原核型異檸檬酸脫氫酶及其用于提高轉基因植物氮利用的應用
【專利說明】原核型異檸檬酸脫氫酶及其用于提高轉基因植物氮利用的 應用 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明一般涉及具有改進的氮利用和應激耐受性的植物，更具體地，涉及植物中 異檸檬酸脫氫酶（ICDH)的異源表達，包括基于原核的異檸檬酸脫氫酶的過表達和表征，所 述基于原核的異檸檬酸脫氫酶改進應激耐受性和氮攝取，新陳代謝或兩者。本發(fā)明還包括 將icdh基因與一個或更多個其他轉基因組合（stacking)以改進氮利用和/或應激耐受 性。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 植物在它們的營養(yǎng)生長和生殖生長期間需要氮。通過土壤礦物質化，施用氮肥或 以上兩者植物可以獲得氮。但是，根據估計，給作物施用的氮的50-70 %從植物-土壤系統(tǒng) 損失[Peoples，Μ. B. et al.，"Minimizing Gaseous Losses of Nitrogen，'，In Nitrogen Fertilizer in the Environment(Bacon, P. E. ,ed.)Marcel Dekker，pp.565-606(1995)]〇 氮是供應的最昂貴的植物營養(yǎng)物之一，氮肥并不總是以合理的價格提供，并且氮肥的過量 施用可以產生環(huán)境挑戰(zhàn)。玉米是農學上重要的植物實例，經常需要氮肥以發(fā)揮其遺傳潛能。
[0004] 天然ICDH可以存在于線粒體，葉綠體和胞漿中，每種均具有不同的生理效果，但 是催化作用可以是類似的。一般來說，I⑶Hl定位于胞漿，I⑶H2定位于葉綠體。
[0005] 對于輔因子還原能力來說，I⑶H可以使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)或煙酰 胺腺嘌呤磷酸二核苷酸（NADP+)，取決于在哪種代謝途徑中它是有活性的。一些出版物聲 稱I⑶H的主要功能可能是為其他代謝反應產生還原能力（NADH，NADPH)，例如，在不飽和 脂肪酸的β-氧化中。其他理論包括以下意見，反應產物2-酮戊二酸（OG)可用于支持 通過 GOGAT 循環(huán)的氨基酸合成（Hodges，Μ. Enzyme redundancy and the importance of 2-〇xoglutarate in plant ammonium assimilation. J. Exp. Botany(2002)，迎，905)〇 此 外，與其他一或多個基因組合的ICDH酶的過表達可以允許有效利用額外的碳骨架。先前 關于過表達線粒體icdh基因的轉基因煙草植物的研究集中在氧化還原途徑，既沒有提及 也沒有鑒定對氮利用的任意可能影響（Gray，G.，Villarimo，A.，Whitehead，C.，McIntosh， L.Transgenic Tobacco(Nicotiana tabacum L. )Plants with Increased Expression Levels of Mitochondrial NADP+_dependent Isocitrate Dehydrogenase ：Evidence Implicating this Enzyme in the Redox Activation of the Alternative Oxidase， Plant and Cell Physiology 2004 ;45,1413-1425)〇
[0006] 由于表達，底物，小室和翻譯后調控，NAD-和NADP-依賴性異檸檬酸脫氫酶 (NAD-ICDH，EC I. I. 1. 41和NADP_ICDH，EC I. I. 1. 42)的調控是復雜的。但是仍不清楚哪 種ICDH形式產生用于氨基酸的0G，任意這類OG應該位于或進入葉綠體中，在那里氮被同 化進氨基酸。文獻表明ICDH的植物胞漿形式是同二聚體，具有大約47kD的亞基。線粒體 ICDH疑似具有更多亞基。ICDH的細菌形式可以是單體的，被認為克服了植物中存在的與植 物ICDH有關的表達與功能的典型調控，即磷酸化可以使所述同二聚體失活。
