專(zhuān)利名稱：一種新的人蛋白及其編碼序列,以及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及人Py-CR的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是人吡咯啉-5’-羧酸還原酶(pyrroline-5′-carboxylate reductase，簡(jiǎn)稱為“P5CR”)(EC1.5.1.2)的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
吡咯啉-5’-羧酸還原酶(pyrroline-5′-carboxylate reductase，簡(jiǎn)稱為“P5CR”)(EC1.5.1.2)是一個(gè)分布極為廣泛的酶，普遍存在于各種原核生物和真核動(dòng)植物中。它專(zhuān)一地催化依賴NAD(P)H的、將吡咯啉-5’-羧酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼岬倪€原反應(yīng)，并將NAD(P)H氧化NAD(P)+。其反應(yīng)一般可表示為吡咯啉-5’-羧酸+NAD(P)H→脯氨酸+NAD(P)+在不同的生物體的不同組織中，P5CR發(fā)揮著不同的生理功能。在成纖維細(xì)胞、軟骨和其它大量需要脯氨酸的組織中，P5CR的主要作用是生成脯氨酸，參與蛋白質(zhì)合成(Metabolism 1978，27685-694)；而在紅細(xì)胞中，P5CR參與反應(yīng)產(chǎn)生NAD(P)+作為6-磷酸葡萄糖脫氫酶的輔酶，從而刺激磷酸己糖支路的活化(Biochem.Biophys.Res.Commun.1988，852036-2040)；在耐受干旱或高鹽等環(huán)境壓力的植物中，它產(chǎn)生脯氨酸作為一種有效的滲壓劑(Plant Cell.Physiol.1997，38(10)1095-1102)；另外，它也可以是細(xì)胞內(nèi)氧化還原勢(shì)能的調(diào)節(jié)者，因此P5CR具有重要的生物學(xué)意義。
早在八十年代，人們就從牛角膜、大鼠晶狀體、人紅細(xì)胞等不同來(lái)源中分離得到了P5CR的蛋白分子(Biochim.Biophys.Acta 1982，717215-219；Biochim.Biophys.Acta 1986，88172-78；J.Biol.Chem.1989，264(16)9352-9358)。1982年，Deutch等人最先獲得大腸桿菌P5CR的DNA序列(Nucleic Acid Res.1982，107701-7714)。1990年，Delauney等人通過(guò)功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)克隆了大豆的P5CR基因(Mol.Gen.Genet.1990，221299-305)。1992年，Dougherty小組從人肝細(xì)胞株來(lái)源的cDNA文庫(kù)中克隆了第一個(gè)人P5CR cDNA(J.Biol.Chem.1992.267(2)871-875)。以后，人們又在熱細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)和植物中發(fā)現(xiàn)了編碼P5CR的基因。
然而，迄今為止，尚未見(jiàn)有與本發(fā)明序列一致的報(bào)道。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼吡咯啉-5’-羧酸還原酶(pyrroline-5′-carboxylate reductase，簡(jiǎn)稱為“P5CR”)同系物的一個(gè)新成員，本發(fā)明的P5CR同系物成員被命名為人Py-CR。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人的P5CR同系物成員，該蛋白被命名為人Py-CR蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的Py-CR多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的Py-CR核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人Py-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人Py-CR蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人Py-CR蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人Py-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人Py-CR蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人Py-CR蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人Py-CR蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人Py-CR蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長(zhǎng)為1121個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.3，其中開(kāi)放讀框位于136-1098位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人Py-CR蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人PY-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中136-1098位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框136-1098位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中136-1098位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人Py-CR相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人Py-CR蛋白多肽”指具有人Py-CR蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人Py-CR蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人Py-CR蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人Py-CR DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Py-CR多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人Py-CR多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人Py-CR多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Py-CR多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人Py-CR蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然人Py-CR多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人Py-CR保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表
