專利名稱:抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)治療藥物,特別是涉及一種抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷。
反義核苷(Antisense)是90年代誕生的一種新型生物技術(shù)治療藥物,該藥物特異地、選擇性地攻擊引起疾病的基因其特定的堿基序列,從而阻斷其活性和某種蛋白質(zhì)的完成,最終達(dá)到治療效果。反義核苷作為生物技術(shù)治療藥物已被公認(rèn),對(duì)于人體多種疾病,它的特異性和特效性在動(dòng)物模型上已經(jīng)得到證實(shí)。目前在國(guó)外多種反義核苷藥物,包括治療惡性腫瘤、愛(ài)滋病及其它病毒類疾病、炎癥等均已進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)階段。腫瘤基因之一bcl-2的高表達(dá)與多種人體腫瘤,包括小細(xì)胞肺癌、非惡性淋巴癌、白血病、前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Bcl-2蛋白的大量合成導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞走凋亡(Apopolosis)的途徑受抑制,利用序列特異性的反義核苷來(lái)抑制細(xì)胞內(nèi)bcl-2基因的復(fù)制,以阻止Bcl-2蛋白的合成,排除腫瘤細(xì)胞走凋亡之路的障礙,達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤發(fā)展的目的。利用反義核苷技術(shù)的堿基序列特異性地抑制與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生,已成為當(dāng)今分子藥物領(lǐng)域中的一個(gè)嶄新產(chǎn)業(yè)。
本發(fā)明的目的在于提供一種尤其對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞有最強(qiáng)抑制活性的抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷。
本發(fā)明抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷的DNA序列是5’AGG TGC AGC TGC CTG GAC AT3’。
本發(fā)明抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷的合成是采用修飾過(guò)的固相磷酸硫代合成方法(Phosphorothioate),利用先進(jìn)的核酸合成儀自動(dòng)合成,其基本原理是,根據(jù)氰乙基磷酸胺化學(xué)合成程序,即把起始核苷的3’端通過(guò)連接鏈接到固相載體上,從此末端開(kāi)始逐步接長(zhǎng)寡核苷酸鏈,每接長(zhǎng)一個(gè)核苷,則為一個(gè)反應(yīng)循環(huán)。接長(zhǎng)的寡核苷酸鏈一直固定在固相載體(DMP CPG)上。過(guò)量的反應(yīng)物及副產(chǎn)物,通過(guò)乙腈洗滌除去。當(dāng)寨核苷酸合成到所需長(zhǎng)度后,它將被從固相載體上切除下來(lái),然后再脫出保護(hù)基,分離純化,最終得到所需產(chǎn)物。每個(gè)所接的核苷都需經(jīng)過(guò)保護(hù)、脫保護(hù)、縮合、戴帽、氧化的循環(huán)過(guò)程。本發(fā)明為20堿基,需要經(jīng)過(guò)20個(gè)循環(huán)才能完成。其合成反應(yīng)通過(guò)磷酸酯和羥基的縮合而形成3’,5’-磷酸二酯鏈。對(duì)于反義核苷的合成,采用硫代替磷以保護(hù)其結(jié)構(gòu)在生物體內(nèi)不被核酸酶所降解。合成的反義核苷經(jīng)反相高壓液相層析(RHPLC)純化,其純化度可達(dá)98%以上,最終產(chǎn)品冷凍干燥后貯存于4~-20℃暗處。
本發(fā)明抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷是一種治療效果特異的新型分子藥物,與傳統(tǒng)藥物的特性相比,其優(yōu)點(diǎn)在于1)本發(fā)明攻擊的目標(biāo)基因具有特異的mRNA序列。2)本發(fā)明與所攻擊的目標(biāo)基因是以Watson-Crick堿基配對(duì)結(jié)合,所以具有其特異性和親和性。
下面結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例制備及性質(zhì)。