[0007] 胞漿NADP-特異性ICDH催化檸檬酸轉化為酮戊二酸。一種策略是設計包含編碼單 體原核型異檸檬酸脫氫酶基因（icdh)的基因的構建體，并指導ICDH在植物細胞質中過表 達。表達的ICDH酶將通過增強碳流動入氮同化機制而增強植物利用可利用氮的能力。本 文中，我們描述了合成icdh基因的過表達和表征，基于從細菌icdh序列的挑選并為了在玉 米中表達而優(yōu)化，以及icdh基因與其他轉基因的組合。
[0008] 發(fā)明概沐
[0009] 本發(fā)明涉及具有增加的氮利用效率、應激耐受性或這兩者的轉基因植物，所述轉 基因植物已經用包括調節(jié)植物氮利用的icdh核酸序列的新載體構建體轉化。從數(shù)個細菌 和植物基因組測序項目（已經保存于公眾數(shù)據庫，從中可以選擇編碼具有強活性的ICDH酶 的序列）中鑒定多種icdh核酸序列用于本發(fā)明。然后對這些候選icdh序列進行篩選，以 取消選擇具有相對高含量的會抑制植物中表達的PolyA區(qū)域的那些序列。將挑選以例示這 些icdh序列的序列進行密碼子優(yōu)化以在玉米中表達（SEQ ID No 1)。本發(fā)明還包括將icdh 基因與一個或更多個異源基因組合以便誘導ICDH酶與氮同化酶的過表達。本發(fā)明還涉及 用于轉化植物的分離的載體，以及用于檢測轉化植物中目標核苷酸序列的表達的抗體。本 發(fā)明還涉及在植物中表達對應于調節(jié)植物氮利用的核酸序列的核酸分子的方法。
[0010] 具體來說，使用核苷酸序列SEQ ID NO :1和3以及其組合，變體，片段，和互補體構 建用于轉化植物和細菌細胞的載體。這些載體包括Y DNA啟動子序列和Y終止子序列， 其中核酸序列，DNA啟動子序列和終止子序列是可操作連接的，以允許核苷酸序列的轉錄。 在一些實施方案中，啟動子序列可以是組成型植物啟動子或組織特異型啟動子。
[0011] 本發(fā)明還包括多克隆抗體，包括針對由核苷酸序列SEQ ID NO :1和3及其組合編 碼的多肽的多克隆抗體。
[0012] 本發(fā)明還包括用核苷酸序列SEQ ID NO :1和3及其組合，變體和片段轉化的植 物。植物選自玉米（玉蜀黍），高粱，小麥，向日葵，番茄，十字花科植物，胡椒，馬鈴薯，棉花， 水稻，大豆，甜菜，甘蔗，煙草，大麥，和含油種子油菜，蕓苔屬，苜蓿，裸麥，粟，紅花，花生，甘 薯，木薯屬，咖啡，椰子，菠蘿，柑桔樹，可可，茶樹，芭蕉屬植物，鱷梨樹，無花果樹，番石榴， 芒果樹，橄欖樹，番木瓜樹，腰果樹，澳洲堅果，杏樹，燕麥，蔬菜，草（如草皮草，飼草，或牧 草），觀賞植物，樹（如果樹，堅果樹，紙漿樹，油棕）和針葉樹。本發(fā)明還包括這類植物的組 成部分，由這類植物產生的植物種子，和利用本發(fā)明的載體構建體轉化的植物種子。
[0013] 本發(fā)明還包括用選自SEQ ID NO :1和3及其組合的核苷酸序列轉化的宿主細胞。 宿主細胞可以是細菌細胞或植物細胞。
[0014] 本發(fā)明還包括一種表達在植物中調節(jié)氮的核酸分子的方法，所述方法包括以下步 驟：提供利用本發(fā)明的載體構建體轉化的轉基因植物或植物種子，和在所述轉基因植物或 從轉基因植物種子長成的所述植物中有效表達所述核酸分子的條件下生長轉基因植物或 從轉基因植物種子長成的植物。轉基因植物的生長有效增加所述轉基因植物或從轉基因植 物種子長成的所述植物的氮攝取，和/或增加所述轉基因植物或從轉基因植物種子長成的 所述植物的氮利用效率，和/或減少限制使得所述轉基因植物或從轉基因植物種子長成的 所述植物的產量增加。本發(fā)明還包括上述方法，其中提供轉基因植物或提供轉基因種子。 本發(fā)明還包括上述方法，其中所述植物選自玉米（玉蜀黍），高粱，小麥，向日葵，番茄，十 字花科植物，胡椒，馬鈴薯，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，煙草，大麥，和含油種子油菜，蕓苔 屬，苜蓿，裸麥，粟，紅花，花生，甘薯，木薯屬，咖啡，椰子，菠蘿，柑桔樹，可可，茶樹，芭蕉屬 植物，鱷梨樹，無花果樹，番石榴，芒果樹，橄欖樹，番木瓜樹，腰果樹，澳洲堅果，杏樹，燕麥， 蔬菜，草（如草皮草，飼草，或牧草），觀賞植物，樹（如果樹，堅果樹，紙漿樹，油棕）和針葉 樹。