本發(fā)明還包括人Py-CR多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人Py-CR的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人Py-CR多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人Py-CR的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)人Py-CR核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人Py-CR多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人Py-CR DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多范隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人Py-CR基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人Py-CR基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人Py-CR蛋白的分子，也包括那些并不影響人Py-CR蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人Py-CR基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專(zhuān)利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人Py-CR基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人Py-CR或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類(lèi)單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人Py-CR功能的抗體以及不影響人Py-CR功能的抗體。本發(fā)明的各類(lèi)抗體可以利用人Py-CR基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人Py-CR基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得，本發(fā)明的人Py-CR核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人Py-CR的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人肝λgt11cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A5’-CAGAAGCTGCTGTTAGCTCGCCG-3′為正向引物，寡核苷酸B5′-TCACAGAGGGGACAGATGCTGCC-3’為反向引物，進(jìn)行PCR。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后得到SEQ ID NO.3的全長(zhǎng)cDNA序列。
吡咯啉-5’-羧酸還原酶是脯氨酸合成中最后一步反應(yīng)的催化者，以NADPH或NADH為輔酶，促進(jìn)吡咯啉-5’-羧酸還原成脯氨酸，同時(shí)氧化NAD(P)H為NAD(P)+。它具有重要的生物學(xué)功能，在脯氨酸的內(nèi)源生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化—還原勢(shì)能，活化磷酸己糖支路，維持細(xì)胞滲透壓，參與能量從固氮植物向其內(nèi)共生體轉(zhuǎn)換等各種生理過(guò)程中都有重要的作用。吡咯啉-5’-羧酸還原酶的類(lèi)似物很可能也在類(lèi)似途徑中發(fā)揮著重要作用。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人Py-CR與人吡咯啉-5’-羧酸還原酶(P5CR)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人Py-CR的cDNA序列的克隆和測(cè)定1.引物擴(kuò)增以人肝λgt11cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A5’-CAGAAGCTGCTGTTAGCTCGCCG-3’(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸B5’-TCACAGAGGGGACAGATGCTGCC-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A/B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到約1.1kb的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共1121bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.3，其中開(kāi)放讀框位于136-1098位核苷酸。
根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出人Py-CR的氨基酸序列，共320個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID NO.4。
實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人Py-CR的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們與不同來(lái)源的P5CR基因及其編碼蛋白，如人P5CR(M77836)、大豆P5CR(X16352)和Actinidia deliciosa P5CR(U92287)，具有廣泛的同源性。是用PCGENE軟件比較發(fā)現(xiàn)它與人P5CR在蛋白水平上的同一性達(dá)到84％，另有6.6％的氨基酸相似，因此，本發(fā)明的人Py-CR蛋白可歸人P5CR蛋白同系物，并且可以推測(cè)它具有P5CR蛋白同系物的一般功能。
吡咯啉-5’-羧酸還原酶分布極為廣泛，在細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物、植物等各種生物體內(nèi)都有表達(dá)。它是脯氨酸合成中最后一步反應(yīng)的催化者，以NADPH或NADH為輔酶，促進(jìn)吡咯啉-5’-羧酸還原成脯氨酸，同時(shí)氧化NAD(P)H為NAD(P)+。它具有重要的生物學(xué)功能，在脯氨酸的內(nèi)源生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化—還原勢(shì)能，活化磷酸己糖支路，維持細(xì)胞滲透壓，參與能量從固氮植物向其內(nèi)共生體轉(zhuǎn)換等各種生理過(guò)程中都有重要的作用。不同來(lái)源的P5CR由于起不同的生理功能，表現(xiàn)出的底物親和力、輔酶需求以及產(chǎn)物抑制作用有所不同。
在動(dòng)物體中，脯氨酸是合成膠原蛋白的主要原料，因此在像軟骨、骨骼、眼等大量需要脯氨酸的組織中，P5CR的表達(dá)水平特別高，它的主要作用就是還原吡咯啉-5’-羧酸，生成脯氨酸(Metabolism 1978，27685-694)，并且以NADH為輔酶時(shí)具有更高的反應(yīng)速率，并受到產(chǎn)物脯氨酸的抑制調(diào)節(jié)。此外，P5CR在紅細(xì)胞也有表達(dá)，特別是它在脯氨酸合成缺陷的淋巴母細(xì)胞中也有功能(Biochem.Biophys.Res.Commun.1981，101(3)1018-1025)，提示它的另一個(gè)重要作用產(chǎn)生NADP+，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原勢(shì)能，激活糖代謝的另一個(gè)重要途徑——磷酸己糖支路(HMP支路)。HMP支路在各種生物中都存在，它可以循環(huán)分解六碳糖產(chǎn)生NADPH，為脂肪酸、固醇等物質(zhì)的合成代謝提供必須的能量來(lái)源，是乳腺、脂肪組織、腎上腺皮質(zhì)等組織中主要的葡萄糖分解途徑。并且，HPM支路和植物光合作用共有一些酶和中間產(chǎn)物，關(guān)系十分密切，它在植物中的存在更普遍。吡咯啉-5’-羧酸和脯氨酸可以作為一對(duì)氧化還原對(duì)，提供一種氧化還原勢(shì)能的往返機(jī)制(Curr.Top Cell Reg.1985，2591-132)。P5CR作用于此時(shí)，表現(xiàn)出不受產(chǎn)物脯氨酸而受NADP+和ATP的抑制調(diào)節(jié)。