圖1本發(fā)明粗合成物的高壓液相(HPLC)色譜2本發(fā)明粗合成物經(jīng)反相高壓液相(RHPLC)提純后的譜3核酸雜交法鑒定本發(fā)明對(duì)腫瘤細(xì)胞A549bcl-2mRNA表達(dá)的影響譜4蛋白雜交法鑒定本發(fā)明對(duì)腫瘤細(xì)胞A549Bcl-2蛋白合成的影響譜5本發(fā)明對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞走凋亡途徑的作用譜6本發(fā)明對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用曲線7本發(fā)明的濃度對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用結(jié)果圖本發(fā)明抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷合成工藝流程如下1、本發(fā)明由美國(guó)Applied Biosyslems公司出品的ABI392全自動(dòng)DNA合成儀自動(dòng)合成,合成條件嚴(yán)格按照該機(jī)的操作手冊(cè)進(jìn)行,所得粗產(chǎn)品,收集在4毫升的玻璃瓶?jī)?nèi)。
2、合成粗產(chǎn)品用真空離心方法(42℃)使氫氧化銨揮發(fā),并用酒精萃取兩次,乾燥后溶于10mM Tris-HCI·0.4mM EDTA(PH7.6)的緩沖液中。
3、使用FPLC離子交換層析柱,型號(hào)MonoOHR5/5PH12.5(從Pharmacia購(gòu)買)進(jìn)行提純,去離子和鹽。提純前、后的分析監(jiān)定如圖1、圖2所示。
4、提純后的產(chǎn)品在冷凍干燥器內(nèi)降溫和去水,冷凍干燥,得反義核苷白色粉末,于4~-20℃儲(chǔ)存。
其中合成原料β氰乙基DNA磷酰胺(美國(guó)Applied Biosystems)腺苷(美國(guó)Synthegen)鳥(niǎo)苷(美國(guó)Synthegen)胸腺嘧啶苷(美國(guó)Synthegen)胞嘧啶苷(美國(guó)Synthegen)乙睛(美國(guó)Applied Biosystems)
腺苷磷酰胺(美國(guó)APPlied Biosystems)四氮唑(美國(guó)Applied Biosystems)氫氧化銨(美國(guó)Applied Biosystems)蓋髓物試劑醋酸酐/二甲基吡啶/四氫嘸喃氧化反應(yīng)試劑四乙基硫代硫化物/水/比啶/四水嘸喃脫三苯甲基作用試劑三氯醋酸/二氯甲烷1號(hào)瓶(裝有腺苷磷酰胺)乙睛流量1.7毫升/分,用于控制和校準(zhǔn)磷酰胺和四唑的流速。
18號(hào)瓶(裝有乙睛)乙睛流量1.8毫升/分,用于控制和校準(zhǔn)蓋髓物試劑,四乙基硫代硫化物,三氯醋酸和乙睛流量。
合成柱孔徑1000唉玻璃柱,0.2微摩爾流量控制孔。
柱上合成步驟如下1、脫保護(hù)核苷酸是一個(gè)多功能團(tuán)的化合物,在合成中除了反應(yīng)所需的基團(tuán)需要發(fā)生反應(yīng)外,其它基團(tuán)都需要保護(hù),否則會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物。在固相合成第一步時(shí),要脫去5’末端的DMT保護(hù)基,使5’末端的羥基暴露,以便進(jìn)行下一步核苷的縮合反應(yīng)。
2、縮合反應(yīng)當(dāng)核苷脫保護(hù)后,5’末端的羥基與核苷的3’末端上的亞磷酰胺基團(tuán)反應(yīng),脫去二異丙基胺。反應(yīng)在供給體四氮唑的催化下,活化了磷酸酯鍵,使反就速度大大加快。
3、戴帽在固相合成寡核苷酸時(shí),載體上少部分5’末端核苷末起反應(yīng),使用乙酰氯試劑封閉,以減少核苷合成的錯(cuò)誤。
4、氧化反應(yīng)為穩(wěn)定3價(jià)磷的不穩(wěn)定狀態(tài),氧化3價(jià)磷成為5價(jià)磷,使合成的磷酸二酯鍵不易因PH值的變化而斷裂。
氧化反應(yīng)后,固相合成完成了接長(zhǎng)一個(gè)核苷的循環(huán),需進(jìn)一步加長(zhǎng)所需合成的反義核苷,進(jìn)行上述四個(gè)步驟的循環(huán),直到合成所需的長(zhǎng)度。然后把寡核苷酸從載體上切割下來(lái),得反義核苷粗產(chǎn)品。