[0015] 本發(fā)明還包括一種通過在植物中表達被氮調節(jié)的核酸分子而提高植物的應激耐 受性的方法，所述方法包括以下步驟：提供利用本發(fā)明的載體構建體轉化的轉基因植物或 植物種子，和在所述轉基因植物或由轉基因植物種子長成的所述植物中有效表達所述核酸 分子的條件下生長轉基因植物或由轉基因植物種子長成的植物。
[0016] 本發(fā)明還包括一種通過在植物中表達被氮調節(jié)的核酸分子而改變植物的形態(tài)的 方法，所述方法包括以下步驟：提供利用本發(fā)明的載體構建體轉化的轉基因植物或植物種 子，和在所述轉基因植物或由轉基因植物種子長成的所述植物中有效表達所述核酸分子的 條件下生長轉基因植物或由轉基因植物種子長成的植物。
[0017] 本發(fā)明還包括一種載體構建體，包括編碼I⑶H氨基酸序列的核苷酸序列，所述核 苷酸序列包括SEQ ID NO :2和4及其組合，5'DNA啟動子序列，和3'終止子序列，其中所 述核苷酸序列，DNA啟動子序列和終止子序列是可操作連接的，以允許所述核苷酸序列的轉 錄。
[0018] 本發(fā)明還包括一種載體構建體，包括調節(jié)植物中氮的核苷酸序列，其中所述核苷 酸序列選自SEQ ID NO :1和3及其組合；與SEQ ID NO :1和3及其組合的相應核苷酸序列 具有至少85%序列相同性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物中調節(jié)氮；選自編碼 I⑶H氨基酸序列SEQ ID NO :2和4及其組合的那些核苷酸序列的核苷酸序列；和，編碼與 SEQ ID NO :2和4及其組合的氨基酸序列具有至少85%序列相同性的氨基酸序列的核苷酸 序列，其中所述核苷酸序列在植物中調節(jié)氮；其中所述構建體還包括5' DNA啟動子序列和 3'終止子序列，其中所述核苷酸序列，DNA啟動子序列和終止子序列是可操作連接的，以允 許所述核苷酸序列的轉錄。
[0019] 附圖簡沐
[0020] 圖1是質粒PMD08901的載體圖，其中質粒的主要元件（從頂端順時針方向）是： 右側邊界，ScUbi4啟動子，5' UTR外顯子，內含子，icdh基因，35S終止子，ScUbi4啟動子， 5'UTR外顯子，內含子，來自EPSPS的葉綠體轉運肽，nagk基因，35S終止子，ScUbi4啟動子， 5' UTR外顯子，內含子，來自EPSPS的葉綠體轉運肽，草甘膦耐受SM(GRG23ac35)，35S終止 子，左側邊界。
[0021] 圖2是質粒pMD08902的載體圖，其中質粒的主要元件（從頂端順時針方向）是： 右側邊界，ScUbi4啟動子，5' UTR外顯子，內含子，icdh基因，35S終止子，ScUbi4啟動子， 5'UTR外顯子，內含子，來自EPSPS的葉綠體轉運肽，nagk基因，35S終止子，ScUbi4啟動子， 5' UTR外顯子，內含子，草甘膦耐受SM，35S終止子，左側邊界。
[0022] 優(yōu)詵實施方案的詳細說明
[0023] 開發(fā)更有效利用氮的植物品種將減少過量輸入氮的必要，節(jié)約農民的生產成本， 造福發(fā)展中國家的農民（其無法獲得肥料輸入），和減少與過量氮肥施用有關的環(huán)境污染。 已經用于開發(fā)具有提高的氮利用的植物品種的一種方法依賴于傳統(tǒng)的植物繁育技術。但 是，由于缺乏遺傳重組的規(guī)范，這類方法的成功率是不穩(wěn)定的。
