的抗嵌合異源多亞基粘附素抗體，其中所述的組合物能夠抑制配體與其天然異源多亞基受體的結(jié)合，容器上的標(biāo)簽說明組合物如何可用于拮抗配體與天然異源多亞基受體的結(jié)合。
46．一種產(chǎn)品，它包括一容器；所述容器上的標(biāo)簽；所述容器內(nèi)的組合物；其中所述的組合物包含權(quán)利要求23所述的抗嵌合異源多亞基粘附素抗體，其中所述的組合物能夠激活天然異源多亞基受體的活化，容器上的標(biāo)簽說明組合物如何可用于激活天然異源多亞基受體的活化。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種嵌合異源多亞基粘附素及其用途,它結(jié)合天然多亞基受體的配體。異源多亞基粘附素的嵌合分子包括一異源多亞基受體之單體的胞外區(qū)和用于穩(wěn)定粘附素內(nèi)嵌合分子間相互作用的多聚化區(qū)。本發(fā)明特別揭示了以下異源多亞基粘附素,它包含ErbB2和ErbB3或ErbB2和ErbB4的胞外區(qū)。本發(fā)明的嵌合ErbB異源多亞基粘附素可用作神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的拮抗劑或活化劑,用于治療以各種癌癥為例的疾病。
文檔編號C07K19/00GK1225129SQ97196249
公開日1999年8月4日 申請日期1997年7月8日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月12日
發(fā)明者V·D·菲茨帕特里克, M·斯利沃科夫斯基, R·L·范德侖 申請人:基因技術(shù)股份有限公司