本發(fā)明抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷對(duì)bcl-2信息核酸和Bcl蛋白合成有明顯的抑制作用。其中利用Norlhern blot核酸雜交法鑒定本發(fā)明對(duì)A549細(xì)胞mRNA表達(dá)的抑制作用。5×106細(xì)胞經(jīng)處理后用一步提取法提取總的RNA,(Trizol方法,購(gòu)自Gibco公司),每個(gè)樣品取15ugRNA走電泳,然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Hybom公司),用32P標(biāo)記的bcl-2探針與RNA雜交,再用β-actin探針作為樣品濃度鑒定的對(duì)照,經(jīng)沖洗和放射顯影后,結(jié)果如圖3所示。利用WesternBlot蛋白雜交法來(lái)鑒定本發(fā)明對(duì)A549細(xì)胞的Bcl-2蛋白合成的影響。細(xì)胞經(jīng)處理后培養(yǎng)48小時(shí),然后提取可溶性蛋白,蛋白濃度用BioRad方法測(cè)定(購(gòu)自BioRad公司),每個(gè)樣品取100ug走12%的SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Hybond公司),用小鼠抗入Bcl-2單克隆抗體與蛋白膜雜交,再用酶標(biāo)的兔抗鼠I9(Peoxidase)第二抗體與之雜交,最終用EGL方法測(cè)定(Amersham公司),結(jié)果如圖4所示。
本發(fā)明抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷對(duì)腫瘤的殺傷作用為誘導(dǎo)細(xì)胞走凋亡途徑。利用免疫熒光法測(cè)定,對(duì)照無(wú)處理A549細(xì)胞與本發(fā)明處理過(guò)的細(xì)胞(1.5×105),經(jīng)收獲后用PBS洗滌兩次,室溫下用4%的中性福爾馬林液處理10分鐘,取50毫升細(xì)胞懸浮液滴在玻璃片上固定,用PBS沖洗兩次后用細(xì)胞凋亡免疫熒光試劑盒“ApopTag”(購(gòu)自O(shè)necor公司)測(cè)試細(xì)胞凋亡的比例。分析結(jié)果表明,無(wú)處理的細(xì)胞所含凋亡數(shù)量大約在3~5%,而經(jīng)本發(fā)明處理后的細(xì)胞,其凋亡比例高達(dá)70~80%。如圖5所示。
本發(fā)明抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷具有抑制生物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的活性。利用A549引發(fā)的腫瘤(約20mg)植入去腳腺裸鼠表皮內(nèi),一周后開(kāi)始觀察和處理,此時(shí)腫瘤長(zhǎng)到約0.1cm3小,無(wú)處理、本發(fā)明、其它對(duì)照DO1040和DO1050均每日點(diǎn)滴處理一次,劑量5mg/公斤/每天,每周測(cè)定一次腫瘤大小,腫瘤生長(zhǎng)情況如圖6所示;同時(shí)本發(fā)明對(duì)腫瘤的抑制作用是隨濃度增加而增加。采用低濃度劑量25nM和高濃度劑量250nM分別點(diǎn)滴處理植入腫瘤的小鼠,對(duì)照采用生理鹽水,6周后觀察,對(duì)照組腫瘤大小為2cm3,低濃度劑量處理,腫瘤微小,約0.23m,而高濃度劑量處理,無(wú)明顯的腫瘤形成。其結(jié)果如圖7所示。(注DO1040的DNA序列是5’GTC AGT CAG GCA CGT CTG AG3’,DO1050 DNA序列是5’ATGTCC AGG GAG CTG CAC CT3’)。
權(quán)利要求
1.一種抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷,其特征在于DNA序列是5’AGG TGC AGC TGC CTG GAC AT3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抑制人體惡性腫瘤生長(zhǎng)的反義核苷,其DNA序列是5’AGG TGC AGC TGC CTG GACAT3’。它能抑制細(xì)胞內(nèi)bcl-2基因的表達(dá),以阻止Bcl-2蛋白的合成,而B(niǎo)cl-2的高表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展有關(guān),從而排除了腫瘤細(xì)胞走凋亡途徑的障礙,達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)展,最終達(dá)到治療人體惡性腫瘤的目的。對(duì)于治療小細(xì)胞肺癌和前列腺瘤效果尤為顯著。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1227227SQ9811187
公開(kāi)日1999年9月1日 申請(qǐng)日期1998年2月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月27日
發(fā)明者李伯剛 申請(qǐng)人:中科院成都地奧制藥公司