盡管目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)P5CR異常引起的遺傳疾病，但是根據(jù)其重要的生理功能，可以預(yù)測(cè)P5CR的缺陷，可以導(dǎo)致矮小癥、軟骨發(fā)育異常、白內(nèi)障、泌乳障礙、溶血性貧血等疾患(J.Biol.Chem.1992，267(2)871-875)。在一種先天性滲透白內(nèi)障的小鼠(Nakano小鼠)晶狀體中，HMP支路水平一貫低于對(duì)照組水平(Exp.Eye Res.1985，41767-775)。Py-CR的缺陷可能也會(huì)導(dǎo)致類(lèi)似的疾病。
本發(fā)明的人Py-CR除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人Py-CR還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人Py-CR的N端與人P5CR的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人Py-CR的抗體，用于篩選該家族的其他成員(如P5CR的其他類(lèi)似物)，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人Py-CR核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人Py-CR的表達(dá)水平或者抑制人Py-CR的過(guò)度表達(dá)。本發(fā)明的人Py-CR蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人Py-CR缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人Py-CR在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人Py-CR的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.5和6)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人Py-CR cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGTCGACATGAGCGTGGGCTTCATCG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的人Py-CR編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-TTGGAAGCTTTTAGTCCTTCTTGCCTCCC-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人Py-CR的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開(kāi)放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購(gòu)自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人Py-CR的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子克隆。過(guò)夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋?zhuān)缓蠼臃N到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過(guò)使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過(guò)在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人Py-CR。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人Py-CR?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約34KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4人Py-CR在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人Py-CR的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.7和8)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人Py-CR cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTTATGAGCGTGGGCTTCATCG-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的人Py-CR編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-TTGGGAATTCTTAGTCCTTCTTGCCTCCC-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人Py-CR的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和EcoRI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用XbaI酶切及測(cè)序驗(yàn)證人Py-CR的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋?zhuān)x擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽(yáng)性亞克隆。48小時(shí)后，開(kāi)始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTrisáHCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTrisáHCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為34KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人Py-CR基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱一種新的人蛋白及其編碼序列，以及制法和用途(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CAGAAGCTGC TGTTAGCTCG CCG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TCACAGAGGG GACAGATGCT GCC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度1121bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.3CAGAAGCTGC TGTTAGCTCG CCGGTCCTCG GACGCCGCCC GTTCGCCCCT GCGCTGTCCG 60CCCTTCCCCT AGCGTTACTT CCGGTCCCTC GCTGAGGGGG TTCGTGCGGC TCCCAGGAGG 120CGTGAACCGC GGACCATGAG CGTGGGCTTC ATCGGGGCCG GCCAGCTGGC TAATGCTCTG 180GCGCGGGGCT TCACGGCCGC AGGCATCCTG TCGGCTCACA AGATAATAGC CAGCTCCCCA 240GAAATGAACC TGCCCACGGT GTCCGCGCTC AGGAAGATGG GTGTGAACCT GACACGCAGC 300AACAAGGAGA CGGTGAAGCA CAGCGACGTC CTGTTTCTGG