[0024] 需要開發(fā)能夠更有效地吸收和利用氮的植物品種。植物科學家已經采用簡寫 術語氮利用效率（NUE)，并已經開發(fā)出各種測量和評估NUE的方法[Craswell，E. T. and Godwin, D. C. (1984)The efficiency of nitrogen fertilizers applied to cereals grown in different climates.Tn Advances in Plant Nutrition(Vol. I) (Tinker, P.B. and Lauchli,A. ,eds),pp. 1-55,Praeger Publishers ；Steenbjerg,F. and Jakobsen, S.T. (1963)Plant nutrition and yield curves. Soil Sci. 95,69-90 ：Siddiqi, Μ. Y. and Glass, D. M. (1981)Utilization index ：a modified approach to the estimation and comparison of nutrient utilization efficiency in plants. T. Plant Nutr. 4, 289-302 ；Moll, R. H. et al. (1982)Analysis and interpretation of factors which contribute to efficiency of nitrogen utilization. Agron. .L 74, 562-5641 0 在具體定 義和使用背景中存在差異。例如，一些定義基于總生物量，而其他定義基于產生的籽粒重 量。另一組定義使用從土壤提取氮的效率。可以通過農學效率（AE)，生理效率和利用效率 的乘積，或NUEg(其是攝取效率和利用效率的乘積）測量施用氮肥用于提高籽粒產量的效 率。其他定義考慮了生理因素。
[0025] 如本說明書所述，術語氮利用效率，或NUE，被定義為包括同化途徑中任意主要氮 代謝庫規(guī)模的可測量變化（例如，可能包括下列中一種或更多種的可測量變化：硝酸鹽，亞 硝酸鹽，氨，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，賴氨酸，亮氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸，甘 氨酸，色氨酸，酪氨酸，植物部分的總蛋白含量，植物部分的總氮含量，和/或葉綠素含量）， 或其中在更低氮施肥水平植物顯示提供相同或提高的生物量或可收獲產量，或其中在相同 的氮施肥水平，當與未用本發(fā)明的調節(jié)氮的核酸構建體轉化的植物相比時，植物顯示提供 提高的生物量或可收獲產量。"可測量的變化"包括氮同化途徑的任意組分（"代謝庫"）的 量的增加或降低。變化可以包括途徑中一種或更多種代謝庫的降低或增加，或一種或更多 種庫的降低以及一種或更多種其他庫的伴隨增加，如當為了產生另一種中間物或途徑產物 而使用氮同化途徑的一種中間物。例如，在谷氨酸轉化為谷氨酰胺時，谷氨酸的水平可以降 低而谷氨酰胺的水平可以增加。因此，不受任何具體理論或機制的束縛，這些庫中的一種或 更多種的任意變化表明氮正被植物更有效地利用。
[0026] 氮利用效率的增加可以伴隨同化途徑中任意主要氮代謝庫規(guī)模的約5%，約 10%，15%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，125%，150%，約 200%或 更大的可測量變化。在一個實施方案中，當與不包含本發(fā)明的調節(jié)氮的序列的植物相比時， 本發(fā)明的轉基因植物具有增加的從環(huán)境的氮攝取。"調節(jié)氮的序列"旨在表示調節(jié)NUE的核 苷酸或氨基酸序列，非限制性實例如下：通過產生影響NUE的酶，或通過產生與涉及NUE的 組分相互作用的蛋白，或通過產生影響調節(jié)NUE的內部穩(wěn)態(tài)信號級聯(lián)的蛋白，或通過導致N 攝取、N同化、N代謝、N轉運、N利用、N保存或這些組合的可測量變化的這些機制的組合。 本發(fā)明還提供提高植物的應激耐受性的方法，通過在植物中表達一種或更多種調節(jié)氮的核 苷酸序列而進行。在一個實施方案中，調節(jié)氮的核苷酸序列是SEQ ID NO :1，或其變體和片 段。在另一個實施方案中，調節(jié)氮的核苷酸序列是編碼SEQ ID NO :2的核苷酸序列或其變 體和片段。在另一個實施方案中，調節(jié)氮的核苷酸序列分別是編碼SEQ ID NO :1加 SEQ ID NO :2的核苷酸序列或