CTGTGAAGCA CATTATCATC 360CCCTTCATCC TGGATGAGAT TGGGGCCGAC GTGCAAGCCA GACACATCGT GGTCTCCTGT 420GCGGCTGGTG TCACCATCAG CTCTGTGGAG AAGAAGCTGA TGGCATTCCA GCCAGCCCCC 480AAAGTGATTC GCTGCATGAC CAACACACCT GTGGTAGTGC AGGAAGGCGC TACAGTGTAC 540GCCACGGGCA CCCATGCCCT GGTGGAGGAT GGGCAGCTCC TGGAGCAGCT CATGAGCAGC 600GTGGGCTTCT GCACTGAGGT GGAAGAGGAC CTCATCGATG CCGTCACGGG GCTCAGTGGC 660AGCGGGCCTG CCTATGCATT CATGGCTCTG GACGCATTGG CTGATGGTGG GGTGAAGATG 720GGTTTGCCAC GGCGCCTGGC AATCCAACTC GGGGCCCAGG CTTTGCTGGG AGCTGCCAAG 780ATGCTGCTGG ACTCGGAGCA GCATCCATGC CAGCTTAAGG ACAATGTCTG CTCCCCTGGG 840GGAGCCACCA TCCACGCCCT GCACTTTCTA GAGAGTGGGG GCTTCCGCTC TCTGCTCATC 900AATGCAGTTG AGGCCTCCTG TATCCGAACA CGAGAGCTAC AGTCCATGGC CGACCAAGAA 960AAGATCTCCC CAGCTGCCCT TAAGAAGACC CTCTTAGACA GAGTGAAGCT GGAATCCCCC 1020ACAGTCTCCA CACTGACCCC CTCCAGCCCA GGGAAGCTCC TCACAAGAAG CCTGGCCCTG 1080GGAGGCAAGA AGGACTAAGG CAGCATCTGT CCCCTCTGTG A(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度320個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ser Val Gly Phe Ile Gly Ala Gly Gln Leu Ala Asn Ala Leu 15Ala Arg Gly Phe Thr Ala Ala Gly Ile Leu Ser Ala His Lys Ile 30Ile Ala Ser Ser Pro Glu Met Asn Leu Pro Thr Val Ser Ala Leu 45Arg Lys Met Gly Val Asn Leu Thr Arg Ser Asn Lys Glu Thr Val 60Lys His Ser Asp Val Leu Phe Leu Ala Val Lys His Ile Ile Ile 75Pro Phe Ile Leu Asp Glu Ile Gly Ala Asp Val Gln Ala Arg His 90Ile Val Val Ser Cys Ala Ala Gly Val Thr Ile Ser Ser Val Glu 105Lys Lys Leu Met Ala Phe Gln Pro Ala Pro Lys Val Ile Arg Cys 120Met Thr Asn Thr Pro Val Val Val Gln Glu Gly Ala Thr Val Tyr 135Ala Thr Gly Thr His Ala Leu Val Glu Asp Gly Gln Leu Leu Glu 150Gln Leu Met Ser Ser Val Gly Phe Cys Thr Glu Val Glu Glu Asp 165Leu Ile Asp Ala Val Thr Gly Leu Ser Gly Ser Gly Pro Ala Tyr 180Ala Phe Met Ala Leu Asp Ala Leu Ala Asp Gly Gly Val Lys Met 195Gly Leu Pro Arg Arg Leu Ala Ile Gln Leu Gly Ala Gln Ala Leu 210Leu Gly Ala Ala Lys Met Leu Leu Asp Ser Glu Gln His Pro Cys 225Gln Leu Lys Asp Asn Val Cys Ser Pro Gly Gly Ala Thr Ile His 240Ala Leu His Phe Leu Glu Ser Gly Gly Phe Arg Ser Leu Leu Ile 255Asn Ala Val Glu Ala Ser Cys Ile Arg Thr Arg Glu Leu Gln Ser 270Met Ala Asp Gln Glu Lys Ile Ser Pro Ala Ala Leu Lys Lys Thr 285Leu Leu Asp Arg Val Lys Leu Glu Ser Pro Thr Val Ser Thr Leu 300Thr Pro Ser Ser Pro Gly Lys Leu Leu Thr Arg Ser Leu Ala Leu 315Gly Gly Lys Lys Asp(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGAGCGTGG GCTTCATCG 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TTAGTCCTTC TTGCCTCCC 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGAGCGTGG GCTTCATCG 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGAATTC TTAGTCCTTC TTGCCTCCC 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人Py-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列。
4.一種分離的人Py-CR蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有人Py-CR蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人Py-CR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人Py-CR蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸136-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人Py-CR蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人Py-CR蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人Py-CR蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的人Py-CR蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針?lè)肿?，其特征在于，它含有?quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人基因核苷酸序列,更具體地,本發(fā)明提供了人Py－CR的cDNA序列,該cDNA編碼的蛋白是人吡咯林－5'－羧酸還原酶(pyrroline－5'－carboxylate reductase,簡(jiǎn)稱為“P5CR”)(EC1.5.1.2)的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1274728SQ9910707
公開(kāi)日2000年11月29日 申請(qǐng)日期1999年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月25日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 張宏來(lái), 趙勇, 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)